CN102217590A - 银鲳精子冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银鲳精子冷冻保存方法,是选取性成熟的亲鱼采集优质精液,选择适宜基础液及抗冻液,精液与抗冻液按照体积比1∶1混合后,冰上保存4-5min,按照三步降温法降温至-150℃后停留5min,直接投入液氮中保存;解冻时,将冷冻管在液氮蒸汽中停留2min,迅速投入28℃水浴解冻90s后置于室温下完全溶解,将解冻精液用海水激活,精子的快速游动时间平均57.41s,精子活力(快速运动精子占全部精子的百分数)平均为83.62%,极大提高了银鲳的受精率。
Description
技术领域
本发明属于精子冷冻技术领域,具体涉及一种银鲳精子冷冻保存方法。
背景技术
银鲳属于鲈形目、鲳亚目、鲳科、鲳属,肉质洁白、细嫩、少刺,富含蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、钠、钾、维生素A、维生素B1、维生素B2、烟酸等营养素,经常食用能强身健体、预防心肌梗塞、脑血栓等成人疾病,因而倍受养殖业者和消费者的喜爱,市场开发前景广阔。然而由于过度捕捞和环境污染,银鲳资源严重衰退,不能满足广大消费者的需求,开展银鲳的人工繁育技术研究并提供优质苗种为最佳选择。从目前来看,银鲳的人工繁殖采用海上人工受精,需要雌雄同步成熟,天然条件下银鲳雄鱼的发育快于雌鱼,这样必然影响到人工繁殖技术的成功及受精率。因此进行银鲳精子冷冻保存,不但可提高银鲳人工繁殖过程中的受精率,而且还有利于银鲳的种质资源的保护。
关于海水鱼类的精子冷冻保存方法,已公开的专利有“紫红笛鲷精子冷冻保存方法”、“条斑星鲽精子冷冻保存方法”和“圆斑星鲽精子冷冻保存方法”。但不同鱼类精子的冷冻保存方法会由于种类、生活环境的不同而不同,所以本申请人在经过精心实验研究的基础上,提出了本项专利申请技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种受精率高的银鲳精子冷冻保存方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种银鲳精子冷冻保存方法,保存方法的步骤是:
(1)精液采集:选择性腺发育成熟的雄性亲鱼,采用腹部挤压法获取精液,将活动率85%以上的精液用于精子冷冻,精液采集后置于冰上保存;
(2)基础液选择:配制方法:NaCl7.5g/L,NaHCO30.25g/L,KCl0.38g/L,CaCl2·2H2O0.18g/L,MgCl20.22g/L,NaH2PO40.22g/L,D-葡萄糖1g/L,以1N HCl调节pH至7.3,备用;
(3)抗冻剂选择:将上述基础液终浓度的10-15%二甲基亚砜作为抗冻保护剂;
(4)精子的稀释与平衡:将精液与抗冻剂按照体积比1∶1混合,在冰上平衡4-5min;
(5)精子冷冻:将平衡后的精液分装入冻存管中,降温冷冻保存;
(6)精子解冻:先将冻存管提至罐口,在液氮蒸汽中停留1.5-2.5min,然后将冷冻管取出迅速置于25-30℃水浴中解冻80-100s,取出置于室温下至完全融化;
(7)精子激活后的活力检验:室温条件下,以自然海水激活精子,检查精子活力,统计精子快速运动时间。
而且,所述步骤(5)中的精子降温冷冻保存采用三步降温法,即液氮罐颈部-20℃停留3min,液氮面上5cm处-150℃停留5min,再直接投入液氮中保存。
本发明的优点和积极效果是:
本发明选取性成熟的亲鱼采集优质精液,选择适宜基础液及抗冻液,精液与抗冻液按照体积比1∶1混合后,冰上保存4-5min,按照三步降温法降温至-150℃后停留5min,直接投入液氮中保存;解冻时,将冷冻管在液氮蒸汽中停留2min,迅速投入28℃水浴解冻90s后置于室温下完全溶解,将解冻精液用海水激活,精子的快速游动时间平均57.41s,精子活力(快速运动精子占全部精子的百分数)平均为83.62%,极大提高了银鲳的受精率。
具体实施方式
以下结合具体实施方法来进一步说明本发明;需要强调的是:对于本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
一种银鲳精子冷冻保存方法,步骤是:
(1)精液采集:
选择性腺发育成熟的雄性亲鱼,采用腹部挤压法获取精液,5ml离心管收集精液,活动率85%以上的精液用于精子冷冻,精液采集后置于冰上保存;
(2)基础液选择:
基础液选择:配制方法:NaCl7.5g/L,NaHCO30.25g/L,KCl0.38g/L,CaCl2·2H2O0.18g/L,MgCl20.22g/L,NaH2PO40.22g/L,D-葡萄糖1g/L,以1N HCl调节pH至7.3,备用;
(3)抗冻剂选择:
以基础液终浓度的13%DMSO(二甲基亚砜)作为抗冻保护剂;
(4)精子的稀释与平衡:
将精液与抗冻剂按照体积比1∶1混合,在冰上平衡4-5min;
(5)精子冷冻:
将平衡后的精液分装入1.5ml冻存管中,按照三步降温法进行冷冻保存;即液氮罐颈部约-20℃停留3min,液氮面上约5cm处约-150℃停留5min,再直接投入液氮中保存;
(6)精子解冻:
解冻时,先将冻存管提至罐口,在液氮蒸汽中停留约2min,然后将冷冻管取出迅速置于28℃水浴中解冻90s,取出置于室温下至完全融化;
(7)精子激活后的活力检验:
室温条件下,以自然海水激活精子,检查精子活力,统计精子快速运动时间。
经检测,精子的快速游动时间平均57.41s,精子活力(快速运动精子占全部精子的百分数)平均为83.62%。
Claims (2)
1.一种银鲳精子冷冻保存方法,其特征在于:保存方法的步骤是:
(1)精液采集:选择性腺发育成熟的雄性亲鱼,采用腹部挤压法获取精液,将活动率85%以上的精液用于精子冷冻,精液采集后置于冰上保存;
(2)基础液选择:配制方法:NaCl7.5g/L,NaHCO30.25g/L,KCl0.38g/L,CaCl2·2H2O0.18g/L,MgCl20.22g/L,NaH2PO40.22g/L,D-葡萄糖1g/L,以1N HCl调节pH至7.3,备用;
(3)抗冻剂选择:将上述基础液终浓度的10-15%二甲基亚砜作为抗冻保护剂;
(4)精子的稀释与平衡:将精液与抗冻剂按照体积比1∶1混合,在冰上平衡4-5min;
(5)精子冷冻:将平衡后的精液分装入冻存管中,降温冷冻保存;
(6)精子解冻:先将冻存管提至罐口,在液氮蒸汽中停留1.5-2.5min,然后将冷冻管取出迅速置于25-30℃水浴中解冻80-100s,取出置于室温下至完全融化;
(7)精子激活后的活力检验:室温条件下,以自然海水激活精子,检查精子活力,统计精子快速运动时间。
2.根据权利要求1所述的银鲳精子冷冻保存方法,其特征在于,所述步骤(5)中的精子降温冷冻保存采用三步降温法,即液氮罐颈部-20℃停留3min,液氮面上5cm处-150℃停留5min,再直接投入液氮中保存。
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