CN111748517A - 一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法 - Google Patents

一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，包括以下步骤：(1)取性腺处于发育V期的鱼类性腺(2)分离鱼类性腺的间质细胞(3)加入HHBS细胞培养液(4)在离心管中加入3mL透明质酸酶，震荡后加入5mL细胞培养液，离心取上清(5)将上清液用细胞筛过滤(6)将过滤后的细胞上清液，分别添加DMSO，谷胱甘肽、半胱氨酸，吹打混匀，放到‑20℃冷冻保存，即得。本发明的优点是应用效果好、成本低、容易加工生产。

Description

一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法。
背景技术
成熟雄性鱼类的精巢组织，色白，分布于鱼体腹侧，约占活体重的7％左右，其主要成分为精子。由于它具有独特的气味，长期以来没有被充分利用。但现在鱼类性腺已成为一种重要的制药原料，用鱼类性腺制成的药物正在为治疗疾病而贡献自己的力量。鱼类性腺的主要成分为核蛋白、酶类以及多种微量元素(较多的有锰、锌、铜、钼等)。核蛋白是由性腺分离、提取的白色纤维状物质，主要由脱氧核糖核酸DNA和碱性蛋白质(鱼精蛋白)组成，其中DNA占大约2/3，鱼精蛋白占1/3。鱼精蛋白(Protamine)是一种多聚阳离子天然肽类，是一种碱性蛋白质，主要在鱼类(如蛙鱼、蹲鱼、鲱鱼等)成熟精子细胞核中作为和DNA结合的核精蛋白存在。鱼精蛋白具有广谱抗菌活性，是一种天然防腐剂。由于鱼精蛋白完全是天然成分，具有很高的安全性，具有安全、无毒、无副作用的优点，作为一种新型防腐剂，在食品工业中具有广阔的应用前景。
鱼精核蛋白是DNA和鱼精蛋白结合而成的大分子物质，几乎占鱼精精子核的全部。鱼精蛋白的最主要特点是其蛋白质结构中含精氨酸最多，约占2/3。精氨酸具有强化肝功能，刺激垂体释放促性腺激素的作用，可治疗因精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症。而DNA鱼精具有抗衰老、增强机体抵抗力和强化生殖功能的作用。此外，鱼精中含有较多的微量元素锌，鱼精中的精氨酸、DNA和微量元素锌三者产生协同作用，可用于治疗因精液质量下降(少精或无精)、精子活动能力减退、精子畸形率增高而引起的鱼类精子活力降低等症状。
精子活力是指精液中运动精子所占的百分率。由于只有具有运动的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，所以精子活力与雌性受胎率密切相关，从而它是目前评定精液品质优劣的常规检查的主要指标之一。如能有效的提高精子活力，势必会提高亲鱼的繁殖率，进而提高养殖场的经济效益。因此，制备能够显著提高鱼类精子活力的激动剂，具有重要意义。
发明内容
针对现有技术提高鱼类精子活力的缺陷，本发明的目的在于提供一种成本低廉、使用方便、效果显著、毒害作用小的提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，本发明制备的鱼类精子激动剂，体外使用、应用效果好、成本低、容易加工生产，具有较好的市场前景。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取性腺处于发育V期的鱼类性腺，放入加有2％青霉素的28℃Hanks液中浸润45min；
(2)分离鱼类性腺的间质细胞，并用含有2％链霉素的Hanks液清洗两遍；
(3)加入HHBS细胞培养液，28℃培养三天，并适度依据细胞的生长状态，按照生长的细胞1：2或1：3进行传代，将传代后的细胞液转移至离心管中，离心去上清液；
(4)在离心管中加入3mL透明质酸酶，在28℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡4～5次后，加入5mL细胞培养液，取培养好的细胞液2000r/min离心取上清。；
(5)将上清液用细胞筛过滤；
(6)将过滤后的细胞上清液，分别添加DMSO，谷胱甘肽、半胱氨酸，吹打混匀，放到-20℃冷冻保存，即得；
所述步骤(1)的取性腺发育V期的鱼类性腺的间质细胞，具体操作为：选取相同品种雄性鱼类的发育V期的鱼类，用MS-222进行麻醉，剪开雄鱼腹部，取出鱼类性腺并用手术剪剪碎碎至4mm3的组织块，把剪碎后的性腺组织加入含有1％双抗的Hanks液中，在28℃、15％CO2培养箱内孵育60min。
所述步骤(2)的分离鱼类性腺的间质细胞，具体操作为：将孵育后的性腺组织用Hanks液清洗三次，再次用消毒的手术剪剪成碎块大小为1mm3左右，去除血管、间质等杂质后用Hanks液洗2-3次，加入0.25％的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，即得分离的间质细胞。
所述步骤(3)中离心去上清液为4000r/min，离心15min。
所述步骤(4)中细胞培养液为HHBS细胞培养液。
所述步骤(5)中细胞筛网目为500目。
所述步骤(6)中上清液中添加的DMSO、谷胱甘肽、半胱氨酸体积比分别为15％、10％、5％。
本发明双抗就是青链霉素混合液，青链霉素混合液双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。青霉素—链霉素溶液中，青霉素的含量为10000U/mL，链霉素的含量为10mg/mL。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL
青霉素，是抗菌素的一种，是指分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是由青霉菌中提炼出的抗生素，是很常用的抗菌药品。
Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于配制培养液，稀释剂和细胞清洗液。
链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。
HHBS细胞培养液，即具有20mM Hepes缓冲液(HHBS)的Hank's平衡盐溶液用于多种细胞培养应用，例如洗涤细胞，运输细胞或组织样品，稀释细胞用于计数和制备试剂。具有钙和镁的制剂通常用作转运介质，或用于试剂制备，例如钙，膜电位测定缓冲液制备。
透明质酸酶是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。
DMSO是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。
谷胱甘肽是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，存在于几乎身体的每一个细胞，能帮助保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。
半胱氨酸，一种生物体内常见的氨基酸。为含硫α-氨基酸之一，遇硝普盐呈紫色，存在于许多蛋白质、谷胱甘肽中。
本发明的有益效果为：本发明激动剂体外使用、成本低廉、方便使用、效果显著、毒害作用小，可以有效改善鱼类精子微环境，改善人工授精的效果。同时，本发明制备的鱼类精子激动剂应用容易加工生产，便于使用，具有长效作用，方便简单，制备过程简单，易于推广使用。
附图说明
图1为计算机精子辅助分析系统观察到的添加有激动剂的实验组精子运动轨迹图；
图2为计算机精子辅助分析系统观察到的添加有相同体积灭菌海水的对照组精子运动轨迹图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，
通过以下方法制备：
(1)取性腺处于发育V期的大西洋鲑性腺，放入加有2％青霉素的28℃Hanks液中浸润45min；
(2)分离大西洋鲑性腺的间质细胞，并用含有2％链霉素的Hanks液清洗两遍；
(3)加入HHBS细胞培养液，28℃培养三天，并适度依据细胞的生长状态，按照生长的细胞1：2或1：3进行传代，将传代后的细胞液转移至离心管中，离心去上清液；
(4)在离心管中加入3mL透明质酸酶，在28℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡4～5次后，加入5mL细胞培养液，取培养好的细胞液2000r/min离心取上清。；
(5)将上清液用细胞筛过滤；
(6)将过滤后的细胞上清液，分别添加DMSO，谷胱甘肽、半胱氨酸，吹打混匀，放到-20℃冷冻保存，即得；
实施例2
一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取性腺处于发育V期的大菱鲆性腺，放入加有2％青霉素的28℃Hanks液中浸润45min；
(2)分离大菱鲆性腺的间质细胞，并用含有2％链霉素的Hanks液清洗两遍；
(3)加入HHBS细胞培养液，28℃培养三天，并适度依据细胞的生长状态，按照生长的细胞1：2或1：3进行传代，将传代后的细胞液转移至离心管中，离心去上清液；
(4)在离心管中加入3mL透明质酸酶，在28℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡4～5次后，加入5mL细胞培养液，取培养好的细胞液2000r/min离心取上清。；
(5)将上清液用细胞筛过滤；
(6)将过滤后的细胞上清液，分别添加DMSO，谷胱甘肽、半胱氨酸，吹打混匀，放到-20℃冷冻保存，即得；
所述步骤(1)的取性腺发育V期的大菱鲆性腺的间质细胞，具体操作为：选取相同品种雄性大菱鲆的发育V期的鱼类，用MS-222进行麻醉，剪开雄鱼腹部，取出大菱鲆性腺并用手术剪剪碎碎至4mm3的组织块，把剪碎后的性腺组织加入含有1％双抗的Hanks液中，在28℃、15％CO2培养箱内孵育60min。
所述步骤(2)的分离大菱鲆性腺的间质细胞，具体操作为：将孵育后的性腺组织用Hanks液清洗三次，再次用消毒的手术剪剪成碎块大小为1mm3左右，去除血管、间质等杂质后用Hanks液洗2-3次，加入0.25％的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，即得分离的间质细胞。
所述步骤(3)中离心去上清液为4000r/min，离心15min。
所述步骤(4)中细胞培养液为HHBS细胞培养液。
所述步骤(5)中细胞筛网目为500目。
所述步骤(6)中上清液中添加的DMSO、谷胱甘肽、半胱氨酸体积比分别为15％、10％、5％。
需要注意的是，本发明所有步骤中所用到的器械均必须经过高温高压灭菌消毒(121℃，20-30min)。
本发明的技术方案能有效地提高大菱鲆精子活力，本发明通过改变鱼类精子的微环境达到了提高精子活力的效果，实验结果表明，采用本发明的技术方案可以显著有效的提高鱼类精子活力。由于本发明提高了鱼类精子活力，因此降低了产业化应用的生产成本，提高了鱼类和精子的利用价值。通过计算机镜子辅助分析系统观察到的实验组鱼类精子运动状态见图1，计算机镜子辅助分析系统观察到的对照组鱼类精子运动状态见图2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。
下面结合具体的实施例对本发明鱼类精子体外激动剂效果做进一步的说明。
实施例3效果实验
在山东省烟台市东方海洋三文鱼养殖基地选取性腺发育V期的雄性大西洋鲑，用MS-222进行麻醉，剪开雄鱼腹部，取出鱼类性腺组织，使用本发明实施例1所得的激动剂。随机挑选的2条繁殖期雄性大西洋鲑亲鱼(鲑鱼1号和对照组鱼类)，采用人共挤压法分别取上述2条大西洋鲑亲鱼精液，放入干净的消毒离心管中冷藏保存。实验开始后，取出冷藏保存的鱼类精液，显微镜检其精子活力并记录其运动率。鱼类1号的精液分别按照1:10(激动剂：精液)的比例加入激动剂，充分摇匀，对照组鱼类加入相同体积的灭菌海水，充分摇匀。显微镜观察并采用计算机镜子辅助分析系统计算各组鱼类精子运动率精子运动率及精子分级计算标准：运动率：显微镜视野中运动精子占所有精子的比率。
实验结果表明：对照组有活力精子：56.2％，实验组：77.5％，本发明的激动剂对鱼类精子活力明显优于对照组鱼类精子活力，说明本发明体外激动剂具有明显提高精子活力效果。
实施例4效果实验
在山东省威海市芳华海珍养殖公司，使用本发明实施例2所得的激动剂。随机挑选的2条性成熟大菱鲆(鱼类1号和对照组鱼类)，采用人工挤压法取大菱鲆精液，显微镜检其活力后放入干净的消毒离心管中冷藏保存。实验开始后，鱼类1号按照1:10(激动剂：精液)的比例加入发明实施例1～2所得激动剂，充分摇匀。对照组大菱鲆精液加入相同体积的生理盐水，充分摇匀。采用显微镜观察并采用计算机镜子辅助分析系统计算各组鱼类精子运动率，结果如表1所示
精子运动率及精子分级计算标准：
运动率：显微镜视野中运动精子占所有精子的比率。
Figure BDA0002593591180000091
从表1的数据可知：对照组精子活力：40.20±0.36％，添加后精子活力：47.870.56％，P＜0.01，差异极显著。上述结果表明本发明的激动剂对鱼类精子活力明显优于其他处理各组及对照组鱼类精子活力，说明本发明体外激动剂具有明显提高精子活力效果。

Claims (7)

1.一种提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取性腺处于发育V期的鱼类性腺，放入加有2％青霉素的28℃Hanks液中浸润45min；
(2)分离鱼类性腺的间质细胞，并用含有2％链霉素的Hanks液清洗两遍；
(3)加入HHBS细胞培养液，28℃培养三天，并适度依据细胞的生长状态，按照生长的细胞1：2或1：3进行传代，将传代后的细胞液转移至离心管中，离心去上清液；
(4)在离心管中加入3mL透明质酸酶，在28℃下，每隔2分钟剧烈震荡一次，连续震荡4～5次后，加入5mL细胞培养液，取培养好的细胞液2000r/min离心取上清。；
(5)将上清液用细胞筛过滤；
(6)将过滤后的细胞上清液，分别添加DMSO，谷胱甘肽、半胱氨酸，吹打混匀，放到-20℃冷冻保存，即得。
2.根据权利要求1所述的提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的取性腺发育V期的鱼类性腺的间质细胞，具体操作为：选取相同品种雄性鱼类的发育V期的鱼类，用MS-222进行麻醉，剪开雄鱼腹部，取出鱼类性腺并用手术剪剪碎碎至4mm3的组织块，把剪碎后的性腺组织加入含有1％双抗的Hanks液中，在28℃、15％CO2培养箱内孵育60min。
3.根据权利要求1所述的提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的分离鱼类性腺的间质细胞，具体操作为：将孵育后的性腺组织用Hanks液清洗三次，再次用消毒的手术剪剪成碎块大小为1mm3左右，去除血管、间质等杂质后用Hanks液洗2-3次，加入0.25％的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，即得分离的间质细胞。
4.根据权利要求1所述的提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中离心去上清液为4000r/min，离心15min。
5.根据权利要求1所述的提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中细胞培养液为HHBS细胞培养液。
6.根据权利要求1所述的提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中细胞筛网目为500目。
7.根据权利要求1所述的提高鱼类精子活力激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中上清液中添加的DMSO、谷胱甘肽、半胱氨酸体积比分别为15％、10％、5％。
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