CN110241074A - 一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法 - Google Patents

一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)取成年山羊睾丸清洗(2)将睾丸白膜剪开(3)用镊子夹出组织洗涤(4)消化后加入DMEM基础培养液(5)过滤，离心，加入缓冲液，离心(6)加DMEM基础培养液，取细胞悬液离心收集细胞(7)加入PBS，离心后加入DMEM基础培养液培养(8)细胞传代，培养8小时后保存，得基础液I(9)取DMEM基础培养液中添加公山羊血清(EGS)、钙离子载体(IA)、咖啡因、已酮可可碱(PF)、17α‑20β‑双羟孕酮(DHP)、肝素，充分混匀得基础液II(10)将基础液I∶II按照5∶1的比例混合均匀，即得一种新型山羊精子体外激动剂。本发明的优点是应用效果好、成本低、容易加工生产。

Description

一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法
技术领域
本发明属于人工授精技术领域，具体是指一种能够显著提高山羊精子活力的体外激动剂的制备方法。本发明涉及提高山羊精子活力的方法，可以与诸如体外人工授精、子宫内人工授精和体外成熟的辅助生育技术联合使用。在其它方面，本发明涉及用于诱导山羊精子成熟的方法以及对山羊精子微环境提供改善的方法。
背景技术
体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。1982年，美国的Brackett等培育出世界上第一胎体外受精牛，从此以后，种家畜的体外受精都在不断研究，也相继取得了一定的成功。经过30多年的发展，山羊体外受精的研究也在目趋成熟。目前，为了提高生产效率，山羊人工授精技术的应用已经大面积推广实施。山羊人工授精技术操作简单，易学易懂，无需大量设备和投资。山羊人工授精技术能防止母羊生殖器官疾病和接触性传染病的传播，有效选种选配，充分发挥优良品种作用，准确记录配种时间，推算出受体母羊预产期，有利于育种档案资料的收集和管理。山羊人工授精技术采精方便，有利于将精液稀释、保存、运输和输精。可按养殖户需求，随到随配种，对周边乡镇养殖户也提供相关服务，方便了养羊户，加快了肉羊品种改良步伐，有利于开展羊群同期发情技术处理。
目前国内山羊的体外受精技术仍然不成熟，体外培养到囊胚的发育率还很低，主要是采用体外成熟卵母细胞、体外受精、体外培养到2～8细胞、移植回受体羊内而得到的试管羊。山羊作为转基因动物中的一个重要的实验对象，特别是在作为生物反应器方面有着非常重要的意义。对山羊的体外受精研究，有利于深入的了解山羊生殖机理，从而更好的应用在山羊的生产和育种中，充分利用优良山羊品种资源，加快地方品种和不良品种的改良等。山羊体外受精技术还是山羊进行胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。
已有的研究报道，精子活力的高低直接影响着产仔数的多少，限制了山羊人工授精的效率。成功的体外成熟-体外受精体系不仅包括卵母细胞的成熟还包括精子的获能。所用的精液质量、精子活力、受精的温度和精子的浓度在体外受精过程中起着重要的作用。
本技术主要是通过改善山羊精子的微环境，提高精子活力，从而提高山羊人工授精技术。如能有效的提高山羊精子活力，势必会提高山羊的繁殖率，进而提高经济效益。因此，制备能够显著提高山羊精子活力的激动剂，具有重要意义。
发明内容
鉴于山羊体外受精的研究现状，我们认为进行山羊的体外受精的方法学探讨显得非常有必要，只有解决了体外受精的技术问题，提高了体外生产胚胎的效率和质量，才能从根本上推动胚胎工程的发展。因此本发明着手于探讨体外受精各个环节中报道得比较多的影响因素诸如：精子的处理对于山羊体外受精的影响，从而为改善山羊体外受精技术提供一定的生产实践依据，力求建立一套比较完善的山羊体外受精的操作体系，并为即将进行的转基因动物的研究提供良好的技术平台。本发明制备的新型山羊精子体外激动剂，体外使用、应用效果好、成本低、容易加工生产，具有较好的市场前景。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取8～10个月龄内的成年山羊睾丸，放入加有1％青链霉素混合液的37℃生理盐水的保温桶中，带回实验室细胞间超净台上，将睾丸组织用含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液清洗三遍后放入培养皿；
(2)使用手术剪将睾丸白膜剪开然后用镊子将睾丸内部组织与白膜进行剥离，去除白膜，保留睾丸内部组织，用生理盐水冲洗；
(3)用手术刀将睾丸纵向切开，露出睾丸髓质，在睾丸小隔内用镊子夹出3～4个直径4～6mm大小的组织放入直径6cm培养皿，用1％青链霉素混合液PBS缓冲液在体式镜下进行洗涤，洗涤时用镊子将组织平铺开来，勿将曲细精管扯断，洗涤三次；
(4)将洗涤后的组织放入干净培养皿中，使用2.5mg/mL胶原酶IV37℃培养箱进行消化5min，然后在体式镜下用镊子慢慢分离，使组织平铺展开呈絮网状，放入培养箱再消化5min，将间质细胞分离下来，在培养皿中加入等量含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM基础培养液终止消化；
(5)经200目滤膜过滤，收集滤液至15mL离心管，以1000rpm/min离心3～5min，弃上清液。向沉淀中加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，将沉淀吹起混匀，洗涤沉淀，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液；
(6)向离心管内加2～3mLDMEM基础培养液，吹打均匀，取1～2mL粗细胞悬液缓慢加至准备好的Percoll分层液的液面上，800g低速离心30min后，收集处于Percoll分层液的1/2-3/5之间的细胞于另一离心管；
(7)向离心管内加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液，重复用培养液洗涤一次沉淀，最后获得较纯的间质细胞，加入DMEM基础培养液，吹打混匀成细胞悬液，移至6cm培养皿，在37℃、饱和湿度、5％CO2浓度条件的培养箱中培养2h；
(8)去除细胞培养皿中的细胞培养液，加入新的细胞培养液，进行培养，对细胞进行传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种1×106个细胞，培养8小时后放到-20℃保存，得基础液I；
(9)取DMEM基础培养液中添加10～25％山羊公羊血清(EGS)、0.3～0.6μmol/L钙离子载体(IA)、3～5mmol/L咖啡因、1～3g/L己酮可可碱(PF)、5～15μg/L 17α-20β-双羟孕酮(DHP)、30～70mg/L肝素，充分混匀得基础液II；
(10)将-20℃保存的基础液I 25℃水浴解冻，将基础液II水浴加热到37℃，按照5∶1的比例混合均匀，即得一种新型山羊精子体外激动剂。
本发明的青链霉素混合液，又称双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。青霉素-链霉素溶液中，青霉素的含量为10000U/mL，链霉素的含量为10mg/mL。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。
PBS缓冲液表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养。主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等。
胶原酶IV，在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织，包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等，是一种蛋白酶，一种肽链内切酶，能够特异性的识别Pro-X-Gly-Pro序列(该序列高频率出现在胶原中，很少发现于其他蛋白中)并切割该序列中性氨基酸(X)和甘氨酸(Gly)之间的肽键。许多蛋白酶都能水解单链且变性的胶原多肽，但胶原酶是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内。。
胎牛血清(FBS)，是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。胎牛血清取自剖腹产的胎牛，提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物，其主要作用为提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。起酸碱度缓冲液作用。提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。
DMEM基础培养液是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。
发情公山羊血清(EGS)，采自健康发情期公山羊，可以用于细胞培养、免疫荧光和免疫组化时的封闭等。
钙离子载体(IA)，是一种移动性离子载体，它的功能是运输钙离子、镁离子等二价阳离子。在运输氧离子进入细胞的同时，将两个氢离子带至细胞外。如果把A23187加入到含有钙离子的或细胞培养液中，则钙离子很快进入到细胞质内。因此，在细胞生物学研究中，广泛用于增加细胞质的游离钙离子浓度。
咖啡因，是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，能够暂时的驱走睡意并恢复精力，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。
己酮可可碱，化学名为3，7-二氢-3，7-二甲基-1-(5-氧代己基)-1H-嘌呤-2，6-二酮，白色针状结晶。熔点105℃。易溶于水、苯、乙醇、氯仿，微溶于乙醇。无臭，味苦，为脑循环及末梢血管障碍改善剂。临床用于治疗脑血管障碍、卒中或外伤引起的后遗症，改善其症状如注意力和记忆力减退，精神状态差等。具有扩张脑及外周血管的作用，同时能降低血液黏稠度，改善脑和四肢血液循环。另外，尚有抗纤维化的作用。不仅能改善皮肤微循环、改善皮肤血流量，还能改善缺氧组织的氧化能力，对萎缩性皮肤病有一定疗效。
17α-20β-双羟孕酮(DHP)，在17α-20β位连接有两个羟基的孕酮，具有促进精母细胞减数分裂及与膜受体基因结合提高精子的活力等功能，还通过调节精巢内的酸碱度、离子浓度、精浆流动性等对精子的成熟起作用。
肝素，首先从肝脏发现而得名，由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15KD，呈强酸性。它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或羊小肠黏膜提取。作为一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。
本发明的有益效果为：本发明激动剂体外使用、成本低廉、方便使用、效果显著、毒害作用小，可以有效改善种山羊精子微环境，改善人工授精的效果。同时，本发明制备的山羊精子激动剂容易加工生产，便于使用，具有长效作用，方便简单，制备过程简单，易于推广使用。
附图说明
图1为计算机精子辅助分析系统观察到的添加有激动剂的实验组精子运动轨迹图；
图2为计算机精子辅助分析系统观察到的添加有相同体积生理盐水的对照组精子运动轨迹图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取8～10个月龄内的成年山羊睾丸，放入加有1％青链霉素混合液的37℃生理盐水的保温桶中，带回实验室细胞间超净台上，将睾丸组织用含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液清洗三遍后放入培养皿；
(2)使用手术剪将睾丸白膜剪开然后用镊子将睾丸内部组织与白膜进行剥离，去除白膜，保留睾丸内部组织，用生理盐水冲洗；
(3)用手术刀将睾丸纵向切开，露出睾丸髓质，在睾丸小隔内用镊子夹出3～4个直径4～6mm大小的组织放入直径6cm培养皿，用1％青链霉素混合液PBS缓冲液在体式镜下进行洗涤，洗涤时用镊子将组织平铺开来，勿将曲细精管扯断，洗涤三次；
(4)将洗涤后的组织放入干净培养皿中，使用2.5mg/mL胶原酶1V37℃培养箱进行消化5min，然后在体式镜下用镊子慢慢分离，使组织平铺展开呈絮网状，放入培养箱再消化5min，将间质细胞分离下来，在培养皿中加入等量含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM基础培养液终止消化；
(5)经200目滤膜过滤，收集滤液至15mL离心管，以1000rpm/min离心3～5min，弃上清液。向沉淀中加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，将沉淀吹起混匀，洗涤沉淀，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液；
(6)向离心管内加2～3mLDMEM基础培养液，吹打均匀，取1～2mL粗细胞悬液缓慢加至准备好的Percoll分层液的液面上，800g低速离心30min后，收集处于Percoll分层液的1/2-3/5之间的细胞于另一离心管；
(7)向离心管内加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液，重复用培养液洗涤一次沉淀，最后获得较纯的间质细胞，加入DMEM基础培养液，吹打混匀成细胞悬液，移至6cm培养皿，在37℃、饱和湿度、5％CO2浓度条件的培养箱中培养2h；
(8)去除细胞培养皿中的细胞培养液，加入新的细胞培养液，进行培养，对细胞进行传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种1×106个细胞，培养8小时后放到-20℃保存，得基础液I；
(9)取DMEM基础培养液中添加10～25％山羊公羊血清(EGS)、0.3～0.6μmol/L钙离子载体(IA)、3-5mmol/L咖啡因、1～3g/L已酮可可碱(PF)、5～15μg/L 17α-20β-双羟孕酮(DHP)、5～15mg/L肝素，充分混匀得基础液II
(10)将-20℃保存的基础液I 25℃水浴解冻，将基础液II水浴加热到37℃，按照5∶1的比例混合均匀，即得一种新型山羊精子体外激动剂。
实施例2
一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取8～10个月龄内的成年山羊睾丸，放入加有1％青链霉素混合液的37℃生理盐水的保温桶中，带回实验室细胞间超净台上，将睾丸组织用含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液清洗三遍后放入培养皿。
(2)使用手术剪将睾丸白膜剪开然后用镊子将睾丸内部组织与白膜进行剥离，去除白膜，保留睾丸内部组织，用生理盐水冲洗。
(3)用手术刀将睾丸纵向切开，露出睾丸髓质，在睾丸小隔内用镊子夹出3～4个直径4～6mm大小的组织放入直径6cm培养皿，用1％青链霉素混合液PBS缓冲液在体式镜下进行洗涤，洗涤时用镊子将组织平铺开来，勿将曲细精管扯断，洗涤三次；
(4)将洗涤后的组织放入干净培养皿中，使用2.5mg/mL胶原酶IV37℃培养箱进行消化5min，然后在体式镜下用镊子慢慢分离，使组织平铺展开呈絮网状，放入培养箱再消化5min，将间质细胞分离下来，在培养皿中加入等量含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM基础培养液终止消化；
(5)经200目滤膜过滤，收集滤液至15mL离心管，以1000rpm/min离心3～5min，弃上清液。向沉淀中加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，将沉淀吹起混匀，洗涤沉淀，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液；
(6)向离心管内加2～3mLDMEM基础培养液，吹打均匀，取1～2mL粗细胞悬液缓慢加至准备好的Percoll分层液的液面上，800g低速离心30min后，收集处于Percoll分层液的1/2～3/5之间的细胞于另一离心管；
(7)向离心管内加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液，重复用培养液洗涤一次沉淀，最后获得较纯的间质细胞，加入DMEM基础培养液，吹打混匀成细胞悬液，移至6cm培养皿，在37℃、饱和湿度、5％CO2浓度条件的培养箱中培养2h。；
(8)去除细胞培养皿中的细胞培养液，加入新的细胞培养液，进行培养，对细胞进行传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种1×106个细胞，培养8小时后放到-20℃保存，得基础液I；
(9)取DMEM基础培养液中添加10～25％山羊公羊血清(EGS)、0.3～0.6μmol/L钙离子载体(IA)、3-5mmol/L咖啡因、1～3g/L已酮可可碱(PF)、5～15μg/L 17α-20β-双羟孕酮(DHP)、5～15mg/L肝素，充分混匀得基础液II
(10)将-20℃保存的基础液I 25℃水浴解冻，将基础液II水浴加热到37℃，按照5∶1的比例混合均匀，即得一种新型山羊精子体外激动剂。
本发明的技术方案能有效地提高山羊精子体外激动剂活力，本发明通过8～10个月龄内的成年山羊睾丸组织制备的准备液I与准备液II按比例混合制得，可以有效改变山羊精子的微环境达到了提高精子活力的效果，实验结果表明，采用本发明的技术方案可以有效提高种公羊精子活力23％以上，由于本发明提高了山羊精子活力，因此降低了产业化应用的生产成本，提高了山羊和精子的利用价值。通过计算机镜子辅助分析系统观察到的对照组种公羊精子运动状态见图2，计算机镜子辅助分析系统观察到的实验组种公羊精子运动状态见图1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。
下面结合具体的实施例对本发明一种新型山羊羊精子体外激动剂的效果做进一步的说明。
实施例3治疗效果实验
在山东省青岛市平度市某羊场选取出生后8～10月龄的公山羊，从中随机挑选身体健康的取睾丸组织，使用本发明实施例1～2所得的激动剂。随机挑选的4头发情期种公羊(种公羊1号、种公羊2号、种公羊3号和对照组种公羊)，采用假阴道法分别取上述4头种公羊精液，放入干净的消毒离心管中冷藏保存。实验开始后，取出冷藏保存的种公羊精液，显微镜检其精子活力并记录其运动率。种公羊1～3号的精液分别按照1∶10(激动剂∶精液)的比例加入激动剂，充分摇匀，对照组种公羊加入相同体积的生理盐水，充分摇匀。显微镜观察并采用计算机镜子辅助分析系统计算各组种公羊精子运动率，结果如表1所示
精子运动率及精子分级计算标准：
运动率：显微镜视野中运动精子占所有精子的比率。
A级精子：快速向前运动的精子。
B级精子：慢速向前运动的精子。
C级精子：不动或仅颤动精子。
表1治疗效果统计
分组 种公羊1 种公羊2 种公羊3 对照组种公羊
运动率(％) 93 95 97 74
A级精子比例 85 88 91 57
B级精子比例 8 7 6 17
C级精子比例 5 3 2 26
从表1的数据可知：本发明的激动剂对种公羊精子活力明显优于对照组种公羊精子活力，说明本发明体外激动剂具有明显提高精子活力效果。
实施例4效果实验
在山东省青岛市即墨区某羊场选取出生后8～10月龄的公山羊，从中随机挑选身体健康的公山羊去势，取睾丸组织，使用本发明实施例1～2所得的激动剂。随机挑选的5头发情期种公羊(种公羊1号、种公羊2号、种公羊3号、种公羊4号和对照组种公羊)，采用电刺激法分别取上述5头种公羊精液，显微镜检其活力后放入干净的消毒离心管中冷藏保存。1～3号种公羊按照1∶10(激动剂∶精液)的比例加入发明实施例1～2所得激动剂，充分摇匀。4号种公羊精液加入相同体积的生理盐水，充分摇匀，5号种公羊精液不做处理。采用显微镜观察并采用计算机镜子辅助分析系统计算各组种公羊精子运动率，结果如表2所示
运动率：显微镜视野中运动精子占所有精子的比率。
表1治疗效果统计
分组 种公羊1 种公羊2 种公羊3 种公羊4 对照组种公羊5
运动率开始时(％) 63 69 72 70 71
运动率添加激动剂后(％) 94 92 95 71 69
精子运动率变化情况(％) +31 +23 +23 +1 -2
从表2的数据可知：1号种公羊精子运动率提高了31％；2号种公羊精子运动率提高了23％；3号种公羊精子运动率提高了23％；4号种公羊精子运动率提高了1％；对照组种公羊5号，精子运动率下降了2％。上述结果表明本发明的激动剂对种公羊精子活力明显优于添加生理盐水对照组及对照组种公羊精子活力，说明本发明体外激动剂具有明显提高精子活力效果。

Claims (6)

1.一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取成年山羊睾丸，放入加有1％青链霉素混合液的37℃生理盐水的保温桶中，带回实验室细胞间超净台上，将睾丸组织用含1％青链霉素混合液的PBS缓冲液清洗三遍后放入培养皿；
(2)使用手术剪将睾丸白膜剪开然后用镊子将睾丸内部组织与白膜进行剥离，去除白膜，保留睾丸内部组织，用生理盐水冲洗；
(3)用手术刀将睾丸纵向切开，露出睾丸髓质，在睾丸小隔内用镊子夹出3～4个直径4～6mm大小的组织放入直径6cm培养皿，用含1％青链霉素混合液的PBS缓冲液在体式镜下进行洗涤，洗涤时用镊子将组织平铺开来，勿将曲细精管扯断，洗涤三次；
(4)将洗涤后的组织放入干净培养皿中，使用2.5mg/mL胶原酶IV37℃培养箱进行消化5min，然后在体式镜下用镊子慢慢分离，使组织平铺展开呈絮网状，放入培养箱再消化5min，将间质细胞分离下来，在培养皿中加入等量含有胎牛血清(FBS)的DMEM基础培养液终止消化；
(5)经200目滤膜过滤，收集滤液至15mL离心管，以1000rpm/min离心3～5min，弃上清液。向沉淀中加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，将沉淀吹起混匀，洗涤沉淀，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液；
(6)向离心管内加2～3mLDMEM基础培养液，吹打均匀，取1～2mL粗细胞悬液缓慢加至准备好的细胞分层液的液面上，800g低速离心30min后，收集部分细胞于另一离心管；
(7)向离心管内加入含有1％青链霉素混合液的PBS缓冲液，1000rpm/min离心3～5min，弃上清液，重复用培养液洗涤一次沉淀，最后获得较纯的间质细胞，加入DMEM基础培养液，吹打混匀成细胞悬液，移至6cm培养皿，在37℃、饱和湿度、5％CO2浓度条件的培养箱中培养2h；
(8)去除细胞培养皿中的细胞培养液，加入新的细胞培养液，进行培养，对细胞进行传代，传代后，每个直径为6cm的细胞培养皿接种1×106个细胞，培养8小时后放到-20℃保存，得基础液I；
(9)取DMEM基础培养液中添加发情公山羊血清(EGS)、钙离子载体(IA)、咖啡因、乙酮可可碱(PF)、17α-20β-双羟基孕酮(DHP)、肝素，充分混匀得基础液II
(10)将-20℃保存的基础液I 25℃水浴解冻，将基础液II水浴加热到37℃，按照5∶1的比例混合均匀，即得一种新型山羊精子体外激动剂。
2.根据权利要求1所述的一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征在于：所述成年公羊指出生后8～10个月龄的成年山羊。
3.根据权利要求1所述的一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(3)、(5)、(7)中的含1％青链霉素混合液的PBS缓冲液为含有1％青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液的PBS磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述的胎牛血清(FBS)浓度为10％。
5.根据权利要求1所述的一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，细胞分层液为Percoll分层液，收集的部分细胞为处于Percoll分层液的1/2-3/5之间的细胞。
6.根据权利要求1所述的一种新型山羊精子体外激动剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(9)中，所述的发情山羊公羊血清(EGS)、钙离子载体(IA)、咖啡因、己酮可可碱(PF)、17α-20β-21-三羟基孕酮(20-β)、肝素的浓度分别为10～25％、0.3～0.6μmol/L、3-5mmol/L、1～3g/L、5～15μg/L、30～70mg/L。
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