CN103710300A - 一种用于培养猪孤雌激活胚及体外受精胚胎的体外培养液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪体外胚胎培养液。本发明所提供的猪体外胚胎培养液，是在NCSU-23胚胎培养液中加入终浓度为0.1～1.0μg/mL的小檗碱后得到的培养液。本发明所提供的猪体外胚胎培养液中加入了中药单体成分——小檗碱，实验证明，利用该培养液对猪孤雌激活胚和体外受精胚胎进行体外培养，可有效提高胚胎发育效率及囊胚内细胞团及其总细胞数量。本发明为其他生物技术、医学研究以及畜牧业发展奠定基础，同时为阐明猪早期胚胎发育机制提供一定的理论基础。

Description

一种用于培养猪孤雌激活胚及体外受精胚胎的体外培养液

技术领域

本发明涉及一种猪体外胚胎培养液，特别涉及一种用于培养猪孤雌激活胚及体外受精胚胎的体外培养液。

背景技术

动物胚胎的体外培养是胚胎生物技术中的重要环节。在体外培养条件下，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程，而停顿在某个特定发育时期，这一现象被称为胚胎体外发育阻断（in vitro block of embryonic development），因而严重影响早期胚胎体外发育质量，如猪体外囊胚发育率一般仅为20%左右，内细胞团数量在3个左右，导致后代的出生率下降，极大地阻碍了猪在农业、生物工程和医学中的研究应用。

动物胚胎的体外培养与三方面的因素有关，即胚胎种类、培养条件和培养液的成分，其中培养液成分的改进是体外培养的技术的基础和关键环节所在，直接影响到体外培养效果和体外生产胚胎的质量。

能量代谢是胚胎在体外发育过程中的基本生命活动，能量物质是胚胎培养液中的重要成分。丙酮酸、乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺等作为能源物质，其作用机理，不同动物有差异。尤其是葡萄糖对早期胚胎培养的作用已证实对小鼠、仓鼠的受精卵有显著的抑制作用，是胚胎克服发育阻断的障碍。猪也有类似的现象，2-细胞和4-细胞的猪体外发育胚胎对葡萄糖的需求低于桑椹胚和囊胚期的胚胎。

氨基酸和维生素是胚胎发育所必需的。氨基酸是蛋白质合成的前提，同时也参与能量代谢，故大多数培养液中含有氨基酸。维生素作为碳水化合物和氨基酸代谢过程中必不可少的成分，能促进细胞对葡萄糖的摄取和乳糖的合成，从而影响胚胎的代谢和发育。在输卵管和子宫液中有20～25种哺乳动物所需要的必需和非必需氨基酸，其中牛磺酸、天门冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸的含量很高。谷氨酰胺可作为小鼠、仓鼠、猪胚胎发育的重要能源物质，对致密化后期的胚胎发育有利，促进胚胎向囊胚发育和胚泡的形成，并增加滋养层细胞的数量和囊胚的孵化能力。

无机盐离子是培养液中不可缺少的组成部分，它不仅是培养液渗透压的主要维持者，而且其本身也直接或间接的参与胚胎代谢过程。哺乳动物输卵管液以高浓度的K⁺为特征。由于胚胎能在较宽的离子浓度范围正常培养，因此寻找培养基的最佳离子组成比较繁杂。在众多无机盐离子中，Mg²⁺是许多酶，特别是糖酵解和三羧酸循环中许多酶的辅酶，在能量代谢中可能起到重要作用；Ca²⁺对维持细胞膜的稳定性、通透性以及细胞之间的连接有重要的作用，对桑椹胚的紧缩及囊胚的形成和扩展起至关重要的作用。

血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分，它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。血清的已知成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、生长因子等。胚胎培养时，一般加入牛血清、羊血清、兔血清等，及牛血清白蛋白（BSA）。血清加入有利于胚胎发育，但因厂家、批次不同，培养效果相差甚远。血清来源不同效果不同，牛血清有胎牛血清（FCS）（来源少，价格高）、新生犊牛血清（NCS）（刚产下未哺乳的小牛）、小牛血清（CS）（哺乳后的小牛，含有更复杂的成分）、发情牛血清（OCS）、阉公牛血清（SS）。因此，选择血清也是培养的关键。

在胚胎发育过程中研究较多的生长因子主要为胰岛素样生长因子（IGF-I、IGF-II）和表皮生长因子（EGF）。IGF-I、IGF-II及其受体基因在早期胚胎中均有表达，IGF-I在输卵管及子宫分泌物中存在，IGF-I可以通过改变凋亡相关基因减轻猪孤雌胚体外发育中早期胚胎凋亡的发生。NCSU-23培养液中有或无BSA时添加10或100ng/ml IGF-I并没有明显改善孤雌胚的发育率；然而，在有BSA存在时，IGF-1却增加了囊胚细胞数。EGF是血清和卵泡液中都存在的生长因子，无血清培养液中加入EGF能促进牛胚胎的发育，增加蛋白质的合成和囊胚的孵化率，但不增加囊胚中的细胞数量，有的研究则认为EGF的作用仅表现在促进孵化，也有研究发现EGF也能增加囊胚细胞数量。猪克隆胚胎和体外受精胚在成熟的卵母细胞、桑椹胚和囊胚均有EGF mRNA的表达。而且，EGF的表达量在2-细胞后有减少的趋势，因此可以推测2-细胞后添加EGF有可能促进胚胎发育；同时发现EGFR仅在2-细胞、桑椹胚和囊胚阶段表达，而在4-8细胞内未见表达。可推测，在胚胎不同发育阶段，EGF通过与其受体的相互作用而对胚胎发育产生直接或间接的影响

除上述的常规添加成分外，一些学者也曾尝试过在猪培养液中添加一些其他成分，以提高胚胎卵裂率和囊胚率等。如培养基中加入适当浓度的EDTA-Na₂、20g/L马尾藻类多糖、亚硒酸钠等。

综上所述，随着研究者们对胚胎早期发育的环境需求及自身代谢特性认识的不断深入，体外胚胎的的发育率和质量有了相应的提高，但仍无法从根本上解决培养系统存在的缺陷，囊胚发育率及其细胞数量较少等问题未能得到很好的改善。

近年来，中草药以其低毒副作用、无抗药性、相对安全、不良反应少等特点被广泛的应用于医药、饲料、化妆、食物等领域，其新的作用和机理也不断的被发现。多方面的研究，显示出其具有从整体上、多靶点、全方位改善机体生理状况的药理特点。而早期胚胎的发育和细胞的增殖与其适宜的微环境密切相关，因此，根据胚胎不同发育阶段的营养需要和代谢特点，建立适宜早期胚胎体外生长发育的培养体系，以寻找新的途径和方法改善早期胚胎体外培养的微环境，从而提高体外胚胎发育质量显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪体外胚胎培养液。

本发明所提供的猪体外胚胎培养液，具体为在NCSU-23胚胎培养液中加入终浓度为0.1～1.0μg/mL（如0.1～0.2μg/mL或0.2～1.0μg/mL，具体如0.1μg/mL、0.2μg/mL或1.0μg/mL）的小檗碱（Berberine，BR）后得到的培养液，pH7.2。

在本发明中，所述NCSU-23胚胎培养液，具体为将NCSU-23基础培养液、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸、L-半胱氨酸、青霉素、硫酸链霉素，以及牛血清白蛋白按照1L：1.1g：0.146g：0.876g：0.546g：0.069g：100000IU：70000IU：4g的配比混合而成，pH7.2。

在本发明中，所述NCSU-23基础培养液的溶剂为水，溶质及其浓度具体如下：NaCl6.354g/L、KCl0.356g/L、K₂HPO₄0.162g/L、CaCl₂·2H₂O0.250g/L、MgSO₄·7H₂O0.293g/L、NaHCO₃2.106g/L、青霉素108333IU/L、硫酸链霉素50000IU/L，pH7.2。

本发明是再一个目的是提供一种培养猪体外胚胎的方法。

本发明所提供的培养猪体外胚胎的方法，是将猪体外胚胎置于如上所述的猪体外胚胎培养液中进行培养。

在本发明中，所述猪体外胚胎具体可为猪孤雌激活胚，也可为猪体外受精胚胎。

无论是对于以上所述的猪体外胚胎培养液，还是对于以上所述的培养猪体外胚胎的方法：当所述猪体外胚胎为猪孤雌激活胚时，所述猪体外胚胎培养液中所述小檗碱的终浓度以0.2μg/mL效果较好；当所述猪体外胚胎为猪体外受精胚胎时，所述猪体外胚胎培养液中所述小檗碱的终浓度以0.1μg/mL效果较好。

在培养所述猪体外胚胎的方法中，将所述猪体外胚胎置于所述猪体外胚胎培养液中培养具体为：每个50μL所述猪体外胚胎培养液的液滴中培养15～20枚所述猪体外胚胎，同时覆盖矿物油。

进一步，其培养的条件为：39℃，5%CO₂，95%空气，100%饱和湿度。在培养所述猪体外胚胎时可在符合上述条件的CO₂培养箱中进行。

将所述猪体外胚胎置于所述猪体外胚胎培养液中培养的过程中，需间隔48h换液一次。

本发明所提供的猪体外胚胎培养液中加入了中药单体成分——小檗碱（BR），实验证明，利用该培养液对猪孤雌激活胚和体外受精胚胎进行体外培养，可有效提高胚胎发育效率及囊胚内细胞团及其总细胞数量。本发明为其他生物技术、医学研究以及畜牧业发展奠定基础，同时为阐明猪早期胚胎发育机制提供一定的理论基础。

附图说明

图1为对照组和BR2组的猪孤雌激活胚在胚胎培养至168h（第7天）的囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡情况鉴定结果。其中，A、A’和A”为对照组；B、B’和B”为BR2组；A和B为各组别囊胚（自然光）；A’和B’表示相应各组别总细胞数（蓝色）；A”和B”表示各组别胚胎细胞凋亡征象（红色）。

图2为对照组和BR1组的猪体外受精胚胎在胚胎培养至168h（第7天）的囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡情况鉴定结果。其中，A、A’和A”为对照组；B、B’和B”为BR1组；A和B为各组别囊胚（自然光）；A’和B’表示相应各组别总细胞数（蓝色）；A”和B”表示各组别胚胎细胞凋亡征象（红色）（×400）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小檗碱：中国药品生物制品检定所，编号110713-200208。

NCSU-23基础培养液：准确称取NaCl（Sigma，S5886）0.6354g、KCl（Sigma，P5405）0.0356g、KH₂PO₄（Sigma，P5655）0.0162g、CaCl₂·2H₂O（Sigma，C7902）0.0250g、MgSO₄·7H₂O（Sigma，M2773）0.0293g、NaHCO₃（Sigma，S5761）0.2106g、青霉素（Sigma，P3032）10833IU、硫酸链霉素（Sigma，S1277）5000IU，用超纯水溶解并定容至100mL，待前一种药物完全溶解后再加入后一种药物，充分混匀，pH7.2。

NCSU-23胚胎培养液：在100mL NCSU-23基础培养液中依次加入D-葡萄糖（Sigma，G6152）0.1100g、L-谷氨酰胺（Sigma，G3126）0.0146g、牛磺酸（Sigma，T8691）0.0876g、亚牛磺酸（Sigma，H1384）0.0546g、L-半胱氨酸（Sigma，C7352）0.0069g、青霉素10000IU、硫酸链霉素7000IU、牛血清白蛋白（BSA，Sigma，A3311）0.4g，待前一种药物完全溶解后再加入后一种药物，充分混匀，pH7.2。

实施例1、小檗碱对猪孤雌激活胚体外发育的影响

一、含有小檗碱的猪体外胚胎培养液的配制

取三份NCSU-23胚胎培养液，分别添加小檗碱（BR），使其终浓度分别达0.1μg/mL、0.2μg/mL和1.0μg/mL。

二、猪孤雌激活胚的获得

1.卵母细胞的采集和成熟培养

将屠宰场收集的猪卵巢保存在添加双抗（青霉素和硫酸链霉素）的34～37℃生理盐水中并于1h内运回实验室。卵巢经上述灭菌生理盐水冲洗三次，除尽周围的脂肪和系膜，用12号针头抽取卵巢表面上直径为2～6mm卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），在体视显微镜下选择卵丘细胞2层以上、胞质均匀的COCs，用TL-Hepes-PVA和在CO₂培养箱中平衡2h以上的体外成熟培养液分别洗涤3次后进行体外成熟培养，培养用Φ=35mm培养皿（Nunc）。每滴50μL的培养液中放入15～20个COCs，覆盖矿物油。体外成熟培养40～44h。培养条件为39℃，5%的CO₂，95%空气，100%饱和湿度。

其中，TL-Hepes-PVA和体外成熟培养液的配方如下：

TL-Hepes-PVA洗卵液：NaCl3.3311g、KCl0.1193g、CaCl₂·2H₂O0.1471g、MgCl₂·6H₂O（Sigma，M2393）0.0509g、NaH₂PO₄（Sigma，S5011）0.0204g、NaHCO₃0.0840g、山梨醇1.0930g、Hepes（Sigma，H4034）1.1916g、PVA（Sigma，P8136）0.5g、丙酮酸钠0.0110g以及乳酸钠(Sigma，16H50495)0.4245mL，分别用500mL超纯水溶解并定容，然后将后者缓缓加入前者中，并不断的摇动，充分混匀后，加入青霉素54167IU、硫酸链霉素25000IU、抽滤除菌，分装。使用前37℃恒温箱中保温4h。

体外成熟培养液：mTCM199（GIBCOBRL，1069982）中添加0.57mmol/L L-半胱氨酸、3.05mmol/L D-葡萄糖、0.91mmol/L丙酮酸钠、10ng/mLEGF（Sigma，E9644）、0.1%(w/v)PVA和10%(v/v)卵泡液（PFF）、125000IU/L青霉素、50000IU/L硫酸链霉素。培养前22h添加LH（Sigma，L9773）0.5μg/mL、FSH（Sigma，F2293）0.5μg/mL，培养后22h不添加FSH、LH。以上各浓度为相应组分在体外成熟培养液中的终浓度。

2.去除颗粒细胞

体外成熟培养44h后，将COCs移入含有0.1％（质量百分含量）透明质酸酶的NCSU-23基础培养液溶液中用移液枪反复吹打，待完全脱去卵丘细胞后，挑选明显具有第一极体的卵母细胞NCSU-23基础培养液中，洗涤3次。置于37℃的恒温台上备用。

3.成熟卵母细胞的孤雌激活

将上述成熟卵母细胞移入含20μmol/L Ion（离子霉素）（Sigma，I0634）的NCSU-23基础培养液滴中培养40min后，用NCSU-23基础培养液洗涤3次，移入含2mmol/L6-DMAP（6-二甲基嘌呤）（Sigma，D2629）的NCSU-23基础培养液中培养5.5h，随后用NCSU-23基础培养液清洗3次。获得猪孤雌激活胚。

三、含有不同剂量小檗碱的猪体外胚胎培养液对猪孤雌激活胚体外发育的影响

以未添加小檗碱（BR）的NCSU-23胚胎培养液为对照组，以步骤一制备的含有不同剂量小檗碱（BR）的猪体外胚胎培养液为试验组，分别观察低、中、高（BR1、BR2、BR3）不同剂量的小檗碱对猪孤雌激活胚体外发育的影响。

1.胚胎培养

将步骤二获得的猪孤雌激活胚移入50μL胚胎培养液的液滴中培养（对照组：NCSU-23胚胎培养液；试验组：含有不同剂量小檗碱的猪体外胚胎培养液），每滴15～20枚胚胎，覆盖矿物油。培养条件为：39℃，5%CO₂，95%空气，100%饱和湿度。间隔48h换液一次。

2.卵裂率和囊胚率的计算

在胚胎培养至48h时统计各组的卵裂胚胎数，进而计算卵裂率；在胚胎培养至168h（第7天）时统计各组的囊胚数，进而计算囊胚率。

3.囊胚细胞数量的统计、囊胚细胞凋亡情况鉴定及凋亡指数计算

在胚胎培养至168h（第7天）时统计各组的囊胚细胞总数，以及内细胞团细胞数和滋养层细胞数，并对囊胚细胞凋亡情况进行鉴定，计算凋亡指数。

（1）囊胚细胞数量的统计

将囊胚（第7天）放入含有0.5%(w/v)链霉蛋白酶的TL-Hepes-PVA液除去透明带，在含有0.4%（0.4g/100mL）BSA的TL-Hepes-PVA液中清洗5min，在39℃不含CO₂的培养箱中孵育40min（50μL TL-Hepes-PVA小滴中添加5.5μL兔抗猪全血清(Sigma，P3164)并覆盖石蜡油），然后用含有10%(v/v)胎牛血清的TL-Hepes-PVA液结束抗体反应5min。在无石蜡油的TL-Hepes-PVA液中清洗5min，并重复3次，然后在39℃不含CO₂的培养箱中孵育90min（50μL TL-Hepes-PVA液小滴中添加3.5μL豚鼠血清(Sigma，S16390)并覆盖石蜡油），在豚鼠补体（Sigma，S16390）中孵育的同时用10μL的Hoechst33342（Sigma，B2261）和10μL的PI（Sigma，P4170）染色，之后在含有含有0.4%（0.4g/100mL）BSA的TL-Hepes-PVA液中清洗5min，将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，用凡士林在载玻片四角点四个柱，盖上盖玻片，再轻轻压盖玻片，最后用指甲油封片。在荧光显微镜下观察，并计数囊胚的内细胞团细胞数、滋养层细胞数、总细胞数。

（2）孤雌发育胚细胞凋亡的评价

孤雌激活第7天的囊胚在TL-Hepes-PVA液中清洗三次，随后在4%多聚甲醛（Solarbio，P1040）固定1h（室温），随后在TL-Hepes-PVA液中清洗三次，在添加有0.1%(v/v)TritonX-100的2.3%（2.3g/100mL）柠檬酸钠水溶液中孵育1h（室温）。DNA碎片（DNA fragmentation）检测应用原位细胞凋亡检测试剂盒（In Situ Cell DeathDetection Kit，Roche，Germany）。即采用TUNEL检测评价细胞凋亡的程度，被固定的胚胎在TUNEL反应混合液中孵育1h（暗室，38.5℃）并清洗干净后放入10μg/mL PI中室温避光染色5min，滴加抗淬灭剂DABCO后封片，用锡箔纸覆盖好，准备观察，使用荧光显微镜检测整个胚胎的凋亡的细胞核和总细胞核。

凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数

实验重复三次。

四、结果

1.卵裂率和囊胚率的计算

对照组和试验组的卵裂率和囊胚率计算结果如表1所示。

表1小檗碱对猪孤雌激活胚体外发育效果的影响

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示无显著差异（P>0.05）。

由表1可知，孤雌激活胚体外发育至48h，BR1组、BR2组的卵裂率显著高于对照组和BR3组（P<0.05）。孤雌激活胚体外发育至168h（第7天），BR2组的囊胚率显著高于其他试验组和对照组（P<0.05）。

2.囊胚细胞数量的统计

对照组和试验组的囊胚细胞计数结果见表2。

表2小檗碱对猪孤雌激活胚囊胚细胞数量的影响

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示无显著差异（P>0.05）。

由表2可知，孤雌激活胚体外发育至168h（第7天）囊胚，BR2组内细胞团细胞数、滋养层细胞数及总细胞数均显著高于其他试验组和对照组（P<0.05），ICM/TE各组之间均无显著差异（P>0.05）。

3.囊胚细胞凋亡情况鉴定及凋亡指数计算

对照组和由步骤1、2鉴定得到的效果较优的试验组（BR2组）的囊胚细胞凋亡情况鉴定结果如图1所示。从图中可以看出，BR2组第7天囊胚总细胞数显著高于对照组（P<0.05），而凋亡细胞数显著低于对照组（P<0.05）。

对照组和由步骤1、2鉴定得到的效果较优的试验组（BR2组）的囊胚细胞凋亡指数计算结果如表3所示。

表3小檗碱对猪孤雌激活胚囊胚细胞凋亡的影响

组别	观察囊胚数/枚	凋亡指数
			对照组	13	12.3±1.4a
BR2组	18	6.3±1.1b

由表3可知道，由步骤1、2鉴定得到的效果较优的试验组（BR2组）的囊胚细胞凋亡指数显著低于对照组（P<0.05）。

实施例2、小檗碱对猪体外受精胚胎体外发育的影响

一、含有小檗碱的猪体外胚胎培养液的配制

取三份NCSU-23胚胎培养液，分别添加小檗碱（BR），使其终浓度分别达0.1μg/mL、0.2μg/mL和1.0μg/mL。

二、猪体外受精胚胎的获得

1.卵母细胞的采集和成熟培养

将屠宰场收集的猪卵巢保存在添加双抗（青霉素和硫酸链霉素）的34～37℃生理盐水中并于1h内运回实验室。卵巢经上述生理盐水冲洗三次，除尽周围的脂肪和系膜，用12号针头抽取卵巢表面上直径为2～6mm卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），在体视显微镜下选择卵丘细胞2层以上、胞质均匀的COCs，用TL-Hepes-PVA和在CO₂培养箱中平衡2h以上的体外成熟培养液分别洗涤3次后进行体外成熟培养。培养用Φ=35mm培养皿（Nunc）。每滴50μL的体外成熟培养液中放入15～20个COCs，覆盖矿物油。体外成熟培养40～44h。培养条件为39℃，5%的CO₂，95%空气，100%饱和湿度。

2.体外受精

COCs在体外成熟44h后，用含1mg/mL透明质酸酶的NCSU-23基础培养液脱除包裹在其周围的卵丘细胞，选择卵周隙明显，卵细胞膜完整，且排出第一极体的成熟卵母细胞在平衡4h以上的mTBM受精液中清洗3次，最后将10～15枚成熟卵母细胞置于50μL的mTBM受精液液滴中，备受精。将在mTBM+100μg/mL肝素（Sigma，H3393）液中获能30min的精液，以l×10⁶个/mL的终浓度置于含有卵母细胞的50μL mTBM受精液液滴中，在39℃，5%的CO₂，95%空气，100%饱和湿度的培养箱中受精6h，获得猪体外受精胚胎。

其中，mTBM受精液：NaCl0.6610g、KCl0.0224g、CaCl₂·2H₂O0.1103g、丙酮酸钠0.0550g、D-葡萄糖0.2180g、BSA0.4g和Tris0.2422g，配制时所称量药物依次加入超100mL纯水中，待前一种药物完全溶解后再加入后一种药物，然后定容，抽滤，分装，标记后于4℃冰箱中保存备用。

三、含有不同剂量小檗碱的猪体外胚胎培养液对猪体外受精胚胎体外发育的影响

以未添加小檗碱（BR）的NCSU-23胚胎培养液为对照组，以步骤一制备的含有不同剂量小檗碱（BR）的猪体外胚胎培养液为试验组，分别观察低、中、高（BR1、BR2、BR3）不同剂量的小檗碱对猪体外受精胚胎体外发育的影响。

1.胚胎体外培养

将步骤二获得的猪体外受精胚胎用NCSU-23胚胎培养液清洗3遍，然后转移到平衡4h以上的培养液滴中（对照组：NCSU-23胚胎培养液；试验组：含有不同剂量小檗碱（BR）的猪体外胚胎培养液），每滴15～20枚胚胎，覆盖矿物油，39℃，5%CO₂，95%空气，100%饱和湿度的CO₂培养箱中培养。间隔48h换液一次。

2.卵裂率和囊胚率的计算

同实施例1步骤三2。

3.囊胚细胞数量的统计、囊胚细胞凋亡情况鉴定及凋亡指数计算

同实施例1步骤三3。

四、结果

1.卵裂率和囊胚率的计算

对照组和试验组的卵裂率和囊胚率计算结果如表4所示。

表4小檗碱对猪体外受精胚胎体外发育效果的影响

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。

由表4可知，体外受精胚胎体外发育至48h的卵裂率，BR1组的卵裂率与对照组、BR2组和BR3组之间差异显著（P<0.05）。体外受精胚胎体外发育至168h（第7天）的囊胚率，BR1组和BR3组显著高于对照组和BR2组（P<0.05）。

2.囊胚细胞数量的统计

对照组和试验组的囊胚细胞计数结果见表5。

表5小檗碱对猪体外受精胚胎囊胚细胞数量的影响

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示无显著差异（P>0.05）。

由表5可知，体外受精胚体外发育至168h（第7天）囊胚，BR1组内细胞团细胞数、滋养层细胞数及总细胞数均极显著高于对照组和其他试验组（P<0.01），ICM/TE各组之间均无显著差异（P>0.05）。

3.囊胚细胞凋亡情况鉴定及凋亡指数计算

对照组和由步骤1、2鉴定得到的效果较优的试验组（BR1组）的囊胚细胞凋亡情况鉴定结果如图2所示。从图中可以看出，BR1组第7天囊胚总细胞数均显著高于对照组（P<0.05），而凋亡细胞数显著低于对照组（P<0.05）。

对照组和由步骤1、2鉴定得到的效果较优的试验组（BR1组）的囊胚细胞凋亡指数计算结果如表6所示。

表6小檗碱对体外受精胚胎囊胚细胞凋亡的影响

组别	观察囊胚数/枚	凋亡指数
			对照组	40	13.67±1.00A
BR1组	40	6.26±0.97B

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。

由表6可知，由步骤1、2鉴定得到的效果较优的试验组（BR1组）的囊胚细胞凋亡指数极显著低于对照组（P<0.01）。

Claims (9)

1.一种猪体外胚胎培养液，其特征在于：所述猪体外胚胎培养液是在NCSU-23胚胎培养液中加入终浓度为0.1～1.0μg/mL的小檗碱后得到的培养液。

2.根据权利要求1所述的猪体外胚胎培养液，其特征在于：所述NCSU-23胚胎培养液为将NCSU-23基础培养液、D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸、L-半胱氨酸、青霉素、硫酸链霉素，以及牛血清白蛋白按照1L：1.1g：0.146g：0.876g：0.546g：0.069g：100000IU：70000IU：4g的配比混合而成。

3.根据权利要求2所述的猪体外胚胎培养液，其特征在于：所述NCSU-23基础培养液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl6.354g/L、KCl0.356g/L、K₂HPO₄0.162g/L、CaCl₂·2H₂O0.250g/L、MgSO₄·7H₂O0.293g/L、NaHCO₃2.106g/L、青霉素108333IU/L、硫酸链霉素50000IU/L。

4.一种培养猪体外胚胎的方法，是将猪体外胚胎置于权利要求1-3中任一所述的猪体外胚胎培养液中进行培养。

5.根据权利要求1-3中任一所述的猪体外胚胎培养液，或权利要求4所述的方法，其特征在于：所述猪体外胚胎为猪孤雌激活胚或猪体外受精胚胎。

6.根据权利要求1-5中任一所述的猪体外胚胎培养液或方法，其特征在于：当所述猪体外胚胎为猪孤雌激活胚时，所述猪体外胚胎培养液中所述小檗碱的终浓度为0.2μg/mL；当所述猪体外胚胎为猪体外受精胚胎时，所述猪体外胚胎培养液中所述小檗碱的终浓度为0.1μg/mL。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：将所述猪体外胚胎置于所述猪体外胚胎培养液中培养为：每个50μL的所述猪体外胚胎培养液的液滴中培养15～20枚所述猪体外胚胎。

8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：将所述猪体外胚胎置于所述猪体外胚胎培养液中培养的条件为：39℃，5%CO₂，100%饱和湿度。

9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于：将所述猪体外胚胎置于所述猪体外胚胎培养液中培养，间隔48h换液一次。

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