CN107058215A - 一种添加中药单体的猪卵母细胞体外受精液及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种添加中药单体的卵母细胞体外受精液，其特征在于，所述体外受精液包括由猪卵母细胞常规培养液和中药单体，其中，所述中药单体为金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为2μg/ml、0.5μg/ml和0.5μg/ml。本发明还提出了基于上述受精液的提高猪体外受精胚胎体外发育的方法。本发明研究表明，在体外受精液中添加中药单体成分金丝桃苷，对猪卵母细胞胚胎发育具有良好的促进作用，在卵裂率和囊胚发育率等方面均好于未加中药成分的对照组。

Description

一种添加中药单体的猪卵母细胞体外受精液及培养方法
技术领域
本发明具体地涉及一种添加中药单体的猪卵母细胞体外受精液。
背景技术
器官移植是拯救脏器终末期疾病患者的有效手段之一，但器官移植的发展由于供体严重短缺受到极大制约。随着生物技术的发展和伦理学上的共识，从动物身上寻求患者需要的细胞、组织、器官，实现异种移植，已成为当今医学领域的研究热点。由于猪的生理和解剖指标与人类极其相近，还具有育程短、产仔多、仔猪生长迅速、易于在无指定病原体(designated pathogen-free，DPF)条件下饲养以及与灵长类相比伦理学障碍较小等特点，转基因猪已成为目前研究异种器官移植最具优势的大动物供体。而猪卵母细胞和胚胎有望成为研究人卵母细胞和受精卵相关功能作用的最佳研究模型。猪转基因及克隆等繁殖新技术的发展，使得胚胎需求量大幅增加，高效的胚胎体外生产将极大地解决这一问题。卵母细胞体外成熟是胚胎体外生产过程的关键环节，因为它决定卵母细胞的质量，影响胚胎的发育。但由于体内外发育环境的较大差异，体外培养条件的不适宜，猪体外受精(in vitrofertilization，IVF)胚胎体外发育效率及质量远低于体内胚胎。当前猪卵母细胞体外成熟(In vitro maturation，IVM)体系仍不完善，导致猪卵母细胞的体外成熟质量不高、胚胎发育受阻，这制约了其在科学研究和畜牧生产中的应用。研究发现，猪卵母细胞和早期胚胎中含有大量的脂肪滴，致使其对外界环境极为敏感，特别是低温条件会造成猪胚胎发育停止或死亡。同时这也造成了胚胎冷冻保存的困难。通过在培养液中添加激素、细胞因子或生长因子等促进卵母细胞成熟已取得一定进展，但是体外成熟的卵母细胞的发育能力仍然不及体内成熟的卵母细胞，这说明卵母细胞的体外成熟体系还不完善，仍需要进一步优化。
近年来，诸多研究进展证明，中药单体成分有利于促进猪IVF胚胎体外发育。赵菊等在NCSU-23培养液中添加中药单体成分ICA，其48h卵裂率、120h桑囊率、168h囊胚率均极显著高于对照组(P＜0.01)。可见，在NCSU-23中添加ICA获得了较好的胚胎发育效果，中药单体成分ICA能够有利于促进猪IVF胚胎体外发育。随着哺乳动物细胞核移植研究的深入，卵母细胞孤雌激活的研究也越来越得到关注。常用的孤雌激活方法有电激活和化学激活。许多学者在研究基本孤雌激活方法的基础上，进一步探讨在孤雌胚发育的培养体系中添加不同物质，进一步提高孤雌胚的体外发育率。潘登科等研究了促减数分裂甾醇(MAS)对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响，研究结果表明，在体外培养液中添加20μmol/LMAS合成代谢过程中的抑制剂AY9944，得到孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加。文国艺等就马尾藻类多糖对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响进行了探索。结果表明，在培养液中添加20g/L马尾藻类多糖后获得的孤雌激活分裂率(60.4％)显著高于对照组(42.6％)。李玉芳等观察了中药肉苁蓉和黄芪水提液对猪早期胚胎体外发育的影响。证明其对胚胎发育有一定的促进作用。卢晟盛等探讨了乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期胚胎发育的影响，通过在成熟液和胚胎培养液中同时添加100μmol/L EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进用。Yanhong等在猪孤雌胚体外培养液中添加了0.1μg/mL SPP1，证明了SPP1的添加在一定程度上改善了猪孤雌激活囊胚体外发育质量，第7天囊胚形成率(36.2％±8.08％)显著高于不添加组(29.1％±8.08％)。Spinaci等研究结果发现，在猪孤雌激活胚体外培养系统中添加2.5μg/mL的EGCG可提高囊胚形成率。徐捷等在NCSU一23基础液中添加中药单体成分黄芩苷(baicalin，Bai)、黄芪多糖(astragalus membranaceuspolysaccharide，APS)、川穹嗪、小檗碱等，该试验中川芎嗪小剂量、小檗碱中剂量及淫羊藿中剂量添加组均能显著提高猪孤雌胚体外发育的囊胚率，结果证明这些成分对小鼠胚胎发育具有良好的促进作用，在囊胚发育率、胚胎孵化率、孵化胚胎细胞数目和胚胎移植后出生率、产仔率和成活率、冷冻解冻及移植效果等方面均显著好于未加中药成分的对照组。
发明内容
本发明的目的在于提供一种添加中药单体的猪卵母细胞体外受精液，以发掘金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响。
为了建立良好的猪胚胎体外培养体系，以体外成熟培养的卵母细胞为材料，分别研究中药单体成分金丝桃苷(Hyp)、淫羊藿苷(Ica)和川芎嗪(Lig)对猪体外受精胚胎体外培养效果的影响。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出一种添加中药单体的卵母细胞体外受精液，所述体外受精液包括猪卵母细胞常规培养液和中药单体，所述中药单体为金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种，其中，当所述中药单体为金丝桃苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为1-4μg/ml；当所述中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml；当所述中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml。
具体地，所述的猪卵母细胞常规受精液为mTBM受精液，mTBM受精液的配方见下表1，所有配方成分均购自SIAMA公司。
表1 Modified TRIS-Buffered Medium(mTBM)受精液
首先按照表1配好上述液体，然后在做体外受精操作的前一天添加下述表2所述两种
成分：
表2
37℃CO2培养箱过夜平衡
本发明进一步提出了上述中药单体在制备用于提高猪体外受精胚胎体外发育的猪卵母细胞体外受精液中的应用，其中，所述的中药单体为金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。
本发明同时提出了一种提高猪体外受精胚胎体外发育的方法，包括如下步骤：将卵丘卵母细胞复合体(COCs)在预平衡过的卵母细胞成熟液(PZM-3)培养成熟42-44h，将培养成熟的M II卵母细胞置于添加有中药单体的猪卵母细胞常体外受精培养液中，所述中药单体为金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种，当所述中药单体为金丝桃苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为1-4μg/ml；当所述中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml；当所述中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过在体外受精液中添加中药单体成分金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪，结果证明这些成分对猪胚胎发育具有良好的促进作用，在卵裂率和囊胚发育率等方面均好于未加中药成分的对照组。本试验中金丝桃苷中剂量添加组能显著提高猪体外受精胚胎体外发育的囊胚率，表明适宜浓度的中药单体成分添加可以促进猪体外受精胚胎的体外发育，这可能与中药的抑菌、抗氧化、促进细胞增殖等特性有关。中药单体成分的添加促进体外受精胚胎的受精率，其确切调节机制还有待进一步研究。
具体实施方式
实验样品及材料：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1卵巢与精子来源
猪卵巢由南京市肉联厂提供，猪种为类长白。猪精子由句容市农业学校种猪场提供，猪种为枫泾猪。
1.1.2主要试剂
氯化钠(NaCI)、氯化钾(KCI)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、结晶氯化钙(CaCl·H2O)、结晶硫酸镁(MgSOt·7H2O)、六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)、碳酸氢钠(NaHCO3)、丙酮酸钠(sodium pyruvate)、牛血清白蛋白(BSA)、谷氨酰胺(L-glutamine)、13-葡萄糖(D-glucose)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、青霉素钾(penicillin G)、硫酸链霉素(streptomycin)、矿物油(mineral oil)、牛磺酸(taurine)、亚牛磺酸(hypotaurine)、酚红(phenol red)、透明质酸酶(hyaluronidase)、促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)、表皮生长因子(EGF)，以上均购自Sigma公司，TCM-199粉剂购自Gibco公司，金丝桃苷(hyperin，Hyp)、淫羊藿苷(icariin，Ica)和川芎嗪(Ligustrazine，Lig)购自中国药品生物制品检定所。
1.2方法
1.2.1卵母细胞采集和体外成熟培养
从合作屠宰场收集猪卵巢，放置于0.9％的盐水瓶中，整个操作过程中盐水瓶始终放置于37℃保温箱中，1h内运回实验室。操作步骤如下：
1.次日早晨于胚胎实验室进行未成熟卵母细胞的抽取。使用18G的一次性注射器抽空3-8mm直径的卵泡。将含有卵子的卵泡液倒入15ml离心管中。
2.沉淀20min后倒掉上清，用洗卵液(TL-hepes配方见表3)洗三遍，每次间隔20min。
3.第三次加入洗卵液后轻轻摇匀，倒入100mm培养皿中，在体视显微镜下用自行拉制的毛细玻璃管将卵丘卵母细胞复合体(COCs)拣出。
4.将拣出的COCs在预平衡过的卵母细胞成熟液(IVM配方见表4)中洗三遍后放入用于卵母细胞成熟的四孔板中，四孔板中每孔加入700μl IVM，上层覆盖300μl矿物油。
5.38.5℃、5％CO2培养箱中成熟42-44h。
表3猪卵母细胞洗卵液(TL-hepes)
PH：7.2-7.4
表4卵母细胞成熟液(IVM)
PH：7.2-7.4
1.2.2、卵子准备、精子处理与体外受精
操作步骤如下：
1.将培养42-44h的卵丘卵母细胞复合体(COCs)移入透明质酸酶溶液中震荡去除颗粒细胞，震荡时间不要过长。尽量去除卵母细胞透明带外的颗粒细胞。
2.在卵母细胞体外操作液(配方见表5)中洗三遍后移入50μl覆矿物油的微滴中。
3.在微滴中挑出有卵间隙有第一极体的卵母细胞。弃去卵母细胞胞质弥散、胞质不完整、卵周隙不清楚、胞膜不清楚、碎裂极体、巨大极体的卵母细胞。将成熟的卵母细胞移入50μl受精滴中备用，每滴40枚卵母细胞，
4.精子处理：将原精用精子稀释液以1∶3稀释，精子稀释液为4.9克猪常温精液稀释保护剂-I号(LOT NO：13042230065)溶于100ml超纯水中，充分混匀。取4ml 60％percoll于15ml离心管中，预热至室温。取1ml稀释后的精液置于3ml事先预热至室温的sperm wash(配方见表6)中，轻轻混匀。将精子及sperm wash轻轻的加入4ml 60％percoll中，一定要轻轻加入。1900rpm，室温，离心10min。用移液器将最下层的精子沉淀吸出。用10ml预热至室温的spem wash将精子沉淀轻轻重悬。1900rpm，室温，离心8min。将上清液吸出，要轻轻的尽量将上清吸干净，不要将沉淀震荡起来。用100μl预热后的mTBM(配方见表1)将精子沉淀重悬。
5.计数：取10μl重悬后的精子于990μl水中，震荡混匀。再取100μl稀释后的精子于900μl水中，震荡混匀。取10pl稀释后的精子于血细胞计数板上。统计血细胞计数板上4个大格中的精子总数，然后求平均数。N×107/ml就是第4步中mTBM所含的精子总数。
6.加精：用mTBM将精子浓度稀释至1×106。取50m稀释后的精子加入事先做好的50μl受精滴中，这样，精子终浓度即为0.5×106/ml。
7.将精子及卵母细胞置于38.5℃、5％CO2培养箱中4-6h。然后将受精后的卵母细胞于后置于四孔板中，四孔板中每孔700μl猪卵母细胞发育液PZM-3(配方见表7)覆盖300μl矿物油。每孔放50到80个受精后的卵母细胞。
表5卵母细胞体外操作液
PH：7.2-7.4
表6Sperm wash配置
PH：7.2-7.4
表7猪卵母细胞发育液(PZM-3)
PH：7.2-7.4
1.2.3试验设计
设计3个试验组别，试验均以mTBM受精液为对照组，命名为C1，实验组1分别添加小、中、大3种剂量的金丝桃苷(Hyp)，金丝桃苷占猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比分别为1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml，依次命名为Hyp1、Hyp2、Hyp3。实验组2分别添加小、中、大3种剂量的淫羊藿苷(Ica)，淫羊藿苷占猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml和1.0μg/ml，依次命名为Ical、Ica2、Ica3；实验组3分别添加小、中、大3种剂量的和川芎嗪(Lig)，川芎嗪占猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25μg/ml、0.5μg/ml和1.0μg/ml，依次命名为Lig1、Lig2、Lig3。各组培养液在配置完成后，均要经0.22μm的滤器过滤后备用。对体外受精胚胎进行体外培养，分别于加精后48h、第7天观察卵裂率和囊胚发育率。比较了各组猪体外受精早期胚胎的体外发育效果，从而进行中药单体成分最佳浓度的筛选。
1.2.4数据处理
使用SPSS16.0统计软件，对卵裂率和囊胚率进行统计分析，数据以均值±标准差(x±s)表示，采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2结果与分析
2.1金丝桃苷对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响
以mTBM体外受精液为对照组，以添加不同剂量的金丝桃苷为试验组，分别观察小、中、大(Hyp1、Hyp2、Hyp3)不同剂量的金丝桃苷对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响，结果见表8。由表8可见，体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Hyp2组高于其他各组，但并无统计学差异。体外受精胚胎发育至第7天囊胚发育率Hyp2组均于其他各组，有统计学差异。
表8金丝桃苷对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响
Table8Effects of Hyperin on development of porcine IVF embryos
注：同一竖栏肩注不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
Note.Values with different superscripts in the same column meanstratistical significantly difference(P＜0.01)
2.2淫羊藿苷对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响
以mTBM体外受精液为对照组，以添加不同剂量的淫羊藿苷为试验组，分别观察小、中、大(Ica1、Ica2、Ica3)不同剂量的淫羊藿苷对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响，结果见表9。由表9可见，体外受精胚胎发育至48h的卵裂率和第7天囊胚发育率Ica2组均高于其他各组，但并无统计学差异。
表9淫羊藿苷对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响
Table 9Effects of Icariin on development of porcine IVF embryos
2.3川芎嗪对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响
以mTBM体外受精液为对照组，以添加不同剂量的川芎嗪为试验组，分别观察小、中、大(Lig1、Lig2、Lig3)不同剂量的川芎嗪对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响，结果见表10。由表10可见，体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Lig2组高于其他各组，有统计学差异。体外受精胚胎发育至第7天囊胚发育率Lig1组高于其他各组，但无统计学差异。
表10川芎嗪对猪体外受精早期胚胎体外发育效果的影响
Table 10Effects of Ligustrazine on development of porcine IVF embryos
注：同一竖栏肩注不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
Note.Values with different superscripts in the same column meanstratistical significantly difference(P＜0.01)
结果表明，体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Hyp2组高于其他各组，但并无统计学差异，体外受精胚胎发育至第7天囊胚发育率Hyp2组均于其他各组，有统计学差异；体外受精胚胎发育至48h的卵裂率和第7天囊胚发育率Ica2组均高于其他各组，但并无统计学差异；体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Lig2组高于其他各组，有统计学差异。体外受精胚胎发育至第7天囊胚发育率Lig1组高于其他各组，但无统计学差异。鉴于以上实验结果，我们可以得出如下结论：在mTBM中添加最佳浓度的金丝桃苷能显著提高猪体外受精胚胎的体外发育效果。

Claims (4)

1.一种添加中药单体的卵母细胞体外受精液，其特征在于，所述体外受精液包括猪卵母细胞常规培养液和中药单体，所述中药单体为金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种，其中，当所述中药单体为金丝桃苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为1-4μg/ml；当所述中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml；当所述中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml。
2.根据权利要求1所述的猪卵母细胞体外受精液，其特征在于，所述的猪卵母细胞常规受精液为mTBM受精液。
3.中药单体在制备用于提高猪体外受精胚胎体外发育的猪卵母细胞体外受精液中的应用，其中，所述的中药单体为金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。
4.一种提高猪体外受精胚胎体外发育的方法，其特征在于，包括如下步骤：将卵丘卵母细胞复合体(COCs)在预平衡过的卵母细胞成熟液(PZM-3)培养成熟42-44h，将培养成熟的MII卵母细胞置于添加有中药单体的猪卵母细胞常体外受精培养液中，所述中药单体为金丝桃苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种，当所述中药单体为金丝桃苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为1-4μg/ml；当所述中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml；当所述中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与猪卵母细胞常规培养液的质量比/体积比范围为0.25-1.0μg/ml。
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