CN102499788B

CN102499788B - Sry抗体的应用

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Publication number: CN102499788B
Application number: CN201110355017.5A
Authority: CN
Inventors: 周虚; 李纯锦; 刘卓; 陈璐
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2011-11-10
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2031-11-10
Also published as: CN102499788A

Abstract

本发明涉及细胞工程技术领域，具体的说是涉及SRY抗体在制备控制哺乳动物胚胎性别的产品中的应用及一种体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法。本发明利用SRY抗体处理雄性哺乳动物精液，SRY抗体能单一的作用于Y精子携带的SRY蛋白，使Y精子活力降低或干扰Y精子与卵母细胞识别和结合能力，但是对X精子的功能没有影响，使所得胚胎的性别大部分为雌性，从而达到生产雌性胚胎的目的。本发明属于免疫学方法，简便、快捷，对精子损害小，效率高，减少了非所需要的性别的胚胎，避免胚胎废弃造成浪费，适合于规模化养殖。

Description

SRY抗体的应用

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体的说是涉及SRY抗体的应用。

背景技术

性别控制(sex control)是指通过人为的干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。性别控制是一项能显著提高养殖业经济效益的生物工程技术。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益。其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。通过控制胚胎性别还可克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害。

哺乳动物性别控制的方法多种多样，主要可分为两种：受精前性别控制和受精后性别控制。受精前的性别控制主要是通过X、Y精子的分离来实现的，例如利用流式细胞仪分离精子；受精后的性别控制主要是利用生物学和非生物学方法进行性别鉴定后通过移植已知性别的胚胎达到控制后代性别比例，如核型分析法、X-相关酶法、DNA探针法、荧光原位杂交、LAMP法等。但最有效的方法是通过分离X、Y精子和鉴定早期胚胎的性别来控制后代的性别。

分离X、Y精子并用于人工授精或显微授精是控制家畜性别最简单、可行的方法。X、Y精子分离主要是依据两类精子理化特性的不同而进行的。关于这方面国外科技工作者进行了多方面研究，发现X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。Ke-hui Cui(1997)证实X、精子在长度、头部面积、周径、颈部长度、尾长等形态上显著大于Y精子，从而为分离精子提供了依据。

根据两类精子理化特征上的细微差异，人们设计了诸如沉降法、离心法、过滤法、电泳法等来分离X、Y精子，并有控制性别比例的报道，但许多研究结果的可重复性很差，并且后代出生的性别比例并没有明显超出自然出现的性别比例范围，实际生产中推广的意义不大。近年来发展起来的细胞流式分类器和免疫学方法在分离两类精子的效率上显示出较大的优势。

Johnson(1994)研究表明X与Y精子在染色体的DNA组成上存在最高可达12.5％差别，依据这一原则设计出的流式细胞分类器可将X与Y精子分开并进行体外受精，已获得预期性别的牛、兔、猪、绵羊的活后代。目前流式细胞分类器分离X、Y精子是所有方法中效率最高的，日本已将该法做为实施性别控制技术的基础。但此法分离速度很慢，同时精子分离操作过程中，有些步骤还会对精子产生损害作用，如高浓度的荧光染色剂、激光照射、极高的流速、高稀释倍数和离心力等，且仪器价格昂贵，直接限制了其应用范围。

应用免疫学方法分离精子是从Eichwald和Silmser发现雄性特异性弱组织相容性Y抗原(male specific minor histocmpatibility-Y anti-gen)，简称H-Y抗原，后逐渐发展起来的。现已证明H-Y抗原被保留在整个进化过程中，除了某些过渡品种外，在所有异配子型性别品种的体细胞中均发现H-Y抗原存在。许多实验都证实，只有Y精子才能表达H-Y抗原，因而，利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，再通过一定的分离程序，就能将精子分离成为H-Y⁺(Y精子)和H-Y^-(X精子)两类。将所需性别的精子进行人工授精，即可获得预期性别的后代。H-Y⁺、H-Y^-精子分离的主要方法有：免疫亲和柱层析法、直接分离法及免疫磁力法。Bradley(1989)用免疫亲和柱层析法分离绵羊的H-Y⁺和H-Y^-精子，发现不被层析柱上而后被洗脱下来的有70％～80％为H-Y^-，结合到层析柱上而后被洗脱下来的有75％～80％的H-Y⁺，对照组有43％～44％为H-Y⁺，56％～57％为H-Y^-。虽然该法分离精子的效率较高，然而经处理后的精子数目少而且活力低，很难在实际生产中应用。

早期胚胎的性别鉴定也是实现性别控制的主要途径之一，包括核型分析法、X染色体连接酶活力测定法、H-Y抗原法(包括细胞毒性分析法和间接免疫荧光法)以及针对性别决定区特定基因序列的聚合酶链式反应(PCR)方法和荧光原位杂交技术(FISH)。以上这些早期胚胎性别鉴定技术业已成熟，但这些方法要么准确率不高、要么费时，而且必须利用胚胎移植技术，不适宜在实际生产中应用推广。而且由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上取下少量细胞，因而性别鉴定的胚胎经冷冻-解冻处理仅有少量胚胎存活，导致胚胎移植的成功率下降。其次，性别鉴定的胚胎需反复转移胚胎，再移植的胚胎其成活率降低。再次，不论怎样进行胚胎的性别鉴定，按照生态平衡原理所产生的雌雄胚胎比例总是1∶1，在移植时，所需要的性别的胚胎被保留下来，而另一半因没有用处被扔掉，造成胚胎的浪费，不适合规模化养殖。

因此建立一种快速、准确的，尽量减少对胚胎产生损害的非侵害性方法以控制早期胚胎性别具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是提供一种SRY抗体的新应用及一种对胚胎损害小、效率高的体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法。

性别形成的机理是进行性别控制的基础。早期研究证实了人类X和Y染色体的存在，指出当卵子与X精子受精，后代为雌性，Y精子受精，后代为雄性。哺乳动物胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，但已具备了有分化潜能的生殖器官的原始胚基。如果性染色体为XX，那么性腺原基发育为卵巢，个体为雌性；如果性染色体为XY，那么性腺原基发育为睾丸，个体为雄性。家畜性别的分化则是在性染色体基因和常染色体性别相关基因的复杂作用下的最终结果。

研究表明，Y染色体的性别决定区(sex determining region of the Y，Sry)即为性别决定因子。性别发育以Sry基因为核心，Sry基因在胚胎发育的早期开始表达。哺乳动物的SRY基因是含有DNA结合基序(HMG盒)的睾丸决定基因，为单拷贝，编码有大约78个氨基酸的HMG盒，从有袋动物到胎生动物都是保守的。SRY基因的表达与肇丸分化密切相关，SRY转基因XX小鼠发育成雄性。Sry基因编码的SRY蛋白的结合活性位于HMG盒中，这个结构域的突变与XY雌性个体的性逆转有关。

SRY抗体是哺乳动物机体的免疫系统在SRY蛋白抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与SRY蛋白抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。利用SRY抗体处理雄性哺乳动物精液，SRY抗体能单一的作用于Y精子携带的SRY蛋白，使Y精子活力降低或干扰Y精子与卵母细胞的识别和结合能力，但是对X精子没有影响，使所得胚胎的性别大部分为雌性，从而达到控制胚胎性别的目的。

实验表明，经胚胎性别鉴定，采用SRY抗体处理的牛精液进行体外受精，所得到的牛胚胎雌雄比例可达到75～82％。因此本发明提供了SRY抗体在制备控制哺乳动物胚胎性别的产品中的应用。其中，所述哺乳动物可以为牛、猪、羊、马、兔或狗。

本发明还提供了一种对胚胎损害小、效率高的体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法。

一种体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法，将新鲜的或冷冻解冻的雄性哺乳动物精液缓慢注入2mL含有SRY抗体的受精液底部孵育，然后取上清置于离心管中离心，取沉淀用受精液洗涤，注入含有成熟卵母细胞的受精滴中进行体外受精培养，培养24h后将胚胎移入胚胎培养液中，继续培养即得；

其中，所述受精液配方为NaCl 6.66g/L、KCl 0.238g/L、MgCl₂.6H₂O 0.1g/L、CaCl₂.2H₂O 0.294g/L、NaH₂PO₄.2H₂O 0.062g/L、NaHCO₃2.09g/L、丙酮酸钠27.5g/L、乳酸钠1.121g/L、Hepes 2.4g/L、BSA 6g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、肝素60μg/mL；所述受精滴大小为15～30μL每滴含15～20枚成熟卵母细胞。其中，Hepes，中文名为羟乙基哌嗪乙硫磺酸，是一种非离子两性缓冲液，其在pH 7.2～7.4范围内具有较好的缓冲能力，在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值；BSA为牛血清白蛋白，是牛血清中的一种球蛋白。

本发明所述方法利用SRY抗体在受精前处理精子，干扰Y精子与卵母细胞的识别和结合能力，达到控制胚胎性别的目的，属于免疫学方法，方法简便、快捷，对精子损害小，且效率高。同时减少了非所需要的性别的胚胎，避免胚胎废弃造成浪费，适合于规模化养殖。

本发明所述方法可用于牛、猪、羊、马、兔、狗等哺乳动物的性别控制，在具体实施方式中，所述哺乳动物为牛。

本发明所述方法所述雄性哺乳动物精液可以为新鲜提取的精液，也可以为冷冻保存的精液。精液与SRY抗体混合之前需要先进行相应处理。

冷冻保存的精液需要先进行解冻，可以采用低温冰水解冻(0～5℃)、温水解冻(30～40℃)以及高温解冻(50～70℃)，优选采用更为实用、安全、高效的温水解冻方法对冷冻保存的精液进行解冻。

新鲜提取的精液需要进行精液稀释，添加一定数量的、适宜于精子存活并保持受精能力的溶液，以增加精液容量，供给精子营养，延长其存活时间。所述稀释剂可以为商品化的稀释粉剂加蒸馏水配制而成，其中稀释粉剂含有供应精子的营养物质葡萄糖、维持pH值和渗透压的无机盐及有机酸、抑制微生物繁殖与活动的抗生素等成分。哺乳动物种类不同，稀释的比例也不同，通常牛的精液的稀释倍数为10～40倍；猪的精液的稀释倍数为2～4倍；羊的精液的稀释倍数为2～4倍；马的精液的稀释倍数为2～3倍；兔的精液的稀释倍数为3～5倍。

由于在不同的物种中，SRY蛋白的HMG域高度保守，但是即使是在有亲缘关系的物种之间，SRY蛋白的其余部分也并不同源。因此，本发明所述SRY抗体为针对SRY蛋白的HMG域的非特异抗体。优选的，所述SRY抗体的浓度为200～400μg/L。

本发明所述方法将SRY抗体处理雄性哺乳动物精液注入含有成熟卵母细胞的受精滴中进行体外受精，其中所述含有成熟卵母细胞的受精滴制备方法具体为将采集的卵巢剪去结缔组织，置于37℃生理盐水中2h之内带回实验室，将卵巢用预热的生理盐水洗几遍，选取直径为2～8mm的卵泡用一次性注射器抽取卵泡液，在解剖显微镜下收集透明带完整的卵母细胞，洗卵液洗2～3次，成熟液洗1次；将卵母细胞转入成熟液中进行成熟培养，培养22～28h后得成熟卵母细胞；去掉成熟卵母细胞周围的颗粒细胞，用受精液洗涤，置于受精液中制成的受精滴中；

其中，所述洗卵液为配方为TCM-1999.5g/L、NaHCO₃2.2g/L、丙酮酸钠25mg/L、Hepes 4.8g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L；所述成熟液配方为TCM-1999.5g/L、谷氨酰胺100mg/L、NaHCO₃2.2g/L、促卵泡素10μg/mL、促黄体素10μg/mL、雌二醇1.5μg/mL、链霉素75μg/mL、青霉素100μg/mL、Hepes 10mM、10％胎牛血清；所述受精液配方为NaCl 6.66g/L、KCl 0.238g/L、MgCl₂.6H₂O 0.1g/L、CaCl₂.2H₂O 0.294g/L、NaH₂PO₄.2H₂O 0.062g/L、NaHCO₃2.09g/L、丙酮酸钠27.5g/L、乳酸钠1.121g/L、Hepes 2.4g/L、BSA 6g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、肝素60μg/mL；所述受精滴大小为15～30μL每滴含15～20枚卵母细胞。

其中，所述促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)，是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，成分为糖蛋白，主要作用为促进卵泡成熟；促黄体素又称黄体生成素(luteinizing hormone，LH)，是由脑垂体分泌的一种促性腺激素，促黄体素可刺激卵巢卵泡的最后成熟和破裂，以及黄体分泌孕酮，促黄体素和促卵泡素具有协同作用。所述雌二醇(Estradiol)卵巢分泌的类固醇激素有很强的性激素作用，是卵巢分泌的最重要的性激素。胎牛血清(fetalcalf serum，FBS)，是采自胎牛的血清，含有多种生长因子，常用于体外细胞培养。

本发明所述方法中所述雄性哺乳动物精液，与SRY抗体混合孵育，使SRY抗体与Y精子携带的SRY蛋白充分作用。优选的，所述孵育条件为38.5℃孵育20min。

雄性哺乳动物精液与SRY抗体混合孵育后，取上清离心得取沉淀即为X精子。优选的，所述离心条件为2000g离心6min。

体外受精培养后需要将胚胎转入胚胎培养液中进行胚胎培养。优选的，所述胚胎培养液配方为TCM-199 9.5g/L、NaHCO₃2.2g/L、丙酮酸钠0.11g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、20％胎牛血清。

本发明所述方法还包括胚胎性别鉴定步骤，以进一步对受精后的胚胎性别进行鉴定，为性别控制的实现提供了双重保证。所述胚胎性别鉴定可以为利用X染色体连接酶活力测定法、H-Y抗原间接免疫荧光法、DNA探针法以及针对性别决定区特定基因序列的聚合酶链式反应(PCR)方法和荧光原位杂交技术(FISH)判断胚胎性别。优选的，所述胚胎性别鉴定为利用聚合酶链式反应方法判断胚胎性别。

本发明所述体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法利用SRY抗体在受精前处理精子，干扰Y精子与卵母细胞的识别和结合能力，达到生产雌性胚胎的目的，属于免疫学方法，方法简便、快捷，对精子损害小，效率高，减少了非所需要的性别的胚胎，避免胚胎废弃造成浪费，适合于规模化养殖。

本发明还提供了一种控制哺乳动物生雌性胚胎的方法，取雄性哺乳动物精液，与SRY抗体混合孵育，静置后取上清置于离心管中离心，取沉淀用受精液洗，然后将精子吹开，输入雌性哺乳动物子宫内受精。所述方法可用于牛、猪、羊、马、兔、狗等哺乳动物的性别控制，在具体实施方式中，所述哺乳动物为牛。

附图说明

图1示体外受精生产牛胚胎PCR扩增产物电泳图，图中泳道M为DL2000标准分子量；泳道1、2和3均为胚胎PCR产物。

具体实施方式

本发明实施例公开了SRY抗体的应用及一种体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：牛体外受精获得性控胚胎

1.卵巢的采集与预处理

将采集的卵巢剪去结缔组织，置于37℃生理盐水中2h之内带回实验室。将卵巢用预热的生理盐水洗几遍，备用。

2.卵母细胞体外成熟

选取直径为2-8mm的卵泡用一次性注射器抽取卵泡液。在解剖显微镜下收集透明带完整卵母细胞，将收集的卵母细胞用洗卵液洗三次，在成熟液中洗一次，然后置于成熟液中，在38～39℃、5％CO2的空气及饱和湿度条件下进行成熟培养，培养22-28小时得成熟卵母细胞。所述洗卵液为配方为TCM-199 9.5g/L、NaHCO₃2.2g/L、丙酮酸钠25mg/L、Hepes 4.8g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L；所述成熟液配方为TCM-199 9.5g/L、谷氨酰胺100mg/L、NaHCO₃2.2g/L、促卵泡素10μg/mL、促黄体素10μg/mL、雌二醇1.5μg/mL、链霉素75μg/mL、青霉素100μg/mL、Hepes 10mM、10％胎牛血清。

3.卵母细胞体外受精

去掉成熟卵母细胞周围的颗粒细胞，用受精液洗几次，置于受精液中制成受精滴。受精液配方为NaCl 6.66g/L、KCl 0.238g/L、MgCl₂.6H₂O 0.1g/L、CaCl₂.2H₂O 0.294g/L、NaH₂PO₄.2H₂O 0.062g/L、NaHCO₃2.09g/L、丙酮酸钠27.5g/L、乳酸钠1.121g/L、Hepes 2.4g/L、BSA 6g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、肝素60μg/mL；所述受精滴大小为15～30μL每滴含15～20枚成熟卵母细胞。

将冻精从液氮中取出，39℃解冻15s，将精液分别缓慢注入2mL含有不同浓度商业化SRY抗体(购自美国santa公司)的受精液底部，其中SRY抗体浓度分别为200μg/L和400μg/L，38.5℃孵育20min，取上清置于离心管中2000g离心6min。取沉淀用受精液洗涤，注入含有成熟卵母细胞的受精滴中，在38.5℃、5％CO₂的空气及饱和湿度条件下进行体外受精培养。

4.胚胎的体外培养

受精24h后，将胚胎移入胚胎培养液中，继续培养即得。其中，胚胎培养液配方为TCM-199 9.5g/L、NaHCO₃2.2g/L、丙酮酸钠0.11g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、20％胎牛血清。

实施例2：胚胎性别鉴定

当胚胎卵裂数＞4时，分别取不同浓度SRY抗体孵育后受精胚胎用PCR方法进行性别鉴定。

根据SRY基因和常染色体基因设计了两对引物，引物如表1所示。

表1胚胎性别鉴定的引物序列

PCR前对胚胎进行处理：在胚胎中加入3.5μL的蛋白酶K，55℃变性30min，使细胞裂解，98℃10min使蛋白酶K失活。然后用随机引物扩增模板反应体系及反应程序如下：

PCR扩增模板反应体系为：

PCR扩增模板反应程序为：

利用多重PCR进行胚胎性别鉴定，其中能同时扩增出300bp和538bp两个片段的胚胎判断为雄性，只扩增出538bp片段的胚胎判断为雌性。反应体系及反应程序如下：

多重PCR反应体系为：

多重PCR反应程序为：

PCR反应完成后，2％琼脂糖凝胶电泳检测，部分电泳结果如图1所示。由图1可见，1号胚胎仅扩增出一条538bp的片段，为常染色体基因条带，为雌性胚胎；而2号和3号胚胎均扩增出538bp和300bp两条条带，为雄性胚胎。

统计不同浓度SRY抗体孵育获得胚胎的雌雄性别比例，结果如表2所示。

表2不同浓度SRY抗体孵育获得胚胎的雌雄性别比例

由表2结果可见，采用SRY抗体处理的牛精液进行体外受精，所得到的牛胚胎雌雄比例可达到75～82％。表明SRY抗体可用于生产哺乳动物雌性体外胚胎。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种体外生产哺乳动物雌性胚胎的方法，其特征在于，将新鲜的或冷冻解冻的雄性哺乳动物精液缓慢注入2mL含有SRY抗体的受精液底部孵育，然后取上清置于离心管中离心，用受精液洗涤沉淀，注入含有成熟卵母细胞的受精滴中进行体外受精培养，培养24h后将胚胎移入胚胎培养液中，继续培养即得；

其中，所述受精液配方为NaCl6.66g/L、KCl0.238g/L、MgCl₂.6H₂O0.1g/L、CaCl₂.2H₂O0.294g/L、NaH₂PO₄.2H₂O0.062g/L、NaHCO₃2.09g/L、丙酮酸钠27.5g/L、乳酸钠1.121g/L、Hepes2.4g/L、BSA6g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、肝素60μg/mL；所述受精滴大小为15～30μL每滴含15～20枚成熟卵母细胞；所述哺乳动物不为人。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述哺乳动物为牛、猪、羊、马、兔或狗。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述SRY抗体的浓度为200～400μg/L。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎培养液配方为TCM-1999.5g/L、NaHCO₃2.2g/L、丙酮酸钠0.11g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、20％胎牛血清。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述含有成熟卵母细胞的受精滴的制备方法具体为：将卵巢用预热的生理盐水洗几遍，选取直径为2～8mm的卵泡用一次性注射器抽取卵泡液，在解剖显微镜下收集透明带完整的卵母细胞，洗卵液洗2～3次，成熟液洗1次；将卵母细胞转入成熟液中进行成熟培养，培养22～28h后得成熟卵母细胞；去掉成熟卵母细胞周围的颗粒细胞，用受精液洗涤，置于受精液制成的受精滴中；

其中，所述洗卵液为配方为TCM-1999.5g/L、NaHCO₃2.2g/L、丙酮酸钠25mg/L、Hepes4.8g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L；所述成熟液配方为TCM-1999.5g/L、谷氨酰胺100mg/L、NaHCO₃2.2g/L、促卵泡素10μg/mL、促黄体素10μg/mL、雌二醇1.5μg/mL、链霉素75μg/mL、青霉素100μg/mL、Hepes10mM、10％胎牛血清；所述受精液配方为NaCl6.66g/L、KCl0.238g/L、MgCl₂.6H₂O0.1g/L、CaCl₂.2H₂O0.294g/L、NaH₂PO₄.2H₂O0.062g/L、NaHCO₃2.09g/L、丙酮酸钠27.5g/L、乳酸钠1.121g/L、Hepes2.4g/L、BSA6g/L、青霉素100mg/L、链霉素40mg/L、肝素60μg/mL；所述受精滴大小为15～30μL每滴含15～20枚卵母细胞。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括胚胎性别鉴定步骤。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述胚胎性别鉴定为利用聚合酶链式反应方法判断胚胎性别。