CN1623604A - 一种基于sry基因的哺乳动物生雌性控方法 - Google Patents

一种基于sry基因的哺乳动物生雌性控方法 Download PDF

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CN1623604A CN 200410032070 CN200410032070A CN1623604A CN 1623604 A CN1623604 A CN 1623604A CN 200410032070 CN200410032070 CN 200410032070 CN 200410032070 A CN200410032070 A CN 200410032070A CN 1623604 A CN1623604 A CN 1623604A
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魏宏泉
许越琰
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Abstract

本发明涉及一种基于SRY基因的对哺乳类动物进行生雌性控的方法，其特征在于使用以SRY蛋白为靶抗原的疫苗免疫雌性动物，诱导其对SRY蛋白产生特异性免疫反应。在生殖过程中，母体内免疫系统能特异性识别表达SRY蛋白的雄性胚胎，并通过细胞毒作用等方式清除或损伤雄性胚胎，但对雌性胚胎不产生影响；或使用抗SRY抗血清、抗SRY抗体或抗SRY的单克隆抗体在体外或体内处理胚胎，杀死雄性胚胎或阻滞其发育，从而达到生雌性控的目的。本发明所使用的疫苗可以是核酸疫苗，也可以是蛋白疫苗，本发明同时也涉及这两类疫苗的制备、生产和使用技术。

Description

一种基于SRY基因的哺乳动物生雌性控方法
技术领域
本发明属于哺乳类动物性别控制技术领域。特别涉及以SRY蛋白为靶抗原对雌性动物进行免疫，通过诱导产生SRY蛋白特异的免疫反应而杀死表达该蛋白的雄性胚胎；或以SRY蛋白为靶抗原对动物进行免疫，获得抗SRY抗血清、抗SRY抗体或抗SRY的单克隆抗体，在体外或体内处理胚胎，杀死雄性胚胎或阻滞其发育，从而实现生雌性控目的的方法。
背景技术
在农业生物技术领域中，性别控制问题长期以来一直是生物科学家致力于研究的重大课题之一，而且具有巨大的经济价值。性别控制的方法很多，但基本可归类为两大技术领域：一类是通过对X型精子和的分离达到性别控制的目的，另一类是通过对早期胚胎进行性别鉴定后进行胚胎移植从而达到性别控制的目的。经过长期的研究和发展，在这两类技术领域中已经形成了许多具有现实应用价值的方法和技术。
在精子分离技术领域，改进型流式细胞仪的出现使得准确高效分离精子成为可能(GeorgeE.Seidel，Reproduction(2002)124，733-743)，并迅速于2000年在英国和美国进入了商业化应用领域，这标志着精子分离技术获得了实质性的成功。尽管流式细胞分选器技术比较成功，但该方法还无法象人们预期中那样能生产出满足人工授精所需数量的性控精子，而且该设备价格极为昂贵，直接限制了其应用范围。同时在精子分离操作过程中，有些步骤还会对精子产生损害作用，如高浓度的荧光染色剂、激光照射、极高的流速、高稀释倍数和离心力等，其中以冷冻保存处理造成的损害最大。因此，在当前日趋规模化的现代化养殖业中，仅就该技术的分离速度和成本来看，这一技术仅可用于体外受精，采用冷冻分离精液人工授精的成本仍然太高，所以真正用于生产还需要进一步地改进和降低成本。
在早期胚胎性别鉴定技术领域，经过长期发展和应用，目前基本发展成熟的是PCR性鉴技术，其主要内容是利用PCR技术扩增牛胚胎细胞中SRY基因核心序列或其5’端非编码区序列，通过对扩增产物的分析而对胚胎性别进行鉴定。在这方面，美国的Herr CM等首先成功应用了PCR技术鉴定牛和羊胚胎的性别(Herr CM，Theriogenology，1991，35(1)：45-54)。其后，随着胚胎移植技术的产业化推广，该项技术日益发展成熟，已成为国内外目前最常用的性别控制技术。该方面的情况已为业内人士所熟知，此处不再详述。对胚胎进行性别鉴定虽是一种很好的性别控制方法，但这种技术的设计思想本身就存在着许多难以克服的困难和问题。首先，它只能应用于胚胎移植；其次，反复转移胚胎，再移植的胚胎的成活率降低；再次，不论怎样进行胚胎的性别鉴定，按照生态平衡的理论所产生的雌雄胚胎的比例总是1∶1，在移植时，我们所需要的性别的胚胎被保留下来，而另一半因没有用处被扔掉，造成胚胎的浪费。在畜牧业中，如果是大型规模化养殖，这是一项既艰巨又很浪费人力、物力和财力的做法。
综上所述，这两类技术各有其不足之处，主要表现在成本高、操作难度大、技术实施过程复杂，在现实生产中，这些不足直接限制了它们的应用规模，科学家们一直在试图建立一种新的技术系统，力图使性别鉴定成为一种操作简单、成本低廉、效果良好、具有普及实施价值的技术。
现有研究已证实，SRY基因(Sex-determining region Y gene)在哺乳动物的性别决定中起着总开关的作用，可以启动雄性性状的发育。其原理在于，雄性动物的发育以SRY为核心，层次调控基因表达。其过程是：SRY基因编码的蛋白是一种DNA结合蛋白，当与线性DNA结合后能使DNA弯曲，引起变形，并使SRY蛋白与受控基因的启动子序列结合，调节基因表达，诱导精巢发生，启动SF-1基因转录，SF-1的表达激活MIS表达，MIS表达产物引起缪勒管退化，吴式管在精巢分泌的睾酮作用下分化出雄性器官。用反转录PCR(RT-PCR)方法检测小鼠SRY转录产物的试验结果表明，SRY基因仅在交配后10.5～12.0d的有限时间内表达，并且这种表达是随着细胞的发育在生殖脊细胞内进行的，在小鼠交配后9.5d无预先的表达征兆，只在交配后12.5d，睾丸索明显形成的时候，才有表达痕迹。这种极短时间的表达揭示SRY启动睾丸的发育，但对长时间维持睾丸特异基因的表达不是必需的。由于突变和缺失都会使SRY蛋白的DNA结合能力下降或丧失，从而导致SRY蛋白所调控的基因不能开启转录，发生XY性反转。
由于SRY蛋白为雄性特异产物，以其为靶抗原对雌性动物进行免疫将会诱导产生免疫反应，而雄性胚胎将在发育至10.5～12.0d时表达SRY蛋白，根据免疫学原理，在细胞内所表达的任何蛋白都会因被递呈而在细胞表面形成特异的淋巴细胞识别表位，因此，母体免疫系统将会特异识别雄性胚胎并以细胞毒作用将其杀死，而对雌性胚胎不产生影响，这样就产生了生雌性控的效果。同样，如果制备出抗SRY抗血清、抗SRY抗体或抗SRY的单克隆抗体，在进行胚胎体外培养时加入培养液中，或在动物配种或人工授精后选择合适的时间加入子宫中，也同样可以杀死雄性胚胎或阻滞其发育，从而实现生雌性控的目的。
发明内容
本发明的技术方案是通过以下的措施来达到的：
一种基于SRY基因的哺乳动物生雌性控方法，其特征在于使用以SRY蛋白为靶抗原的疫苗免疫雌性动物；或以SRY蛋白为靶抗原对动物进行免疫，获得能特异识别SRY蛋白的免疫物质，在体外或体内处理胚胎。
本发明的技术方案是通过以下措施来达到的：
一种基于SRY基因的哺乳动物生雌性控方法，其特征在于使用以SRY蛋白为靶抗原的疫苗免疫雌性动物；或以SRY蛋白为靶抗原对动物进行免疫，获得能特异识别SRY蛋白的免疫物质，在体外或体内处理胚胎。
上述所使用的以SRY蛋白为靶抗原的疫苗是核糖核酸或脱氧核糖核酸或蛋白质。
上述以SRY蛋白为靶抗原对动物进行免疫的方法是核酸免疫或蛋白质免疫。
上述所使用的能特异识别SRY蛋白的免疫物质是指抗SRY抗血清或抗SRY抗体或抗SRY的单克隆抗体。
上述在体外或体内处理胚胎的方法是：将能特异识别SRY蛋白的免疫物质加入胚胎培养液中作用于胚胎，或将其置入雌性动物子宫中作用于胚胎。
上述核酸疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的DNA质粒。
上述核酸疫苗是通过以下方法得到的：通过分子克隆的方法获得某种哺乳动物的SRY蛋白编码cDNA，将其插入到真核表达质粒中得到重组质粒并转化到大肠杆菌中，用真核细胞瞬时表达的方法确认该重组质粒可以表达SRY蛋白，经大肠杆菌培养扩增后提取质粒，纯化后溶于生理盐水或含有不同佐剂的生理盐水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
上述核酸疫苗是通过以下方法生产的：通过分子克隆的方法获得某种哺乳动物的SRY蛋白编码cDNA，将其插入到真核表达质粒中得到重组质粒并转化到大肠杆菌中，用真核细胞瞬时表达的方法确认该重组质粒可以表达SRY蛋白，经大肠杆菌培养扩增后提取质粒，纯化后溶于生理盐水或含有不同佐剂的生理盐水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
一种对哺乳类动物进行性别控制的蛋白疫苗，其特征在于该疫苗由纯化的某种哺乳动物的SRY蛋白与佐剂组成。
上述蛋白疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的蛋白质。
上述核酸疫苗是通过通过以下方法之一得到：
方法一：通过分子克隆的方法获得某种哺乳动物的SRY蛋白编码cDNA，将其插入到原核或真核表达质粒中，将该重组质粒转化或转染到原核或真核细胞中，以细胞内或分泌的形式表达SRY蛋白，以生物化学的方法收集所表达的蛋白并进行纯化，然后溶于生理盐水或含有不同佐剂的生理盐水中，得到所需要的SRY蛋白疫苗。
方法二：用生物化学的方法从雄性哺乳动物组织中直接分离。
上述的对哺乳类动物进行性别控制的核酸疫苗的使用方法是：以注射、喷射、口服的方式经鼻、眼、生殖道、肠道通过渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述疫苗进行机体；或者是：上述疫苗被其它物质包裹或混合后进入机体。
具体实施方式
借助以下实施例对本发明作进一步描述。
下面这些实施例是示范性的，而不是限制性的，可根据上述发明的技术方案和试剂情况，来确定具体的实施方式。
一、小鼠SRY核酸疫苗的制备及免疫
1、材料与方法
菌株与质粒：大肠杆菌DH5α和HB101、质粒pVAX1和pSecTag为Invitrogen公司产品，pMD18-T质粒为Takara公司产品。
实验动物：6-8周龄的BALB/C小鼠，重18-20g，购自北京实验动物中心。
主要试剂：各种限制性内切酶、DNA修饰酶、mRNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自Takara公司，阳离子脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司，羊抗鼠IgG-HRP、BSA、SDS、ELISA板均购自华美公司。
2、表达载体pVAX-SRY的构建和鉴定
1)、获得SRY蛋白基因ORF的编码cDNA
mRNA提取：使雌性小鼠与雄性小鼠同笼，在交配后第11天将雌鼠拉颈处死，从子宫中冲出胚胎，收集胚胎并进行匀浆，然后按mRNA提取试剂盒操作要求进行操作，获得mRNA。
cDNA合成及扩增：设计以下引物(上游引物：5’atggagggccatgtcaagcgccccatgaatgcatt 3’，下游引物5’tcatgagactgccaaccacagggctgtgctgaggt 3’)，按RT-PCR试剂盒操作要求进行操作，获得长度为1188bp的SRY蛋白基因ORF的cDNA，并将其克隆到pMD18-T质粒中，得到克隆载体pMD-SRY。
2)、质粒pVAX-SRY的构建
酶切pMD-SRY：用内切酶Pst I和Xba I双酶切质粒pMD-SRY，分离并纯化SRY cDNA。
酶切pVAX1：用内切酶Pst I和Xba I双酶切质粒pVAX1并纯化。
连接反应：建立连接酶反应体系，将SRY cDNA克隆到质粒pVAX1中。
转化并筛选重组子：将重组子转化到感受态的E.coli DH5α中，用卡那霉素筛选获得阳性克隆，并进行酶切鉴定。
3、重组质粒pVAX-SRY在真核细胞中的瞬时表达
复苏Hela细胞，用RPM1640-20％FBS培养液传代培养，将细胞浓度调整为4×105/ml，将纯化好的质粒pVAX-SRY用脂质体转染法转染Hela细胞，更换培养液后继续培养32小时，然后收获细胞，按常规免疫印迹(Western blotting)法，观察是否表达了SRY蛋白。
4、SRY核酸疫苗的制备和动物免疫
按常规方法对含有质粒pVAX-SRY的菌株进行大量培养并提取质粒，溶入生理盐水中，测定OD260和OD280值，按1OD＝50μgDNA/ml进行计算，将质粒溶液浓度调定为1mg/ml。
将25只雌性BALB/C小鼠分为四组：pVAX1肌注组、pVAX-SRY肌注组、pVAX1阴道组、pVAX-SRY阴道组、阴性对照组，分别进行免疫，每组5只。其中对于肌注组，每次免疫前24小时在后腿股四头肌内注射0.25％普鲁卡因50μl，免疫时注射质粒溶液50μl，其后于初免后第3周和第7周各加强免疫一次。对于阴道组，免疫时向阴道内滴加质粒溶液50μl，其后于初免后第3周和第7周各加强免疫一次。对各组在免疫前及初次免疫后的第1、3、4、7、9周时由眼眶静脉采血分离血清，采用ELISA法检测血清抗SRY蛋白的效价。
5、生育实验及性别控制效果的验证
在各组鼠笼中分别放入一只成年雄鼠，检查雌鼠阴拴出现后移出雄鼠，待雌鼠生产后检查仔鼠性别，并与阴性对照组进行比较。
二、小鼠SRY蛋白疫苗的制备及免疫
1、SRY蛋白制备
1)、质粒pSecTag-SRY的构建
酶切pMD-SRY：用内切酶Ecor I和Not I双酶切质粒pMD-SRY，分离并纯化SRY cDNA。
酶切pVAX1：用内切酶Ecor I和Not I双酶切质粒pSecTag并纯化。
连接反应：建立连接酶反应体系，将SRY cDNA克隆到质粒pSecTag中。
转化并筛选重组子：将重组子转化到感受态的E.coli DH5α中，用氨苄青霉素筛选获得阳性克隆，并进行酶切鉴定。
2)、SRY蛋白的表达及回收和纯化
复苏SKBR-3细胞，经5代传代培养，将细胞浓度调整为2×106/ml，将纯化好的质粒pSecTag-SRY用脂质体转染法转染SKBR-3细胞，继续培养96小时，将培养液离心，回收上清，在高压液相层析(HPLC)上柱洗脱，收集47.5kDa蛋白峰。
2、动物免疫
1)将SRY蛋白与弗氏完全佐剂充分混合、乳化备用。
2)将15只雌性BALB/C小鼠分三两组：皮下注射组、阴道滴加组、阴性对照组，分别进行免疫，每组5只。两组都于初免后第3周和第7周各加强免疫一次。对各组在免疫前及初次免疫后的第1、3、4、7、9周时由眼眶静脉采血分离血清，采用ELISA法检测血清抗SRY抗体的效价。
3、生育实验及性别控制效果的验证
在各组鼠笼中分别放入一只成年雄鼠，检查雌鼠阴拴出现后移出雄鼠，待雌鼠生产后检查仔鼠性别，并与阴性对照组进行比较。

Claims (10)

1、一种基于SRY基因的哺乳动物生雌性控方法，其特征在于使用以SRY蛋白为靶抗原的疫苗免疫雌性动物：或以SRY蛋白为靶抗原对动物进行免疫，获得能特异识别SRY蛋白的免疫物质，在体外或体内处理胚胎。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于使用以SRY蛋白为靶抗原的核酸疫苗或蛋白质疫苗免疫动物；或制备抗SRY抗血清或抗SRY抗体或抗SRY单克隆抗体等免疫物质，将其加入胚胎培养液中作用于胚胎，或将其置入雌性动物子宫中作用于胚胎。
3、一种如权利要求1所述的对哺乳类动物进行性别控制的核酸疫苗，其特征在于该疫苗以真核表达载体为基本骨架，同时含有某种哺乳动物的SRY蛋白编码cDNA。
4、如权利要求3所述的核酸疫苗，其特征在于该核酸疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的DNA质粒。
5、如权利要求3或4所述的核酸疫苗，其特征在于该疫苗通过以下方法得到：通过分子克隆的方法获得某种哺乳动物的SRY cDNA，将其插入到真核表达质粒中得到重组质粒并转化到大肠杆菌中，用真核细胞瞬时表达的方法确认该重组质粒可以表达SRY蛋白，经大肠杆菌培养扩增后提取质粒，纯化后溶于生理盐水或含有不同佐剂的生理盐水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
6、一种如权利要求3或4或5所述的核酸疫苗的生产方法，其特征在于该生产方法是：通过分子克隆的方法获得某种哺乳动物的SRY cDNA，将其插入到真核表达质粒中得到重组质粒并转化到大肠杆菌中，用真核细胞瞬时表达的方法确认该重组质粒可以表达SRY蛋白，经大肠杆菌培养扩增后提取质粒，纯化后溶于生理盐水或含有不同佐剂的生理盐水中，得到所需要的SRY核酸疫苗。
7、一种如权利要求1所述的对哺乳类动物进行性别控制的蛋白疫苗，其特征在于该疫苗由纯化的某种哺乳动物的SRY蛋白与佐剂组成。
8、如权利要求7所述的蛋白疫苗，其特征在于该疫苗是人工合成的或者通过生物体生产而成的蛋白质。
9、如权利要求7或8所述的蛋白疫苗，其特征在于该疫苗通过以下方法之一得到：
方法一：通过分子克隆的方法获得某种哺乳动物的SRY cDNA，将其插入到原核或真核表达质粒中，将该重组质粒转化或转染到原核或真核细胞中，以细胞内或分泌的形式表达SRY蛋白，以生物化学的方法收集所表达的蛋白并进行纯化，然后溶于生理盐水或含有不同佐剂的生理盐水中，得到所需要的SRY蛋白疫苗。
方法二：用生物化学的方法从雄性哺乳动物组织中直接分离。
10、一种如权利要求3或4或5或6或7或8或9所述的疫苗的使用方法，其特征在于该使用方法是：以注射、喷射、口服的方式经鼻、眼、生殖道、肠道通过渗透、吸收、物理或化学介导的方法使上述疫苗进入机体；或者是：上述疫苗被其它物质包裹或混合后进入机体。
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