CN103153336B

CN103153336B - 用于控制外寄生物感染的疫苗组合物

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Publication number: CN103153336B
Application number: CN201180049619.6A
Authority: CN
Inventors: A·罗德里格斯马龙; E·费尔南德斯迪亚斯; M·P·埃斯特拉达加西亚; Y·卡普里奥冈萨雷斯
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2031-09-26
Also published as: AU2011307690A1; AU2011307690B2; MX2013003542A; PE20131363A1; WO2012041260A1; RU2013119630A; MX344598B; CA2818027A1; CU23919B1; BR112013007662A2; CN103153336A; CU20100188A7; EP2623114B1; CO6731074A2; CA2818027C; HUE028787T2; PT2623114T; CL2013000876A1; US20130273095A1; US9085634B2

Abstract

本发明涉及核糖体蛋白P0的肽在制备疫苗组合物中的用途，所述疫苗组合物用于控制外寄生物感染和因此其相关病原体的传播。所述肽位于蛋白P0的氨基酸267和301之间，并且可以通过重组方法或借助化学合成来获得。可以将所述肽融合至载体蛋白或肽，或者融合至免疫增强剂并包含在油性制剂中。包含所述肽的疫苗制剂赋予针对蜱和称为“海虱”的外寄生物的保护，而在宿主生物中不出现自身免疫的产生。在所述蜱中，可以提及微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）、血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）和肩突硬蜱（Ixodes scapularis）这些物种，和在所述海虱中，包括鱼虱属（Caligus）和疮痂鱼虱属（Lepeophtheirus）的那些。

Description

用于控制外寄生物感染的疫苗组合物

发明领域

本发明属于兽医学领域，特别地关于外寄生物感染和其相关病原体的传播的控制。所述控制通过在疫苗组合物的制备中使用核糖体蛋白P0的肽来实现。包含所述肽的疫苗制剂赋予保护，而在宿主生物中不出现自身免疫的产生。

现有技术

陆生吸血性外寄生物例如蚊子、跳蚤和蜱是传播引起疾病的传染因子的媒介。这些疾病中的一些直接影响人类和/或其情感寄托动物，而其他的则在农业领域中引起巨大的经济损失。由外寄生物传播的疾病的例子为疟疾、利什曼病、登革热、埃利希菌病和莱姆病。蜱被认为是第二的对于人类的疾病传播者，仅次于蚊子（Parola P.和RaoultD.,Clin.Microbiol.Infect.2001,7:80-83）。由蜱传播的血寄生虫感染在畜牧业中引起数十亿美元级别的年损失，其主要影响热带和亚热带地区中的牛生产。在这方面最重要的疾病之中，包括无形体病、巴贝虫病、莱姆病（由布氏疏螺旋体（Borrelia burdogferi）引起）和所谓的东海岸热（由小泰来虫（Theileria parva）引起）。

称为海虱的外寄生物（桡足纲（Copepoda），鱼虱科（Caligidae））是最近30年在鲑鱼业中最广泛分布的海洋病原体，其在最近15年扩展至其他养殖鱼类物种和鲑科的野生群体（Pike,A.W.和Wadsworth,S.L.,Advances in Parasitology2000,44:233-337；Ragias,V.等人,Aquaculture2004,242:727-733）。主要的经济损失由鱼虱属（Caligus）和疮痂鱼虱属（Lepeophtheirus）的生物造成。所谓的海虱可以在其宿主中引起生理学变化，包括形成应激反应、免疫功能下降、无法进行渗透调节和死亡，如果不对感染进行治疗（Johnson,S.C.等人,ZoolStudies2004,43:8-19）。还存在有一些证据暗示了，海虱可能是用于向鱼类传播由病毒和细菌产生的感染的媒介（Barker,E.D.等人,Parasitology Research2009,105:1173-1177）。

已使用了各种各样的化学试剂和药物来控制由蜱和海虱产生的感染。化学杀虫剂例如脒、有机磷酸盐、过氧化氢等的使用目前是用于控制这些外寄生物的基本措施。然而，这些物质的密集使用的缺点在于化学残留污染食品（鱼、肉和奶）、损害环境和外寄生物形成抗性（Shahein Y.E.,Vet.Immunol.and Immunopathol.2008,121:281-289；Denholm,I.Pest Manag Sci2002,58:528-536；Bravo,S.等人,Aquaculture2008,282:7-12；Lees等人,J.Fish Dis.2008,31:947-951）。

从其效力、环境安全和经济可持续性的观点来看，疫苗接种被认为是用于控制外寄生物感染的有希望的备选方案。已经用基于重组的蛋白Bm86的针对微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）的商业疫苗（TickGARD,Hoechst Animal Health,Australia；和GAVAC,由Heber Biotec,Cuba进行销售）证明了为此目的使用通过重组脱氧核糖核酸（DNA）技术产生的抗原的可行性。重组的蛋白Bm86在现场研究中具有有效的结果，当在综合防治计划中包括其应用时。在海虱的情况下，在使用蛋白质作为疫苗候选物方面存在有一些进展，正如Caligus rogercresseyi的akirin-2（其被命名为my32）的情况，并且进行了攻击试验，其中得到有希望的结果（专利申请WO2008/145074“Secuencias deácidos nucleicos y aminoácidos,y vacuna para elcontrol de infestaciones por ectoparásitos en peces”）。

对于增加这些疫苗的效力来说，新的保护性抗原的鉴定是限制性步骤。虽然近来已鉴定了新的蜱蛋白质并且已提出它们作为可能的保护性分子，但仅对其中有限数目的蛋白质作为通过重组方法产生的抗原在疫苗接种试验中进行了评价。在海虱（其是以食宿主的粘液、皮肤和血液为生并因此与宿主的免疫系统仅具有有限接触的外寄生物（Boxaspen,K.ICES Journal of Marine Science2006,63:1304-1316））的情况下，作为疫苗候选物，调查了在粘附和进食位点处抑制宿主的免疫应答的寄生虫免疫调节蛋白（Wikel,S.K.等人,"Arthropod modulation of host immune responses",The Immunologyof Host-Ectoparasitic Arthropod Relationships.编辑:Wikel,S.K.,CAB Int.,1996,第107-130页）。还研究了其他与卵黄原蛋白相似的分子和用于粘附至宿主的蛋白（Johnson,S.C.等人,Zool Studies2004,43:8-19；Boxaspen,K.ICES Journal of Marine Science2006,63:1304-1316），但是由于对于鲑鱼被海虱感染的机制和病理学知之甚少，鉴定出用于预防和治疗该感染的靶标还未获成功。无论如何，通过在免疫接种试验中评价不同疫苗候选物来进行的调查的结果已表明，参与不同生理过程的各种分子的联合使用是用于控制外寄生物感染的可行方法。

真核生物的核糖体由独个的核糖体核糖核酸（rRNA）分子和超过80种蛋白质（其组织成大亚基和小亚基）形成。大多数核糖体蛋白是碱性的（等电点（pI）>8.5），但是也存在有一组酸性蛋白质（pI=3.0-5.0），其在核糖体的大亚基中形成与茎类似的结构。由于其能够被磷酸化，因而这些酸性蛋白质被命名为蛋白P（P0、P1和P2），其在核糖体的翻译活性的调节中起着基本作用（Wojda I.等人,ActaBioch.Pol.2002,49:947-957）。蛋白P含有大约17个氨基酸的保守的C-末端区，其最后六个残基是高度保守的，这是它们之间以及与其他物种的蛋白P的交叉免疫反应性的基础。蛋白P0对于60S核糖体亚基的装配来说是极其重要的，其中P0与P1、P2、28S rRNA和因子eEF2直接结合。其的缺乏会导致产生缺少60S亚基的核糖体，后者对于蛋白质合成来说是无活性的，从而导致细胞死亡。

蛋白P是高度免疫原性的，并且由于其与自身免疫疾病和与癌发生的关联，已在人中广泛地进行了研究。核糖体蛋白的这些应用已经通过其各自作者的专利而得到了保护。特别地，核糖体蛋白P0是针对各种原生动物和细菌的有希望的疫苗候选物。作为重组抗原（要么使用完整的蛋白质，要么使用由最后11-16个氨基酸组成的C-末端区），或者通过针对鼠弓形体（Toxoplasma gondii）、犬新孢子虫（Neospora caninum）（Zhang H.等人,Mol.Biochem.Parasitol2007,153:141-148）、克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi）（Skeiky Y.A.等人,J.Immunol.1993,151:5504-5515）、婴儿利什曼原虫（Leishmaniainfantum）（Iborra S.等人,Infect.Immunol.2003,71:6562-6572和2005,72:5515-5521）以及各种巴贝虫属（Babesia）物种（Terkawi M.A.等人,Vaccine2007,25:2027-2035；Terkawi M.A.等人,Parasitol.Res.2007,102:35-40）和疟原虫属（Plasmodium）物种（Chatterjee S.等人,Infect.Immunol.2000,68:4312-4318；Rajeshwari K.等人,Infect.Immunol.2004,72:5515-5521）用裸DNA进行免疫接种，该蛋白质经证明是免疫原性的。在这些试验的大部分中所获得的免疫应答的特征在于：高滴度的特异性抗体的产生，该特异性抗体能够赋予针对感染的主动和被动的保护；T淋巴细胞的激活；和作为Th1型应答模式的一部分的γ干扰素（IFNγ）的产生。

其作为针对各种细菌和原生动物的免疫原的用途（没有关于在宿主中的自身免疫性质的反应的报道）归因于该蛋白质在这些微生物与哺乳动物之间相对较低的氨基酸序列同一性。最引人注目的情况是用由恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的核糖体蛋白P0的最后16个氨基酸组成的肽对小鼠进行免疫接种（Rajeshwari K.等人,Infect.Immunol.2004,72:5515-5521），该肽与小鼠中的该相同蛋白质的C-末端区具有68%的同一性。然而，该蛋白质或其C-末端区作为用于控制蜱和海虱感染的免疫原的用途受到在外寄生物与其宿主生物之间就该抗原而言存在的高氨基酸同一性程度的限制。

最近在长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）中用对于该蛋白质的表达的沉默来说特异的干扰RNA来进行的实验显示了在蜱的重量增益方面的显著减少，和由在唾液腺和角质层水平上的结构损害而引起的96%的死亡率；这暗示核糖体蛋白P0对于蜱和可能地其他外寄生物的血液摄取和生存力是必需的（Gong H.等人,Vet.Parasitol.2008,151:268-278）。然而，基于该抗原的疫苗候选物的开发的缺点在于在脊椎动物与外寄生物（例如蜱和海虱）的所报道的序列之间存在高同一性程度，该同一性在该蛋白质的C-末端区中是更高的，这可能导致宿主生物中耐受性的诱导或自身抗体应答的产生。

用于控制由蜱和海虱产生的感染的化学试剂和药物的密集使用的缺点在于化学残留污染食品、损害环境和外寄生物形成抗性。因此，疫苗接种被认为是有希望的备选方案，并且存在鉴定新的疫苗抗原的需要，所述新的疫苗抗原能够独自地赋予保护或者可以掺入到现有疫苗中。

发明说明

本发明通过提供用于控制外寄生物感染的疫苗组合物而解决了前面提及的问题，所述疫苗组合物包含所述外寄生物的核糖体蛋白P0的肽。首次，根据在本发明中所揭示的研究结果，所述组合物包含有在外寄生物和受其侵害的生物之间很少地保守的核糖体蛋白P0的免疫原性区域作为抗原。在核糖体蛋白P0中鉴定出的该区域包含在其氨基酸267和301之间。

蛋白P0在所有生物中作为对于细胞生存力来说极其重要的核糖体结构组分的存在，对于使用这些序列以便获得针对不同外寄生物物种的疫苗候选物来说是一种优势。然而，该蛋白质或其C-末端区作为用于控制蜱和海虱感染的免疫原的用途受到在外寄生物与其宿主生物之间就该抗原而言存在的高氨基酸同一性程度的限制。

通过鉴定出该蛋白质中高度免疫原性的区域（其与在这些组的生物之间具有低序列相似性的区域相一致），在本发明中首次成功避免了这种处境。通过生物信息学预测，证明该区域与该蛋白质的具有低疏水性和高可接近性程度的区域相一致，这使其成为高度可能被暴露的氨基酸序列。

从微小扇头蜱和血红扇头蜱（R.sanguineus）的幼虫以及Caligusrogercresseyi的成年海虱的总RNA开始，通过反转录产生互补DNA。从这些互补DNA和特异的寡核苷酸开始，通过聚合酶链反应（PCR）扩增出编码这些蜱（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）和该海虱的核糖体蛋白P0的核苷酸序列。

相应于外寄生物血红扇头蜱和微小扇头蜱的蛋白P0的多肽序列在它们之间是相同的，并且被指定为SEQ ID NO.3。该序列和C.rogercresseyi的P0的序列与其宿主生物的P0具有大于70%的序列同一性，其中对于构成被描述为该蛋白质中最具免疫原性的区域的C-末端区的最后16个氨基酸来说序列同一性更加高。在包含在氨基酸267和301之间的区域（SEQ ID NO.4，微小扇头蜱的蛋白P0中的相应肽[pP0]；SEQ ID NO.6，肩突硬蜱（Ixodes scapularis）的蛋白P0中的相应肽[pP0Is]；SEQ ID NO.8，克氏鱼虱（Caligus clemensi）的蛋白P0中的相应肽[pP0Cc]；SEQ ID NO.9，鲑疮痂鱼虱（L.salmonis）的蛋白P0中的相应肽[pP0Ls]；和SEQ ID NO.10，C.rogercresseyi的蛋白P0中的相应肽[pP0Cr]）中，在所有情况下都检测到具有较小氨基酸序列相似性的区域，其同时具有结果是暴露的和是免疫原性的可能性。

因此，在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物包含具有标识为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的氨基酸序列的肽，这些序列的片段，或者展示出与这些序列的至少70%同一性的肽或多肽。

本发明还涉及那些疫苗组合物，其中所指明的P0的肽与用于增加其免疫原性或增强其保护效应的其他分子相融合、相缀合或进行共施用。在这些分子中，包括载体蛋白和免疫增强剂。在本发明的一个实施方案中，所述分子选自由下列组成的组：血蓝蛋白、T细胞表位、形成病毒样颗粒的蛋白质、微小扇头蜱的蛋白Bm86、血红扇头蜱的蛋白Rs86和C.rogercresseyi或鲑疮痂鱼虱的蛋白my32。

具有35至36个氨基酸、标识为SEQ ID NO.4、6、9和10的肽，以及它们的具有20个氨基酸的片段，通过化学合成来获得，并将其缀合至大匙孔帽贝（Megathura crenulata）的血蓝蛋白（匙孔虫戚血蓝蛋白，KLH）以增强其免疫原性。用所述缀合物，采用在受控条件下的攻击进行了免疫接种实验，以便评价其保护能力。分别在兔和牛中针对血红扇头蜱和微小扇头蜱检验了肽pP0（SEQ ID NO.4），在兔中针对肩突硬蜱评价了pP0Is（SEQ ID NO.6）。至于肽pP0Ls和pP0Cr（分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10），分别针对鲑疮痂鱼虱和C.rogercresseyi进行了评价，两者都在大西洋鲑（Salmo salar）中。

用含有蛋白质缀合物（pP0-KLH）和佐剂Montanide888的疫苗制剂对兔和牛进行的免疫接种，在两种情况下都能够诱导强有力的针对该肽的特异性体液免疫应答。在所使用的实验动物中没有观察到自身免疫性质的应答出现的迹象，所述自身免疫性质的应答由针对肽pP0而产生的抗体对于这些哺乳动物的蛋白P0的识别和反应性引起。这通过在兔肾细胞系RK-13中的“体外”交叉反应性试验（其使用在小鼠中获得的针对该肽的超免疫血清）得到确认。用缀合物pP0-KLH进行的疫苗接种诱导出针对血红扇头蜱和微小扇头蜱的保护，其中在这两个蜱物种中都引起了结构损害和对于生物学参数的影响。此外，针对肩突硬蜱获得了类似的结果，在用与血蓝蛋白相缀合的该蜱的蛋白P0的合成肽（pP0Is）进行免疫接种后。

用缀合物pP0Ls-KLH和pP0Cr-KLH对鲑鱼进行的疫苗接种诱导出针对由这两个海虱物种引起的感染的保护，这通过“寄生虫数目/鱼”的显著降低而得到证明。此外，还进行了使用通过重组方法获得的pP0和pP0Cr的免疫接种实验，所述pP0和pP0Cr在同一个遗传构建物中融合至破伤风毒素和麻疹病毒融合蛋白（MVF）的T表位。作为用这些嵌合抗原进行的免疫接种实验的结果，对于海虱的情况，发现相比与KLH相缀合的抗原而言，与非种系选择性T表位相融合显著地改善了保护。还将pP0融合至兔出血病病毒（RHDV）的病毒样颗粒（VLP），并且进一步证明当将该肽融合至抗原Bm86时，该肽的保护效应得到增强。这可能归因于针对这两种免疫原所产生的抗体的联合效应，和/或归因于这样的事实，即在蜱的肠水平上由针对抗原Bm86的抗体所引起的结构损伤促进了针对核糖体蛋白P0的肽的特异性抗体的作用。至于pP0Cr，将其在另一个遗传构建物中融合至蛋白my32，并且在该情况下，获得了在对于C.rogercresseyi的伤害方面最突出的效应，据推测可能通过所述两种抗原的独个的特异性效应的增强。

以这种方式，在本发明中证明，基于肽pP0的疫苗组合物对于控制外寄生物（例如蜱和海虱）感染是有效的。因此，基于pP0的组合物对于控制与所述外寄生物相关的病原体的传播也是有用的。

该疫苗在药学上可接受的佐剂中包含免疫学有效量的抗原，借助于其可以控制这些病原体的感染。如已经表示的，该疫苗中的抗原由这些外寄生物的核糖体蛋白P0的肽构成，该肽包含在所述蛋白质的氨基酸267和301之间，其相应于在所述外寄生物的该蛋白质的氨基酸序列中与其各自宿主生物中该蛋白质的相同区域具有最小相似性的区域。所述肽通过重组方法或化学合成来获得。还可以通过重组方法来获得包含肽pP0的融合多肽。如该技术领域中的专业人员已知的，为了通过重组方法来获得所述抗原，可以使用在酵母、细菌、植物、昆虫幼虫、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的表达系统。

在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物另外可以包含疫苗佐剂。在本发明的背景下，评价了包含油性类型的佐剂的疫苗制剂。然而，作为佐剂，尤其可以使用铝盐、脂质体囊泡、与免疫系统有关的分子（例如细胞因子）。

可以以非常不同的方式来施用本发明的组合物。在本发明的一个实施方案中，通过注射来施用所述组合物。在另一个实施方案中，借助于饲料制剂来进行施用。在向鱼类施用所述组合物的情况下，可以借助于浸浴来施用这些组合物。

本发明的目标还为用于控制外寄生物感染的疫苗组合物，其包含编码所述外寄生物的核糖体蛋白P0的肽的核酸，该肽相应于该蛋白质的氨基酸267和301之间的区域；并且通过用裸DNA进行免疫接种而产生针对所述肽的免疫应答。在本发明的一个实施方案中，所述肽具有标识为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10的氨基酸序列，或者是这些序列的片段，或者是展示出与这些序列的至少70%同一性的肽或多肽。

此外，本发明还涉及包含在外寄生物的核糖体蛋白P0的氨基酸267和301之间的区域在制备用于控制由这些寄生虫引起的感染或与之相关的病原体的传播的疫苗组合物中的用途。在一个实施方案中，所述肽具有标识为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的氨基酸序列，或者是这些序列的片段，或者是展示出与这些序列的至少70%同一性的肽或多肽。

附图简述

图1.在微小扇头蜱和血红扇头蜱的核糖体蛋白P0中存在的氨基酸残基的可接近性程度的预测。相应于定义为SEQ ID NO.4的序列的区域用圆圈标出。

图2.通过ELISA来检测的抗-P0肽的特异性IgG抗体的应答，在用缀合物pP0-KLH进行免疫接种的BALB/c小鼠的血清中。数据表示为抗体平均滴度的倒数，所述抗体平均滴度被确定为具有大于阴性血清的光密度（OD）平均值的三倍数的OD平均值的最后血清稀释度。标准偏差通过正向的误差条来表示。在第0天，对于任何动物未检测到抗体滴度。

图3.用针对P0而在小鼠中产生的多克隆抗体，通过Western印迹法分析的在兔细胞系RK-13中扇头蜱属（Rhipicephalus）蜱的核糖体蛋白P0的表达图式。1.分子量标准；2.用质粒pAdTrack-P0Rs转染的RK-13细胞的裂解物，在还原条件下；3.用质粒pAdTrack-P0Rs转染的RK-13细胞的裂解物，在非还原条件下；4.未转染的RK-13细胞的裂解物，在还原条件下；5.用质粒pAdTrack-P0Rs转染的RK-13细胞的裂解物在还原条件下在十二烷基硫酸钠存在下在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳（SDS-PAGE）。

图4.通过ELISA来检测的抗-KLH、抗-P0肽和抗-Bm86的IgG抗体的应答，在用这些抗原进行免疫接种的兔的血清中（实施例6）。数据表示为抗体平均滴度的倒数，所述抗体平均滴度被确定为具有大于根据相应情况的阴性对照组的OD平均值的三倍数的OD平均值的最后血清稀释度。标准偏差通过正向的误差条来表示。在该试验的第0天，对于任何组未检测到针对所述抗原的特异性抗体滴度。

图5.在实施例6的经免疫接种的兔中血红扇头蜱的幼虫、若虫和成虫的回收率。数据表示为在不同实验组中回收的幼虫、若虫和成虫的百分比的平均值。组的标准偏差通过正向的误差条来表示。在该图中，用不同的字母指出了在实验组之间存在的统计学上显著的差异（ANOVA和Bonferroni多重比较检验[p<0.01]。为了该分析，事先将比率数据转换为其平方根的反正弦）。

图6.从在实施例6的不同实验组上饲养的幼虫开始，血红扇头蜱的刚蜕皮的若虫。(A)阴性对照组；(B)用Bm86进行免疫接种的组；(C)用缀合物pP0-KLH进行免疫接种的组；和(D)从在用pP0-KLH进行免疫接种的兔上饲养的幼虫开始，蜕皮的死亡若虫的外观。

图7.从在实施例6中进行免疫接种的兔上饲养的饱血雌蜱（teleoginas）开始，血红扇头蜱的卵孵化百分比。数据表示为平均值/组。每个组的标准偏差通过正向的误差条来表示。统计学上显著的差异通过星号来指示（ANOVA和Bonferroni多重比较检验（p<0.05））。

图8.相应于用与不同的免疫增强剂分子相融合的该肽的变体进行免疫接种的兔，抗-P0肽的IgG抗体的应答(A)，以及血红扇头蜱的幼虫、若虫和成虫的存活率(B)。标准偏差通过正向的误差条来表示。

图9.在巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）MP36株的破裂沉淀物中嵌合蛋白Bm86-pP0的表达图式的通过Western印迹法的分析，其中使用针对肽pP0(A)和针对蛋白Bm86(B)而产生的超免疫血清。对于这两种情况，泳道1.在还原条件下的破裂沉淀物，泳道2.在非还原条件下的破裂沉淀物，泳道3.通过用酶PNGase F进行消化而去糖基化的蛋白质。

图10.通过ELISA来检测的抗-P0肽和抗-Bm86的IgG抗体的应答，在独个地用这些抗原、联合地用这些抗原或者用嵌合蛋白Bm86-pP0进行免疫接种的牛的血清中。数据表示为抗体平均滴度的倒数，所述抗体平均滴度被确定为具有大于阴性对照组的OD平均值的三倍数的OD平均值的最后血清稀释度。标准偏差通过正向的误差条来表示。在该试验开始时，对于任何组未检测到抗体滴度。

图11.在实施例8中进行免疫接种的牛上饲养的微小扇头蜱的饱血雌蜱和卵的重量平均值。在该图中，通过不同的字母指出了在实验组之间存在的统计学上显著的差异，以及相对于阴性对照组而言实验组中的每一个组的统计学上显著的差异（ANOVA和Newman-Keuls多重比较检验[p<0.05]）。

图12.通过ELISA来检测的抗-pP0Is的IgG抗体的应答，在用该抗原进行免疫接种并随后用肩突硬蜱进行攻击的兔的血清中。数据表示为抗体平均滴度的倒数，所述抗体平均滴度被确定为具有大于阴性对照组的OD平均值的三倍数的OD平均值的最后血清稀释度。标准偏差通过正向的误差条来表示。在该试验的第0天，对于任何组未检测到抗体滴度。

图13.在用缀合物pP0Is-KLH进行免疫接种的兔中肩突硬蜱的生物学参数的表现。显示了幼虫的生存力以及若虫和成虫的回收率(A)，以及卵的孵化百分比(B)。数据表示为平均值/组。标准偏差通过正向的误差条来表示。在该图中，用星号来指出相比于阴性对照组而言存在的统计学上显著的差异（ANOVA和Bonferroni多重比较检验[p<0.05]）。

所提出的解决方案的优点：

在本发明中证明了疫苗制剂（其含有包含在不同外寄生物的核糖体蛋白P0的氨基酸267和301之间的肽）针对微小扇头蜱、血红扇头蜱和肩突硬蜱这些蜱以及称为海虱的外寄生物（鲑疮痂鱼虱和C.rogercresseyi）的保护能力，而没有与宿主生物的该蛋白质的交叉反应的出现。在所有免疫接种中，以与免疫增强剂分子相缀合或相融合的形式来施用pP0，以改善动物的免疫应答。在蜱的情况下，与蛋白Bm86相融合或与之相联合的该肽（或其片段）的应用诱导了比当独个地使用时由所述抗原所引起的那种更大程度的对于这些节肢动物的生存力和生物学参数的损害。因此，作为综合防治计划的一部分来应用该嵌合蛋白或者它们的联合，可以导致由这些或其他蜱物种引起的感染的更大的控制，以及由其传播的血寄生虫疾病的发病率的降低。在海虱的情况下，当将pP0Cr融合至非种系选择性T表位和蛋白my32时，观察到对于它们的最大损害。在大多数节肢动物物种与海虱之间所述肽的高氨基酸保守程度以及该序列与哺乳动物和鱼类的所述蛋白质的相应片段的低同一性，使得核糖体蛋白P0的该肽（或其片段）成为用于开发针对外寄生物的疫苗的抗原。

实施方式的详细描述/实施例

实施例1.编码微小扇头蜱、血红扇头蜱和C.rogercresseyi的核糖体蛋白P0的核苷酸序列的扩增和克隆

从微小扇头蜱和血红扇头蜱的幼虫以及C.rogercresseyi的成虫的总RNA开始，通过反转录反应获得互补DNA。所述反应遵照在“Reverse Transcription System”试剂盒（Promega,USA#A3500）中所描述的指导来进行。从所获得的互补DNA开始，通过聚合酶链反应（PCR）来扩增出编码微小扇头蜱和血红扇头蜱的核糖体蛋白P0的核苷酸序列（SEQ ID No.1和SEQ ID No.2）以及C.rogercresseyi的P0的序列。作为用于蜱的PCR的引物，使用从在Genebank基因库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）中对于长角血蜱的P0所报道的登录号为EU048401的核苷酸序列开始设计出的合成寡核苷酸：

“正向”寡核苷酸：

5'ATGGTCAGGGAGGACAAGACCACCTGG3'

“反向”寡核苷酸：

5'CTAGTCGAAGAGTCCGAAGCCCATGTCG3'。

作为用于从C.rogercresseyi的cDNA开始的扩增的引物，使用从在Genebank基因库中对于蜱（长角血蜱和肩突硬蜱）和昆虫（黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、五带淡色库蚊（Culex quinquefasciatus）和埃及伊蚊（Aedes aegypti））的不同物种的P0所报道的核苷酸序列开始设计出的简并合成寡核苷酸：

“正向”寡核苷酸：

F15'ATGGGCAAGAACAC(C/G)ATGAT(C/G)CGCAA(G/A)GC3'

F25'ATGG(T/G)(T/C)AGGGAG(G/A)ACAA(G/A)(A/G)C(C/A/T)

(G/A)C(C/G)TGGAA3'

“反向”寡核苷酸：

R15'TC(G/A)AA(A/C/G)AG(G/A/T)C(C/T)GAA(T/G/A)CCCAT(A/G)TC(A/G)TC3'。

作为与蜱的互补DNA的反应的结果，在两种情况下都获得了大约957bp的DNA条带，将其克隆入商业载体pGEM-Teasy（Promega,USA）中以对其进行测序。在从C.rogercresseyi的互补DNA开始进行PCR反应的情况下，对于寡核苷酸组合F1-R1，获得了大约780bp的DNA条带，和对于寡核苷酸组合F2-R1，获得了大约960bp的条带。在这两种情况下，将所述条带克隆入商业载体pGEM-TEasy（Promega,USA）中以对其进行测序。

实施例2.生物信息学分析

通过使用程序BlastX和ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/）来进行氨基酸序列同一性的分析。从由蜱的互补DNA扩增出的DNA序列开始推导出的具有318个氨基酸的序列在它们之间是相同的（SEQ IDNO.3），并且相对于长角血蜱和肩突硬蜱的核糖体蛋白P0的序列（Genebank，登录号DQ066213）而言，分别具有95%和93%的同一性。该序列还分别与从包括在彩饰花蜱（Amblyoma variegatum）的数据库的TC533中的部分阅读框开始推导出的多肽序列具有96%的同一性，和与从在非洲扇头蜱（R.appendiculatus）和微小扇头蜱的ESTs数据库的TC1424和TC9038中所包含的两个开放阅读框开始推导出的多肽序列具有99%的同一性（http://compbio.dfci.harvard.edu/index. html）。

相应于血红扇头蜱和微小扇头蜱的蛋白P0的多肽序列（被命名为SEQ ID NO.3）还与牛的P0（家牛（Bos taurus），Genebank登录号AAX09097）具有70%的序列同一性，其中对于构成被描述为该蛋白质中最具免疫原性的区域的C-末端区的最后16个氨基酸来说具有87%的序列同一性。该序列还与犬的蛋白P0（家犬（Canisfamiliaris），Genebank登录号XM535894）具有71%的序列同一性。

在从C.rogercresseyi的互补DNA序列开始推导出的P0的氨基酸序列的情况下，观察到与对于其他海虱物种（例如克氏鱼虱和鲑疮痂鱼虱）所报道的序列的高同一性百分比。像在蜱和其宿主的情况下一样，在海虱的P0与大西洋鲑的P0（Genebank登录号ACI70184）之间存在高的序列同一性。

在这些外寄生物的P0与其宿主生物的P0之间存在的高序列同一性使得使用该分子作为用于控制其感染的疫苗抗原是非常危险的，因为可能产生针对宿主的该蛋白质的自身免疫。对于使用在所有这些生物中高度保守的C-末端区（最后11-16个氨基酸）来说，该危险性增加。

与哺乳动物的蛋白P0的序列具有较小序列相似性的所述两个蜱物种的蛋白P0的区域包含在氨基酸267和301之间（SEQ ID NO.4）。通过使用在网站http://www.ca.expasy.org/sprot/中所包括的生物信息学工具，证实所述蛋白质的该区域与具有低疏水性的区域相一致，其高度可能在所述蛋白质中被暴露（图1）。随后，评价了该肽的免疫原性能力以及其作为用于控制由这些或其他蜱物种引起的感染的疫苗抗原的效用。

通过翻译编码Caligus rogercresseyi的蛋白P0的克隆出的基因的序列，在包含在氨基酸267和301之间的相同区域中鉴定出与大西洋鲑的P0具有低同源性的类似的肽（SEQ ID NO.10，pP0Cr）。此外，还在对于克氏鱼虱（Genebank登录号ACO14779）和鲑疮痂鱼虱（Genebank，登录号ACO12290）所报道的蛋白P0中鉴定出具有较低氨基酸相似性的相同区域（SEQ ID NO.8和9，pP0Cc和pP0Ls）。

实施例3.肽的合成和与KLH的缀合

通过化学合成来获得定义为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10的肽以及所述肽的具有20个氨基酸的片段，并且通过使用HPLC系统的反相色谱法（反相高压液相色谱法）进行纯化。获得了15毫克的每种合成肽，具有99.3%的纯度。通过质谱法验证了每种肽的分子质量。

为了增强所述肽的免疫原性能力，将其与蛋白KLH相融合。通过可溶性碳二亚胺方法来进行所述合成肽与KLH的缀合。它们的连接通过使用琥珀酸酐作为间隔试剂来进行。缀合物的分开通过凝胶过滤层析来进行。通过双金鸡宁酸方法来估计每种缀合物的最终浓度。

实施例4.针对微小扇头蜱和血红扇头蜱的核糖体蛋白P0的肽（pP0）的小鼠超免疫血清的获得

使用六只体重为18至22g的六周龄的雄性Balb/c小鼠，它们在第0、14、21和28天通过皮下途径用250μg的在弗氏佐剂中的缀合物pP0-KLH（等价于125μg肽和125μg KLH）进行免疫接种。在第0、7、14、21、40和65天进行血液抽取。在第65天对动物进行放血，并且通过在3500rpm下离心10分钟来获得血清。

通过间接ELISA来监测抗体动力学。为了包被平板，使用1μg/孔的pP0，并且用稀释度为1:15000的与辣根过氧化物酶相缀合的抗-小鼠IgG来进行检测。使用含有在0.1M柠檬酸、0.2M NaH₂PO₄（pH5.0）和0.015%过氧化氢中的0.4mg/mL邻苯二胺的底物溶液来进行揭示。用2.5M H₂SO₄来终止反应。抗体滴度被建立为最大稀释度的倒数，在该最大稀释度下，所考虑的血清的OD的平均值为阴性对照血清的OD的平均值的三倍。

从该实验的第14天开始，经免疫接种的动物显示出针对所述肽的特异性抗体的滴度，其在第65天对于所述动物中的两只达到了1:10240（图2）。在表达和“体外”交叉反应性试验中，使用包含等量的从六只用缀合物pP0-KLH进行免疫接种的小鼠获得的超免疫血清的混合物作为多克隆抗体。

实施例5.扇头蜱属蜱的核糖体蛋白P0在细胞系RK-13中的表达以及“体外”交叉反应性试验

将编码血红扇头蜱的核糖体蛋白P0的DNA序列（SEQ ID NO.2）克隆到质粒pAdTrack-CMV（9.2kb）中，在人巨细胞病毒的即时/早期启动子/增强子（pCMVITh）和猿猴空泡病毒SV40的晚期终止/多腺苷酸化信号的控制之下。该载体在其序列中包含编码绿色荧光蛋白（GFP）的报道基因和赋予对于卡那霉素的抗性的基因（He T.C.等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1998,95:2509-2514）。使用所得到的质粒转染兔肾细胞系RK-13。按照制造商的指导，使用lipofectamine（Invitrogen,USA）来进行所述转染。在24小时后，通过在光学显微镜下（使用紫外光和40X的放大倍数）观察GFP的表达来验证转染效率。

在48小时后，进行细胞裂解，并且使所获得的细胞提取物经历在10%聚丙烯酰胺凝胶上的电泳（SDS-PAGE），其中使用还原和变性条件，根据Laemmli（Laemmli U.K.,Nature1970,227:680-685）所描述的技术。

使用在小鼠中获得的针对所述肽的多克隆血清（稀释度1:3000）作为一抗和使用与过氧化物酶相缀合的抗-小鼠IgG（以稀释度1:10000）作为二抗，通过Western印迹法来分析扇头蜱属蜱的核糖体蛋白P0的表达图式（图3）。在相应于用所述质粒转染的细胞的样品中，检测到大约35kDa的具有对于蛋白P0所预期的大小的单一条带。在非还原条件下进行走样的样品中类似条带的存在表明，该肽在所述蛋白质的三维结构中是暴露的。在相应于阴性对照样品（未转染的兔细胞RK-13）的泳道中未检测到任何条带，这表明在小鼠中针对扇头蜱属蜱的蛋白P0的具有35个氨基酸的肽而产生的抗体不能识别在兔的蛋白P0中的相应肽，从而证明在蜱的该免疫原性肽与兔的核糖体蛋白P0中的相应肽之间不存在交叉反应性。

实施例6.扇头蜱属蜱的肽pP0的免疫原性以及其针对血红扇头蜱感染的保护能力的测定

进行评价微小扇头蜱和血红扇头蜱的核糖体蛋白P0的肽作为针对血红扇头蜱的疫苗抗原的效用。为此，将20只体重超过2.5kg的12至14周龄的雄性白色新西兰兔随机分成三个实验组，其中对于pP0-KLH组和Bm86组，每组7只兔子，和对于用KLH进行免疫接种的阴性对照组，每组6只兔子。将包含在1X PBS中的免疫原佐以Montanide888VG（制备成在矿物油中10%），以60/40的免疫原/佐剂比例。如下来分配实验组：

组1：在第0、21、36和60天，以500μg/动物（等价于250μg肽/动物）的剂量用缀合物pP0-KLH通过皮下途径进行免疫接种；

组2（阴性对照）：在第0、21、36和60天，以250μg/动物的剂量用KLH通过皮下途径进行免疫接种；

组3（阳性对照）：在第0和28天，以100μg/动物的剂量用微小扇头蜱的蛋白Bm86通过皮下途径进行免疫接种。

该试验持续120天的时间。在第0、14、21、28、36、59、73和87天，在动物中取血清样品以测量抗体应答。在整个试验期间每天观察动物的一般行为和体温。在该实验的第72天，放置三个小室/动物，并且在第73天，用血红扇头蜱的大约250只幼虫、100只若虫和50只新成虫（20只雄蜱和30只雌蜱）感染每只动物。在第75和120天之间，进行蜱的收集、计数、称重和蜕皮分析。将收集的幼虫和若虫维持在处于28℃的培养箱中，具有80%的相对湿度和12:12小时（光照:黑暗）的光周期。在相同条件下将饱血雌蜱（吸饱血的雌蜱）维持在固定不动的独个塑料平板中直至产卵。

在任何动物中没有观察到正常行为的改变，也没有观察到发热。通过与前面所描述的类似的间接ELISA研究了针对所述免疫原中的每一种所产生的体液应答，其中用1μg/孔的每种抗原来包被平板，并且在该情况下使用以1:10000稀释度的与过氧化物酶相缀合的抗-兔IgG抗体（SIGMA）。从每个组中的独个值来确定抗体滴度的平均值。针对Bm86的特异性滴度仅在用Bm86进行免疫接种的组3的动物中获得。针对P0的肽（pP0）的特异性滴度仅在用缀合物pP0-KLH进行免疫接种的动物的组1中获得，而针对KLH的特异性滴度在用缀合物pP0-KLH和用单独的KLH进行免疫接种的组1和组2中获得（图4）。

为了研究所述免疫原对于血红扇头蜱的效应，分析了其各种生物学参数的表现。在幼虫、若虫和成虫中，分析了平均进食时间和回收率。在幼虫和若虫的情况下，还分析了蜕皮和所获得的后期蜱感染首次用于实验的动物的能力。在成虫的情况下，还研究了吸饱血的雌蜱的重量、卵的重量和孵化百分比。根据先前所描述的（Bennett G.F.等人,Acarologia1974,16:52-61）来计算至卵的转化效率指数，例如转化成卵的雌蜱的重量百分比。一般地，用Bm86进行免疫接种的组的幼虫、若虫和新成虫比在对照动物和用P0肽进行疫苗接种的动物上的相同阶段蜱花费更多的时间来进食。通过ANOVA和Bonferroni多重比较检验（p<0.01）比较了所述三个组之间幼虫、若虫和新成虫的回收率值。在幼虫和若虫的情况下，作为相对于幼虫和蜕皮的若虫的量而言能够感染首次用于实验的动物的下一阶段蜱的最终量，分析了存活率或生存力。对于新成虫，作为在温育后能够存活且具有产卵能力的蜱的最终数目，测量了存活率。幼虫回收率的平均值在实验组之间未显示出统计学上显著的差异。在若虫回收率的情况下，尽管有回收到更少的在用pP0-KLH和用Bm86进行免疫接种的组上饲养的若虫的倾向，但相对于用KLH进行免疫接种的对照组而言不存在统计学上显著的差异。在成虫的情况下，关于用抗原pP0进行疫苗接种的组，回收率显示出相对于阴性对照组和用Bm86进行疫苗接种的组而言统计学上显著的差异（图5）。

相对于在对照组上所收集的而言，观察到在从在用所述两种抗原进行疫苗接种的组中饲养的幼虫开始的刚蜕皮的若虫的生存力和外观方面的严重损害。在用pP0-KLH进行疫苗接种的组中，观察到刚蜕皮的若虫（其具有明显的形态学损害）的高死亡率，相对于阴性对照组和用Bm86进行疫苗接种的组而言，在用pP0-KLH进行疫苗接种的组中存在有该参数的统计学上显著的差异。还有在用Bm86进行疫苗接种的组和阴性对照组之间在生存力方面的显著差异（图6）。在表1中显示了每个实验组中的死亡率百分比。

表1.从在所述三个实验组中饲养的幼虫开始的刚蜕皮的若虫的死亡率百分比。不同的字母意味着经转换的数据的通过ANOVA和随后的Bonferroni多重比较检验（P<0.001）而获得的统计学上显著的差异。

阶段	死亡率（%）
		pP0-KLH	77.70^b
KLH	13.45^a
		Bm86	44.70^c

通过用每个组的回收的、蜕皮的且活的样本感染首次用于实验的犬来测定来自实验组的刚蜕皮的若虫和新成虫以及刚孵出的幼虫感染新动物的能力。关于该参数，在实验组之间未发现统计学上显著的差异。

通过ANOVA和Bonferroni多重比较检验（p<0.05）来进行饱血雌蜱和卵的重量数据的统计学分析。对于这两个参数，在实验组之间没有发现显著差异。至卵的转化效率指数在疫苗接种组和对照组之间也不具有显著差异。在这一点上，应当强调，10%的在用pP0-KLH进行免疫接种的兔上饲养的新成虫未产卵，相对于在用KLH进行免疫接种的对照组中3%未产卵和在用Bm86进行免疫接种的兔上饲养的组中6%未产卵而言。相对于用KLH进行免疫接种的对照组而言，在用pP0-KLH进行免疫接种的组中观察到在卵孵化百分比（%）方面的统计学上显著的差异（p<0.01）（图7）。虽然在用Bm86进行免疫接种的组中具有比阴性对照组低的孵化百分比，但是从统计学观点来看，这些差异不是显著的。从所述三个实验组的卵孵化出的幼虫能够感染犬并且正常地进食。

通过用pP0的具有20个氨基酸的片段对兔进行免疫接种而实施了实验，其中具有与在本实施例中前面所描述的那些类似的结果。所评价的肽具有下列氨基酸序列：AAGGGAAAAKPEESKKEEAK、EYLKDPSKFAAAAAPAAGGG和FAAAAAPAAGGGAAAAKPEE。将所述肽缀合至KLH。用相应于pP0的最后20个氨基酸的肽获得了最好的结果。

实施例7.与不同的免疫增强剂分子相融合的微小扇头蜱和血红扇头蜱的pP0的免疫原性的测定

在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的破裂上清液中以高表达水平获得了RHDV（AST/89株）的衣壳蛋白VP60。通过重组方法获得的该蛋白质形成具有高分子量的多聚体，其具有与天然病毒颗粒类似的抗原性和结构特征（Farnós O.等人,Antiv.Res.2009,81:25-36）。为了利用这些病毒样颗粒（VLP）的高免疫原性能力，产生了重组DNA构建物以获得暴露在RHDV的VLP表面上的pP0。为此，将编码所述肽的SEQ ID No.4的从位置15至位置35的20aa的片段（AAGGGAAAAKPEESKKEEAK）的核苷酸序列插入到质粒pNAOVP60中，在蛋白VP60的基因的突出结构域的位置处。该构建物允许，pP0以融合至VP60的C-末端（其是在VLP装配后暴露在外的区域）的方式进行表达。将所获得的重组质粒用于转化巴斯德毕赤酵母的MP36株。以350mg/L的水平，在破裂上清液中以可溶的形式获得蛋白VP60pP0。C-末端区域的暴露和VLP的形成通过“夹心”ELISA来进行验证，其中使用抗-RHDV的超免疫血清以及单克隆抗体6H6和1H8（由Istituto Zooprofilattico Sperimentale dellaLombardia,Brescia,Italia的Dr.Lorenzo Capucci惠赠），其分别识别在蛋白VP60的C-末端区域中和在病毒颗粒或经正确装配的VLP中存在的表位（Capucci L.等人,Virus.Res.1995,37:221-238）。在TSK-G3000PW柱中通过HPLC来纯化VP60pP0的VLP，以大约50%的纯度获得。

用与数种非种系选择性T细胞表位相偶联的P0的22aa的相同肽来实现另一种重组构建物。特别地，使用了破伤风类毒素的ttP2表位和麻疹病毒的T细胞表位（TT-MVF）。将数个拷贝的22aa的pP0（AAGGGAAAAKPEESKKEEAK）和非种系选择性T抗原（其与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的内含肽相融合）的DNA序列插入到质粒pTBY12中，在T7启动子和lac操纵子的阻抑物（其允许仅在用IPTG进行诱导后该融合蛋白才表达）的控制之下。将所获得的重组质粒用于转化大肠杆菌（E.coli）的ER2566株。通过抗-pP0的小鼠多克隆血清，在该菌株的破裂上清液中检测到嵌合肽TT-MVF-pP0-内含肽。表达水平据估计在大约100mg/L培养物。该肽在壳多糖柱上通过亲和性来进行纯化，并且在硫醇基团存在下自身消化以释放出目的肽。

在兔中进行免疫接种实验，以评价所获得的嵌合变体的免疫原性能力和所产生的抗体对于血红扇头蜱的幼虫、若虫和新成虫的效应，相比于与血蓝蛋白相缀合的核糖体蛋白P0的合成肽的效应而言。为此，将28只雄性白色新西兰兔随机分成4个组，每组7只动物。给所述免疫原佐以Montanide888VG，并且以下列方式来进行施用：

组1：以500μg/动物（等价于250μg肽/动物）的剂量用缀合物pP0-KLH通过皮下途径进行免疫接种；

组2（阴性对照）：以250μg/动物的剂量用KLH通过皮下途径进行免疫接种；

组3：以等价于250μg蛋白质/动物的剂量用VLPsVP60pP0通过皮下途径进行免疫接种；

组4：以等价于250μg肽/动物的剂量用嵌合肽TT-MVF-pP0通过皮下途径进行免疫接种。

该试验持续90天的时间。在第0、21和36天对动物进行免疫接种。血清的抽取、抗体滴度的测定以及蜱的感染和收集，以与实施例6中所描述的类似的方式来进行。

对于统计学分析，使蜱的回收率和生存力的值经历方差分析（ANOVA）和Bonferroni多重比较检验。从免疫接种后第14天开始，在用嵌合体VLPsVP60pP0进行疫苗接种的动物中检测到最大的抗-P0肽的抗体的滴度。对于嵌合变体VLPsVP60pP0来说从第21天开始，和对于用嵌合体TT-MVF-pP0进行免疫接种的动物来说从第28天开始，这些抗体达到高于1:5000的滴度。这些滴度一直保持，直至实验结束（图8A）。

对于用P0的肽的嵌合变体进行疫苗接种的组，幼虫的生存力以及若虫和新成虫的回收率的平均值显示出显著差异（p<0.05），相对于用KLH进行免疫接种的阴性对照组而言（图8B）。在表2中，显示了在幼虫生存力百分比方面以及在若虫和成虫回收率百分比方面，实验组相对于阴性对照组而言的降低。

表2.相对于用KLH进行免疫接种的对照组而言，每个阶段的蜱的回收率百分比的降低

阶段	pP0-KLH（%）	TT-MVF-pP0（%）	VLPsVP60pP0（%）
				幼虫	30.00	28.00	34.00
若虫	38.00	16.00	42.00
				成虫	36.67	30.00	36.67

实施例8.相对于pP0而言，嵌合蛋白Bm86-pP0针对微小扇头蜱感染的保护能力的测定

先前在巴斯德毕赤酵母的MP36株中表达出了微小扇头蜱的抗原Bm86（Valle M.R.等人,J.Biotech.1994,33:135-146）。在该构建物中，去除了相应于信号肽和相应于该蛋白质的跨膜区的基因片段（SEQID NO.5）。对于嵌合蛋白Bm86-pP0的构建，将上面所描述的蛋白Bm86的核苷酸序列紧接着酿酒酵母的蔗糖转化酶的分泌信号（ssSUC2）插入到质粒pPS10中，在AOX1启动子的控制之下。将编码微小扇头蜱的核糖体蛋白P0的具有35个氨基酸的肽的DNA序列融合至Bm86的该序列。用所得到的质粒来转化巴斯德毕赤酵母的MP36株，并且通过组氨酸营养缺陷的逆转来选择转化体。在细胞培养物中达到3至4的OD后，用甲醇来诱导所获得的克隆。在诱导96小时后，通过Western印迹法来进行表达分析，其中使用抗-pP0的小鼠超免疫血清（在实施例4中提及的）和抗-Bm86的多克隆抗体（图9A和9B）。在细胞破裂沉淀物中以300mg/L的水平检测到该重组蛋白。在所述分析中，观察到100kDa的条带，其相应于糖基化蛋白质，它在用酶PNGase F进行消化后降至大约70kDa的条带，这与对于该蛋白质所预期的大小相一致。在非还原条件下进行分析的样品之中未观察到任何条带，这暗示了多聚体结构的形成，这样的多聚体结构不能进入聚丙烯酰胺凝胶中。通过电子显微术验证了在破裂沉淀物中这些具有高分子量的蛋白质聚集体的存在。通过酸沉淀法来纯化该嵌合蛋白，以大约95%的纯度获得。

在牛中进行了免疫接种试验，其中比较了与KLH相缀合的pP0、蛋白Bm86、嵌合蛋白Bm86-pP0以及抗原pP0_KLH与Bm86的共施用（作为疫苗候选物）对于微小扇头蜱的效应。为此，将20头体重大于240kg的、没有蜱的牛随机分成五个实验组，每组4只动物。在Montanide888VG（制备成在矿物油中10%）中，以60/40的水相/油相比例，施用所述免疫原。实验组如下来进行设计：

组1：按照0、4和7周的方案，以500μg缀合物/动物（等价于250μg肽/动物）的剂量用缀合物pP0-KLH通过肌内途径进行免疫接种；

组2（阴性对照）：按照0、4和7周的方案，以250μg/动物的剂量用KLH通过肌内途径进行免疫接种；

组3（阳性对照）：按照0、4和7周的方案，以250μg/动物的剂量用微小扇头蜱的蛋白Bm86通过肌内途径进行免疫接种；

组4：按照0、4和7周的方案，以250μg/动物的剂量用嵌合蛋白Bm86-pP0通过肌内途径进行免疫接种；

组5：按照0、4和7周的方案，以250μg Bm86/动物和500μg缀合物/动物的剂量用蛋白Bm86和缀合物pP0-KLH通过肌内途径进行免疫接种。

该试验持续140天的总时间。在第0、14、28、49、70、82、120和140天，在动物中取血清样品以测量抗体应答。在该实验的第82天，放置四个小室/动物，并且在第84和86天之间，按每天4000只幼虫，用3000只微小扇头蜱幼虫/小室（12000只幼虫/动物）进行感染。在第107和117天之间，进行蜱的收集、计数和称重。将饱血雌蜱（吸饱血的雌蜱）维持在独个塑料平板中，具有28℃、90%的相对湿度和12小时光照的光周期。

通过ELISA来研究抗-pP0和抗-Bm86的抗体的动力学，在该情况下使用以1:10000稀释度的缀合物抗-牛-过氧化物酶（SIGMA）。在所有用这些抗原进行免疫接种的动物中，从第14天开始，检测到针对Bm86和针对pP0的特异性IgG抗体应答。对于Bm86在第28天后和对于P0肽的情况在第60和90天之间，这些抗体达到高于1:5000的滴度，这些一直保持直至实验结束。在用这两种抗原分开地或联合地进行接种的组之间，或者相对于用嵌合体Bm86-pP0进行疫苗接种的组而言，对于抗-Bm86或抗-pP0的抗体的滴度均未发现统计学上显著的差异（图10）。

分析了所产生的抗体对于微小扇头蜱的回收率、饱血雌蜱和卵的重量以及孵化百分比的效应。相对于该实验的阴性对照组而言，在所有疫苗接种组中，饱血雌蜱的回收率显著地降低。相对于阴性对照组而言，对于用Bm86进行免疫接种的组，蜱的回收率的降低为32.6%，对于用pP0-KLH进行免疫接种的组，蜱的回收率的降低为55.2%，对于用所述两种独个抗原进行免疫接种的组，蜱的回收率的降低为62.13%，和对于用嵌合体Bm86-pP0进行免疫接种的组，蜱的回收率的降低为65.2%。对于用嵌合体Bm86-pP0进行免疫接种的组和用Bm86和pP0-KLH的联合进行免疫接种的组，该参数显著地更小，相对于其中这些抗原独个地进行应用的组而言。相对于用所述两种抗原的联合进行免疫接种的组而言，用所述嵌合体进行免疫接种的组不具有显著差异。饱血雌蜱的重量和卵的重量这些参数在用Bm86进行免疫接种的组中显示出显著的损害，相对于阴性对照而言（ANOVA和Newman-Keuls多重比较检验[p<0.05]）。对于在用嵌合体Bm86-pP0和用所述抗原的联合进行免疫接种的组中观察到这些生物学参数的显著降低，相对于用独个所述抗原进行疫苗接种的组而言（图11）。在阴性对照组中卵的孵化百分比为87.4%，而对于用Bm86、pP0-KLH、Bm86与pP0-KLH的联合和嵌合体Bm86-pP0进行免疫接种的组，卵的孵化百分比分别为75.1%、64.6%、54.8%和55.9%，这显示了相对于对照而言在所有这些组中的显著降低。这些结果证明，用包含作为本发明目标的核糖体蛋白P0的肽（其融合至蛋白Bm86或者与之相联合）的制剂进行疫苗接种引起在微小扇头蜱的存活率和生物学参数方面的更大损害，这导致对于由该蜱引起的感染的更有效的控制。

实施例9.肩突硬蜱的蛋白P0的肽（pP0Is）针对肩突硬蜱感染的保护能力的测定

进行评价包含在肩突硬蜱的核糖体蛋白P0的氨基酸267-302之间的肽的免疫原性能力，该肽与微小扇头蜱和血红扇头蜱的蛋白P0的免疫原性肽同源。这些肽彼此之间具有68%的序列同一性。肩突硬蜱的该肽的化学合成和与血蓝蛋白KLH的缀合以与实施例3中所描述的类似的方式来进行。随后，将12只雄性白色新西兰兔随机分成两个实验组，每组六只兔子，对它们进行免疫接种并用肩突硬蜱的幼虫、若虫和新成虫进行攻击。将所述免疫原佐以Montanide888VG（以60/40的免疫原/佐剂比例），并且如下进行应用：

组1：以500μg/动物（等价于250μg肽/动物）的剂量用缀合物pP0Is-KLH通过皮下途径进行免疫接种；

组2（阴性对照）：以250μg/动物的剂量用KLH通过皮下途径进行免疫接种。

在第0、21和36天，对这两个组进行免疫接种。在从开始该实验起的第0、14、21、28、36和60天，进行血清抽取。抗-P0肽的抗体的滴度的测定以及蜱的感染、收集、计数和维持以与实施例6中所描述的类似的方式来进行。

在任何动物中没有观察到正常行为的改变，也没有观察到发热。从免疫接种后第14天开始，在用缀合物pP0Is-KLH进行免疫接种的动物中检测到抗-pP0Is抗体的滴度。在第36天，这些抗体达到高于1:3500的滴度，这些一直保持直至实验结束（图12）。

在168小时之时，已经收集到这两个组的所有饲养阶段。通过ANOVA和Bonferroni多重比较检验（p<0.05），在所述组之间比较了被用于感染动物的蜱的所有阶段的回收率和生存力、饱血雌蜱和卵的重量以及卵的孵化率的%。在用缀合物pP0Is-KLH进行疫苗接种的组中若虫和饱血雌蜱的回收率显示出统计学上显著的差异，相对于阴性对照组而言。显示出饲养的刚蜕皮的幼虫的高死亡率，在所述组之间具有统计学上显著的差异（图13A）。饱血雌蜱和卵的重量不具有统计学上显著的差异。至卵的转化效率指数在阴性对照组中为45.49%，和在用缀合物pP0Is-KLH进行免疫接种的组中为40.19%；并且卵的孵化百分比对于阴性对照为95.20%，和对于用所述缀合物进行免疫接种的组为83.10%。当进行统计学分析时，后一个参数是显著的（图13B）。

实施例10.鲑疮痂鱼虱的pP0（pP0Ls）的保护能力的测定

为了评价pP0Ls作为疫苗抗原的效用，将80条平均重量为80g的鲑鱼分成4组，每组20条鱼。将两组用在油性佐剂Montanide888中配制的缀合物P0Ls-KLH，以10μg缀合物/g鲑鱼体重（等价于5μgpP0Ls/g鲑鱼重量）的剂量，通过腹膜内途径（i.p.）进行注射。其他两组为用5μg KLH/g体重（佐以Montanide888）进行免疫接种的阴性对照。在经过500个任意热单位后，使鲑鱼适应海水，并且用2000±200只桡足幼体/池进行感染。攻击在黑暗条件、恒定通气、支持性供氧、控制温度（15-17℃）和盐度（大约30ppm）下施行。为了避免桡足幼体的损失和促进其附着，使池中的水流保持关闭并且每48小时进行人工更换；此外，还在排水管中安装220μ的滤网。将放入桡足幼体的时刻定义为第0天。这些条件自攻击开始起保持40天。

在40天时，通过麻醉过量来处死这些鱼，并且通过寄生虫计数来进行结果的评价。表3中给出的结果显示了在用pP0Ls-KLH进行疫苗接种的组中寄生虫数目/鱼的显著降低，相比于仅用KLH进行疫苗接种的阴性对照而言。

表3.在攻击实验结束时寄生虫计数的结果

参数	疫苗接种组1	疫苗接种组2	对照1	对照2
					寄生虫数目/鱼	15±6^a	16±6^a	38±9^b	37±10^b
鱼的存活率（%）	95	90	95	85
					感染的抑制（%）	60	56	-	-

不同的字母指明了统计学上显著的差异。应用了Dunn多重比较检验（p<0.001）。

以相同的方式，进行了具有与在本实施例中所描述的结果类似的结果的实验，但是用肽pP0Ls的具有20个氨基酸的片段对鲑鱼进行免疫接种。所评价的肽分别具有序列PAAGATKAAAAAPAKADEPE、SKFASVAAAPAAGATKAAAA和EYLADPSKFASVAAAPAAGA，并且缀合至KLH。尽管所有肽都赋予了保护，但用相应于pP0Ls的最后20个氨基酸的肽获得了最好的结果。

实施例11.与非种系选择性T表位相融合的C.rogercresseyi的蛋白P0的肽（pP0Cr）和缀合物pP0Cr-KLH的保护能力的测定

评价了缀合物pP0Cr-KLH和与其他免疫增强剂分子（例如非种系选择性T表位）相融合的pP0Cr的免疫原性能力。在该情况下，同样使用了破伤风类毒素的ttP2表位和麻疹病毒的T细胞表位（TT-MVF）。在用下述质粒转化的巴斯德毕赤酵母的MP36株的培养物上清液中检测到嵌合肽TT-MVF-pP0Cr，所述质粒包含一个拷贝的pP0Cr（在其N-末端与两个拷贝的非种系选择性T表位相融合）的编码序列，其在醇氧化酶1（AOX1）启动子的控制之下，它们之前为酿酒酵母的蔗糖转化酶的分泌信号（ssSUC2）。表达水平据估计在大约150mg/L培养物。

进行评价通过重组方法获得的该多肽作为疫苗抗原的效用，并且将其与缀合物pP0Cr-KLH的效应进行比较。为此，将120条平均重量为80g的鲑鱼分成6组，每组20条鱼。所述实验组为：

组1和2：以10μg/g体重（等价于5μg pP0Cr/g重量）的剂量，用缀合物pP0Cr-KLH通过腹膜内途径进行注射；

组3和4：以5μg/g重量的剂量，用KLH通过腹膜内途径进行注射；

组5和6：以5μg/g重量的剂量，用嵌合蛋白TT-MVF-pP0Cr通过腹膜内途径进行注射。

在所有情况下，将所述免疫原在油性佐剂Montanide888中进行配制。实验程序与实施例10类似，只是在该情况下，作为海虱，C.rogercresseyi具有更短的生活史，在24天时（在完成该寄生虫的两个生活史后），通过麻醉过量来杀死这些鱼，并且通过寄生虫计数来进行结果的评价。在下表中给出了结果，其显示了在用pP0Cr-KLH和TT-MVF-pP0Cr进行疫苗接种的组中寄生虫数目/鱼的显著降低，相比于仅用KLH进行疫苗接种的阴性对照而言。在TT-MVF-pP0Cr组中观察到最好的保护，其以寄生虫数目/鱼进行评价。

表4.在攻击实验结束时寄生虫计数的结果

参数	组1	组2	组3	组4	组5	组6
							寄生虫数目/鱼	21±7^a	19±6^a	48±10^b	47±8^b	14±3^c	13±2^c
鱼的存活率（%）	90	85	95	85	95	90
							感染的抑制（%）	55	60	-	-	70	72

实施例12.与多肽my32相融合的pP0Cr的免疫原性的测定

为了评价与先前已知的抗原my32相融合的pP0Cr的免疫原性能力，通过使用在前面的实施例中对于所有融合蛋白所描述的相同程序，产生了嵌合肽my32-pP0Cr。在该情况下，用其转化巴斯德毕赤酵母的MP36株的质粒包含一个拷贝的通过其N-末端与一个拷贝的my32相融合的pP0Cr，其在AOX1启动子的控制之下，它们之前为分泌信号ssSUC2。在培养物上清液中以大约135mg/L培养物的浓度检测到嵌合肽my32-pP0Cr。

为了评价通过重组方法获得的该多肽作为疫苗抗原的效用，将160条平均重量为80g的鲑鱼分成若干组，每组20条鱼。所述实验组为：

组1和2：以10μg/g体重（等价于5μg pP0Cr/g重量）的剂量，用缀合物pP0Cr-KLH进行注射；

组3和4：以5μg/g体重的剂量，用KLH进行注射；

组5和6：以5μg/g重量的剂量，用嵌合蛋白my32-pP0Cr进行注射；

组7和8：以5μg/g重量的剂量，用通过重组方法获得的蛋白my32进行注射。

所有动物通过腹膜内途径接受佐以Montanide888的所述免疫原。所遵循的实验程序与实施例11相同。在表5中给出了在攻击后24天时进行取样的结果，其显示了在用pP0Cr-KLH、my32-pP0Cr和my32进行疫苗接种的组中寄生虫数目/鱼的显著降低，相比于仅用KLH进行接种的动物而言。在my32-pP0Cr组中观察到最好的保护，其以寄生虫数目/鱼进行评价。

表5.在攻击实验结束时寄生虫计数的结果

参数	组1	组2	组3	组4	组5	组6	组7	组8
									寄生虫数目/鱼	17±7^a	15±6^a	30±9^b	31±8^b	3±1^c	4±2^c	15±3^a	14±6^a
鱼的存活率（%）	85	95	95	85	90	95	95	85
									感染的抑制（%）	43	50	-	-	90	87	50	53

Claims

1.用于控制外寄生物感染或与之相关的病原体的传播的疫苗组合物，其包含所述外寄生物的核糖体蛋白P0的肽，该肽相应于该蛋白质的氨基酸267和301之间的区域，其中所述外寄生物为蜱或海虱，并且其中所述肽由下列组成：标识为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的氨基酸序列，或者由AAGGGAAAAKPEESKKEEAK、EYLKDPSKFAAAAAPAAGGG、FAAAAAPAAGGGAAAAKPEE、PAAGATKAAAAAPAKADEPE、SKFASVAAAPAAGATKAAAA或EYLADPSKFASVAAAPAAGA构成的片段。

2.根据权利要求1的组合物，其中将所述肽与用于增加其免疫原性或增强其保护效应的其他分子相融合、相缀合或进行共施用。

3.根据权利要求2的组合物，其中所述分子选自由下列组成的组：血蓝蛋白、来自破伤风毒素或麻疹病毒融合蛋白的T细胞表位、形成兔出血病病毒的病毒样颗粒的蛋白质、微小扇头蜱的蛋白Bm86、血红扇头蜱的蛋白Rs86和C.rogercresseyi或鲑疮痂鱼虱的蛋白my32。

4.根据权利要求1的组合物，其中所述肽通过重组方法或化学合成来获得。

5.根据权利要求4的组合物，其中通过重组方法的所述肽的获得借助于在酵母、细菌、植物、昆虫幼虫、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的表达系统来实现。

6.根据权利要求1的组合物，其另外还包含疫苗佐剂。

7.根据权利要求1的组合物，其特征在于，所述组合物通过下列方式来进行施用：通过在0.001-25μg肽/g经疫苗接种的动物的体重这样的范围内实施注射；借助于在0.01-300μg肽/g饲料这样的范围内的饲料制剂；或者借助于在0.01-10mg肽/L水这样的范围内的用于鱼类的浸浴。

8.用于控制外寄生物感染或与之相关的病原体的传播的疫苗组合物，其包含编码所述外寄生物的核糖体蛋白P0的肽的核酸，该肽相应于该蛋白质的氨基酸267和301之间的区域；并且通过用裸DNA进行免疫接种而产生针对所述肽的免疫应答；其中所述外寄生物为蜱或海虱，并且所述肽由下列组成：标识为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的氨基酸序列，或者由AAGGGAAAAKPEESKKEEAK、EYLKDPSKFAAAAAPAAGGG、FAAAAAPAAGGGAAAAKPEE、PAAGATKAAAAAPAKADEPE、SKFASVAAAPAAGATKAAAA或EYLADPSKFASVAAAPAAGA构成的片段。

9.外寄生物的核糖体蛋白P0的肽在制备用于控制外寄生物感染或与之相关的病原体的传播的疫苗组合物中的用途，该肽相应于该蛋白质的氨基酸267和301之间的区域，其中所述外寄生物为蜱或海虱，并且所述肽由下列组成：标识为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.9或SEQ ID NO.10的氨基酸序列，或者由AAGGGAAAAKPEESKKEEAK、EYLKDPSKFAAAAAPAAGGG、FAAAAAPAAGGGAAAAKPEE、PAAGATKAAAAAPAKADEPE、SKFASVAAAPAAGATKAAAA或EYLADPSKFASVAAAPAAGA构成的片段。

10.根据权利要求9的用途，其中所述疫苗组合物通过下列方式来进行施用：通过在0.001-25μg肽/g经疫苗接种的动物的体重这样的范围内实施注射；借助于在0.01-300μg肽/g饲料这样的范围内的饲料制剂；或者借助于在0.01-10mg肽/L水这样的范围内的用于鱼类的浸浴。