BR112013007662B1 - Composições imunogênicas para o controle de infestações por ectoparasitas, uso de ácidos nucleicos naked que codificam um polipeptídeo da proteína ribossômica po dos ectoparasitas e uso do referido polipeptídeo - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE VACINA PARA O CONTROLE DE INFESTAÇÕES POR ECTOPARASITAS. A presente invenção refere-se ao uso de um peptídeo da proteína ribossômica P0 na produção de uma composição de vacina para o controle de infestações por ectoparasitas e, por conseguinte, da transmissão de seus patógenos associados. O referido peptídeo fica localizado entre os aminoácidos 267 e 301 da proteína PO, e pode ser obtido por via recombinante ou mediante sintase química. O referido peptídeo pode ser fundido a uma proteína ou peptídeo portador, ou a um imunopotencializador e ser incluído em uma formulação oleosa. As formulações de vacina que compreendem o referido peptídeo conferem proteção contra os carrapatos e os ectoparasitas conhecidos como "piolhos do mar', sem que ocorra geração de autoimunidade no organismo hospedeiro. Entre os referidos carrapatos podemos mencionar as espécies Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus sangineus e Ixodes scapularis, e entre os piolhos do mar encontram-se aqueles dos gêneros Caligus e Lepeophtheirus.

Description

Campo da técnica

[0001] A presente invenção encontra-se no campo da medicina veterinária, em particular com o controle de infestações por ectoparasitas e da transmissão de seus patógenos associados. O referido controle é obtido mediante o uso de um peptídeo da proteína ribossômica PO na produção de composições de vacina. As formulações de vacina que compreendem o referido peptídeo conferem proteção sem que ocorra geração de autoimunidade no organismo hospedeiro.

Estado da técnica anterior

[0002] Os ectoparasitas hematófagos terrestres tais como mosquitos, pulgas e carrapatos constituem vetores para a transmissão de agentes infecciosos causadores de doenças. Algumas dessas doenças afetam diretamente o ser humano e/ou seus animais de estimação, enquanto que outras são a causa de grandes perdas econômicas na esfera agropecuária. Exemplos de doenças que são transmitidas por ectoparasitas são a malária, a leishmaniose, a dengue, a erliquiose e a doença de Lyme. Os carrapatos são considerados os segundos transmissores de doenças para os humanos, logo atrás dos mosquitos (Parola P. e Raoult D.; Clin. Microbiol. Infect. 2001, 7: 80-83). As infecções hemoparasitárias transmitidas por carrapatos causam prejuízos anuais da ordem de bilhões de dólares americanos na indústria pecuária, afetando fundamental mente a produção bovina nas áreas tropicais e subtropicais. Entre as doenças de maior relevância neste sentido encontram-se a anaplasmose, a babesiose, a doença de Lyme (produzida por Borrelia burdogferi) e a chamada febre da Costa Este (produzida por Theileria parva).

[0003] Os ectoparasitas conhecidos como piolhos do mar (Copepoda, Caligidae) constituem o patógeno marinho que mais se expandiu nos últimos 30 anos na indústria salmoneira, tendo se estendido nos últimos 15 anos a outras espécies de peixes em cultivo e a populações selvagens de salmonídeos (Pike, A.W. e Wadsworth, S.L. Advances in Parasitology 2000, 44:233-337, Ragias, V. et al. Aquaculture 2004, 242: 727-733). Os maiores prejuízos econômicos são causados pelos organismos dos gêneros Caligus e Lepeophtheirus. Os chamados piolhos do mar podem causar alterações fisiológicas em seus hospedeiros, que incluem o desenvolvimento de uma resposta de estresse, a redução das funções imunológicas, falha na osmorregulação e morte, se a infecção não for tratada (Johnson, S.C., et al. Zool Studies 2004, 43: 8-19). Existem ainda algumas evidências que sugerem que os piolhos do mar poderiam constituir vetores para a transmissão de infecções produzidas por vírus e bactérias aos peixes (Barker, E.D., et al. Parasitology Research 2009, 105: 1173-1177).

[0004] Uma ampla variedade de agentes químicos e fármacos vêm sendo utilizados para controlar as infestações produzidas por carrapatos e piolhos do mar. O uso de pesticidas químicos como amidinas, organofosforados, peróxido de hidrogênio e outros representa atualmente a medida fundamental para o controle destes ectoparasitas. Não obstante, o uso intensivo destes apresenta como inconvenientes a contaminação dos alimentos (peixes, carne e leite) com resíduos químicos, afetação do meio ambiente e o desenvolvimento de resistência por parte dos ectoparasitas (Shahein Y. E. Vet Immunol, and Immunopathol. 2008, 121 : 281-289, Denholm, I. Pest Manag Sci 2002, 58: 528-536; Bravo, S. et al. Aquaculture 2008, 282: 7-12; Lees et al. J. Fish Dis. 2008, 31 : 947-951).

[0005] A vacinação é considerada uma alternativa promissora para o controle de infestações por ectoparasitas do ponto de vista de sua eficácia, segurança ambiental e sustentabilidade econômica. A viabilidade do uso de antígenos produzidos por técnicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante com este propósito já foi demostrado com as vacinas comerciais contra o carrapato Rhipicephalus microplus, baseadas na proteína Bm86 recombinante (TickGARD, de Hoechst Animal Health, Austrália; e GAVAC, comercializada por Heber Biotec, Cuba). Esta última mostrou-se eficaz em estudos de campo quando sua aplicação se encontra incluída dentro de um programa de controle integrado. No caso piolho do mar existem alguns avanços no uso de proteínas como candidatos a vacinas, como é o caso da akirin-2 de Caligus rogercresseyi, que foi denominada my32, e a realização de ensaios de desafio com resultados promissores (Pedido de Patente W02008/145074 "Secuencias de ácidos nucleicos e aminoácidos, e vacuna para el control de infestaciones por ectoparásitos en peces").

[0006] A identificação de novos antígenos protetores representa a etapa limitativa para aumentar a eficácia destas vacinas. Embora novas proteínas de carrapatos tenham sido identificadas recentemente, e tenham sido propostas como possíveis moléculas protetoras, apenas um número limitado das mesmas foi avaliado como antígenos produzidos por via recombinante em ensaios de vacinação. No caso dos piolhos do mar, que são ectoparasitas que se alimentam de muco, pele e sangue do hospedeiro e, portanto, fazem um contato apenas limitado com o sistema imunológico do mesmo (Boxaspen, K. ICES Journal of Marine Science 2006, 63: 1304-1316), foram investigadas, como candidatos a vacinas, proteínas imunomoduladoras do parasita que suprimem a resposta imunológica do hospedeiro no sítio de adesão e alimentação (Wikel, S. K. et al., "Arthropod modulation of host immune responses". In: The Immunology of Host-Ectoparasitic Arthropod Relationships. Editors: Wikel, S. K., CAB Int., 1996, pás. 107-130). Também foram estudadas outras moléculas semelhantes à vitelogenina e proteínas de adesão ao hospedeiro (Johnson, S.C. et al. Zool Studies 2004, 43: 8-19; Boxaspen, K. ICES Journal of Marine Science 2006, 63: 1304-1316), porém devido ao pouco conhecimento dos mecanismos e da patologia da infestação dos salmões pelo piolho do mar, a identificação de brancos para a prevenção e o tratamento desta infestação ainda não obteve êxito. De qualquer forma, os resultados das investigações realizadas na avaliação de diferentes candidatos à vacina em ensaios de imunização demostraram que o uso combinado de várias moléculas, envolvidas em diferentes processos fisiológicos, constitui um método viável para controlar as infestações por ectoparasitas.

[0007] Os ribossomas eucarióticos são compostos por moléculas individuais de ácido ribonucleico ribossômico (rRNA) e mais de 80 proteínas organizadas dentro das subunidades maior e menor. A maioria das proteínas ribossômicas são básicas (ponto isoelétrico (pl)>8,5), mas além delas existe um grupo de proteínas ácidas (pl=3, 0- 5,0) que formam uma estrutura similar a um talo na subunidade maior do ribossoma. Estas proteínas ácidas são chamadas de proteínas P (P0, P1 e P2), devido a sua capacidade de ser fosforiladas, as quais desempenham um papel fundamental na regulação da atividade transducional dos ribossomas (Wojda I. et al. Acta Bioch. Pol. 2002, 49: 947-957). As proteínas P contêm uma região C-terminal conservada, de aproximadamente 17 aminoácidos, cujos últimos seis resíduos se encontram altamente conservados, o que constitui a base da reatividade imunológica cruzada entre elas e com as proteínas P de outras espécies. A proteína PO é fundamental para a montagem da subunidade ribossômica 60S, em que ela se une diretamente a P1, P2, ao rRNA 28S e ao fator eEF2. Sua ausência leva à produção de ribossomas deficientes da subunidade 60S, os quais são inativos para a síntese de proteínas, resultando na morte celular.

[0008] As proteínas P são altamente imunogênicas, e foram estudadas extensamente em humanos, devido a sua associação com doenças autoimunes e com a carcinogênese. Estas aplicações das proteínas ribossômicas foram protegidas por patentes por seus respectivos autores. A proteína ribossômica PO, em particular, representa um candidato a vacina promissor contra vários protozoários e bactérias. A proteína se mostrou imunogênica como antígeno recombinante (seja empregando a proteína completa ou a região C- terminal que consiste nos últimos 11-16 aminoácidos) ou mediante a imunização com DNA desnudo, contra Toxoplasma gondi-i, Neospora caninum (Zhang H. et al. Mol. Biochem. Parasitol 2007, 153: 141-148), Trypanosoma cruzi (Skeiky Y. A. et al. J. Immunol. 1993, 151 : 5504- 5515), Leishmania infantum (Iborra S. et al.; Infect. Immunol. 2003, 71 : 6562-6572 e 2005, 72: 5515-5521) e várias espécies de Babesia (Terkawi M. A. et al.; Vaccine 2007, 25: 2027-2035; Terkawi M. A. et al. Parasitol. Res. 2007, 102: 35-40) e Plasmodium (Chatterjee S. et al. Infect. Immunol. 2000, 68: 4312-4318; Rajeshwari K. et al. Infect. Immunol. 2004, 72: 5515-5521). A resposta imunológica obtida na maioria dessas experiências caracterizou-se pela produção de altos títulos de anticorpos específicos, capazes de conferir proteção de forma ativa e passiva contra a infecção, a ativação de linfócitos Tea produção de interferon gama (IFNy) como parte de um padrão de resposta do tipo Th1.

[0009] Seu uso como imunógeno contra várias bactérias e protozooários, sem relato de reações de naturais autoimunes no hospedeiro, deveu-se à relativamente baixa identidade de sequência aminoacídica desta proteína entre esses micro-organismos e os mamíferos. O caso que mais chamou atenção foi a imunização de camundongos com um peptídeo consistente nos últimos 16 aminoácidos da proteína ribossômica PO de Plasmodium falciparum (Rajeshwari K. et al.; Infect. Immunol. 2004, 72: 5515-5521), o que representa uma identidade de 68% com a região C-terminal desta mesma proteína em camundongos. No entanto, o uso desta proteína, ou da região C-terminal da mesma, como imunógeno para o controle de infestações por carrapatos e piolhos do mar é limitado pelo alto grau de identidade aminoacídica existente para este antígeno entre os ectoparasitas e seus organismos hospedeiros.

[00010] Experiências realizadas recentemente com RNA de interferência específico para o silenciamento da expressão desta proteína no carrapato Haemaphysalis longicornis mostraram uma diminuição considerável no ganho de peso dos carrapatos, e uma mortalidade de 96%, provocada por afetações estruturais no nível da glândula salivar e cutícula; o que sugere que a proteína ribossômica P0 é necessária para a ingestão de sangue e a viabilidade dos carrapatos e, possivelmente, de outros ectoparasitas (Gong H. et al. Vet. Parasitol. 2008, 151 : 268-278). Não obstante, o desenvolvimento de um candidato à vacina baseado neste antígeno tem como inconvenientes o alto grau de identidade existente entre as sequências reportadas de vertebrados e ectoparasitas como carrapatos e piolhos do mar, a qual é superior na região C-terminal da proteína, o que pode trazer como consequência a indução de tolerância ou a criação de uma resposta de autoanticorpos no organismo hospedeiro.

[00011] O uso intensivo de agentes químicos e fármacos para controlar as infestações produzidas por carrapatos e piolhos do mar tem como inconvenientes a contaminação dos alimentos com resíduos químicos, a afetação do meio ambiente e o desenvolvimento de resistência por parte dos ectoparasitas. Por isso, a vacinação é considerada uma alternativa promissora e existe a necessidade de identificar novos antígenos para vacina que sejam capazes de conferir proteção por si sós ou que possam ser incorporados às vacinas existentes.

Explicação da invenção

[00012] A presente invenção resolve o problema acima mencionado ao fornecer uma composição de vacina para o controle de infestações por ectoparasitas que compreende um peptídeo da proteína ribossômica PO dos referidos ectoparasitas. A referida composição compreende, como antígeno, uma região imunogênica da proteína ribossômica PO que é pouco conservada entre os ectoparasitas e os organismos afetados pelos mesmos, de acordo com os resultados de um estudo que é revelado nesta invenção, pela primeira vez. A região identificada dentro da proteína ribossômica PO está compreendida entre os aminoácidos 267 e 301 da mesma. A presença da proteína PO em todos os organismos, como um componente estrutural dos ribossomas que é fundamental para a viabilidade celular, representa uma vantagem para uso destas sequências com o objetivo de obter candidatos a vacina contra diferentes espécies de ectoparasitas. No entanto, o uso desta proteína, ou da região C-terminal da mesma, como imunógeno para o controle de infestações por carrapatos e piolhos do mar é limitado pelo alto grau de identidade aminoacídica existente para este antígeno entre os ectoparasitas e seus organismos hospedeiros.

[00013] Nesta invenção é possível escapar desta situação, pela primeira vez, ao identificar regiões altamente imunogênicas dentro da proteína, que coincidem com zonas de baixa semelhança de sequência entre esses grupos de organismos. Mediante predições bioinformáticas, foi comprovado que esta região coincide com uma zona de baixa hidrofobicidade e de alto grau de acessibilidade da proteína, que a converte em uma sequência aminoacídica com altas probabilidades de encontrar-se exposta.

[00014] A partir de RN A total de larvas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e R. sanguineus, e de piolhos do mar adultos da espécie Caligus rogercresseyi foram gerados DNAs complementares por transcrição reversa. As sequências nucleotídicas que codificam para a proteína ribossômica PO desses carrapatos (SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2) e desse piolho do mar foram amplificadas por reação em cadeia de polimerase (do inglês Polymerase Chain Reaction, abreviado PCR), a partir desses DNAs complementares e oligonucleotídeos específicos.

[00015] As sequências polipeptídicas correspondentes às proteínas P0 dos ectoparasitas R. sanguineus e R. microplus foram idênticas entre si, e foram designadas como SEQ ID N° 3. Esta sequência e aquela da P0 de C. rogercresseyi apresentaram uma identidade de sequência maior que 70% com a P0 de seus organismos hospedeiros, sendo ainda maior para os últimos 16 aminoácidos que compõem a região C-terminal, descrita como a zona mais imunogênica dentro da proteína. A zona de menor semelhança na sequência aminoacídica, que por sua vez tem possibilidades de ficar exposta e de ser imunogênica, foi detectada em todos os casos na região compreendida entre os aminoácidos 267 e 301 (SEQ ID N° 4, peptídeo correspondente na proteína P0 de Rhipicephalus microplus [pPO]; SEQ ID N° 6, peptídeo correspondente na proteína P0 de Ixodes scapularis [pPOIs]; SEQ ID N° 8, peptídeo correspondente na proteína P0 de Caligus clemensi j[pPOCc], SEQ ID N° 9, peptídeo correspondente na proteína P0 de L. salmonis_[pPOLs] e SEQ ID N° 10, peptide correspondente na proteína PO de C. rogercresseyi [pPOCr]).

[00016] Portanto, em uma modalidade da invenção, a composição de vacina compreende um peptídeo com uma sequência aminoacídica identificada como SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 10, um fragmento das referidas sequências, ou um peptídeo ou polipeptídeo que exibe pelo menos uma identidade de 70 % com as referidas sequências.

[00017] A presente invenção refere-se também a composições de vacina nas quais o peptídeo de P0 indicado é fundido, conjugado ou coadministrado com outra molécula, para aumentar sua imunogenicidade ou potencializar seu efeito protetor. Entre as referidas moléculas encontram-se proteínas portadoras e imunopotencializadoras. Em uma modalidade da invenção, a referida molécula é selecionada do grupo composto por hemocianina, os epítopos de células T, as proteínas que formam partículas semelhantes a vírus, a proteína Bm86 do carrapato R. microplus, a proteína Rs86 do carrapato R. sanguineus e a proteína my32 piolho do mar C. rogercresseyi ou L. salmonis.

[00018] Os peptídeos identificados como SEQ ID N° 4, 6, 9 e 10, de entre 35 e 36 aminoácidos, e fragmentos desses 20 aminoácidos, foram obtidos por síntese química e foram conjugados com hemocianina (do inglês Keyhole Limpet Hemocyanin, abreviado KLH) de Megathura crenulata, para potencializar sua imunogenicidade. Com os conjugados foram realizadas experiências de imunização, com desafio em condições controladas, para avaliar suas capacidades protetora. O peptídeo pPO (SEQ ID N° 4) foi testado contra R. sanguineus e R. microplus em coelhos e bovinos, respectivamente, o pPOIs (SEQ ID N° 6) foi avaliado contra /. scapularis em coelhos. Por sua vez, os peptídeos pPOLs e pPOCr (SEQ ID N° 9 e SEQ ID N° 10, respectivamente) foram avaliados contra L. salmonis e C. rogercresseyi, respectivamente, ambos em Salmo salar.

[00019] A imunização de coelhos e bovinos com a formulação de vacina que contém o conjugado proteico (pPO-KLH) e o adjuvante Montanide 888 foi capaz de induzir em ambos casos uma potente resposta imune humoral específica contra o peptídeo. Não foram observados indícios da ocorrência de uma resposta de natureza autoimune nos animais experimentais utilizados, que fosse provocada pelo reconhecimento e pela reatividade da proteína PO desses mamíferos por parte dos anticorpos gerados contra o peptídeo pPO. Isto foi confirmado por um ensaio de reatividade cruzada "in vitro"na linhagem celular de rim de coelho RK-13, empregando um soro hiperimune contra o peptídeo obtido em camundongos. A vacinação com o conjugado pPO-KLH induziu proteção contra as infestações por R. sanguineus e R. microplus, provocando afetações estruturais e dos parâmetros biológicos em ambas as espécies de carrapatos. Além disso, foram obtidos resultados similares contra o carrapato /. scapularis depois da imunização com o peptídeo sintético da proteína PO deste carrapato (pPOIs) conjugado com hemocianina.

[00020] A vacinação de salmões com os conjugados pPOLs-KLH e pPOCr-KLH induziu proteção contra as infestações por ambas as espécies de piolhos do mar, evidenciado em uma diminuição significativa do número de parasitas por peixe. Além disso, foram ainda realizadas experiências de imunização com o pPO e o pPOCr obtidos por via recombinante, fundidos aos epítopos T da toxina tetânica e da proteína de fusão do vírus do sarampo (do inglês Measles Virus Fusion protein, abreviado MVF) em uma mesma construção genética. Como resultado das experiências de imunização com esses antígenos quiméricos, no caso do piolho do mar, foi constatado que a fusão aos epítopos T promíscuos melhora significativamente a proteção, em comparação com o antígeno conjugado com KLH. O pPO também foi fundido a partículas semelhantes a vírus (do inglês Virus-like Particles, abreviado VLPs) do vírus da doença hemorrágica do coelho (do inglês Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, abreviado RHDV), e foi ainda constatado que quando o peptídeo se funde ao antígeno Bm86, o efeito protetor do peptídeo é potencializado. Isto pode ser devido ao efeito combinado dos anticorpos produzidos contra ambos os imunógenos, e/ou ao fato de que o dano estrutural provocado pelos anticorpos dirigidos contra o antígeno Bm86, no nível do intestino dos carrapatos favorece a ação dos anticorpos específicos contra o peptídeo da proteína ribossômica PO. Por sua vez, o pPOCr foi fundido à proteína my32 em outra construção genética, e neste caso foram obtidos os efeitos mais relevantes nos danos ao C. rogercresseyi, presumivelmente pela potencialização do efeito específico individual dos dois antígenos.

[00021] Desta forma, na invenção foi demonstrado que as composições de vacina à base do peptídeo pPO são eficazes para o controle de infestações por ectoparasitas, como os carrapatos e os piolhos do mar. Portanto, as composições à base de pPO são úteis também para o controle da transmissão dos patógenos associados aos referidos ectoparasitas.

[00022] Esta vacina compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno em um adjuvante farmaceuticamente aceitável, por meio da qual é possível controlar as infestações por esses patógenos. Como já mencionado, o antígeno nesta vacina consiste em um peptídeo da proteína ribossômica P0 desses ectoparasitas, compreendido entre os aminoácidos 267 e 301 da referida proteína, que corresponde à zona de menor semelhança na sequência aminoacídica da proteína dos ectoparasitas com a mesma região da proteína em seus respectivos organismos hospedeiros. O referido peptídeo é obtido por via recombinante ou por síntese química. Também é possível obter por via recombinante os polipeptídeos fundidos que compreendem o peptídeo pPO. Como sabem os especialistas neste campo da técnica, para a obtenção dos referidos antígenos por via recombinante, pode-se empregar um sistema de expressão em leveduras, bactérias, plantas, larvas de insetos, células de insetos ou células de mamíferos.

[00023] Em uma modalidade da invenção, as composições de vacina podem compreender, adicionalmente, um adjuvante de vacina. No contexto da invenção, foram avaliadas formulações de vacina que compreendem um adjuvante de tipo oleoso. No entanto, como adjuvantes podemos empregar sais de alumínio, vesículas lipossômicas, moléculas relacionadas com o sistema imune como as citocinas, entre outros.

[00024] As composições da invenção podem ser administradas de formas muito diversas. Em uma modalidade da invenção, a composição é administrada por injeção. Em uma outra modalidade, a composição é administrada por meio de formulações de ração. No caso em que as composições são administradas a peixes é possível aplicar as mesmas por meio de banhos de imersão.

[00025] Constitui também um objetivo da presente invenção uma composição de vacina para o controle de infestações por ectoparasitas que compreende ácidos nucleicos que codificam para o peptídeo da proteína ribossômica P0 dos referidos ectoparasitas, correspondente à região entre os aminoácidos 267 e 301 da proteína, e que gera uma resposta imunológica contra o referido peptídeo mediante imunização com DNA desnudo. Em uma modalidade da invenção, o referido peptídeo tem uma sequência aminoacídica identificada como SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 10, é um fragmento das referidas sequências, ou é um peptídeo ou polipeptídeo que exibe pelo menos uma identidade de 70 % com as referidas sequências.

[00026] A invenção refere-se ainda ao uso da região compreendida entre os aminoácidos 267 e 301 da proteína ribossômica PO de ectoparasitas para a produção de uma composição de vacina para o controle de infestações por esses parasitas ou da transmissão dos patógenos associados aos mesmos. Em uma modalidade, o referido peptídeo tem uma sequência aminoacídica identificada como SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 10, é um fragmento das referidas sequências, ou é um peptídeo ou polipeptídeo que exibe pelo menos uma identidade de 70 % com as referidas sequências.

Breve descrição das figuras

[00027] Figura 1. Predição do grau de acessibilidade dos resíduos aminoacídicos presentes na proteína ribossômica P0 de R. microplus e R. sanguineus. A região correspondente à sequência definida como SEQ ID N° 4 encontra-se assinalada com um círculo.

[00028] Figura 2. Resposta de anticorpos IgG específicos anti- peptídeo P0, detectada por ELISA no soro de camundongos BALB/c imunizados com o conjugado pPO-KLH. Os dados estão expressos como o recíproco do título promédio de anticorpos, determinado como a última diluição de soro com uma média de densidade óptica (DO) maior que o triplo da média da DO de um soro negativo. Os desvios padrão estão representados por barras de erro no sentido positivo. Não foram detectados títulos de anticorpos para nenhum dos animais no dia zero.

[00029] Figura 3. Padrão de expressão da proteína ribossômica P0 de carrapatos Rhipicephalus na linhagem celular RK-13 de coelho analisada por meio da mancha ocidental com o anticorpo policlonal gerado em camundongos contra P0. 1. Padrão de peso molecular, 2. lisado de células RK-13 transfectadas com o plasmídio pAdTrack- PORs em condições redutoras, 3. lisado de células RK-13 transfectadas com o plasmidio pAdTrack-PORs em condições não redutoras, 4. Lisado de células RK-13 não transfectadas em condições redutoras, 5. Electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) em condições redutoras do lisado de células RK-13 transfectadas com o plasmidio pAdTrack-PORs.

[00030] Figura 4. Resposta de anticorpos IgG anti-KLH, anti- peptideo P0 e anti-Bm86 detectados por ELISA no soro de coelhos imunizados com estes antígenos (Ejemplo 6). Os dados estão expressos como o recíproco do título promédio de anticorpos, determinado como a última diluição de soro com uma média de DO maior que o triplo da média da DO dos grupos de controle negativo correspondentes. Os desvios padrão estão representados por barras de erro no sentido positivo. Não foram detectados títulos de anticorpos específicos contra os antígenos para nenhum dos grupos no dia zero do ensaio.

[00031] Figura 5. Recuperação de larvas, ninfas e adultas de R. sanguineus nos coelhos imunizados do Exemplo 6. Os dados estão expressos como o promédio das percentagens de larvas, ninfas e adultas recuperadas nos diferentes grupos experimentais. Os desvios padrão dos grupos estão representados por barras de erro no sentido positivo. No gráfico estão mostrados, com letras diferentes, as diferenças estatisticamente significativas existentes entre os grupos experimentais (ANOVA e teste de comparações múltiplas de Bonferroni [p<0,01]. Para a análise, os dados em proporções foram previamente transformados em arco seno de sua raiz quadrada).

[00032] Figura 6. Ninfas recém-mudadas de R. sanguineus a partir das larvas depositadas sobre os diferentes grupos experimentais do exemplo 6. (A) Grupo de controle negativo (B) Imunizados com Bm86 (C) Imunizados com o conjugado pPO-KLH e (D) Aparecimento das ninfas mortas mudadas a partir de larvas depositadas sobre os coelhos imunizados com o pPO-KLH.

[00033] Figura 7. Percentagem de eclosão das ovas de R. sanguineus a partir de teleóginas depositadas sobre os coelhos imunizados no Exemplo 6. Os dados estão expressos como o promédio por grupo. Os desvios padrão para cada grupo estão representados por barras de erro no sentido positivo. As diferenças estatisticamente significativas estão representadas por um asterisco (ANOVA e um teste de comparações múltiplas de Bonferroni (p<0,05).

[00034] Figura 8. Resposta de anticorpos IgG anti-peptídeo P0 (A) e sobrevivência de larvas, ninfas e adultas de R. sanguineus (B) correspondentes aos coelhos imunizados com as variantes desse peptídeo fundido a diferentes moléculas imunopotencializadoras. Os desvios padrão estão representados por barras de erro no sentido positivo.

[00035] Figura 9. Análise por meio da mancha ocidental do padrão de expressão da proteína quimérica Bm86-pP0 no precipitado de ruptura da cepa MP36 de P. pastoris, utilizando soros hiperimunes gerados contra o peptídeo pPO (A) e contra a proteína Bm86 (B). Para ambos os casos, linha 1. Precipitado de ruptura em condições redutoras, 2. Precipitado de ruptura em condições não redutoras, 3. Proteína desglicosilada por digestão com a enzima PNGasa F.

[00036] Figura 10. Resposta de anticorpos IgG anti-peptídeo P0 e anti-Bm86, detectada por ELISA no soro de bovinos imunizados com esses antígenos de maneira individual, combinada ou com a proteína quimérica Bm86-pP0. Os dados estão expressos como o recíproco do título promédio de anticorpos, determinado como a última diluição de soro com uma média de DO maior que o triplo da média da DO do grupo de controle negativo. Os desvios padrão estão representados por barras de erro no sentido positivo. Não foram detectados títulos de anticorpos para nenhum dos grupos no início do ensaio.

[00037] Figura 11. Promédio do peso das teleóginas e das ovas de R. microplus depositadas sobre bovinos imunizados no Exemplo 8. No gráfico estão mostradas as diferenças estatisticamente significativas existentes entre os grupos experimentais e de cada um deles em relação ao grupo de controle negativo por meio de letras diferentes (ANOVA e teste de comparações múltiplas de Newman-Keuls [p<0,05]).

[00038] Figura 12. Resposta de anticorpos IgG anti-pPOIs detectada por ELISA no soro de coelhos imunizados com este antígeno e posteriormente desafiados com /. scapularis. Os dados estão expressos como o recíproco do título promédio de anticorpos, determinado como a última diluição de soro com uma média de DO maior que o triplo da média da DO do grupo de controle negativo. Os desvios padrão estão representados por barras de erro no sentido positivo. Não foram detectados títulos de anticorpos para nenhum dos grupos no dia zero do ensaio.

[00039] Figura 13. Comportamento dos parâmetros biológicos de /. scapularis nos coelhos imunizados com o conjugado pP0ls-KLH. Estão representadas a viabilidade das larvas e a recuperação de ninfas e adultas (A) e a porcentagem de eclosão das ovas (B). Os dados estão expressos como o promédio por grupo. Os desvios padrão estão representados por barras de erro no sentido positivo. No gráfico estão mostradas com um asterisco as diferenças estatisticamente significativas existentes em relação ao grupo de controle negativo (ANOVA e teste de comparações múltiplas de Bonferroni [p<0,05]).

Vantagens da solução proposta:

[00040] Na presente invenção demonstramos a capacidade protetora de uma formulação de vacina, que contém um peptídeo compreendido entre os aminoácidos 267 e 301 da protein ribossômica PO de diferentes ectoparasitas, contra os carrapatos R. microplus, R. sanguineus e /. scapularis, e os ectoparasitas conhecidos como piolhos do mar L salmonis e C. rogercresseyi, sem a ocorrência de reações cruzadas com a proteína do organismo hospedeiro. Em todas as imunizações, o pPO foi administrado conjugado ou fundido a uma molécula imunopotencializadora para melhorar a resposta imune dos animais. No caso das carrapatos, a aplicação desse peptídeo (ou fragmentos do mesmo) fundido à proteína Bm86 ou combinado com a mesma, induz um maior grau de afetação da viabilidade, e dos parâmetros biológicos desses artrópodes que aquele provocado pelos referidos antígenos quando são utilizados individualmente. Portanto, a aplicação dessa proteína quimérica ou de uma combinação da mesma como parte de um programa de luta integrada, poderia resultar em um maior controle de infestações por estas ou outras espécies de carrapatos, assim como na diminuição da incidência de doenças hemoparasitárias transmitidas pelos mesmos. No caso dos piolhos do mar, a maior afetação dos mesmos foi observada quando o pPOCr foi fundido aos epítopos T promíscuos e à proteína my32. O alto grau de conservação aminoacídica do referido peptídeo entre a maioria das espécies de artrópodes e piolhos do mar, e a baixa identidade dessa sequência com o fragmento correspondente das proteínas de mamíferos e peixes, convertem esse peptídeo da proteína ribossômica PO (ou fragmentos do mesmo) em um antígeno para o desenvolvimento de vacinas contra ectoparasitas.

Descrição Detalhada de Modos de Realização / Exemplos de Realização

[00041] Exemplo 1. Amplificação e clonagem das sequências nucleotídicas que codificam para a proteína ribossômica PO de R. microplus, R. sanguineus e C. rogercresseyi.

[00042] Por meio de reações de transcrição reversa a partir de RNA total de larvas de R. microplus e R. sanguineus e adultos de C. rogercressey foram obtidos DNAs complementares. As reações foram realizadas seguindo-se as instrução descritas no kit "Reverse Transcription System" (Promega, USA #A3500). A partir dos DNAs complementares obtidos, as sequências de nucleotídeos que codificam para a proteína ribossômica PO de R. microplus e R. sanguineus (SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2) e a sequência da PO de C. rogercresseyi foram amplificadas por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR). Como iniciadores para as PCRs de carrapatos foram utilizados oligonucleotídeos sintéticos desenhados a partir da sequência nucleotídica reportada no banco de genes Genebank, para a PO de Haemaphysalis longicornis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) sob o número de acesso EU048401 : Oligonucleotídeo "Forward": 5' ATGGTCAGGGAGGACAAGACCACCTGG 3' Oligonucleotídeo "Reverse": 5' CTAGTCGAAGAGTCCGAAGCCCATGTCG 3'

[00043] Como iniciadores para a amplificação a partir de DNAc de C. rogercresseyi foram utilizados oligonucleotídeos sintéticos degenerados desenhados a partir de as sequências nucleotídicas reportadas no banco de genes Genebank para a PO de diferentes espécies de carrapatos (Haemaphysal/s longicornis e Ixodes scapuiaris) e insetos (Drosophila melanogaster, Culex quinquefasciatus e /Aedes aegypti): Oligonucleotídeos "Forward": F1 5' ATGGGCAAGAACAC(C/G)ATGAT(C/G)CGCAA(G/A)GC 3' F2 5' ATGG(T/G)(T/C)AGGGAG(G/A)ACAA(G/A)(A/G)C(C/A T)(G/A)C(C/G)TGGAA 3' Oligonucleotideo "Reverse": R1 5' TC(G/A)AA(A/C/G)AG(G/A/T)C(C/T)GAA(T/G/A)CCCAT (A/G)TC(A/G)TC 3'

[00044] Como resultado das reações com DNA complementares de carrapatos foi obtido um cordão de DNA de aproximadamente 957 pb em ambos os casos, o qual foi clonado no vetor comercial pGEM- TEasy (Promega, EUA) para seu sequenciamento. No caso da reação de PCR a partir de DNA complementar de C. rogercresseyi, foi obtido um cordão de DNA de aproximadamente 780 pb para a combinação dos oligonucleotídeos F1-R1 e um cordão de aproximadamente 960 pb para a combinação dos oligonucleotídeos F2-R1. Em ambos os casos, os cordões foram clonados no vector comercial pGEM-TEasy (Promega, EUA) para seu sequenciamento.

Exemplo 2. Análise bioinformática.

[00045] As análises de identidade de sequências aminoacídicas foram feitas com o uso dos programas BlastX e ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/). As sequências de 318 aminoácidos deduzidas a partir das sequências de DNA amplificadas dos DNA complementares de carrapatos foram idênticas entre si (SEQ ID N° 3) e apresentaram uma identidade de 95% e de 93%, em relação às sequências da proteína ribossômica P0 de Haemaphysalis longicornis e de Ixodes scapularis (Genebank, número de acesso DQ066213), respectivamente. Esta sequência apresentou ainda uma identidade de 96% com a sequência polipeptídica deduzida a partir de uma fase de leitura parcial incluída no TC533 da base de dados de Amblyoma variegatum, e de 99% com aquelas deduzidas a partir de duas fases de leitura abertas, contidas no TC1424 e no TC9038, das bases de dados de ESTs de R. appendiculatus e R. microplus, respectivamente (http://compbio.dfci.harvard.edu/index.html).

[00046] A sequência polipeptídica correspondente à proteína PO de R. sanguineus e R. microplus denominada como SEQ ID N° 3 apresenta ainda uma identidade de sequência de 70% com a P0 de bovino (Bos taurus, Genebank número de acesso AAX09097), sendo de 87% para os últimos 16 aminoácidos que compõem a região C- terminal, descrita como a zona mais imunogênica dentro da proteína. Esta sequência apresenta ainda uma identidade de sequência de 71% com a proteína P0 de cachorro (Canis familiaris, Genebank número de acesso XM535894). No caso da sequência aminoacídica da P0 deduzida a partir da sequência de DNA complementar de C. rogercresseyi, foi observada uma alta percentagem de identidade com as sequências informadas para outras espécies de piolhos do mar, como C. clemensi e L. salmonis. Assim como no caso dos carrapatos e seus hospedeiros, houve uma elevada identidade de sequência entre a P0 dos piolhos do mar em relação à P0 de Salmo salar (Genebank número de acesso ACI70184).

[00047] A elevada identidade de sequência existente entre as PO desses ectoparasitas em relação às P0 de seus organismos hospedeiros faz com seja muito arriscado utilizar esta molécula como antígeno para vacina para controlar suas infestações, devido à possibilidade de criar autoimunidade contra a proteína do hospedeiro. Esse risco é ainda maior para o uso da região C-terminal (últimos 11- 16 aminoácidos), a qual se encontra altamente conservada entre todos esses organismos.

[00048] A região da proteína P0 de ambas as espécies de carrapatos que apresenta menor semelhança de sequência com as proteínas P0 de mamíferos fica compreendida entre os aminoácidos 267 e 301 (SEQ ID N° 4). Mediante o uso de ferramentas bioinformáticas que se encontram no site http://www.ca.expasv.org/sprot, foi comprovado que essa região da proteína coincide com uma zona de baixa hidrofobicidade, a qual apresenta grandes possibilidades de se encontrar exposta na proteína (Figura 1). Posteriormente, foi avaliada a capacidade imunogênica desse peptídeo e sua utilidade como antígeno para vacina para o controle de infestações por essas ou outras espécies de carrapatos.

[00049] Ao traduzir a sequência de gene clonado que codifica para a proteína PO do piolho do mar Caligus rogercresseyi, foi identificado um peptídeo similar, de baixa homologia com a PO de Salmo salar na mesma região compreendida entre os aminoácidos 267 e 301 (SEQ ID N° 10, pPOCr). Além disso, foram também identificadas as mesmas regiões de menor semelhança aminoacídica (SEQ ID N° 8 e 9, pPOCc e pPOLs) nas proteínas P0 reportadas para Caligus clemensi (Genebank número de acesso AC014779) e Lepeophtheirus salmonis (Genebank, número de acesso ACO12290).

[00050] Exemplo 3. Síntese dos peptídeos e conjugação com a KLH.

[00051] Os peptídeos definidos como SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 9 e SEQ ID N° 10, e fragmentos de 20 aminoácidos dos referidos peptídeos, foram obtidos por síntese química e foram purificados por cromatografia de fase reversa empregando um sistema de HPLC (do inglês: Reverse Phase-High Pressure Liquid Chromatograph). Foram obtidos 15 miligramas de cada peptídeo sintético, com uma pureza de 99,3%. A massa molecular de cada um deles foi verificada por espectrometria de massas.

[00052] Com o propósito de potencializar as capacidades imunogênicas dois peptídeos foram fundidos à proteína KLH. As conjugações dos peptídeos sintéticos com KLH foram feitas pelo método da carbodi-imida solúvel. A união dos mesmos foi efetuada utilizando-se anidrido succínico como agente espaçador. A separação dos conjugados foi efetuada por meio de cromatografia de filtração em gel. A concentração final de cada conjugado foi estimada pelo método do ácido bicinconínico.

[00053] Exemplo 4. Obtenção de soro hiperimune de camundongo contra o peptídeo da proteína ribossômica PO de R. microplus e R. sanguineus (pPO).

[00054] Foram usados seis camundongos Balb/c, machos, de 6 semanas de idade, com pesos corporais entre 18 e 22 g, os quais foram imunizados por via subcutânea nos dias 0, 14, 21 e 28 com 250 pg do conjugado pPO-KLH (equivalente a 125 pg do peptídeo e 125 pg de KLH) em adjuvante de Freund. As coletas de sangue foram feitas nos dias 0, 7, 14, 21, 40 e 65. Os animais foram dessangrados aos 65 dias e os soros foram obtidos por centrifugação durante 10 minutos a 3500 rpm. A cinética de anticorpos foi monitorada por um ELISA indireto. Para o revestimento das placas foi utilizado 1 pg de pPO por poço e a detecção foi efetuada com um anti-lgG de camundongo conjugado com peroxidase de raiz-forte em uma diluição 1:15000. A revelação foi efetuada empregando-se uma solução substrato que continha o-fenilenodiamina 0,4 mg/mL em ácido cítrico 0,1 M; NahhPO 0,2 M; pH 5,0 e peróxido de hidrogênio 0,015%. A reação foi interrompida com H2SO4 2,5 M. O título de anticorpos foi estabelecido como o inverso da maior diluição cuja média da DO do soro em questão é três vezes maior que a média da DO de um soro de controle negativo.

[00055] Os animais imunizados apresentaram títulos de anticorpos específicos contra o peptídeo a partir do dia 14 da experiências, que chegaram a ser de 1 :10240 para dois dos animais no dia 65 (Figura 2). Uma mistura que contém igual quantidade dos referidos obtidos a partir dos seis camundongos imunizados com o conjugado pPO-KLH foi usada como anticorpo policlonal nos ensaios de expressão e de reatividade cruzada "in vitro".

[00056] Exemplo 5. Expressão da proteína ribossômica PO de carrapatos Rhipicephalus na linhagem celular RK-13 e ensaio de reatividade cruzada "in vitro".

[00057] A sequência de DNA que codifica para a proteína ribossômica P0 de R. sanguineus (SEQ ID N° 2) foi clonada no plasm ídio pAdTrack-CMV (9,2 kb), sob o controle do promotor/potencializador imediato/prematuro do citomegalovírus humano (pCMVITh) e o sinal de terminação/poliadenilação tardia do vírus vascuolizante símio SV40. Este vetor contém em sua sequência o gene repórter que codifica para a proteína fluorescente verde (do inglês: Green Fluorescent Protein, abreviado GFP) e o gene que confere resistência à canamicina (He T. C. et al.; Proc Nati Acad Sei U S A. 1998, 95: 2509-2514). O plasmídio resultante foi utilizado para transfectar a linhagem celular RK-13 de rim de coelho. A transfecção foi efetuada utilizando-se lipofectamina (Invitrogen, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência da transfecção foi comprovada depois de 24 horas, mediante a observação da expressão da GFP no microscópio óptico, empregando luz ultravioleta e uma amplificação de 40X.

[00058] Depois de 48 horas procedeu-se à lise celular e os extratos celulares obtidos foram submetidos a uma eletroforese em gel de poliacrilamida a 10 % (SDS-PAGE), sendo usadas condições redutoras e desnaturalizantes, de acordo com a técnica descrita por Laemmli (Laemmli U. K.; Nature 1970, 227: 680-685).

[00059] O padrão de expressão da proteína ribossômica P0 de carrapatos Rhipicephalus foi analisado por meio da mancha ocidental, utilizando-se como anticorpo primário o soro policlonal contra o peptídeo obtido em camundongos (diluído 1 :3000) e como anticorpo secundário um anti-lgG de camundongo conjugado com peroxidase em diluição 1 :10000 (Figura 3). Na amostra correspondente às células transfectadas com o plasmidio foi detectada uma faixa única do tamanho esperado para a proteína PO, de aproximadamente 35 kDa. A presença de uma faixa semelhante na amostra corrida em condições não redutoras indicou que esse peptídeo encontra-se exposto na estrutura tridimensional da proteína. Nenhuma faixa foi detectada no sulco correspondente à amostra de controle negativo (células RK-13 de coelhos não transfectadas), o que indicou que os anticorpos gerados em camundongo contra o peptídeo de 35 aminoácidos da proteína PO de carrapatos Rhipicephalus não são capazes de reconhecer o peptídeo correspondente na proteína PO de coelho, ficando assim demonstrada a ausência de reatividade cruzada entre o peptídeo imunogênico de carrapatos e o peptídeo correspondente na proteína ribossômica PO de coelho.

[00060] Exemplo 6. Determinação da imunogenicidade do peptídeo pPO de carrapatos Rhipicephalus e da sua capacidade protetora frente a infestações com o carrapato R. sanguineus.

[00061] Em seguida foi avaliada a utilidade do peptídeo da proteína ribossômica P0 de R. microplus e R. sanguineus como antígeno para vacina contra p carrapato R. sanguineus. Para tanto, 20 coelhos Nova Zelândia brancos, machos, de entre 12 e 14 semanas de idade e peso corporal acima de 2,5 kg foram distribuídos aleatoriamente em três grupos experimentais de sete coelhos para os grupos de pPO-KLH e Bm86 e de 6 coelhos para o grupo de controle negativo imunizado com KLH. Os imunógenos, contidos em PBS1X, tiveram como adjuvante Montanide 888 VG (preparado a 10% em óleo mineral) em uma proporção 60/40 de imunógeno/adjuvante. Os grupos experimentais foram distribuídos da seguinte forma:

[00062] Grupo 1: Imunização por via subcutânea com o conjugado pPO-KLH em uma dose de 500 pg/animal (equivalente a 250 pg de peptídeo/animal) nos dias 0, 21, 36 e 60.

[00063] Grupo 2 (controle negativo): Imunização por via subcutânea com KLH em uma dose de 250 pg/animal nos dias 0, 21, 36 e 60.

[00064] Grupo 3 (controle positivo): Imunização por via subcutânea com a proteína Bm86 de R. microplus em uma dose de 100 pg/animal nos dias 0 e 28.

[00065] O ensaio teve uma duração de 120 dias. Amostras de soro foram coletadas dos animais para medir a resposta de anticorpos nos dias 0, 14, 21, 28, 36, 59, 73 e 87. O comportamento geral e a temperatura corporal dos mesmos foram observados diariamente durante todo o ensaio. Foram colocadas três câmaras por animal no dia 72 da experiência e cada animal foi infestado no dia 73 com aproximadamente 250 larvas, 100 ninfas e 50 neóginas (20 machos e 30 fêmeas) de R. sanguineus. A coleta, contagem, pesagem e análise da muda dos carrapatos foram efetuadas entre os dias 75 e 120. As larvas e ninfas coletadas foram colocadas em uma incubadora a 28°C, com 80% de umidade relativa e um fotoperíodo de 12:12 h (luz: escuridão). As teleóginas fêmeas ingurgitadas foram mantidas em placas plásticas individuais imobilizadas até a oviposição nas mesmas condições.

[00066] Não foi observada mudança no comportamento normal, nem febre em nenhum dos animais. A resposta humoral gerada contra cada um dos imunógenos foi estudada por meio de ELISA indireto semelhante ao descrito anteriormente, revestindo-se as placas com 1 pg de cada antígeno por poço e utilizando-se neste caso um anticorpo anti-lgG de coelho conjugado com peroxidase (SIGMA) em uma diluição 1:10000. As médias dos títulos de anticorpos foram determinadas a partir dos valores individuais em cada grupo. Títulos específicos contra Bm86 foram obtidos somente nos animais do grupo 3 imunizados com Bm 86. Títulos específicos contra o peptídeo de P0 (pPO) foram obtidos somente no grupo 1 de animais imunizados com o conjugado pPO-KLH e títulos específicos contra KLH foram obtidos nos grupos 1 e 2 imunizados com o conjugado pPO-KLH e com KLH isolado (Figura 4).

[00067] Para estudar o efeito dos imunógenos sobre os carrapatos R. sanguineus o comportamento de vários parâmetros biológicos dos mesmos foi analisado. Em larvas, ninfas e adultas foram analisados o tempo promédio de alimentação e a recuperação. No caso de larvas e ninfas foram analisados ainda a muda e a capacidade do estágio posterior obtido, de infestar um animal virgem. No caso de adultos foram estudados ainda o peso da fêmea ingurgitada, o peso das ovas e a percentagem de eclosão. O índice de eficiência de conversão em ovos foi calculado de acordo com o já descrito anteriormente (Bennett G. F. et al.; Acarologia 1974, 16: 52-61), como a percentagem de peso da fêmea convertida em ovos. De um modo geral, as larvas, ninfas e neóginas do grupo imunizado com Bm86 demoraram mais tempo para alimentar-se do que os mesmos estágios dos animais de controle e vacinados com o peptídeo PO. Os valores de recuperação de larvas, ninfas e neóginas entre os três grupos foram comparados usando-se um ANOVA e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni (p<0,01). No caso das larvas e ninfas foram analisadas a sobrevivência ou viabilidade como a quantidade final do estágio seguinte que foi capaz de infestar animais virgens em relação à quantidade de larvas e ninfas mudadas. Para as neóginas, a sobrevivência foi medida como o número final de carrapatos capazes de sobreviver depois da incubação e com capacidade de ovipositar. A média da recuperação de larvas não apresentou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos experimentais. No caso da recuperação de ninfas, apesar de uma tendência a recuperar menos ninfas depositadas sobre os grupos imunizados tanto com pPO-KLH quanto com Bm86 não foram observadas diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo de controle imunizado com KLH. No caso dos adultos, a recuperação apresentou diferenças estatisticamente significativas para o grupo vacinado com o antígeno pPO em relação aos grupos de controle negativo e vacinados com Bm86. (Figura 5).

[00068] Foram observadas sérias afetações na viabilidade e na aparência das ninfas recém-mudadas a partir das larvas depositadas nos grupos vacinados com ambos os antígenos em relação àquelas coletadas sobre o grupo de controle. No grupo vacinado com o pPO- KLH foi observada uma elevada mortalidade das ninfas recém- mudadas com uma afetação evidente da morfologia, havendo diferenças estatisticamente significativas desse parâmetro no grupo vacinado com o pPO-KLH em relação aos grupos de controle negativo e ao grupo vacinado com Bm86. Além disso existem diferenças significativas na viabilidade entre o grupo vacinado com Bm86 e o grupo de controle negativo (Figura 6). Na Tabela 1 apresentamos as percentagens de mortalidade em cada grupo experimental.

[00069] Tabela 1. Percentagens de mortalidade das ninfas recém- mudadas a partir de larvas depositadas nos três grupos experimentais. As letras diferentes significam diferenças estatisticamente significativas obtidas por um ANOVA seguido de um teste de comparações múltiplas de Bonferroni (P<0,001) dos dados transformados.

[00070] A capacidade das ninfas e neóginas recém-mudadas e das larvas recém-eclosionadas provenientes dos grupos experimentais para infestar um novo animal foi determinada por meio da infestação de cachorros virgens com os exemplares recuperados, mudados e viáveis de cada grupo. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas para esse parâmetro entre os grupos experimentais.

[00071] A análise estatística dos dados de peso da teleógina e da ova foi efetuada por meio de um ANOVA e de um teste de comparações múltiplas de Bonferroni (p<0,05). Não foram encontradas diferenças significativas para ambos os parâmetros entre os grupos experimentais. O índice de eficiência de conversão em ovos tampouco apresentou diferenças significativas entre os grupos vacinados e o grupo de controle. Neste ponto devemos destacar que 10% das neóginas depositadas sobre coelhos imunizados com pPO-KLH não colocaram ovos contra 3% delas no grupo de controle imunizado com KLH e 6% não colocaram ovos no grupo depositado sobre coelhos imunizados com Bm86. Foram observadas diferenças estatisticamente significativas (p<0,01) na % de eclosão dos ovos no grupo imunizado com pPO-KLH em relação ao grupo de controle imunizado com KLH (Figura 7). Ainda que no grupo imunizado com Bm86 tenha havido uma percentagem de eclosão menor que no grupo de controle negativo, estas diferenças não foram significativas do ponto de vista estatístico. As larvas eclosionadas dos ovos dos três grupos experimentais foram capazes de infestar cachorros e alimentar-se normalmente.

[00072] Foram realizadas experiências com resultados similares àqueles descritos previamente neste exemplo, imunizando-se os coelhos com fragmentos de 20 aminoácidos de pPO. Os peptídeos avaliados têm as seguintes sequências aminoacídicas: AAGGGAAAAKPEESKKEEAK, EYLKDPSKFAAAAAPAAGGG e

[00073] FAAAAAPAAGGGAAAAKPEE. Os referidos peptídeos foram conjugados com KLH. Os melhores resultados foram obtidos com o peptídeo correspondente aos últimos 20 aminoácidos de pPO.

[00074] Exemplo 7. Determinação da imunogenicidade da pPO de R. microplus e R. sanguíneas fundida a diferentes moléculas imunopotencializadoras.

[00075] A proteína do capsídeo VP60 de RHDV (cepa AST/89) foi obtida com altos níveis de expressão no sobrenadante de ruptura da levadura Pichia pastoris. Esta proteína obtida por via recombinante forma multímeros de alto peso molecular com características antigênicas e estruturais semelhantes à partícula virai nativa (Farnós O. et al.; Antiv. Res. 2009, 81 : 25-36). Aproveitando a alta capacidade imunogênica dessas partículas semelhantes a vírus (VLPs), foi gerada uma construção de DNA recombinante para obter a pPO exposta na superfície das VLPs de RHDV. Para tanto, a sequência nucleotídica que codifica para o fragmento de 20 aa a partir da posição 15 até a 35 da SEQ ID N° 4 do referido peptídeo (AAGGGAAAAKPEESKKEEAK) foi inserida no plasmidio pNAOVP60, na posição do domínio protuberante do gene da proteína VP60. Esta construção permite que a pPO seja expressa fundida à extremidade C-terminal da VP60, região que fica exposta ao exterior depois da montagem das VLPs. O plasmidio recombinante obtido foi usado para transformar a cepa MP36 de P. pastoris. Foi obtida a proteína VP60pP0 solúvel no sobrenadante de ruptura em níveis de 350 mg/L. A exposição da região C-terminal e a formação de VLPs foram verificadas por meio de um ELISA sanduíche utilizando-se um soro hiperimune anti-RHDV e os anticorpos monoclonais 6H6 e 1H8 (gentilmente cedidos pelo Dr. Lorenzo Capucci do Istituto Zooprofilattico Sperimentale delia Lombardia, Brescia, Itália), que reconhecem epítopos presentes na região C-terminal da proteína VP60 e em partículas virais ou VLPs corretamente montadas, respectivamente (Capucci L. et al.; Virus. Res. 1995, 37: 221-238). As VLPs de VP60pP0 foram purificadas por HPLC em uma coluna TSK-G3000PW, sendo obtida uma pureza aproximada de 50 %.

[00076] A outra construção recombinante foi feita com o mesmo peptídeo de 20 a. a. de P0 acoplado a vários epítopos de células T promíscuos. Especificamente, foram usados os epítopos ttP2 do toxoide tetânico e o epítopo de células T do vírus do sarampo (TT- MVF). Foram inseridas várias cópias da sequência de DNA da pPO de 20 a.a (AAGGGAAAAKPEESKKEEAK) e dos antígenos T promíscuos fundidos à inteína de Saccharomyces cerevisiae no plasmídio pTBY 12 sob o controle do promotor T7 e do repressor do opéron lac que permite a expressão da proteína de fusão somente depois da indução com IPTG. O plasmídio recombinante obtido foi usado para transformar a cepa ER2566 de E coli. O peptídeo quimérico TT-MVF- pPO- inteína foi detectado no sobrenadante de ruptura desta cepa pelo soro policlonal murino anti-pPO. Os níveis de expressão foram estimados em aproximadamente 100 mg/L de cultivo. O peptídeo foi purificado por afinidade a uma coluna de quitina e autodigerido na presença de grupos tiol para liberar o peptídeo de interesse.

[00077] Foi realizada uma experiência de imunização em coelhos para avaliar a capacidade imunogênica das variantes quiméricas obtidas e o efeito dos anticorpos gerados sobre as larvas, ninfas e neóginas de R. sanguineus em comparação ao efeito do peptídeo sintético da proteína ribossômica P0 conjugada com hemocianina. Para tanto, 28 coelhos Nova Zelândia, brancos e machos, foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 7 animais cada um. Os imunógenos tiveram como adjuvante Montanide 888 VG e foram administrados da seguinte forma:

[00078] Grupo 1 : Imunização por via subcutânea com o conjugado pPO-KLH em uma dose de 500 pg/animal (equivalente a 250 pg de peptídeo/animal).

[00079] Grupo 2 (controle negativo): Imunização por via subcutânea com KLH em uma dose de 250 pg/animal.

[00080] Grupo 3: Imunização por via subcutânea com as VLPsVPδOpPO em uma dose equivalente a 250 pg de proteina/animal.

[00081] Grupo 4: Imunização por via subcutânea com o peptídeo quimérico TT-MVF-pP0, em uma dose equivalente a 250 pg de peptídeo/animal.

[00082] O ensaio teve uma duração de 90 dias. Os animais foram imunizados nos dias 0, 21 e 36. As coletas dos soros, a determinação dos títulos de anticorpos, e a infestação e coleta dos carrapatos foram realizadas de maneira semelhante àquela descrita no Exemplo 6.

[00083] Para a análise estatística, os valores de recuperação e viabilidade de carrapatos foram submetidos a uma análise de variância (ANOVA) e a um teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Os títulos mais altos de anticorpos anti-peptídeo P0 foram detectados nos animais vacinados com a quimera VLPsVPδOpPO a partir do dia 14 pós-imunização. Estes anticorpos alcançaram títulos superiores a 1:5000 para a variante quimérica VLPsVPδOpPO a partir do dia 21, e a partir do dia 28 para os animais imunizados com a quimera TT-MVF- pPO. Os títulos foram mantidos até o final da experiência (Figura 8 A).

[00084] A média da viabilidade das larvas e da recuperação de ninfas e neóginas apresentou diferenças significativas (p<0,05) para os grupos vacinados com as variantes quiméricas do peptídeo da P0 em relação ao grupo de controle negativo, imunizado com KLH. (Figura 8 B). Na Tabela 2 apresentamos a diminuição, em relação ao grupo de controle negativo, na percentagem de viabilidade das larvas e na percentagem de recuperação de ninfas e adultos por grupos experimentais.

[00085] Tabela 2. Diminuição na percentagem de recuperação de carrapatos em cada estágio em relação ao grupo de controle imunizado com KLH.

[00086] Exemplo 8. Determinação da capacidade protetora da proteína quimérica Bm86-pP0 em relação àquela da pPO, frente a infestações com o carrapato R. microplus.

[00087] O antígeno Bm86 do carrapato R. microplus foi expresso antecipadamente na cepa MP36 de P. pastoris (Valle M. R. et al., J. Biotech. 1994, 33: 135-146). Nessa construção foram eliminados os fragmentos do gene correspondentes ao peptídeo de sinal e à região transmembrana da proteína (SEQ ID N° 5). Para a construção da proteína quimérica Bm86-pP0, a sequência nucleotídica da proteína Bm86 descrita anteriormente, seguida pelo sinal de secreção da sacarose invertase de S. cerevisiae (ssSUCZ) foi inserida no plasmidio pPS10 sob o controle do promotor AOX 1. A esta sequência de Bm86 foi fundida a sequência de DNA que codifica para o peptídeo de 35 aminoácidos da proteína ribossômica P0 de R. microplus. A cepa MP36 de P. pastoris foi transformada com o plasmidio resultante e os transformantes foram selecionados por meio de reversão da auxotrofia ao aminoácido histidina. Os clones obtidos foram induzidos com metanol depois de atingir uma DO entre 3 e 4 na cultura celular. Depois de 96 horas de indução foi efetuada a análise de expressão por meio da mancha ocidental, utilizando-se um soro hiperimune murino anti-pPO (mencionado no Exemplo 4) e por um anticorpo policlonal anti-Bm86 (Figura 9A e 9B). A proteína recombinante foi detectada no precipitado de ruptura celular em níveis de 300 mg/L. Na referida análise foi observada uma faixa de 100 kDa, correspondente à proteína glicosilada, que foi reduzida para uma banda de aproximadamente 70 kDa, coincidente com o tamanho esperado para a proteína, depois da digestão com a enzima PNGasa F. nenhuma faixa foi observada na amostra analisada em condições não redutoras, o que sugeriu a formação de estruturas multiméricas, que foram incapazes de penetrar no gel de poliacrilamida. A presença desses agregados proteicos de alto peso molecular no precipitado de ruptura foi verificada por microscopia eletrônica. A proteína quimérica foi purificada pelo método de precipitação ácida, sendo obtida com uma pureza de aproximadamente 95%.

[00088] Foi realizado um ensaio de imunização em bovinos no qual foram comparados os efeitos sobre R. microplus do pPO conjugado com KLH, da proteína Bm86, da proteína quimérica Bm86-pP0 e da coadministração dos antígenos pP0_KLH e Bm86 como candidatos à vacina. Para tanto, 20 bovinos livres de carrapatos, pesando mais de 240 kg de peso foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos experimentais de 4 animais cada um. Os imunógenos foram administrados em Montanide 888 VG (preparado a 10% em óleo mineral) na proporção de 60/40 de fase aquosa/fase oleosa. Os grupos experimentais foram concebidos da seguinte forma:

[00089] Grupo 1 : Imunização por via intramuscular com o conjugado pPO-KLH em uma dose de 500 pg de conjugado/animal (equivalente a 250 pg de peptídeo/animal) com o esquema de 0, 4 e 7 semanas.

[00090] Grupo 2 (controle negativo): Imunização por via intramuscular com KLH em uma dose de 250 pg/animal com o esquema de 0, 4 e 7 semanas.

[00091] Grupo 3 (controle positivo): Imunização por via intramuscular com a proteína Bm86 de R. microplus em uma dose de 250 pg/animal com o esquema de 0, 4 e 7 semanas.

[00092] Grupo 4: Imunização por via intramuscular com a proteína quimérica Bm86-pP0 em uma dose de 250 pg/animal com o esquema de 0, 4 e 7 semanas.

[00093] Grupo 5: Imunização por via intramuscular com a proteína Bm86 e o conjugado pPO-KLH em uma dose de 250 pg de Bm86/animal e 500 pg do conjugado/animal com o esquema de 0, 4 e 7 semanas.

[00094] O ensaio teve uma duração total de 140 dias. Amostras de soro foram coletadas dos animais para medir a resposta de anticorpos nos dias 0, 14, 28, 49, 70, 82, 120 e 140. Foram colocadas quatro câmaras por animal no dia 82 da experiência que foram infestadas com 3000 larvas por câmara (12000 larvas por animal) de R. microplus a uma razão de 4000 larvas diárias entre os dias 84 e 86. A coleta, contagem e pesagem dos carrapatos foram efetuadas entre os dias 107 e 117. As teleóginas fêmeas ingurgitadas foram mantidas em placas plásticas individuais a 28°C, 90 % de umidade relativa e com um fotoperíodo de 12 horas de luz.

[00095] A cinética de anticorpos anti-pPO e anti-Bm86 foi estudada por ELISA, utilizando-se neste caso um conjugado anti-bovino- peroxidase (SIGMA) em uma diluição 1 :10000. Foi detectada uma resposta de anticorpos IgG específicos contra Bm86 e contra a pPO a partir do dia 14, em todos os animais imunizados com estes antígenos. Esses anticorpos alcançaram títulos superiores a 1 :5000 depois do dia 28 para Bm86 e entre os dias 60 e 90 para o caso do peptídeo P0, os quais se mantiveram até o final da experiência. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas para os títulos de anticorpos anti-Bm86 nem anti-pPO entre os grupos inoculados com ambos os antígenos separadamente ou combinados, nem em relação ao grupo vacinado com a quimera Bm86-pP0 (Figura 10).

[00096] Foram analisados o efeito dos anticorpos gerados sobre a recuperação, o peso da teleógina e da ova e a percentagem de eclosão de R. microplus. A recuperação de teleóginas diminuiu de maneira significativa em todos os grupos vacinados em relação ao grupo de controle negativo da experiência. Para o grupo imunizado com Bm86 em relação ao grupo de controle negativo a diminuição da recuperação de carrapatos foi de 32,6%, de 55,2 % para o grupo imunizado com pPO-KLH, de 62,13 % para o grupo imunizado com os dois antígenos individuais e de 65,2% para o grupo imunizado com a quimera Bm86-pP0. Esse parâmetro foi significativamente menor para os grupos imunizados com a quimera Bm86-pP0 e com a combinação de Bm86 e pPO-KLH em relação aos grupos nos quais estes antígenos foram aplicados de maneira individual. Não foram verificadas diferenças significativas do grupo imunizado com a quimera em relação ao grupo imunizado com a combinação dos dois antígenos. Os parâmetros de peso da teleógina e de peso da ova apresentaram uma afetação significativa nos grupos imunizados com Bm86 em relação ao controle negativo (ANOVA e teste de comparações múltiplas de Newman-Keuls [p<0,05]). Foi observada uma diminuição significativa para esses parâmetros biológicos nos grupos imunizados com a quimera Bm86-pP0 e com a combinação dos antígenos, em relação aos grupos vacinados com os antígenos individuais (Figura 11). A percentagem de eclosão dos ovos no grupo de controle negativo foi de 87,4%, ao passo que para os grupos imunizados com Bm86, pPO-KLH, com a combinação de Bm86 e pPO-KLH e com a quimera Bm86-pP0 foi de 75,1%, 64,6%, 54,8% e 55,9%; respectivamente, mostrando uma diminuição significativa em todos os grupos em relação ao controle. Estes resultados comprovam que a vacinação com uma formulação que contém o peptídeo da proteína ribossômica PO objeto desta invenção seja fundido à proteína Bm86 ou combinado com a mesma provoca uma maior afetação na sobrevivência e nos parâmetros biológicos de R. microplus, o que se traduz em um controle mais eficiente das infestações deste carrapato.

[00097] Exemplo 9. Determinação da capacidade protetora do peptídeo da proteína PO de Ixodes scapularis (pPOIs) frente a infestações com o carrapato /. scapularis.

[00098] Procedeu-se então à avaliação da capacidade imunogênica do peptídeo compreendido entre os aminoácidos 267-302 da proteína ribossômica P0 de /. scapularis, homólogo ao peptídeo imunogênico da proteínas P0 de R. microplus e R. sanguineus. Estes peptídeos apresentam uma identidade de sequência entre si de 68%. A síntese química do peptídeo de /. scapularis e a conjugação com a hemocianina KLH foram realizadas de maneira similar àquelas descritas no Exemplo 3. Posteriormente, 12 coelhos Nova Zelândia brancos, machos, foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos experimentais de seis coelhos cada um, os quais foram imunizados e desafiados com larvas, ninfas e neóginas de /. scapularis. Os imunógenos tiveram com adjuvante Montanide 888 VG em uma proporção 60/40 de imunógeno/adjuvante e foram aplicados da seguinte forma:

[00099] Grupo 1 : Imunização por via subcutânea com o conjugado pP0ls-KLH em uma dose de 500 pg/animal (equivalente a 250 pg de peptídeo/animal).

[000100] Grupo 2 (controle negativo): Imunização por via subcutânea com KLH em uma dose de 250 pg/animal.

[000101] Ambos os grupos foram imunizados nos dias 0, 21 e 36. As coletas dos soros foram feitas nos dias 0,14, 21, 28, 36 e 60 depois de começada a experiência. A determinação dos títulos de anticorpos anti- peptídeo P0 e a infestação, coleta, contagem e manutenção dos carrapatos foram efetuadas de maneira semelhante àquelas descritas no Exemplo 6.

[000102] Não foi observada mudança no comportamento normal, nem febre em nenhum dos animais. Títulos de anticorpos anti-pPOIs nos animais imunizados com o conjugado pPOIs-KLH foram detectados a partir do dia 14 pós-imunização.

[000103] Esses anticorpos alcançaram títulos superiores a 1:3500 no dia 36, que se mantiveram até o final da experiência (Figura 12).

[000104] Em 168 horas, já haviam sido coletados todas os estágios depositados dos dois grupos. A recuperação e a viabilidade de todos os estágios de carrapatos com que os animais foram infestados, o peso das teleóginas e das ovas e a % de eclosão dos ovos foram comparados entre os grupos por meio de um ANOVA e do teste de comparações múltiplas de Bonferroni (p<0,05). A recuperação de ninfas e teleóginas apresentaram diferenças estatisticamente significativas no grupo vacinado com o conjugado pPOIs-KLH em relação ao grupo de controle negativo. Foi observada uma elevada mortalidade de larvas depositadas e recém-mudadas com diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (Figura 13A). O peso das teleóginas e das ovas não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. O índice de eficiência de conversão em ovos foi de 45,49% no grupo de controle negativo e de 40,19% no imunizado com o conjugado pPOIs-KLH e a percentagem de eclosão dos ovos foi de 95,20% para o controle negativo e de 83,10% para o grupo imunizado com o conjugado. Este último parâmetro mostrou-se significativo quando foi feita a análise estatística do mesmo (Figura 13 B).

[000105] Exemplo 10. Determinação da capacidade protetora da pPO de L. salmonis (pPOLs).

[000106] Para avaliar a utilidade das pPOLs como antígeno para vacina 80 salmões com um peso promédio de 80 g foram distribuídos em 4 grupos de 20 peixes cada um. Dois grupos foram injetados por via intraperitoneal (i.p.) com o conjugado POLs-KLH, a uma dose de 10 pg do conjugado/g de peso corporal dos salmões (equivalente a 5 pg de pPOLs/g de peso do salmão), formulado no adjuvante oleoso Montanide 888. Os outros dois grupos foram controles negativos imunizados com 5 pg de KLH /g de peso corporal, formulado no adjuvante Montanide 888. Transcorridas 500 unidades térmicas arbitrárias, os salmões estavam adaptados à água de mar e foram infestados com 2000 ± 200 copepoditos por tanque. O desafio foi realizado em condições de escuridão, aeração constante, oxigenação de apoio, controle de temperatura (15-17 °C) e salinidade (aproximadamente 30 ppm). Com o propósito de evitar a perda de copepoditos e facilitar a fixação dos mesmos, o fluxo de água nos tanques foi mantido fechado e uma troca manual era realizada a cada 48 horas além de terem sido instaladas peneiras de 220 p nos tubos de desaguamento. O momento da inclusão dos copepoditos foi definido como o dia 0. Estas condições foram mantidas por 40 dias desde o início do desafio.

[000107] Depois de 40 dias os peixes foram sacrificados, com uma sobredose de anestesia, e procedeu-se então à avaliação dos resultados mediante a contagem de parasitas. Os resultados que aparecem na Tabela 3 mostraram uma diminuição significativa no número de parasitas por peixe nos grupos vacinados com pPOLs-KLH, em comparação com os controles negativos vacinados somente com KLH.

[000108] Tabela 3. Resultados da contagem de parasitas ao término da experiência de desafio.

[000109] Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas. Foi aplicado um teste de comparações múltiplas de Dunn (p<0,001).

[000110] Da mesma forma, foram realizadas experiências com resultados similares àqueles descritos neste exemplo, mas os salmões foram imunizados com fragmentos de 20 aminoácidos do peptídeo pPOLs. Os peptídeos avaliados tinham a sequência PAAGATKAAAAAPAKADEPE, SKFASVAAAPAAGATKAAAA, e

[000111] EYLADPSKFASVAAAPAAGA, respectivamente, e foram conjugados com KLH. Embora todos os peptídeos tenham conferido proteção, os melhores resultados foram obtidos com o peptídeo correspondente aos últimos 20 aminoácidos da pPOLs.

[000112] Exemplo 11. Determinação da capacidade protetora do peptídeo da proteína P0 de C. rogercresseyi (pPOCr) fundido a epítopos T promíscuos e do conjugado pPOCr-KLH.

[000113] Foi avaliada a capacidade imunogênica do conjugado pPOCr-KLH e do pPOCr fundido a outras moléculas imunopotencializadoras como os epítopos T promíscuos. Neste caso foram igualmente utilizados os epítopos ttP2 do toxoide tetânico e o epítopo de células T do vírus do sarampo (TT-MVF). O peptídeo quimérico TT-MVF-pP0Cr foi detectado no sobrenadante de cultura da cepa MP36 de P. pastoris transformada com um plasmídio que continha uma cópia da sequência codificadora para a pPOCr fundida em sua extremidade N-terminal a duas cópias dos epítopos T promíscuos sob o controle do promotor da álcool oxidase 1 (AOX 1), precedido pelo sinal de secreção da sacarose invertase de S. cerevisiae (ssSUC2). Os níveis de expressão foram estimados em aproximadamente 150 mg/L de cultura.

[000114] Procedeu-se então à avaliação da utilidade desse polipeptídeo, obtido por via recombinante, como antígeno para vacina e à comparação do mesmo com os efeitos do conjugado pPOCr-KLH. Para tanto 120 salmões com um peso promédio de 80 g foram distribuídos em 6 grupos, de 20 peixes cada um. Os grupos experimentais foram:

[000115] Grupos 1 e 2: Os peixes foram injetados por via i.p. com o conjugado pPOCr-KLH, a uma dose de 10 pg/g de peso corporal (equivalente a 5 pg de pPOCr Zg de peso).

[000116] Grupos 3 e 4: Os peixes foram injetados por via i.p. com KLH, a uma dose de 5 pg/g de peso.

[000117] Grupos 5 e 6: Os peixes foram injetados por via i.p. com a proteína quimérica TT-MVF-pPOCr, a uma dose de 5 pg/g de peso.

[000118] Em todos os casos, o imunógeno foi formulado no adjuvante oleoso Montanide 888. O procedimento experimental foi semelhante àquele do Exemplo 10, exceto que neste caso como o piolho do mar C. rogercresseyi tem um ciclo de vida menor, com 24 dias (depois de completar dois ciclos de vida do parasita) os peixes foram abatidos com uma sobredose de anestesia, e procedeu-se à avaliação dos resultados mediante contagem dos parasitas. Na tabela que se segue estão apresentados os resultados que mostraram uma diminuição significativa no número de parasitas por peixe nos grupos vacinados com pPOCr-KLH e TT-MVF-pPOCr, em comparação com os controles negativos vacinados somente com KLH. A maior proteção, avaliada como número de parasitas/peixe foi observada no grupo TT-MVF- pPOCr.

[000119] Tabela 4. Resultados da contagem de parasitas ao término da experiência de desafio.

[000120] Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas. Foi aplicado um teste de comparações múltiplas de Dunn (p<0,001).

[000121] Exemplo 12. Determinação da imunogenicidade do pPOCr fundido ao polipeptídeo my32.

[000122] Para avaliar a capacidade imunogênica do pPOCr fundido ao antígeno my32, já conhecido, foi gerado o peptídeo quimérico my32-pP0Cr, utilizando-se o mesmo procedimento descrito nos exemplos anteriores para todas as proteínas de fusão. Neste caso, o plasmídio com o qual foi transformada cepa MP36 de P. pastoris continha uma cópia do pPOCr fundido por sua extremidade N-terminal a uma cópia de my32, sob o controle do promotor AOX 1, precedida pelo sinal de secreção ssSUC2. O peptídeo quimérico my32-pP0Cr foi detectado no sobrenadante de cultura em uma concentração de aproximadamente 135 mg/L de cultura.

[000123] Para avaliar a utilidade deste polipeptídeo obtido por via recombinante como antígeno para vacina, 160 salmões com um peso promédio de 80 g foram distribuídos em grupos, de 20 peixes cada um. Os grupos experimentais foram:

[000124] Grupos 1 e 2: Os peixes foram injetados com o conjugado pPOCr-KLH a uma dose de 10 pg g de peso corporal (equivalente a 5 g de POCr Zg de peso).

[000125] Grupos 3 e 4: Os peixes foram injetados com KLH a uma dose de 5 pg/g de peso corporal.

[000126] Grupos 5 e 6: Os peixes foram injetados com a proteína quimérica my32-pP0Cr, a uma dose de 5 g/g de peso.

[000127] Grupos 7 e 8: Os peixes foram injetados com a proteína my32, obtida por via recombinante, a uma dose de 5 pg g de peso.

[000128] Todos os animais receberam o imunógeno por via i.p. e formulado com o adjuvante Montanide 888. O procedimento experimental seguido foi o mesmo que aquele do Exemplo 11. Na Tabela 5 estão mostrados os resultados das amostras em 24 dias pós- desafio, que comprovam uma diminuição significativa no número de parasitas por peixe nos grupos vacinados com pPOCr-KLH, my32- pPOCr e my32, em comparação com os animais inoculados somente com KLH. A maior proteção, avaliada como número de parasitas/peixe foi observada no grupo my32-pP0Cr.

[000129] Tabela 5. Resultados da contagem de parasitas ao término da experiência de desafio.

[000130] Lei ras diferentes indicam d iferenças esl tatisticamente significativas. Foi aplicado ‘um teste de comparações múltiplas de Dunn (p<0,001).

Claims (8)

1. Composição imunogênica para o controle de infestações por ectoparasitas, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo isolado consistindo dos aminoácidos da região entre 267 e 301 da proteína ribossômica PO dos referidos ectoparasitas, em que o referido peptídeo é selecionado dentre o grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16; em que o referido peptídeo isolado foi fusionado ou conjugado com outra molécula para a aumentar sua imunogenicidade ou potencializar seu efeito protetor.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula é selecionada dentre o grupo composto por hemocianina, um epítopo de células T proveniente da toxina tetânica ou da proteína de fusão do vírus do sarampo, proteínas que formam partículas semelhantes a vírus do vírus da doença hemorrágica do coelho, a proteína Bm86 do carrapato R. microplus,a proteína Rs86 do carrapato R. sanguineuse a proteína my32 piolho do mar C. rogercresseyi ou L. salmonis.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido peptídeo é obtido por técnicas de DNA recombinante ou síntese química.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o peptídeo é obtido pela expressão em leveduras, bactérias, plantas, larvas de insetos, células de insetos ou de mamíferos.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que que compreende ainda um adjuvante de vacina.

6. Uso de ácidos nucleicos nakedque codificam um polipeptídeo da proteína ribossômica PO dos ectoparasitas, em que os referidos polipeptídeos são selecionados dentre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição de vacina para controlar infestações por ectoparasitas, em que o referido ácido nucleico isolado foi fusionado ou conjugado com outra molécula para a aumentar sua imunogenicidade ou potencializar seu efeito protetor.

7. Uso de um polipeptídeo da proteína ribossômica PO de ectoparasitas, em que os referidos polipeptídeos são selecionados dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição de vacina, como definida na reivindicação 1, para controlar infestações por ectoparasitas, em que o referido polipeptídeo foi fusionado ou conjugado com outra molécula para a aumentar sua imunogenicidade ou potencializar seu efeito protetor.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os referidos ectoparasitas são carrapatos, piolhos do mar ou patógenos transmitidos com os referidos ectoparasitas.

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