JP2021526866A - 犬トキソプラズマの感染を予防するワクチン及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(1)人のトキソプラズマの感染率は極めて高く、一般的は20%〜50%であり、特に女と児童の感染率の方がより高い。世界中の約1/3の人がトキソプラズマに感染している。中国のトキソプラズマの感染率が5%〜20%である。妊婦が感染後、臨床症状があるかどうかに関わらず、約50%の可能性で垂直感染が発生し、早産、流産、胎児の発育異常及び死産などの症状を引き起こす。6%〜10%のエイズ患者がトキソプラズマ病を合併する。エイズ患者が罹患する脳炎の50%がトキソプラズマの感染によるものである。
(2)猫、犬、豚、羊、牛、兎などの家畜がトキソプラズマに感染することは非常に普通で、その感染率は10%〜50%に達し、豚、牛、羊の流産率が30〜40.7%に達する。豚は、トキソプラズマに感染することにより「豚高熱症候群」も引き起こし、病死率は60%に達する。従って、トキソプラズマ病は、家畜流産の重要な原因の一つであり、畜産業に影響する。
(3)家庭で飼うペットの数の増加に伴って、犬や猫はペットとして広く飼われている。犬はトキソプラズマの重要な中間宿主で、猫は唯一の終宿主であり、人と緊密に接触することにより、人がトキソプラズマ病の主要伝染源になってしまう。
(4)トキソプラズマは全ての有核細胞を感染させることができ、動物(豚、牛、羊、鶏、鴨、グースなど)の感染率の平均は15.4%で、感染後のトキソプラズマがブラディゾイトの形式で、全身の各組織に広がる。これによって、トキソプラズマが肉、乳、卵類を通じて大量に食品市場に流入してしまい、ヒトの伝染源になり、動物性食品の公衆衛生安全に対する深刻な脅威になる。
(2)前記組換え発現ベクターを大腸菌に転換して、遺伝子工学菌が得られるステップと、
(3)前記遺伝子工学菌を発酵培養して、cyclophilin変異体タンパク質を発現するステップと、
(4)遺伝子工学菌の菌体を破砕した上清液を回収して、トキソプラズマcyclophilin変異体タンパク質を分離精製するステップと、を備える、上記cyclophilin変異体タンパク質を作製する方法。
1)配列表におけるSEQ ID NO2の配列を有するポリペプチド、
2)1)と少なくとも80%の相同性を有するポリペプチド。
フォワードプライマー:ATGGAATTC ATGGAAAACGCGGGCGTGCGCAAA
リバースプライマー:AAGCTT TTCTTTTTTGCCAATATCGGTAA
Claims (21)
- cyclophilin変異体タンパク質であり、SEQ ID 2に記載のアミノ酸配列により構成される、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
- SEQ ID 2に記載の前記アミノ酸配列を代替、削除、または置換して得られるタンパク質変異体である、請求項1に記載のトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
- SEQ ID 2に記載の前記アミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列により構成されるタンパク質である、請求項1に記載のトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
- SEQ ID 2に記載のアミノ酸配列をコードする核酸であり、SEQ ID 1に記載の核酸配列を有する、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質をコードできる核酸。
- (1)関連遺伝子を発現ベクタープラスミドにクローンして、組換え発現ベクターが得られるステップと、
(2)前記組換え発現ベクターを大腸菌に転換して、遺伝子工学菌が得られるステップと、
(3)前記遺伝子工学菌を発酵培養して、cyclophilin変異体タンパク質を発現するステップと、
(4)遺伝子工学菌の菌体を破砕した上清液を回収して、トキソプラズマcyclophilin変異体タンパク質を分離精製するステップと、を備える、請求項1〜3のいずれか一項に記載のcyclophilin変異体タンパク質を作製する方法。 - ステップ(2)の前記ベクターがPET−28aであり、大腸菌がBL21(DE3)である、請求項5に記載の方法。
- ステップ(2)の前記組換え遺伝子工学菌がDH5α/pET28a−18Cである、請求項5に記載の方法。
- ステップ(3)の前記遺伝子工学菌がトキソプラズマcyclophilin変異体タンパク質を構成的発現の形式により発現する、請求項5に記載の方法。
- ステップ(3)における前記組換えトキソプラズマcyclophilin変異体タンパク質が下記三種のポリペプチドの任意一種である、
1)配列表におけるSEQ ID NO2の配列を有するポリペプチド、
2)1)と少なくとも80%の相同性を有するポリペプチド、
請求項5に記載の方法。 - ステップ(1)における前記発現ベクタープラスミドが、pMAL−p5x、pET−42b(+)、pCold−GST、pTrcHis A、pGEX−KG、pET−28b(+)、pBAD102/D−TOPO、pAmCyan、ptdTomato、pCS105、pET101/D−TOPO、pET−24a(+)、pET−24c(+)、pET−24d(+)、pET−27b(+)、pET−25b(+)、pET−28c(+)、pET−29a(+)、pET−29b(+)、pET−29c(+)、pET−30b(+)、pET−30c(+)、pET−30 Xa/LIC、pET−30 EK/LIC、pET−31b(+)、pET−32b(+)、pET−32c(+)、pET−32 EK/LIC、pET−32 Xa/LIC、pET−33b(+)、pET−39b(+)、pET−40b(+)、pET−41a(+)、pET−41b(+)、pET−42c(+)、pET−43.1a(+)、pET−43.1b(+)、pET−43.1c(+)、pET−43.1 EK/LIC、pET−43.1 EK/LIC、pET−44a(+)、pET−44b(+)、pET−44c(+)、pET−44 EK/LIC、pET−45b(+)、pET−46 EK/LIC、pET−47b(+)、pET−48b(+)、pET−49b(+)、pETDuet−1、pET−37b(+)、pET−5b(+)、pET−51b(+)、pET−52b(+)、pBV220、pkk232−8、pET−15b、pQE−16、pCold IV、pQE−70、pSUMO、pET−SUMO、pDsRed−Express2、pColdS−SUMO、pCold TF、pCold III、pCold II、pCold I、pE−SUMO 、pCold−ProS2、pBAD202/D−TOPO、pACYC184、pBAD/Thio−TOPO、pBad/Myc−His C、pBad/Myc−His B、pBad/Myc−His A、pBad/His C、pBad/His B、pBad/His A、pBAD−TOPO、pET−23b(+)、pET−23a(+)、pET−23c(+)、pET−23(+)、pET−12b(+)、pET−12c(+)、pET−12a(+)、pET−11b(+)、pET−11a(+)、ET−11c(+)、pBad24、pQE−81L、pQE−32、pQE−9、pQE−31、pQE−60、pQE−40、pET−50b(+)、pET−26b(+)、pET−32a(+)、pET−21b(+)、pET−22b(+)、pET−14b、pET−16b、pET−19b、pET−20b(+)、pET−21d(+)、pET−21c(+)、pET−21b(+)、pET−21a(+)、pET−30a(+)、pGEX−4T−3、pGEX−5X−2、pG−KJE8、pGro7、pCDFDuet−1、pTf16、pEZZ18、pBAD18、pMAL−c5x、pMal−p2E、pMal−p2X、pET−41 EK/LIC、pMal−c4X、pTrcHis B、pET−3b(+)、pGEX−3X、pGEX−4T−2、pGEX−4T−1、pTrc99a、pET−His、pALEX a,b,c、pACYC177、pKD4、pKD20、pMXB10、pKJE7、pRSET B、pGEX−2T、pRSFDuet−1、pCOLADuet−1、pET−3a(+)、pGEX−6P−3、pGEX−6P−2、pGEX−6P−1、pGEX−5X−3、pGEX−5X−1、pGEX−2TK、pRSET A、pMal−c2G、pMal−c2E、pMal−c2X、pRSET C、及び上記任意のベクターを基づいて改造されるベクターも含む、請求項5に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の前記トキソプラズマcyclophilin変異体タンパク質及び精製ラベルを含む可溶性融合タンパク質。
- 前記精製ラベルのアミノ酸配列がSEQ ID NO.3である、請求項11に記載のタンパク質。
- 犬トキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項1、2また11に記載の前記タンパク質の応用。
- ヒトトキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項1、2また11に記載の前記タンパク質の応用。
- 猫トキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項1、2また11に記載の前記タンパク質の応用。
- 請求項1に記載の前記アミノ酸配列及びその変異体、または請求項4に記載の前記ヌクレオチド配列及びその至適化配列、及び医学上に許容されるベクターを含む、トキソプラズマのサブユニット不活性化ワクチン。
- 請求項1に記載の前記アミノ酸配列及びその変異体、または請求項4に記載の前記ヌクレオチド配列及びその至適化配列、及び医学上に許容されるベクターを含む犬トキソプラズマの感染を予防する薬剤の作製において請求項16に記載の前記サブユニット不活性化ワクチンの応用。
- 前記サブユニット不活性化ワクチンがトキソプラズマ抗原を請求項12に記載の前記発現ベクターに接続し、原核発現工学菌に転換して、高効率の発現を誘導して、精製することにより得られるタンパク質が可溶性タンパク質で、ワクチン佐剤を添加することにより作製される、請求項16の前記サブユニット不活性化ワクチンを作製する方法。
- 前記タンパク質の濃度が少なくとも10μg/ml〜300μg/mlである、請求項18のいずれか一項に記載の前記犬トキソプラズマ病を予防するワクチン。
- 前記原核発現工学菌がBL21(DE3),BLR(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)、C41(DE3)pLysS、C41(DE3)、BL21、AD494、BL21−SI、BL21 trxB(DE3)pLysS、BL21 trxB(DE3)、Origami 2(DE3)pLysS、B834(DE3)pLysS、Rosetta−gami B(DE3)、Rosetta−gami B(DE3)pLysS、Rosetta−gami(DE3)pLysS、NovaBlue T1、Tuner(DE3)pLacI、Tuner(DE3)pLysS、Tuner(DE3)、Tuner、RosettaBlue(DE3)pLysS、RosettaBlue(DE3)pLacI、RosettaBlue(DE3)、RosettaBlue、Rosetta−gami B(DE3)pLacI、Rosetta−gami B、Rosetta−gami2(DE3)pLacI、Rosetta−gami 2、Rosetta−gami(DE3)pLacI、Rosetta−gami、Rosetta2(DE3)pLacI、Rosetta2(DE3)、Rosetta 2、Origami 2(DE3)pLacI、Rosetta(DE3)pLacI、Rosetta、OrigamiB(DE3)pLacI、OrigamiB(DE3)pLysS、Origami B、Origami 2、Origami(DE3)pLacI、Origami(DE3)pLysS、Origami、BL21(DE3)pLacI、BLR、B834(DE3)、BLR(DE3)、DH10MultiBac、ER2738、ET12567(pUZ8002)、BL21−AI、BJ5183、Rosetta−gami 2(DE3)pLysS、Rosetta−gami 2(DE3)、Rosetta−gami(DE3)、BL21(DE3)pLySs、Rosetta 2(DE3)pLySs、Rosetta(DE3)pLySs、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)、Origami 2(DE3)、BL21−Gold(DE3)、M15[pREP4]、Sure、BL21 Star(DE3)pLySs、BL21 Star(DE3)、及び上記任意の工学菌に基づいて改造される工学菌である、請求項18に記載の前記原核発現工学菌。
- SEQ ID 1またはその変異体と対応する核酸及び生物学ベクターを含む宿主細胞。
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