CN108822200B - 一种用于预防犬弓形虫感染的疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

发明提供一种具有弓形虫免疫原性的蛋白，该蛋白为cyclophilin突变体蛋白，由SEQ ID 2所述氨基酸序列组成。本发明还提供一种可编码具有弓形虫免疫原性的蛋白的核酸，具有SEQ ID 1所述的核酸序列。本发明提供一种疫苗，其中疫苗是将弓形虫抗原基因双酶切后连接pET28a等原核表达载体，转化入BL21(DE3)等原核表达工程菌，诱导其高效表达，纯化后得到的蛋白为可溶性蛋白，并且保持其特有的免疫原性。本发明对cyclophilin蛋白的序列进行优化，使其在原核细胞大肠杆菌中的表达量显著增加。本发明提供的疫苗可以在工程菌种制备，再添加疫苗佐剂，制备而成，其疫苗保持其特有的免疫原性，适合于工业化生产。

Description

一种用于预防犬弓形虫感染的疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学和生物学领域，涉及一种用于预防犬弓形虫感染的疫苗和制备方法，尤其涉及疫苗在犬弓形虫病感染预防中的应用。

背景技术

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由孢子虫纲、弓形虫属的龚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种寄生于动物或人的细胞内的多宿主原虫病，是一种呈世界性分布的人畜共患寄生虫病，猫科动物是终末宿主，人和多种动物是中间宿主。弓形虫病已成为我国亟待解决的重要公共卫生问题之一，其原因主要体现在以下几点：(1)人类弓形虫感染率极高，一般为20％～50％，尤其是妇女和儿童，感染率更高，全球约有1/3的人感染弓形虫，我国人群弓形虫感染率为5％～20％。孕妇感染后不管是否有临床症状，大约50％可发生垂直传播，造成早产、流产、胎儿发育畸形或死胎等症状；有6％～10％的艾滋病患者并发弓形虫病，而且艾滋病病人所患脑炎中有50％是由弓形虫感染所引起的。(2)猫、犬、猪、羊、牛、兔等家畜感染弓形虫非常普遍，其感染率高达10％～50％，猪、牛、羊的流产率达到30-40.7％；猪感染弓形虫还可引起“无名高热”，病死率达60％，因此弓形虫病是造成家畜流产的重要因素之一，影响畜牧业生产。(3)随着家庭饲养宠物犬的数量不断增加，犬猫作为伴侣动物更是掀起一阵"犬猫宠物热"，犬作为弓形虫的重要中间宿主，猫作为唯一终末宿主，与人接触亲密，成为人类弓形虫病的主要传染源。(4)弓形虫可以感染所有的有核细胞，(猪牛羊鸡鸭鹅等)动物感染率平均为15.4％，感染后弓形虫以缓殖子形式遍布全身各个组织。这就造成弓形虫很容易经肉、乳、蛋类大量流入食品市场，成为人类的传染源，严重威胁着动物性食品的公共卫生安全。

然而，迄今为止国内外仍然没有理想的商品化防治犬弓形虫病的疫苗和药物，弓形虫感染后可引起宿主保护性免疫应答，因此研制安全、有效的疫苗应是弓形虫病良好的预防措施。弓形虫疫苗的研制从60年代至今一直围绕全虫疫苗。全虫疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，但灭活疫苗对小鼠缺乏免疫保护性，因此无实际应用价值；弓形虫速殖子经紫外线、放射线及化学试剂等处理后毒力减弱，能诱导较强的免疫应答，如Ts-4、T-263和S48，但减毒活疫苗存在减毒不充分和毒力返祖等危险，因此弱毒疫苗不能广泛使用；本发明的基因工程疫苗是将弓形虫抗原基因在高效表达载体中表达，从而得到大量纯化的单一抗原，其优点是免疫原性好、生物安全性高、免疫刺激性小。综合以上论述可以发现，基因工程疫苗是弓形虫疫苗发展的希望，更具有开发应用价值。

弓形虫的发育可分成五个阶段，即滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，其中前两个阶段是在中间宿主内进行，而后三个阶段只在终末宿主也就是猫科动物的肠道和体表上。虫体发育过程是猫科动物食入发育成熟的卵囊或者包含弓形虫包囊的动物组织，卵囊内的子孢子或者包囊内的滋养体就会侵入机体消化道，且逐渐移动到肠上皮细胞，并在细胞内呈现球虫型的发育和繁殖。

犬患弓形虫病多因食入了孢子化的卵囊或吞食含有包囊及滋养体的肉、内脏等而引起感染，除此之外还可经受损的皮肤、呼吸道、眼及胎盘等途径感染。患犬多是1岁以内的幼犬或青年犬，怀孕母犬可感染弓形虫病引起流产、早产，成年犬多呈隐性感染或一过性，但也有发生死亡的病例的报道。另外，该病的发生还与犬具有的食粪恶习或者捕食鼠类等相关。当犬食入猫排出的卵囊后，里面的子孢子会通过淋巴液和血液循环侵入肠道组织以外的细胞中，并进行双芽方式繁殖，生成很多速殖子，此时为急性感染期。当机体产生免疫力时，速殖子会变成缓殖子，并形成包囊，且会长时间生存在脑、眼、骨骼肌以及心中，此时为慢性感染期。如果犬没有形成免疫力和抵抗力，加之弓形虫具有很强毒性，就可能导致机体出现急性发病。反之，如果弓形虫繁殖收到阻碍，就会出现轻微的发病或者没有表现出任何临床症状。

亲环蛋白(cyclophilin,CyP)是广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白质，在结构上高度保守。目前，已经发现，CyP存在于细粒棘球绦虫(Taenia echinococcus)、马来丝虫(Filaria malayi)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmondiumfalciparum)、犬新孢子虫(Neospora caninum)、日本血吸虫(Schistosomiasisjaponica)、痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)及柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)等寄生虫中

发明内容

针对目前问题，本发明提供一种用于预防犬弓形虫感染的重组亚单位灭活疫苗和应用，利用基因工程技术，克隆并改造弓形虫cyclophilin基因，将改造后的cyclophilin基因转入工程菌进行表达，经诱导后重组抗原获得高效表达，并对重组抗原的特异性和免疫原性进行生理性研究，表现良好的免疫原性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：

本发明第一个目的是提供一种具有弓形虫免疫原性的蛋白，由SEQ ID 2所述氨基酸序列组成。该序列的来源如下：我们对蛋白的空间结构及疏水性，针对cyclophilin蛋白的氨基酸序列进行改造，同时利用密码子优化网站http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm对改造后的氨基酸序列进行密码子优化，以利于其在大肠杆菌中更高效的表达。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一种具有弓形虫免疫原性的蛋白，该蛋白为cyclophilin突变体蛋白，由SEQ ID 2所述氨基酸序列组成。

所述的具有弓形虫免疫原性的蛋白，该蛋白由SEQ ID 2所述氨基酸序列取代、删除、或置换得到蛋白突变体。

所述的具有弓形虫免疫原性的蛋白，该蛋白是与SEQ ID 2所述氨基酸序列有90％以上同源性的氨基酸序列组成的蛋白。

所述的具有弓形虫免疫原性的蛋白，该蛋白是与SEQ ID 2所述氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列组成的蛋白。

制备以上蛋白的方法，将所述SEQ ID 1或其突变体对应的核酸酶切后连接到载体中，转化或转染到原核或真核细胞中进行表达。

一种制备上述cyclophilin突变体蛋白的方法，其特征在于：

(1)克隆相关基因到表达载体质粒中，获得重组表达载体；

(2)所述重组表达载体转化大肠杆菌，获得基因工程菌；

(3)所述基因工程菌进行发酵培养，表达cyclophilin突变体蛋白；

(4)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，分离纯化弓形虫cyclophilin突变体蛋白。

所述的制备cyclophilin突变体蛋白的方法方法中，步骤(2)所述载体为PET-28a，大肠杆菌为BL21(DE3)。

所述的制备cyclophilin突变体蛋白的方法方法中，步骤(2)所述重组基因工程菌为DH5α/pET28a-18C。

所述的制备cyclophilin突变体蛋白的方法方法中，步骤(3)所述基因工程菌表达弓形虫cyclophilin突变体蛋白为组成型表达。

所述的制备cyclophilin突变体蛋白的方法方法中，步骤(3)中所述的重组弓形虫cyclophilin突变体蛋白为如下三种多肽的任意一种：

1)含有序列表中的SEQ ID NO2序列的多肽；

2)与1)所述多肽至少80％同源的多肽；

弓形虫cyclophilin突变体蛋白在制备预防犬弓形虫感染的亚单位灭活疫苗中的应用。

弓形虫cyclophilin突变体蛋白在制备预防在制备人弓形虫疫苗中的应用，在制备猫弓形虫疫苗中的应用。

一种可编码具有弓形虫免疫原性的蛋白的核酸，编码SEQ ID 2所述氨基酸序列的核酸，具有SEQ ID 1所述的核酸序列。

本发明提供一种弓形虫亚单位灭活疫苗，该疫苗包括权利要求1所述氨基酸序列及其突变体，或权利要求4所述核苷酸序列及其优化序列，以及医学上可接受的载体。

所述弓形虫亚单位灭活疫苗在制备预防犬弓形虫感染的药物中的应用，该药物包括权利要求1所述氨基酸序列及其突变体，或权利要求4所述核苷酸序列及其优化序列，以及医学上可接受的载体。

一种制备所述亚单位灭活疫苗的方法，将弓形虫抗原连接到权利要求12所述的表达载体上，转化入原核表达工程菌，诱导其高效表达，纯化后得到可溶性融合蛋白，添加疫苗佐剂制备而成。优选疫苗佐剂为MF59佐剂或赛比克206佐剂制备而成。

所述的用于预防犬弓形虫病的疫苗中，所述蛋白的浓度至少为10μg/ml～300μg/ml.

为了的更好的技术效果，以上用于预防犬弓形虫病的疫苗，所述蛋白的浓度为100μg/ml。

上述的原核表达工程菌，其特征在于，所述原核表达工程菌为BL21(DE3)，BLR(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)、C41(DE3)pLysS、C41(DE3)、BL21、AD494、BL21-SI、BL21trxB(DE3)pLysS、BL21trxB(DE3)、Origami 2(DE3)pLysS、B834(DE3)pLysS、Rosetta-gami B(DE3)、Rosetta-gami B(DE3)pLysS、Rosetta-gami(DE3)pLysS、NovaBlue T1、Tuner(DE3)pLacI、Tuner(DE3)pLysS、Tuner(DE3)、Tuner、RosettaBlue(DE3)pLysS、RosettaBlue(DE3)pLacI、RosettaBlue(DE3)、RosettaBlue、Rosetta-gami B(DE3)pLacI、Rosetta-gami B、Rosetta-gami2(DE3)pLacI、Rosetta-gami 2、Rosetta-gami(DE3)pLacI、Rosetta-gami、Rosetta2(DE3)pLacI、Rosetta2(DE3)、Rosetta 2、Origami 2(DE3)pLacI、Rosetta(DE3)pLacI、Rosetta、OrigamiB(DE3)pLacI、OrigamiB(DE3)pLysS、Origami B、Origami 2、Origami(DE3)pLacI、Origami(DE3)pLysS、Origami、BL21(DE3)pLacI、BLR、B834(DE3)、BLR(DE3)、DH10MultiBac、ER2738、ET12567(pUZ8002)、BL21-AI、BJ5183、Rosetta-gami 2(DE3)pLysS、Rosetta-gami 2(DE3)、Rosetta-gami(DE3)、BL21(DE3)pLySs、Rosetta 2(DE3)pLySs、Rosetta(DE3)pLySs、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)、Origami 2(DE3)、BL21-Gold(DE3)、M15[pREP4]、Sure、BL21Star(DE3)pLySs、BL21Star(DE3)，及以上述任意工程菌为基础改造而成的工程菌。

一种宿主细胞，包括所述SEQ ID 1或其突变体对应的核酸，以及生物学载体。

本发明第二个目的是提供一种载体，所述载体包括核苷酸序列SEQ ID 1；所述载体为pET-28a、pMAL-p5x、pET-42b(+)、pCold-GST、pTrcHis A、pGEX-KG、pET-28b(+)、pBAD102/D-TOPO、pAmCyan、ptdTomato、pCS105、pET101/D-TOPO、pET-24a(+)、pET-24c(+)、pET-24d(+)、pET-27b(+)、pET-25b(+)、pET-28c(+)、pET-29a(+)、pET-29b(+)、pET-29c(+)、pET-30b(+)、pET-30c(+)、pET-30Xa/LIC、pET-30EK/LIC、pET-31b(+)、pET-32b(+)、pET-32c(+)、pET-32EK/LIC、pET-32Xa/LIC、pET-33b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42c(+)、pET-43.1a(+)、pET-43.1b(+)、pET-43.1c(+)、pET-43.1EK/LIC、pET-43.1EK/LIC、pET-44a(+)、pET-44b(+)、pET-44c(+)、pET-44EK/LIC、pET-45b(+)、pET-46EK/LIC、pET-47b(+)、pET-48b(+)、pET-49b(+)、pETDuet-1、pET-37b(+)、pET-5b(+)、pET-51b(+)、pET-52b(+)、pBV220、pkk232-8、pET-15b、pQE-16、pCold IV、pQE-70、pSUMO、pET-SUMO、pDsRed-Express2、pColdS-SUMO、pCold TF、pCold III、pCold II、pCold I、pE-SUMO、pCold-ProS2、pBAD202/D-TOPO、pACYC184、pBAD/Thio-TOPO、pBad/Myc-His C、pBad/Myc-His B、pBad/Myc-His A、pBad/His C、pBad/His B、pBad/His A、pBAD-TOPO、pET-23b(+)、pET-23a(+)、pET-23c(+)、pET-23(+)、pET-12b(+)、pET-12c(+)、pET-12a(+)、pET-11b(+)、pET-11a(+)、ET-11c(+)、pBad24、pQE-81L、pQE-32、pQE-9、pQE-31、pQE-60、pQE-40、pET-50b(+)、pET-26b(+)、pET-32a(+)、pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-14b、pET-16b、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21d(+)、pET-21c(+)、pET-21b(+)、pET-21a(+)、pET-30a(+)、pGEX-4T-3、pGEX-5X-2、pG-KJE8、pGro7、pCDFDuet-1、pTf16、pEZZ18、pBAD18、pMAL-c5x、pMal-p2E、pMal-p2X、pET-41EK/LIC、pMal-c4X、pTrcHis B、pET-3b(+)、pGEX-3X、pGEX-4T-2、pGEX-4T-1、pTrc99a、pET-His、pALEX a,b,c、pACYC177、pKD4、pKD20、pMXB10、pKJE7、pRSET B、pGEX-2T、pRSFDuet-1、pCOLADuet-1、pET-3a(+)、pGEX-6P-3、pGEX-6P-2、pGEX-6P-1、pGEX-5X-3、pGEX-5X-1、pGEX-2TK、pRSET A、pMal-c2G、pMal-c2E、pMal-c2X、pRSET C及以上述任意载体为基础改造而成的载体，优选地，表达载体为pET-28a载体。

本发明第三个目的是提供一种可溶性融合蛋白，所述可溶性融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO.2及其突变体。

较佳地，所述一种可溶性融合蛋白包括弓形虫cyclophilin突变体蛋白，以及组氨酸纯化标签；其中编码所述弓形虫cyclophilin突变体蛋白的DNA序列选自SEQ ID NO.1；所述的纯化标签的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

优选，可溶性融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明第三个目的是提供一种宿主细胞，其特征在于，含有上述的载体，或已用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转染。

本发明第四个目的是提供一种制备可溶性融合蛋白的方法，其特征在于，包括通过宿主细胞表达可溶性融合蛋白，并进行分离。

本发明第五个目的是提供一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括SEQ ID 2中核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

优选，所述疫苗是将弓形虫抗原双酶切后连接到pET28a表达载体，转化入BL21(DE3)工程菌，诱导其高效表达，纯化后得到的蛋白为可溶性融合蛋白，再添加MF59佐剂或赛比克206佐剂，制备而成，其疫苗保持其特有的免疫原性，适合于工业化生产。

本发明的优点在于：选用了弓形虫有效地抗原基因进行亚单位灭活疫苗的研制，该抗原制备的亚单位灭活疫苗具有较强的细胞免疫和体液免疫效果，能够诱导机体的先天性免疫应答，分泌各种细胞炎性因子，从而有效的预防犬弓形虫病。本发明对cyclophilin蛋白的序列进行优化，在原核细胞大肠杆菌中的表达量为优化前的表达量的2倍。本发明提供的疫苗可以在工程菌种制备，再添加疫苗佐剂，制备而成，其疫苗保持其特有的免疫原性，适合于工业化生产。

附图说明

图1.SEQ ID 2基因ORF扩增结果。

附图中：M,DL2000marker；C18，目的基因片段。

图2.弓形虫cyclophilin蛋白和弓形虫cyclophilin突变体蛋白的SDS-PAGE结果。

附图中：M,蛋白marker；r1,弓形虫cyclophilin蛋白可溶性表达；r2,弓形虫cyclophilin突变体蛋白可溶性表达；

图3.弓形虫cyclophilin重组突变体表达蛋白纯化SDS-PAGE结果。

附图中：M,蛋白marker；r,重组cyclophilin突变体蛋白。

图4.Western-blot鉴定体外表达重组蛋白特异性结果。

附图中：M,蛋白marker；r,重组cyclophilin突变体蛋白。

图5.弓形虫cyclophilin重组突变体蛋白刺激小鼠RAW264.7细胞产生TNF-α水平。

图6.弓形虫cyclophilin重组突变体蛋白刺激小鼠树突状细胞产生IL-12水平。

图7.弓形虫cyclophilin重组突变蛋白疫苗注射小鼠产生抗体效价图。

图8.弓形虫cyclophilin重组突变体蛋白疫苗对小鼠抗弓形虫感染的保护作用。

图9.弓形虫cyclophilin重组突变体蛋白疫苗注射犬产生抗体效价图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：弓形虫重组cyclophilin突变体蛋白原核表达载体的构建

根据核酸序列SEQ ID NO.1人工合成基因，同时根据原核表达载体pET28a物理图谱设计引物并引入酶切位点。

上游引物：ATGGAATTC ATGGAAAACGCGGGCGTGCGCAAA

下游引物：AAGCTT TTCTTTTTTGCCAATATCGGTAA

利用人工合成的方法合成SEQ ID NO.1基因序列，利用上述引物大量扩增，并将PCR纯化产物克隆至pMD-18-T经酶切和测序鉴定阳性克隆菌，阳性质粒经EcoRI和Hind III进行双酶切后纯化的目的片段连接到原核表达载体pET28a，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用EcoRI和Hind III进行双酶切反应鉴定，获得原核表达质粒pET28a-C18。将pET28a-C18转化入BL21(DE3)工程菌，挑取单个菌落接种到5ml LB液体培养基中(含100μg/ml卡那霉素)中，37℃，220rpm振荡培养过夜。cyclophilin突变体ORF扩增结果见附图1。

实施例2：表达蛋白的纯化

(1)表达蛋白的提取及可溶性验证

以选取的转化了重组质粒pET-28a(+)-C18的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃过夜振荡培养。次日将种子液转接到800mL LB液体培养基中37℃扩繁，监测菌液OD600至0.6～0.7时，在最适条件下诱导表达。离心收集菌体，菌体用20mLPBS悬浮，反复冻融5次(-80℃,1h/37℃,10min)后，经超声处理,离心取上清即为可溶性蛋白(具有活性的蛋白)。沉淀用10mL变性缓冲液悬浮，室温振摇1h，离心取上清即为非可溶性蛋白(变性蛋白)。将上述两种蛋白分别进行SDS-PAGE检测以验证目的蛋白的可溶性，若目的蛋白主要位于可溶性蛋白上清，说明为可溶性表达；若目的蛋白大部分位于非可溶性蛋白性蛋白上清液中，则说明为包涵体形式表达。结果表明，改造后的弓形虫cyclophilin突变体蛋白为可溶性表达，其表达量为120mg/L,未突变改造的cyclophilin蛋白为可溶性表达(制备方法同文献：弓形虫亲环蛋白基因的克隆及原核表达，李运娜，2010年)，其表达量为60mg/L，其结果见附图2。

(2)融合表达蛋白的纯化

将镍柱使用A液(PBS)平衡至稳定，使用A液冲洗系统，流速20mL/min，冲洗2min，将平衡后的镍柱连接至上样接口，以流速1mL/min流穿样品，使目的蛋白挂柱。流穿结束后，将已挂有目的蛋白的镍柱连接至洗脱接口，首先用A液平衡镍柱，流速1mL/min，洗掉未结合的杂蛋白。保持流速不变，设置梯度洗杂条件，B液(PBS，含有1M咪唑)浓度为10％，即咪唑浓度为100mM,时间30min，洗掉非特异性吸附杂蛋白。保持流速不变，设置洗脱条件，B液浓度为30％，即咪唑浓度为300mM，时间120min，洗脱目的蛋白，将收集的目的蛋白进行SDS-PAGE，观察纯度。其结果见附图3。通过Western-blot鉴定体外表达重组突变体蛋白特异性结果见附图4。

实施例3：表达产物对小鼠巨噬细胞免疫原性检测

将RAW264.7细胞以0.5×106/mL接种到24孔培养板上，每孔0.5mL，5％CO2，37℃培养24h。吸出上清后将制备好的弓形虫重组cyclophilin突变体蛋白溶于RAW264.7细胞培养液中，并按1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的浓度，0.5mL/孔添加至24孔板中，等体积PBS作为阴性对照。将细胞培养板置于5％CO2，37℃培养箱中培养48h，收集上清液，通过ELISA实验检测TNF-a水平。结果表明TNF-a的产生随蛋白浓度的升高而增加，范围从40pg-310pg不等，结果见附图5。说明弓形虫重组cyclophilin突变体蛋白可以刺激RAW264.7细胞产生TNF-a。

实施例4:表达产物对小鼠树突状细胞免疫原性检测

分离小鼠树突状细胞，调整细胞浓度为0.5×106个/mL，接种至24孔组织细胞培养板中，每孔接种0.5mL。将处理的弓形虫重组cyclophilin突变体蛋白分别以每孔100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的浓度添加至细胞培养板中，每孔0.5mL。将细胞培养板置于5％CO2，37℃培养箱中培养24h，收集培养上清液，通过ELISA实验检测上清液中IL-12水平。结果表明各组产生IL-12含量呈现蛋白浓度依赖性，即随着蛋白浓度升高而增加，其结果见附图6。结果说明弓形虫重组cyclophilin突变体蛋白可以刺激小鼠树突状免疫细胞产生大量的IL-12。

实施例5:弓形虫重组亚单位疫苗小鼠免疫攻毒保护实验

将125只8～10周龄左右，雌SPF级BALB/c小鼠分成5组，每组25只，其中第一组cyclophilin实验组I(佐剂为MF59，30μg/只，皮下注射)，第二组为cyclophilin实验组II(佐剂为206，30μg/只，皮下注射)，第三组为阴性对照组I(相等体积量PBS，配以MF59佐剂，皮下注射)，第四组阴性对照组II(相等体积量的PBS，配以206佐剂，皮下注射)，第五组为空白对照组(相等体积量的PBS，皮下注射)。各组注射三次，间隔两周。每周检测抗体滴度。第三次免疫注射一周后腹腔注射纯化的弓形虫滋养体103个/只，每天观察记录小鼠状况。

抗体结果显示一免后三周抗体水平迅速提高，并在6周时达到顶点，疫苗抗体效价见附图7。

免疫保护性试验结果显示实验组免疫存活率明显优于阴性对照组和空白对照组，且MF59佐剂疫苗组效果优于206佐剂疫苗组对照组(见附图8)。

实施例6:弓形虫重组亚单位疫苗犬免疫攻毒保护率实验

选择无病原(包括无寄生虫病、无病毒病、无细菌性传染病)的实验动物犬(比格犬，性成熟的母犬)20只，尤其是无弓形虫、新孢子虫、犬瘟热、犬传染性肝炎、细小病毒等传染性病原。将实验动物分为2组，其中第一组为cyclophilin实验组(佐剂为MF59，300μg/只，皮下注射)，共15只犬。第二组为空白对照组(相等体积量的PBS，皮下注射)，共5只犬。各组注射三次，间隔两周。每周检测抗体滴度。第三次免疫注射一周后腹腔注射纯化的弓形虫滋养体104个/只，30天后，将各犬解剖，通过PCR检测脑、心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、咬肌、舌肌、腹肌组织感染弓形虫情况，若其中任意组织PCR结果为阳性，则该犬判定为弓形虫感染，若全部组织PCR结果为阴性，则判定为弓形虫保护。

抗体结果显示免疫组一免后抗体水平持续升高，疫苗抗体效价见附图9。

攻毒后结果显示对照组犬全部判定为弓形虫感染，免疫组15只犬中13只犬判定为弓形虫保护，2只犬判定为弓形虫感染，保护率为86％。

综合上述实验结果，本发明提供的一种弓形虫亚单位灭活疫苗，对犬弓形虫免疫保护率较高，可以用来作为犬弓形虫病的预防和治疗性候选疫苗。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (16)

1.一种具有弓形虫免疫原性的蛋白，其特征在于：该蛋白为cyclophilin突变体蛋白，由SEQ ID No.2所述氨基酸序列组成。

2.一种编码具有弓形虫免疫原性的蛋白的核酸，其特征在于：编码SEQ ID No.2所述氨基酸序列的核酸。

3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种制备具有弓形虫免疫原性的蛋白的方法，其特征在于：

(1)克隆编码如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白的基因或如SEQ ID No.1所示核苷酸序列到表达载体质粒中，获得重组表达载体；

(2)所述重组表达载体转化大肠杆菌，获得基因工程菌；

(3)所述基因工程菌进行发酵培养，表达具有弓形虫免疫原性的蛋白；

(4)回收基因工程菌菌体破碎后的上清液，分离纯化具有弓形虫免疫原性的蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述表达载体质粒为PET-28a，步骤(2)所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述基因工程菌表达具有弓形虫免疫原性的蛋白为组成型表达。

7.一种可溶性融合蛋白，其特征在于，包括权利要求1所述具有弓形虫免疫原性的蛋白，以及纯化标签。

8.根据权利要求7所述可溶性融合蛋白，其特征在于：所述的纯化标签的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

9.权利要求1所述的具有弓形虫免疫原性的蛋白，或权利要求7或8所述的可溶性融合蛋白在制备预防犬弓形虫感染的亚单位灭活疫苗中的应用。

10.权利要求1所述的具有弓形虫免疫原性的蛋白，或权利要求7或8所述的可溶性融合蛋白在制备预防人弓形虫感染的亚单位灭活疫苗中的应用。

11.权利要求1所述的具有弓形虫免疫原性的蛋白，或权利要求7或8所述的可溶性融合蛋白在制备预防猫弓形虫感染的亚单位灭活疫苗中的应用。

12.一种弓形虫亚单位灭活疫苗，其特征在于，该疫苗包括权利要求1所述的具有弓形虫免疫原性的蛋白，或权利要求2或3所述的编码具有弓形虫免疫原性的蛋白的核酸，以及医学上可接受的载体。

13.权利要求12所述亚单位灭活疫苗在制备预防犬弓形虫感染的药物中的应用。

14.一种制备权利要求12所述的亚单位灭活疫苗的方法，其特征在于，含有权利要求7或8所述的可溶性融合蛋白编码序列的表达载体转化入原核表达工程菌，诱导其高效表达，纯化后得到可溶性融合蛋白，添加疫苗佐剂制备而成。

15.根据权利要求14所述的制备权利要求12所述的亚单位灭活疫苗的方法，其特征在于：所述蛋白的浓度为10μg/ml～300μg/ml.

16.一种宿主细胞，其特征在于：包括如权利要求2或3所述的核酸，以及生物学载体。

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