CN111407886B

CN111407886B - 一种用于预防刚地弓形虫感染的纳米材料亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111407886B
Application number: CN202010128520.6A
Authority: CN
Inventors: 李祥瑞; 徐立新; 严若峰; 宋小凯; 于正青
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: CN111407886A

Abstract

本发明公开了一种刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗的制备方法和应用。该疫苗是利用PLGA包被刚地弓形虫重组蛋白H2A1形成纳米粒子，H2A1重组蛋白来自于刚地弓形虫组蛋白，其氨基酸序列见SEQ ID NO.1所示，经原核表达后用纳米材料PLGA包被成一个全新的疫苗形式。通过评估该疫苗的免疫保护效果后发现，该疫苗能够延长感染小鼠存活时间，表明其可提供部分免疫保护力，本发明可用于预防动物感染弓形虫病。

Description

一种用于预防刚地弓形虫感染的纳米材料亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物兽药技术领域，具体涉及一种用于预防刚地弓形虫感染的纳米材料亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，几乎能够感染所有的温血脊椎动物，包括人、猪、鸡等，对人类及家畜造成重大的危害及经济损失，具有重要的公共卫生意义。刚地弓形虫的生活史十分复杂，可分为有性生殖和无性生殖，在终末宿主猫科动物的小肠上皮细胞内以有性生殖为主，在中间宿主的有核细胞内以无性生殖为主，刚地弓形虫的孢子化卵囊、速殖子及包囊具有感染性。据统计，全世界约有20％的人感染刚地弓形虫，感染后一般呈隐形感染，不表现出任何临床症状；但对免疫缺陷的及后天免疫力低下的感染者有致命的威胁。治疗刚地弓形虫常用的药物有磺胺氯吡嗪和乙胺嘧啶，但磺胺药对人体副作用多、耐受性差；乙胺嘧啶可引起宿主骨髓造血功能下降，尤其对再次感染刚地弓形虫的宿主细胞预防作用不明显。疫苗预防仍是防治该病的重要手段，传统的疫苗有弱毒活疫苗、亚单位疫苗及DNA疫苗等。目前只有减毒活S48菌株疫苗，已获准在欧洲和新西兰的绵羊中用于预防刚地弓形虫的感染，但其造价昂贵，有副作用，存在毒性返强的可能。近年来，研究者主要集中在利用刚地弓形虫速殖子表面抗原(如SAG1、SAG2及SAG3等)制备疫苗的研究上。制备出的疫苗在一定程度上能保护宿主，提高宿主的存活率，但对形成组织囊过程中的刚地弓形虫无法提供免疫保护，尚没有相应的疫苗被批准应用于临床。

本发明基于亚单位疫苗，因其不直接利用病原体制备，因此可有效避免生物安全风险，同时制备的疫苗具有使用安全、性质稳定及生产成本低的优点。使用聚乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)纳米佐剂可加速、延长或増强抗原特异性免疫反应，其常与疫苗共同组成疫苗制剂。PLGA在体内可分解并被代谢，目前美国FDA已批准PLGA用于药物的载体，且在2015版的《中华人民共和国药典》中收录了关于PLGA的技术指标。纳米佐剂是指微粒直径<1,000nm的颗粒物，具有较好的生物相容性和独特的理化性质，与传统佐剂相比，纳米佐剂因具有靶向性、缓释性、安全性及高效性等优点。而传统弗式佐剂易在注射部位产生副作用，例如肿胀、红斑及硬结等，且由于弗式佐剂粘度大而造成注射难度大，因此并未得到广泛应用。有报道显示，长期使用弗式佐剂可能会导致脑病的发生。因此，基于PLGA为载体构建具有良好免疫保护性的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗，对于人类自身健康和畜牧业的高效发展均有重要的价值及意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于预防刚地弓形虫感染的纳米材料亚单位疫苗，该疫苗能够有效抵抗刚地弓形虫的急性感染，有效预防弓形虫病，且具有较高的安全性。

本发明的另一目的是提供该疫苗的制备方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

SEQ ID NO.1所示的重组组蛋白在制备预防刚地弓形虫感染的疫苗中的应用。

一种刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗，所述刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗是由PLGA包被重组蛋白H2A1制成，该重组蛋白来源于刚地弓形虫组蛋白，其氨基酸序列见SEQID NO.1所示。

所述的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗优选主要通过以下方法制备得到：

(1)配制6％聚乙烯醇溶液；

(2)配制0.05g/mL的PLGA二氯甲烷溶液作为有机相；

(3)取1000μg/mL的重组H2A1溶液滴加到等体积6％聚乙烯醇溶液中形成内部水相；

(4)将上述内部水相与有机相进行混合，超声破碎，形成w/o混合液；将w/o混合液逐滴滴加至等体积的6％聚乙烯醇溶液中，滴加完成后继续涡旋，4℃下进行超声破碎，最终形成w/o/w混合液；

(5)挥发去除w/o/w混合液中的有机溶剂，离心分离沉淀，重悬后冻干即得刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗冻干粉。

本发明所述的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制6％聚乙烯醇溶液；

(2)配制0.05g/mL的PLGA二氯甲烷溶液作为有机相；

(3)取1000μg/mL的H2A1蛋白溶液滴加到等体积6％聚乙烯醇溶液中形成内部水相；

作为所述的制备方法的一种优选，步骤(4)将上述内部水相与有机相进行混合，4℃下进行超声破碎，超声破碎仪的功率设成30～50W，超声5～10s，间隔5～10s，超声时间为4～5min，最终形成w/o混合液；将w/o混合液置于涡旋条件下，逐滴滴加至等体积的6％聚乙烯醇中，滴加完成后继续涡旋2min～5min；4℃下进行超声破碎，超声破碎仪的功率设成30～50W，超声5～10s，间隔5～10s，超声时间为4～5min，最终形成w/o/w混合液。

作为所述的制备方法的一种优选，步骤(4)中每次超声破碎功率为40W，超声5s，间隔5s。

作为所述的制备方法的一种优选，步骤(5)将磁力搅拌器置于通风橱环境下，把小型磁力转子置于离心管中并将其固定在磁力搅拌器上，打开离心管的盖子，边搅拌边挥发约4h，使其中的有机溶剂完全挥发即可；将离心管中的液体4℃下40,000r/min离心50min后，液体分为上清和沉淀；用去离子水重悬沉淀，一般重悬后液体体积保证在4mL；重悬完成后将液体转移至西林瓶中并置于-80℃环境下保存至少2h；完成后将冰冻样品放置于冷冻干燥机中冻干24h，取出样品后轻弹即成冻干粉末状。

作为所述的制备方法的一种优选，所述的重组H2A1蛋白通过以下方法制备：

利用RNA提取试剂盒提取刚地弓形虫RH株的总RNA，提取的RNA进行反转录成cDNA，依据SEQ ID NO.1的序列设计PCR引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增刚地弓形虫组蛋白H2A1的ORF区域，将扩增后的PCR产物利用DNA连接酶与线性空载体pET-32a连接，形成pET-32a-H2A1重组质粒；大量扩增上述重组质粒，将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有pET-32a-H2A1重组质粒的大肠杆菌；将上述大肠杆菌置于LB液体培养基中大量扩增，加入一定量的IPTG后，继续培养4h以诱导重组蛋白H2A1的表达，通过离心回收菌体，并超声破碎，将超声后的菌体离心分离沉淀并溶于Binding Buffer中，经0.22μm滤膜过滤后经His标签蛋白纯化柱进行纯化重组蛋白得重组H2A1蛋白。

本发明所述的刚地弓形虫纳米材料包被亚单位疫苗在制备治疗和预防小鼠感染弓形虫病的药物中的应用。

本发明具有以下优点和效果：

(1)目前利用PLGA纳米材料制备刚地弓形虫亚单位疫苗的研究与报道较少，且目前绝大部分疫苗对刚地弓形虫的免疫效果较差，本发明填补了PLGA纳米材料用于刚地弓形虫亚单位疫苗研究的空白。(2)组蛋白H2A1是刚地弓形虫中染色质的重要组成部分，基因非常保守，在基因调控过程中发挥重要作用。本发明将组蛋白H2A1进行重组人工制备用于预防刚地弓形虫。(3)本发明对报道的PLGA纳米材料的包被工艺进行了改进，提升了PLGA纳米材料疫苗的包被率。(4)所述的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗粒径为100-200nm。(5)所述的刚地弓形虫纳米材料可用于制备预防哺乳动物感染的药物的载体。(6)所述的用于预防刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗可用于慢性、急性及先天性刚地弓形虫感染的免疫保护。

附图说明

图1SDS-PAGE分析纯化后的H2A1重组蛋白

M：蛋白Mark(kDa)；1：纯化后的H2A1重组蛋白

图2Western blot分析天然H2A1蛋白和rH2A1蛋白

M：蛋白Mark(kDa)；1：人工感染刚地弓形虫大鼠血清识别rH2A1蛋白；2：正常大鼠血清识别rH2A1蛋白；3：rH2A1免疫大鼠血清识别刚地弓形虫速殖子全虫可溶性蛋白；4：正常大鼠血清识别刚地弓形虫速殖子全虫可溶性蛋白

图3纳米材料亚单位疫苗H2A1-PLGA的扫描电镜结果

图4小鼠免疫rTgH2A1及PLGA包被rTgH2A1前后抗体IgG₁和IgG_2a水平的变化A图为小鼠免疫rTgH2A1及PLGA包被rTgH2A1前后抗体IgG₁水平的变化；B图为小鼠免疫rTgH2A1及PLGA包被rTgH2A1前后抗体IgG₁和IgG_2a水平的变化

图5小鼠免疫rTgH2A1及PLGA包被rTgH2A1前后细胞因子IFN-γ(A图)、IL-4(B图)、IL-10(C图)及IL-17(D图)的变化

图6小鼠免疫rTgH2A1及PLGA包被rTgH2A1后腹腔感染200个刚地弓形虫速殖子后的生存曲线

图7小鼠免疫纳米材料疫苗前后抗体水平的变化

图8小鼠免疫纳米材料疫苗前后细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17的变化

图9小鼠腹腔感染200个刚地弓形虫速殖子后的生存曲线

具体实施方式

基础材料：

1.刚地弓形虫RH株：保存在本实验室的液氮中，每3个月经小鼠腹腔感染后收集腹水复壮。

2.实验动物：18-22g的SPF级BABL/c小鼠及200-220g的SPF级SD大鼠，购自扬州大学实验动物中心，自出生至实验结束均饲养在屏障系统中，自由采食和饮水。

3.质粒载体：含有pET-32a的质粒保存在本实验室-80℃冰箱中。

4.工具酶及试剂：DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞、Rapid Taq MasterMix购自于南京诺唯赞公司；DNA Ligation Kit、EcoR I限制性内切酶、Hind III限制性内切酶及反转录试剂盒购自TaKaRa公司；DAB显色试剂盒及蛋白分子量Marker购自ThermoFisher Scientific公司；PLGA(分子量为40,000-75,000Da，LA/GA为65:35)、聚乙烯醇(分子量为31,000-50,000Da)及弗式佐剂购自于西格玛奥德里奇公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒及RNA提取试剂盒购自于Omega公司；大肠杆菌感受态细胞购自于诺唯赞公司；Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP购自于abcam公司；His标签蛋白纯化柱购自于GE公司；PEG20,000购自于碧云天生物技术公司；聚丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰、考马斯亮蓝购自上海化学试剂分装厂；其余试剂为国产分析纯。

5.主要仪器设备：凝胶成像系统(ChemiDocXRS+，Bio-Rad公司)；蛋白质电泳系统(Mini-PROTEAN，Bio-Rad公司)；半干转膜仪(Trans-Blot SD，美国伯乐公司)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)；冷冻超速离心机(美国Beckman Coulter公司)；真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)；扫描电子显微镜(SU8010，日立公司)。

实施例1刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗H2A1-PLGA的制备

1.基因工程菌制备

按照Omega公司的RNA提取试剂盒说明书提取刚地弓形虫RH株的总RNA，按照TaKaRa公司的反转录试剂盒说明书对提取的RNA进行反转录成cDNA，用SEQ ID NO.2和SEQID NO.3的引物进行PCR扩增。

PCR体系如下：

PCR程序如下：

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳110V 30min后，参照OMEGA公司的胶回收试剂盒说明书将扩增后的543bp条带处进行切胶回收，参照TaKaRa公司EcoR I及Hind III限制性内切酶使用说明书对空载体pET-32a及回收的PCR产物分别进行双酶切，将双酶切后的pET-32a及PCR产物按照1:6的摩尔比参照TaKaRa公司的Ligation Kit说明书进行连接，形成pET-32a-H2A1重组质粒。参照诺唯赞公司感受态细胞的说明书将重组质粒pET-32a-PSMB1转化至E.coli DH5α感受态细胞中，大量扩增并按照Omega公司的质粒小提试剂盒说明书提取质粒，得到大量的重组质粒，并转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。

2.刚地弓形虫重组蛋白H2A1的表达纯化及Western blot分析

刚地弓形虫重组蛋白H2A1的表达纯化：将含有pET-32a-H2A1重组表达质粒BL21(DE3)菌按1:100体积比例接种于LB液体培养基中，置于37℃、180r/min的摇床上，培养至OD₆₀₀为0.5时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达，继续置于上述环境中4h；回收经诱导的菌液，4,800r/min离心10min后弃上清，收集沉淀至上清Binding Buffer中，超声破碎40min(超声功率35W，超声3s，间隔2s)；按照GE公司蛋白纯化柱说明书对H2A1重组蛋白进行纯化；取适量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析纯化情况，结果表明该重组蛋白纯化效果良好(附图1)；将纯化后的重组蛋白放入透析袋中，参照ThermoFisher公司的BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白浓度，用PEG20,000浓缩纯化获得的H2A1重组蛋白至1mg/mL，再用0.22μm滤器过滤重组蛋白以除菌。

Western blot分析：①rH2A1免疫大鼠血清的制备：取上述200μg纯化的重组蛋白与等体积的弗式佐剂混合乳化，皮下免疫大鼠，保证每只大鼠注射剂量不超过1mL，随后每次免疫均间隔2周，分别进行二免、三免、四免及五免。五免结束后通过眼眶采血的方式采血分离血清，用纯化的重组蛋白包被ELISA平板并检验抗体效价。②人工感染刚地弓形虫大鼠血清的制备：取刚地弓形虫RH株速殖子200个/只免疫大鼠，在第4周通过眼眶采血的方式采血取血清。将虫体蛋白、重组蛋白分别进行SDS-PAGE电泳，结束后将凝胶置于NC膜上进行半干转印，转印完成后加入一抗、二抗并显色拍照(附图2)。从附图2中可见一条特异性的条带，而对照组则没有出现，表明该重组蛋白具有良好的抗原性，同时大鼠重组蛋白抗血清能识别天然虫体蛋白。

3.纳米材料亚单位疫苗H2A1-PLGA的制备

制备纳米材料亚单位疫苗H2A1-PLGA：配制6％聚乙烯醇(PVA)：取玻璃小烧杯置于磁力搅拌器上，放入磁力转子并进行加热，加入适量的离子水，称取1.2g聚乙烯醇(PVA)加入到小烧杯中，待聚乙烯醇(PVA)全部溶解后，加入去离子水定容至20mL即可。将装有0.05gPLGA的50mL离心管及二氯甲烷移入通风橱内，向离心管中加入1mL二氯甲烷，滴加过程应迅速，完成后盖上离心管盖子并摇晃混匀溶解，形成有机相。取一支新的离心管并移至通风橱中，加入2mL的6％聚乙烯醇(PVA)中并置于涡旋振动仪上，取1000μg/mL的H2A1共2mL目的蛋白逐滴滴加至新的离心管中，滴加速度为1s滴加1滴，滴加完成后继续涡旋2min。最终形成内部水相。将上述内部水相与有机相进行混合，4℃下进行超声破碎，超声破碎仪的功率设成40W，超声5s，间隔5s，超声时间为4min，最终形成w/o混合液。将w/o混合液置于涡旋条件下，逐滴滴加至等体积的6％聚乙烯醇(PVA)中，滴加完成后继续涡旋2min。4℃下进行超声破碎，超声破碎仪的功率设成40W，超声5s，间隔5s，超声时间为4min。最终形成w/o/w混合液。将磁力搅拌器置于通风橱环境下，把小型磁力转子置于离心管中并将其固定在磁力搅拌器上，打开离心管的盖子，边搅拌边挥发约4h，使其中的有机溶剂完全挥发即可。将离心管中的液体4℃下40,000r/min离心50min后，液体分为上清和沉淀，将上清分离至50mL离心管中。按照以下公式计算包被率：

用去离子水重悬沉淀，一般重悬后液体体积保证在4mL左右。重悬完成后将液体转移至西林瓶中并置于-80℃环境下保存至少2h。完成后将冰冻样品放置于冷冻干燥机中冻干24h，取出样品后轻弹即成冻干粉末状。封装好的疫苗可置于4℃下保存。取出少量PLGA纳米材料亚单位疫苗冻干粉末送至南京农业大学进行扫描电子显微镜观察。结果发现PLGA包裹重组蛋白亚单位疫苗的包埋率为74.76％，PLGA纳米亚单位疫苗的粒径约为100-200nm(附图3)。

实施例2刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗的免疫保护性研究1

1.试验设计

本项目实验研究中所有的实验方案均符合南京农业大学动物伦理、福利等相关规定，符合江苏省科技厅动物福利保护条例。

重为18-22g的SPF级雄性BABL/c小鼠自出生至实验结束均饲养在隔离屏障系统中，无刚地弓形虫的环境中，自由采食和饮水。将小鼠随机分组，每组15只，分别用PBS(CONTROL组)、rTgH2A1(H2A1组)和PLGA包被rTgH2A1(H2A1-PLGA组)经皮下多点注射免疫小鼠，剂量为每只小鼠100μL(表1)。在第0天、第7天及第14天通过小鼠眼眶采血以测定免疫相关的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10及抗体效价IgG₁、IgG_2a。第4周每组任选10只小鼠，腹腔注射新鲜的刚地弓形虫RH株速殖子200个/只以绘制其生存曲线。

表1试验分组与免疫程序

2.免疫保护效果的观察

2.1抗体效价

在试验的第0天、第7天及第14天分别通过眼眶采血的方式收集小鼠血清，用于测定血清中IgG₁和IgG_2a的含量。在第14天时，H2A1-PLGA组的IgG₁的水平显著高于CONTROL组(P<0.01)(附图4A)。在第7天及第14天时，H2A1-PLGA组及H2A1组中检测到较高水平的IgG_2a，均显著高于CONTROL组(P<0.001)，且与H2A1组相比，H2A1-PLGA组产生的IgG2a显著高于H2A1组(P<0.001)(图4B)。

2.2免疫相关细胞因子水平

在试验的第0天、第7天及第14天分别通过眼眶采血的方式收集小鼠血清，用于测定血清中的IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的含量。如附图5所示，在第7天及第14天时，H2A1组及H2A1-PLGA组产生的IFN-γ显著高于CONTROL组(P<0.001)，且H2A1-PLGA组在第7天时(P<0.05)及第14天时(P<0.001)显著高于H2A1组；H2A1在第7天时分泌的IL-4要显著高于CONTROL组(P<0.05)，且在第14天时，H2A1-PLGA组分泌的IL-4要显著高于CONTROL组(P<0.001)及H2A1组(P<0.01)；而在第14天时，H2A1-PLGA组分泌的IL-17要显著高于CONTROL组(P<0.05)。

2.3攻虫试验结果

在腹腔感染200个刚地弓形虫速殖子后，CONTROL组、H2A1组及H2A1-PLGA组均在16天内全部死亡，而CONTROL组在11内全部死亡(附图6)。H2A1组及H2A1-PLGA组小鼠虽全部死亡，但与Control组相比，H2A1组小鼠开始死亡时间延长2天，H2A1-PLGA组小鼠开始死亡时间延长4天，H2A1组小鼠全部死亡时间延长3天，H2A1-PLGA组小鼠全部死亡时间延长5天。

实施例3刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗的免疫保护性研究2

1.试验设计

体重为18-22g的SPF级雄性BABL/c小鼠自出生至实验结束均饲养在隔离屏障系统中，无刚地弓形虫的环境中，自由采食和饮水。将小鼠随机分组，每组15只，分别用PBS(Control组)、pET-32a标签蛋白(pET32a组)、PLGA纳米材料(PBS-PLGA组)、PLGA包被pET-32a标签蛋白(pET32a-PLGA组)和PLGA包被H2A1重组蛋白(H2A1-PLGA组)经皮下多点注射免疫小鼠，剂量为每只小鼠100μL；一免后第2周加强免疫，免疫方式及剂量与一免相同；在第1周、第2周及第4周通过小鼠眼眶采血以测定免疫相关的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10及抗体效价IgG₁、IgG_2a，每组任选5只小鼠；第4周每组任选10只小鼠(非采血小鼠)，腹腔注射新鲜的刚地弓形虫RH株速殖子200个/只以绘制其生存曲线。分组及免疫程序见表2。

表2试验分组与免疫程序

2.免疫保护效果的观察

2.4抗体效价

在试验的第7天及第14天分别通过眼眶采血的方式收集小鼠血清，用于测定血清中IgG₁和IgG_2a的含量。在第14天，H2A1-PLGA组的IgG₁的水平显著高于Control组(P<0.001)及PBS-PLGA组(P<0.01)(附图7)。而在H2A1-PLGA组中检测到较高水平的IgG_2a，无论在第7天还是第14天，均显著高于其他四个组(P<0.001)，且IgG_2a的OD值随着时间的增加而增加。

2.5免疫相关细胞因子水平

在试验的第7天及第14天分别通过眼眶采血的方式收集小鼠血清，用于测定血清中的IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的含量。如附图8所示，在第7天及第14天时，H2A1-PLGA组小鼠所产生的IFN-γ水平显著高于其他四个组(P<0.001)；在第14天时，H2A1-PLGA组小鼠产生的IL-4水平显著高于其他四个组(P<0.001)。在第7天时，H2A1-PLGA组小鼠产生的IL-10水平显著高于PBS-PLGA组小鼠(P<0.05)，在第14天时，H2A1-PLGA组小鼠产生的IL-17水平显著高于Control组(P<0.05)。

2.6攻虫试验结果

在腹腔感染200个刚地弓形虫速殖子后，Control组、pET-32a组及PBS-PLGA组均在11天内全部死亡，而pET32a-PLGA组小鼠则在第12天全部死亡(附图9)。H2A1-PLGA组小鼠虽全部死亡，但与Control组相比，其开始死亡时间延长3天，全部死亡时间延长5天。

3.免疫保护效果分析

对于感染刚地弓形虫的个体，体液免疫应答发挥了重要作用，IgG的含量升高在抑制细胞内刚地弓形虫的活性有着重要作用。通过IgG₁及IgG_2a的检测发现，与Control组相比，H2A1-PLGA组小鼠产生的IgG₁与IgG_2a含量均显著提高，且IgG_2a的OD值比IgG₁的要高。这表明PLGA纳米材料包被重组蛋白H2A1疫苗可诱导小鼠产生持续的Th1型为主的体液免疫，同时也激起了Th2型细胞免疫反应。细胞因子在激活辅助性T细胞的过程中起重要作用。Th1细胞介导细胞免疫，同时也与IgG_2a的合成有关，Th1细胞能分泌细胞因子IFN-γ，进而活化巨噬细胞产生NO以杀灭虫体。大量研究表明，宿主抵抗刚地弓形虫的感染主要是依赖于IFN-γ的Th1型免疫。Th2细胞可介导体液免疫，促进合成IgG₁的同时还可增强B细胞的抗原提呈能力，Th2细胞能够分泌IL-4等细胞因子。IL-10主要是由iTreg细胞产生，具有抑制细胞免疫、介导体液免疫的作用；IL-17由Th17细胞产生，在细胞内感染宿主防御过程中发挥重要作用，也参与了抗弓形虫感染。PLGA纳米材料包被重组蛋白H2A1可诱导小鼠产生了IFN-γ及IL-4，且产生的IL-17显著高于Control组。这表明本发明中构建的刚地弓形虫疫苗可激活辅助性T细胞，增强机体免疫力。

本研究中利用200个刚地弓形虫速殖子对小鼠腹腔进行急性感染，H2A1-PLGA组小鼠相较于其他对照组小鼠存活时间明显延长，这表明该疫苗能够提供部分免疫保护力。综上，PLGA纳米材料包被重组蛋白H2A1疫苗能够诱导机体产生强烈的体液和细胞免疫应答，并且可以延长急性感染刚地弓形虫小鼠的存活时间。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种用于预防刚地弓形虫感染的纳米材料亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Trp Leu Cys Asp Trp Ala Lys Glu Pro Glu Val Ser Phe Phe Asp

1 5 10 15

Ser Tyr Lys Ile Ser Ala Gly Asn Thr His Thr Cys Phe Pro Thr Arg

20 25 30

Gly Arg Leu Leu Pro Val Phe Leu Gly Ser Phe Leu His Ser Val Ser

35 40 45

Leu Val Asp Lys Met Ser Ala Lys Gly Lys Gly Gly Arg Ala Lys Lys

50 55 60

Ser Gly Lys Ser Ser Ser Lys Ser Ala Lys Ala Gly Leu Gln Phe Pro

65 70 75 80

Val Gly Arg Ile Gly Arg Tyr Leu Lys Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Arg

85 90 95

Val Gly Ala Gly Ala Pro Val Tyr Met Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu

100 105 110

Cys Ala Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp His Lys

115 120 125

Lys Thr Arg Ile Ile Pro Arg His Ile Gln Leu Ala Val Arg Asn Asp

130 135 140

Glu Glu Leu Ser Lys Phe Leu Gly Gly Val Thr Ile Ala Ser Gly Gly

145 150 155 160

Val Met Pro Asn Val His Ser Val Leu Leu Pro Lys Lys Ser Lys Gly

165 170 175

Lys Lys Ser Gln

180

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaattcatgt ggttgtgcga ttgg 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttttac tgagacttct tgcccttg 28

Claims

1.SEQ ID NO.1所示的刚地弓形虫重组组蛋白H2A1在制备预防哺乳动物刚地弓形虫感染的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗中的应用；其特征在于所述刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗是由PLGA包被刚地弓形虫重组组蛋白H2A1制成，该重组组蛋白H2A1来源于刚地弓形虫组蛋白；所述的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗其制备方法包括以下步骤：

（1）配制6%聚乙烯醇溶液；

（2）配制0.05g/mL的PLGA二氯甲烷溶液作为有机相；

（3）取1000μg/mL的刚地弓形虫重组组蛋白H2A1溶液滴加到等体积6%聚乙烯醇溶液中形成内部水相；

（4）将上述内部水相与所述有机相进行混合，超声破碎，形成w/o混合液；将w/o混合液逐滴滴加至等体积的6%聚乙烯醇溶液中，滴加完成后继续涡旋，4℃下进行超声破碎，最终形成w/o/w混合液；

（5）挥发去除w/o/w混合液中的有机溶剂，离心分离沉淀，重悬后冻干即得所述的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗冻干粉。

2.一种用于哺乳动物的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗，其特征在于：所述刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗是由PLGA包被刚地弓形虫重组组蛋白H2A1制成，该刚地弓形虫重组组蛋白H2A1来源于刚地弓形虫组蛋白，其氨基酸序列见SEQ ID NO.1所示；所述的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗其制备方法包括以下步骤：

（1）配制6%聚乙烯醇溶液；

（2）配制0.05g/mL的PLGA二氯甲烷溶液作为有机相；

3.权利要求2所述的用于哺乳动物的刚地弓形虫纳米材料亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）配制6%聚乙烯醇溶液；

（2）配制0.05g/mL的PLGA二氯甲烷溶液作为有机相；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（4）将上述内部水相与有机相进行混合，4℃下进行超声破碎，超声破碎仪的功率设成30~50W，超声5~10s，间隔5~10s，超声时间为4~5min，形成w/o混合液；将w/o混合液置于涡旋条件下，逐滴滴加至等体积的6%聚乙烯醇中，滴加完成后继续涡旋2min~5min；4℃下进行超声破碎，超声破碎仪的功率设成30~50W，超声5~10s，间隔5~10s，超声时间为4~5min，最终形成w/o/w混合液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中每次超声破碎功率为40W，超声5s，间隔5s。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的刚地弓形虫重组组蛋白H2A1通过以下方法制备：

利用RNA提取试剂盒提取刚地弓形虫RH株的总RNA，提取的RNA进行反转录成cDNA，依据SEQ ID NO.1的序列设计PCR引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增刚地弓形虫组蛋白H2A1的ORF区域，将扩增后的PCR产物利用DNA连接酶与线性空载体pET-32a连接，形成pET-32a-H2A1重组质粒；大量扩增上述重组质粒，将其转化至大肠杆菌BL21 DE3中，得到含有pET-32a-H2A1重组质粒的大肠杆菌；将上述大肠杆菌置于LB液体培养基中大量扩增，加入IPTG后，继续培养4h以诱导重组组蛋白H2A1的表达，通过离心回收菌体，并超声破碎，将超声后的菌体离心分离沉淀并溶于连接缓冲液中，经0.22μm滤膜过滤后经His标签蛋白纯化柱进行纯化重组蛋白得刚地弓形虫重组组蛋白H2A1。

7.权利要求2所述的亚单位疫苗在制备预防哺乳动物感染弓形虫病的药物中的应用。