CN1931363A - 弓形虫代谢分泌抗原疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
弓形虫代谢分泌抗原疫苗及其制备方法，由弓形虫代谢分泌抗原制成。将弓形虫速殖子，腹腔接种小鼠，致死后浸泡于酒精内体表消毒；收集虫体；将腹腔液离心、收集上清，再离心收集上清；将弓形虫速殖子，接种于vero细胞中，继续培养，待细胞全部脱落后，收集培养液离心、上清再离心，收集上清；将腹腔液与培养液反复冻融3次；将腹腔液与细胞培养液以1∶8－10的比例混合；混合液进行蛋白含量测定，蛋白含量为10mg/ml。将混合液与M206佐剂以1∶1的比例混匀，乳化，分装，即为弓形虫复合疫苗，其中的抗原蛋白含量为10mg/ml。本发明将代谢分泌抗原用于抗弓形虫疫苗的制备，有效地诱生体液免疫与细胞免疫。有高于弱毒苗的免疫效力，但无弱毒苗的散毒危险。
Description
技术领域
本发明涉及弓形虫疫苗领域，具体说是一种弓形虫代谢分泌抗原疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法。
背景技术
弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，该虫能感染包括人体在内的所有哺乳动物，对人类健康和畜牧业发展造成严重的损害。到目前为止，对弓形虫疫苗的研制主要有(1)全虫疫苗，包括死疫苗，活疫苗，减毒活疫苗。死疫苗对于人群和家畜无实用价值，活疫苗存在散毒危险而不能推广应用，减毒活疫苗所需毒株需要组织培养细胞系传代，长期保种后，其遗传稳定性不能保证。(2)虫体特异组分疫苗，用免疫化学方法从虫体裂解物或排泄和分泌抗原(ESA)中，提取特定组分为疫苗，虫体特异组分疫苗具有一定的免疫性，但存在提取困难等问题。(3)分子疫苗，有单价分子疫苗和复合多价疫苗，单价分子疫苗如P30(SAG1)抗原疫苗、P22(SAG2)抗原疫苗、P28抗原疫苗、P23抗原疫苗及其他抗原如缓殖子65kDa的抗原、hsp30/bag抗原、P18抗原、PEF(侵入促进因子)、致密颗粒抗原、微线体抗原、54kDa膜抗原疫苗等。复合多价疫苗是将不同抗原分子或不同抗原分子的功能性表位的氨基酸序列结合起来，设计合成联合抗原或联合表位肽段。动物实验表明单价亚单位疫苗效果不理想，目前正在大力发展复合多价疫苗。(4)核酸疫苗，在核酸疫苗方面，弓形虫疫苗的研究尚未开展。迄今为止，尚无弓形虫虫体抗原-弓形虫代谢分泌抗原复合型疫苗。与本发明有关的文献有：
发明内容
本发明的目的在于避免上述疫苗所具有的保护性弱、存在散毒危险、制作困难等缺点，提供一种弓形虫复合型疫苗及其制备方法，这种疫苗可显著提高机体的特异性体液免疫与细胞免疫。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的。
一种弓形虫复合型疫苗，其特征在于由弓形虫抗原制成。
所述的抗原为弓形虫代谢分泌抗原。
所述的代谢分泌抗原为从细胞培养和小鼠腹腔接种所得抗原的混合抗原。
抗原中从细胞培养和小鼠腹腔接种所得抗原的比例为8-10∶1
采用以下步骤完成：
(1)将1×10^5弓形虫速殖子，腹腔接种20-25克体重小鼠，经72-96小时，小鼠出现精神沉郁、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70-75％酒精内体表消毒；每只小鼠用2-3毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体；将所收集的腹腔液以每分钟3000-4000转的速度离心20-30分钟，收集上清，上清再以每分钟3000-4000转的速度离心3-5次，每次离心20-30分钟，收集上清，在-15--20℃保存备用；
(2)将2×10^7弓形虫速殖子，接种于vero非洲绿猴肾细胞细胞中，在培养箱中37℃条件下继续培养，待细胞全部脱落后，收集培养液，以每分钟3000-4000转的速度离心20-30分钟，上清再以每分钟3000-4000转的速度离心3次，每次离心20-30分钟，收集上清在-15--20℃保存备用；
(3)将腹腔液与培养液反复冻融3次；
(4)将腹腔液与细胞培养液以1∶8-10的比例混合；
(5)混合液进行蛋白含量测定，蛋白含量为10mg/ml。
(6)将混合液与M206佐剂以1∶1的比例混匀，乳化，分装，即为弓形虫复合疫苗。
6如权利要求5所述的弓形虫复合型疫苗的制备方法，其特征在于其中的抗原蛋白含量为10mg/ml。
本发明的优点在于：(1)在以往的弓形虫疫苗制备过程中，小鼠腹腔液中大量的代谢分泌抗原在离心后废弃不用，本发明在国内首次将代谢分泌抗原用于抗弓形虫疫苗的制备。(2)更有效地诱生体液免疫与细胞免疫。表现为产生更高的特异性IgG抗体，特异性淋巴细胞增殖反应阳性率升高，以及在特异性抗原的刺激下诱生机体的单核细胞产生更多的γ-干扰素。(3)有高于弱毒苗的免疫效力，但无弱毒苗的散毒危险。
弓形虫代谢分泌抗原疫苗免疫小鼠后，小鼠无异常反应。42天后弓形虫强毒GJS株攻毒，对照鼠攻毒后第3天发病，精神萎顿、倦缩、被毛松乱、腹围增大，第7天全部死亡，腹液镜检发现含虫量达每视野(40×10倍)≥50个速殖子。E/SA乳化苗免疫鼠攻毒后，6天前存活正常，第7天个别小鼠出现临床症状，第8天开始死亡，第12天全部死亡。结果见表1。
表1 弓形虫代谢分泌抗原疫苗对小鼠的保护力试验
| 组别 | 免疫鼠(只) | 攻击虫体 | 攻毒后死亡数 | |||||
| 7天 | 8天 | 9天 | 10天 | 11天 | 12天 | |||
| 免疫组 | 14 | 10^3/只 | 0 | 1 | 2 | 5 | 4 | 2 |
| 对照组 | 5 | 10^3/只 | 5 | - | - | - | - | - |
免疫抗体和淋巴细胞应答反应：各组羊试验前弓形虫血清抗体均为阴性，第1次免疫后第1-4组羊抗体滴度不同程度升高(1∶4-1∶256)，加强免疫后抗体滴度升至1∶1024。
各组羊血涂片ANAE检测和统计学处理结果，免疫羊与未免疫羊的T、B淋巴细胞免疫应答反应差异极显著(分别为T淋巴细胞P＜0.01，B淋巴细胞P＜0.01)。结果见表2。
表2 弓形虫E/SA疫苗对羊的免疫效果观测
| 处理方式 | 弓形虫IHA抗体检测 | ANAE检测 | |||
| 免疫前 | 第一次免疫 | 加强免疫 | T细胞 | B细胞 | |
| 免疫 | 1∶0-1∶4 | 1∶4-1∶16 | 1∶64-1∶1024 | 53-60 | 40-47 |
| 免疫 | 1∶0-1∶4 | 1∶16-1∶64 | 1∶64-1∶1024 | 53-64 | 36-47 |
| 免疫 | 1∶0-1∶4 | 1∶4-1∶64 | 1∶256-1∶1024 | 54-62 | 38-46 |
| 免疫 | 1∶0-1∶4 | 1∶4-1∶256 | 1∶256-1∶1024 | 56-62 | 38-44 |
| 未免疫 | 1∶0-1∶4 | 1∶0-1∶4 | 1∶0-1∶4 | 24-58 | 52-75 |
弓形虫E/SA疫苗免疫羊群的的流产率明显低于未进行免疫的对照羊群的流产率，其流产率降低50％左右(47.7-52.5％)，6151只试验羊多产羔1323只。结果见表3。
表3 弓形虫E/SA疫苗试验组与对照组羊产羔、流产情况统计表
| 乡镇 | 组别 | 羊群数 | 怀孕母羊(只) | 产羔数(只) | 流产数(只) | 流产率(％) | 流产率降低绝对值 | 流产率降低相对值 |
| 炭山岭 | 试验组 | 30 | 2340 | 1753 | 587 | 25.1 | 27.2 | 52 |
| 对照组 | 10 | 483 | 230 | 253 | 52.3 | 0 | 0 | |
| 石门乡 | 试验组 | 27 | 2135 | 1766 | 369 | 17.3 | 19.1 | 52.5 |
| 对照组 | 8 | 435 | 277 | 158 | 36.4 | 0 | 0 | |
| 朱岔乡 | 试验组 | 21 | 1676 | 1366 | 310 | 17.3 | 16.9 | 47.7 |
| 对照组 | 6 | 318 | 205 | 113 | 35.4 | 0 | 0 | |
| 合计 | 试验组 | 78 | 6151 | 4885 | 1266 | 20.6 | 21.8 | 51.4 |
| 对照组 | 24 | 1236 | 712 | 524 | 42.4 | 0 | 0 |
注射疫苗前，9头猪弓形虫IHA抗体均为阴性；第1次注苗后14天，免疫猪血清抗体滴度为1∶16-1∶64，加强免疫后14天，(第一次免疫后28天)，血清抗体滴度为1∶64-1∶1024。接种疫苗的7头猪，6头在攻毒后6天出现一次性体温反应，1头未出现体温升高反应，精神、食欲未出现明显变化。两头对照猪在攻毒后第3天出现发热(持续7-8天)，体温高达42℃，呈稽留热，食欲减退甚至废绝，精神萎顿，1头死亡。结果见表4。
表4 弓形虫E/SA疫苗对猪的免疫效果观测
| 猪号 | 组别 | 免疫前抗体效价 | 第一次免疫后抗体效价 | 第二次免疫后抗体效价 | 攻毒后的情况 | |||
| 体温 | 高温持续天数 | 精神、食欲情况 | 死亡 | |||||
| 1 | 免疫猪 | 1∶0 | 1∶16 | 1∶64 | 40.6℃ | 3 | 无变化 | 无 |
| 2 | 免疫猪 | 1∶0 | 1∶64 | 1∶256 | 40.5℃ | 3 | 无变化 | 无 |
| 3 | 免疫猪 | 1∶0 | 1∶16 | 1∶256 | 40.5℃ | 2 | 无变化 | 无 |
| 4 | 免疫猪 | 1∶0 | 1∶64 | 1∶256 | 40.8℃ | 2 | 无变化 | 无 |
| 5 | 免疫猪 | 1∶0 | 1∶64 | 1∶256 | 40.8℃ | 3 | 无变化 | 无 |
| 6 | 免疫猪 | 1∶0 | 1∶64 | 1∶1024 | 40.0℃ | 0 | 无变化 | 无 |
| 7 | 免疫猪 | 1∶0 | 1∶64 | 1∶1024 | 40.4℃ | 2 | 无变化 | 无 |
| 8 | 对照猪 | 1∶0 | 1∶0 | 1∶0 | 42.6℃ | 7 | 精神萎顿、食欲下降 | 无 |
| 9 | 对照猪 | 1∶0 | 1∶0 | 1∶0 | 42.8℃ | 8 | 精神萎顿、食 | 死亡 |
| 欲废绝 |
具体实施方式
实施例1、
2003年11月5日以1×10^5弓形虫速殖子/只，腹腔接种20-25克体重小鼠150只，11月8日，小鼠出现了精神沉郁、被毛粗乱等症状，将小白鼠脱颈致死，浸泡于70％酒精内进行体表消毒。每只小鼠用2毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体，共收集腹腔液400ml，将所收集的腹腔液以每分钟3000转的速度离心30分钟，收集上清，上清再以每分钟3000转的速度离心5次，每次离心30分钟，收集上清，在-20℃保存备用。
同时于2003年11月5日以2×10^7弓形虫速殖子/瓶的量，接种于已生长良好而且以将原培养液倾倒又加入新的100ml不含血清培养液的vero细胞中，共接种35瓶，在培养箱中37℃条件下继续培养，11月10日细胞全部脱落后，收集培养液，以每分钟3000转的速度离心30分钟，上清再以每分钟3000转的速度离心3次，每次离心30分钟，收集上清在-20℃保存备用。
2003年11月18日将腹腔液与培养液反复冻融3次，取少量腹腔液与培养液进行蛋白含量测定，结果腹腔液的蛋白含量为30.67mg/ml，细胞培养液的蛋白含量为8.58mg/ml。将腹腔液与细胞培养液以1∶8的比例混合，混合液为3500ml，其蛋白含量为10mg/ml。
2003年11月25日将混合液与M206佐剂以1∶1的比例混匀，乳化，分装。即为弓形虫复合疫苗
实施例2：
2004年2月5日以1×10^5弓形虫速殖子/只，腹腔接种20-25克体重小鼠100只，2月9日，小鼠出现了精神沉郁、被毛粗乱等症状，将小白鼠脱颈致死，浸泡于75％酒精内进行体表消毒。每只小鼠用2-3毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体，共收集腹腔液250ml，将所收集的腹腔液以每分钟4000转的速度离心20分钟，收集上清，上清再以每分钟4000转的速度离心3次，每次离心20分钟，收集上清，在-15℃保存备用。
同时于2004年2月5日以2×10^7弓形虫速殖子/瓶的量，接种于已生长良好而且以将原培养液倾倒又加入新的100ml不含血清培养液的vero细胞中，共接种28瓶，在培养箱中37℃条件下继续培养，2月10日细胞全部脱落后，收集培养液，以每分钟4000转的速度离心20分钟，上清再以每分钟4000转的速度离心3次，每次离心20分钟，收集上清在-15℃保存备用。
2004年2月18日将腹腔液与培养液反复冻融3次，取少量腹腔液与培养液进行蛋白含量测定，结果腹腔液的蛋白含量为32.15mg/ml，细胞培养液的蛋白含量为7.24mg/ml。将腹腔液与细胞培养液以1∶10的比例混合，混合液为2750ml，其蛋白含量为10mg/ml。
2004年2月25日将混合液与M206佐剂以1∶1的比例混匀，乳化，分装。即为弓形虫复合疫苗。
Claims (6)
1、一种弓形虫代谢分泌抗原疫苗，其特征在于含有弓形虫抗原。
2、根据权利要求1所述的一种弓形虫代谢分泌抗原疫苗，其特征在于所述的抗原为弓形虫代谢分泌抗原。
3、根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述的代谢分泌抗原为从细胞培养和小鼠腹腔接种所得抗原的混合抗原。
4、根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述抗原中从细胞培养和小鼠腹腔接种所得抗原的比例为8-10∶1。
5、一种制备如权利要求1所述的一种弓形虫代谢分泌抗原疫苗的制备方法，其特征在于采用以下步骤完成：
(1)将1×10^5弓形虫速殖子，腹腔接种20-25克体重小鼠，经72-96小时，小鼠出现精神沉郁、被毛粗乱等症状时，脱颈致死小白鼠，浸泡于70-75％酒精内体表消毒；每只小鼠用2-3毫升PH7.2PBS缓冲液洗腹收集虫体；将所收集的腹腔液以每分钟3000-4000转的速度离心20-30分钟，收集上清，上清再以每分钟3000-4000转的速度离心3-5次，每次离心20-30分钟，收集上清，在-15--20℃保存备用；
(2)将2×10^7弓形虫速殖子，接种于vero非洲绿猴肾细胞细胞中，在培养箱中37℃条件下继续培养，待细胞全部脱落后，收集培养液，以每分钟3000-4000转的速度离心20-30分钟，上清再以每分钟3000-4000转的速度离心3次，每次离心20-30分钟，收集上清在-15--20℃保存备用；
(3)将腹腔液与培养液反复冻融3次；
(4)将腹腔液与细胞培养液以1∶8-10的比例混合；
(5)混合液进行蛋白含量测定，蛋白含量为10mg/ml。
(6)将混合液与M206佐剂以1∶1的比例混匀，乳化，分装，即为弓形虫复合疫苗。
6、根据权利要求5所述的一种弓形虫代谢分泌抗原疫苗的制备方法，其特征在于其中的抗原蛋白含量为10mg/ml。
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