CN112870341A

CN112870341A - 一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112870341A
Application number: CN202110110937.4A
Authority: CN
Inventors: 储岳峰; 陈胜利; 郝华芳; 颜新敏; 马丽娜; 刘永生
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: US20220233671A1; CN112870341B; US11801289B2

Abstract

本发明提供了一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于动物传染病疫苗制备技术领域，所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合，包括山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊；所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗包括所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和佐剂；所述亚单位疫苗具有安全性高、免疫效果良好、稳定性好、副反应小的优势。

Description

一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于动物传染病疫苗制备技术领域，尤其涉及一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP)是危害世界养羊业的重要动物疫病，是OIE法定报告传染病。山羊传染性胸膜肺炎主要临床表现为发热、咳嗽、呼吸困难，剖检病变主要为纤维素性胸膜肺炎、胸腔积液及肺脏肝样变。山羊传染性胸膜肺炎是一种高度接触性传染病，在新发疫区具有高发病率和高死亡率的特点，给养羊业带来严重威胁和巨大经济损失。野山羊、藏羚羊等多种动物可感染发病。山羊传染性胸膜肺炎在全世界超40多个国家或地区分布，目前在非洲、中东、亚洲等国家或地区流行，造成巨大经济损失。该病的病原是山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp)，对营养要求极高，难于培养。早在1873年就有山羊传染性胸膜肺炎爆发的文献记载，直到1976年Macowan首次分离出病原Mccp。目前，山羊传染性胸膜肺炎在我国广泛流行，但由于病原分离培养困难，技术要求高等原因，分离山羊支原体山羊肺炎亚种菌株的报道很少。

疫苗免疫是预防控制山羊传染性胸膜肺炎的重要手段。目前该病防控疫苗主要为全菌灭活疫苗和组织灭活疫苗。组织灭活疫苗一般采用组织毒或菌液感染健康山羊，采集感染发病山羊肺脏等组织经剔除气管、支气管等组织，研磨、过滤、灭活等程序制备，工艺复杂，对实验动物要求高，容易污染其他病原，质量不稳定，规模化生产能力有限等问题。全菌灭活疫苗较组织灭活疫苗有诸多优势，逐渐成为防控山羊传染性胸膜肺炎的主要手段。然而，现有技术灭活疫苗存在病原培养困难、生长速度慢，产量低，工艺复杂、成本高、规模化生产有限、生物安全风险、副反应较大等问题，限制了其推广应用。亚单位疫苗是山羊传染性胸膜肺炎疫苗研究的重要方向，然而目前国内外尚无山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用；本发明将山羊支原体山羊肺炎亚种菌株中广泛存在、免疫保护效果好的免疫蛋白组合成山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗；所述亚单位疫苗具有安全性高、免疫效果良好、稳定性好、副反应小、成本较低的优势。

本发明涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊系经Mccp全基因组学、比较基因组学、蛋白组学、免疫蛋白组学等分析基础上，对筛选免疫原性蛋白进一步细胞定位、蛋白亲水性、抗原性、信号肽、跨膜区、T细胞表位、B细胞表位等综合分析，并经体内外试验验证分类筛选得到；以上免疫蛋白组合可克服单一蛋白难以诱导全面的体液和细胞免疫，保护效果有限等问题，筛选免疫蛋白组合，配以佐剂配方，制备的亚单位疫苗可以诱导全面的免疫反应，对山羊Mccp感染提供良好保护效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合，包括山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊；所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQID No.5所示。

优选的，所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的浓度分别为20～150μg/ml。

本发明提供了一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，包括所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和佐剂。

优选的，所述佐剂为双佐剂，所述双佐剂包括皂苷和ISA201 VG佐剂。

优选的，所述皂苷的终浓度为1.0～4.0mg/ml。

优选的，所述ISA 201VG佐剂的质量为山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗质量的50％～55％。

优选的，所述山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗还包括防腐剂溶液，所述防腐剂溶液的体积为所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷总体积的0.8％～1.2％，所述防腐剂溶液中防腐剂的质量百分含量为0.8％～1.2％。

本发明提供了所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷混合、静置获得抗原皂苷混合物，所述静置的温度为2～8℃，所述静置的时间为18～48h，所述静置期间每2～4h摇振1次；

2)将所述抗原皂苷混合物与ISA201VG佐剂混合后，乳化获得山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗。

优选的，步骤1)所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷混合之前还包括以下步骤：将所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合中蛋白分别溶于PBS缓冲液、混合；步骤1)所述静置后还包括将防腐剂溶液与静置后的溶液混合获得抗原皂苷混合物。

本发明提供了所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗在制备预防和/或治疗山羊传染性胸膜肺炎的药物中的应用。

本发明提供的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，将山羊支原体山羊肺炎亚种菌株中广泛存在、免疫保护效果好的免疫蛋白组合成安全有效的亚单位疫苗，与现有技术相比，具有以下优点：

安全性高：解决了现有灭活疫苗生产可能存在病原菌灭活不彻底的问题，组织灭活疫苗可能存在其他病原污染的问题，安全性更好，免疫后无不良反应：本发明所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗制备中不涉及病原菌及其核酸，降低了现有灭活疫苗制备中可能存在的病原菌扩散和污染风险，降低生物安全风险。

高效：本发明提供的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗能够提供良好保护效果，可明显降低发病和死亡率，明显降低肺部病变和载菌量；本发明疫苗诱导机体产生良好保护效果，所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合中的甲、乙、丙、丁和戊蛋白的免疫原性良好；进一步的，佐剂选择皂苷和新型基因工程疫苗佐剂ISA 201VG，皂苷能够增强免疫反应，刺激机体细胞和体液免疫应答，免疫持续时间长；ISA 201VG佐剂为新型佐剂，水包油包水型乳剂，具有免疫效果好，稳定、黏度低、易于注射、刺激反应小等优点，将皂苷和ISA201VG佐剂联合使用，能够改善免疫应答反应，刺激机体细胞和体液免疫应答，提高免疫保护效果，减少免疫副反应，可提供良好免疫保护效果。

规模化生产：全菌灭活疫苗需经大量培养病原菌Mccp，Mccp病原难培养，生长速度慢，生长产量低；全菌灭活疫苗需经浓缩、灭活、乳化等步骤制备，工艺较为繁琐，规模化生产能力有限；组织灭活疫苗一般采用组织毒或菌液感染健康山羊，采集感染发病山羊肺脏等组织，剔除气管、支气管等组织，研磨、过滤、灭活等程序制备，工艺复杂，难于规模化生产；本发明直接采用山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白，能够通过原核系统高效表达，工艺较为简单，可实现规模化生产。

稳定性好：与灭活疫苗菌体蛋白或组织相比，本发明提供的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗中抗原成分少，抗原纯度高，为水包油包水型乳剂，稳定性好，运输和保存方便。

副反应小：现有菌体灭活疫苗因抗原成分多，抗原培养中大量动物血清的使用，免疫后容易导致出现副反应等问题，组织灭活疫苗因含动物组织，成分复杂，副反应较大。本发明提供的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗中的抗原成分少，抗原纯度高，制成水包油包水型乳剂，疫苗黏度低、易于注射，刺激反应小，副反应小。

成本较低：Mccp病原难培养，生长慢，产量低，培养成本高，现有菌体灭活疫苗需培养大量菌体经浓缩、灭活等步骤，生产成本高，本发明采用大肠杆菌高效表达抗原，效率高，成本较低。

附图说明

图1为重组蛋白SDS-PAGE电泳图；图中：M为蛋白分子量标准，泳道1～3为丙蛋白，泳道4为丁蛋白，泳道5为乙蛋白，泳道6为甲蛋白，泳道7～8为戊蛋白；

图2为本发明亚单位疫苗免疫后山羊血清Mccp抗体水平；

图3为肺脏剖检病变；图中a为本发明亚单位疫苗组，b：灭活疫苗组，c：攻毒对照组；d：空白对照组。

具体实施方式

本发明提供了一种山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合，包括山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊；所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选为1:1:1:1:1；在本发明中，所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的浓度分别优选为20～150μg/ml，更优选为30～100μg/ml。本发明对所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的溶剂没有特殊限定，采用本领域常规的蛋白溶剂即可；在本发明具体实施过程中，所述溶剂为PBS缓冲液。本发明对所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成、通过原核或真核表达系统进行重组表达均可；在本发明具体实施过程中，优选的采用原核表达系统重组表达的方法制备获得所述甲、乙、丙、丁和戊。本发明对所述原核表达系统重组表达的方法没有特殊限定，采用本领域常规的方法即可，详细步骤参见实施例记载。

在本发明中，所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.5所示，具体如下：

甲蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.1)：

MKTKNQEEEIPNGDAFKGAKSLEKKLSPFSDNTIETQQAGLSRVFIKASKKAYSNNQDDFKNAIERTGGLFILDKNYQDIFFNEELMKIIGVGEVYSKNSSDKRINKKLTLEEFLGEAKAESLQPANFSNKNSPFVSFNLKNEYLKNLIDPKKNKDNNSLTMITSVGHVIETLRTYYKKANSTNKQVIEKYLNTYFNQIIKPIQDYISSHLSDALAVKTLKDLFSIEYSTTTTEGTSGNLAIQRTSLVDSKINKWWKSNQTGKIENTSDLKYVLFGTNNLDKKNDRHIFRFTNSANKFLYDANASEKDFIKDDKGNVGKYYNKLKISSDNSISQDEELDYIDKVSNKLISIIMTEILFKKDTTDKDHVVNRNLDQALFRNNVLLHNNQISPDNTRIVTTNPAIVTDRKTQTTKLYIPVWSNTMAKQVESDILQTSLGYTFKVLSIKEFSSDILE。

乙蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2)：

MSNSSSDQITNFYKQKQDQIAEVKLSNKQDLEYYSLRDEYILFNQYQVNTGLCWDFASIKSLETALMLANNEMYDFSEASISVLNEHWVADGVFFRTFDNLLNRNGIAFESDFRFGDLYYFPNTGIYYDKLLDLYKSKYITNLANKLEAYSFYRYSILEKLKQIKEHISKHSALFVGIDHWQVVKNKVNKQETFQITSGSMGAHAVSIIGWDDNYINNDNSKGAFIVLNSDGFYDNNDGVNYLPYNSSTIYLDLQGYKFIGDKLISSKGINSSIKNKYFNYYNTKLAKKYTETKPLNQNVFSWDDQVEIQYQLNDQIADFKRIQTSIFLWQTRCFRLE。

丙蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.3)：

MSTTSIEKLGRKNFVDEESFKNAFIDPNALPVTEFSEVHNNKRSVKYDPEKNVVKFNGKEISVDQYLQQYYQKYQALPYLNIRYGSFNFYNQYIEAVSPQEFYKFTKWFMKNVSWGPEIITLKSFSIVKGVEMSGNSITLGAHSNKNKEETTIKFYPDAFFGTLPIYSNLSGRGNAYESLTYKLNQQVLTQKDLEGFLANVGNYNSLVNLSQQTINKSYFRGITNVSFLKGQKVFAYKQENWQSKFSKTYSELEKKRLEDRSSYLFVIPANSLQEARKKLEVKLSEYKKESDPFNFFEKINPKNVVLEEKTISDAEVKQDNTNKIIDKKLVLTFNDKTNYIIHNAFSDVLTEQMTSNNRRTYVALKNYVNFSSAKQKLEDKVKNFILQIKENIKLKSNGKEKELEELLKEFESYNNVVSLLEQKNLTSDILKKVDKKIFESETKFNQILNKPNSNKTFNEKEYYKTDIAYSLPELITLETLVQHNNSNKLNWRDFYNLNEFVADRSNILKNGSTEFFVYSKFVKEINANENKKYEELKSENDLIAASSKVELIDILTKKSIIKPNISQEEINKIILKVDLFDLKKEGQNLLISLRNTTAEKASNKEKFGNKWINISINANAKKDVIRATNDLFAVLEYKKVVVPSVLKEESDLRNPITNKLEKTFDVFVDAYENLIDELLEKVLYAAQWLEGPHIKKVLDENGVMQYKLENGKYLGFTKDDRIGLWAILKMSDNNFKGISTDFLKFVGAHEYGHHITLNGAQDLGNKGSDPIFISALTPGATPDISNYYNREVVDLFLKARTHIKLETKRLLDQFGAIKDYGEYAVFNFAKKDKNGNINFDTKDNIGIEKDSDIWGVDIEDPNIRKALSNKKRRFLQDFAGLLAAVKERQKENNLTTDDDKKWLSAFLE。

丁蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.4)：

MTLNPTVNSSDQQNQVVKYMYKDKKGVLRFQPASLKMLDGILKDGKGNPIKFDISNNGKSVEPIVVKGQKDSEGKYYKIDEVLVHNKDGSPIINVPIGVNLRDENSGYNDKKTIDFINEKIKVVESTIKSLVVDKYSINGWNNENTRISLDSKIDLNYPAIKNIFGSKVPNNVSEMYKNIYADYVLNRDVDKGSYKFDEHGEISKVKYYNLDSTKVDRYYNSDTPSSLIYANPSNYKITDDNVELDFKTILWTLYAAGFVTYGNLINAGSSQVLWLSKDKMYMPNVKLQEAYTDLYFLSSLPKEYEQIFEAKKVLKWISKYTPLFISSSSNKTGVWNMIDNEGKFVDFNLLINENFTNSIKLQLNYSRVKTLDSNVLNGLFGTFKDFNDNSLEFDEYDKWLDFVTVDLRKAKYNQKQDRVDWEIDYVKSKVDIDKFKEKYKSEVLDKLDSISSMNDNQKQAFKTFYEKANADKTEQIWANEIMRRFSSSYFAMYNSALSIGEIESNKDLAWIFDSTHGYGDFKKAKFKIKNPDKSKWEISTDDLLNAYKKLAKDLGVETKQLNLVDSLVFDNKTQLYTDQTMTHIYNRKFDLLSIFSSLATAQFHTSPTRDVLDYFYKKTERKVNELFSNYTYNFAEVINRDNLQITYSPSNHDFGNMPSFLSNISEATTGLEYVVDGTTTAKWKKRAIKINDRNGRNGIVNAILDYEKLVDSEAKNKAEALNLKYRNSKLSQKSNLSDDSNYDNSYFGKFQSINNGWFKDRWYRDFLDFKLYDDNGNPIKDETIRIKDLEGKKVDSRVNAFWQFYIQSQGVGKRNISGIWRDANKDAVAMFGYLSSDVANKANYLAFKNQKTGEIKTIKINKQFSSNMFYYKTQNIENEAKYEAAKTQEEKDKIRHTLAHEKYNYKDINGQHTGVGFVSWVSDYAIMSKYKNALLTPGQQYSVYFSSDQKGTKDIIKTDLGNFESIAENGKTFSQAPVRMQKNKQVAKVDKDGTKYYENTLYVYDQFNGVKLE。

戊蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.5)：

MKSQGNFISYKQENSSSSSGTSSGGSDTGAGRNTDTGSGSNGGFETFNTRRNREKDPSFNTFKETIKEKLKKGIEEVKKEIDSFLDKEIKEIGDLKTPDDKNKYFEKIERKTYLTELKKFFDKKDSNSFVDKPDEFGFNISFPYIIANLEKLYTATVKFDGKDYSDIKVGKSGDSAKDIKGSDKKLDYSDVITNDVGKIITDTKAQDNFINSKEFDDVVKGYLATWKNEVKKMIYQKQDILEFGKDIFFEPTNGNTTTSENTTQVDQYKVYLDTKKYKSWSEYIKEKISKRFTHFDLEQNQKFKIVDEAKPTPTPTKPTLPDPTNKPLVPTNPPSSQITQAVEALPNLEPYINYQFASYDLSSIGSQLSSSQDEEKDKYFFFLNPINTRFKYTVDSVNGNSVVVRITDQAKSGNSRTYIYENVQVGKDWRFLMLLEKESKYIEQEFNKLYKALLLDEKINYNSLAHDSLQESVFSLVNAATQIVSSSSFKSLWFENIINNYQKIDESDQLGDYTNWANKKAKYLFETLLKAISASKLNNNPGWYVLVKAFNNVKYDLDQLTNDESTYNSHLKRAQEFDLDLKYYDQLYDALEHSILKLSTTANQLTKNLHISSWFNKYTDDIKDAREYVEILRNLLTGKPISKDSEDYKEFMTNYQKAIDKLNEKNQTTNKTLE。

本发明还提供了一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，包括所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白和佐剂。在本发明中，所述佐剂可选为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。在本发明中，所述佐剂为双佐剂，优选为皂苷和ISA 201VG双佐剂。所述皂苷与所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白抗原溶液的质量体积比优选为1～4mg/ml，更优选为2mg/ml。本发明对所述皂苷的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。所述ISA201VG佐剂的质量优选为山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗质量的50％～55％，更优选为50％。本发明对所述ISA201VG的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。

在本发明中，所述山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗还包括防腐剂溶液，所述防腐剂溶液的体积为所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷总体积的0.8％～1.2％，更优选为1.0％；所述防腐剂溶液中防腐剂的质量百分含量优选为0.8％～1.2％，更优选为1.0％；在本发明具体实施过程中，所述防腐剂优选为硫柳汞。

本发明还提供了所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷混合、静置获得抗原皂苷混合物，所述静置的温度为2～8℃，所述静置的时间为18～48h，所述静置期间每2～4h摇振1次；2)将所述抗原皂苷混合物与ISA201VG佐剂混合后，乳化获得山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗。

在本发明中，将所述山羊传染性胸膜肺炎免疫蛋白组合和皂苷佐剂混合、静置获得抗原皂苷混合物。在本发明中，在所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷混合之前优选的还包括以下步骤：将所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合中的甲、乙、丙、丁和戊分别溶于PBS缓冲液、混合后，获得免疫蛋白抗原溶液。本发明在获得所述免疫蛋白抗原溶液后，将所述免疫蛋白抗原溶液与皂苷混合，所述皂苷与所述免疫蛋白抗原溶液的质量体积比优选为1～4mg/ml；在本发明中，所述免疫蛋白抗原溶液与皂苷混合静置温度优选为4℃，所述静置的时间优选为24h；所述静置期间优选的每2～4h摇振1次，所述摇振的作用是促进皂苷与抗原充分混合。在本发明中，优选的将所述静置后的溶液再与防腐剂溶液混合，获得抗原皂苷混合物。

在本发明将所述抗原皂苷混合物与ISA201VG佐剂混合后，乳化获得山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗。在本发明中，所述ISA201VG佐剂与所述抗原皂苷混合物的体积比优选为(50～55)：(45～50)。在本发明中，所述乳化的时间优选为10～30min。在本发明中，所述乳化优选的采用乳化机进行。本发明在所述乳化结束后获得略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)乳剂即为所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗。

本发明还提供了所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗在制备预防和/或治疗山羊传染性胸膜肺炎的药物中的应用。本发明所述的药物用于预防和/或治疗山羊支原体山羊肺炎亚种感染以及山羊支原体山羊肺炎亚种感染引起的相关疾病。本发明提供的药物能够降低或防止山羊支原体山羊肺炎亚种造成的肺脏损伤，减轻山羊支原体山羊肺炎亚种在肺脏、淋巴结、肾脏的定居和感染。本发明对所述药物的剂型和辅料没有特殊限定，采用山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗能够接受的剂型和辅料即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株，(GenBanK登录号：CP017125.1)，来源于中国农业科学院兰州兽医研究所，参考文献：Chen S，Hao H，Zhao P，ThiaucourtF，HeY，Gao P，GuoH，Ji W，Wang Z，Lu Z，ChuY*，LiuY*.Genome-WideAnalysis ofthe First SequencedMycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae Strain M1601.G3(Bethesda)，2017,7(9):2899-2906.

主要试剂：载体pET30a(+)：来自Novagen公司。大肠杆菌BL21(DE3)、IPTG、卡那霉素购自全式金生物公司；Ni-NTA蛋白纯化树脂购自QIAGEN公司，蛋白Marker购自赛默飞公司。

主要仪器设备：低温高速离心机购自Eppendorf公司，低温高速冷冻离心机购自Beckman公司，超声破碎仪为宁波新芝股份生物科技有限公司产品，电泳仪电源购自北京六一公司，蛋白电泳仪和凝胶成像仪、酶标仪购自Bio-Rad公司，乳化机购自Fluko公司，生物安全柜购自苏净安泰公司，隔水式恒温培养箱购自上海一恒公司。

Mccp感染血清和免疫血清由中国农业科学院兰州兽医研究所制备保存。本发明所述Mccp 1801(M1801)已在文献中公开(吴娅琴，刘保红，袁婷等.山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用.中国兽医科学.2020,50(10):1257～1262)，在中国科学院兰州兽医研究所有保存。

实验动物：新西兰大白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。健康山羊购自甘肃某羊场，布鲁氏菌抗体检测阴性，试验前Mccp抗原抗体检测均阴性。

实施例1

甲蛋白的制备

将编码Mccp甲蛋白基因(GenBank:CP017125.1，M1601_02645，自5’末端第172-1524位核苷酸序列，hypotheticalprotein)，密码子优化后合成至pET30a(+)限制性酶切位点NdeI和XhoI之间，表达SEQ ID No.1所示蛋白。将获得重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。将重组菌接种LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.05mM IPTG，16℃，120rpm诱导12h，获得重组表达菌液，4℃，12000rpm离心30min收集菌体沉淀，预冷的Lysis buffer(50mMNa₂HPO₄,0.3MNaCl,10mMimidazole,pH＝8.0)重悬菌体沉淀，超声破碎30min(超声2s，间隔2s)，4℃，7500rpm离心30min，收集上清，0.45μm滤器过滤上备用。用QIAGEN公司Ni-NTA蛋白纯化树脂进行蛋白纯化，用洗脱缓冲液(50mMNa₂HPO₄,0.3MNaCl,250mM imidazole，pH＝8.0)洗脱获得目的蛋白，透析袋透析去除咪唑，-80℃保存备用。甲蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示。

乙蛋白的制备

将编码Mccp乙蛋白基因(GenBank:CP017125.1，M1601_03335，自5’末端第85-1089位核苷酸序列，hypotheticalprotein)，密码子优化后合成至pET30a(+)限制性酶切位点NdeI和XhoI之间，表达SEQ ID No.2所示蛋白。将获得重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。将重组菌接种LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.05mM IPTG，26℃，180rpm诱导6h，获得重组表达菌液，4℃，12000rpm离心30min收集菌体沉淀，预冷的Lysis buffer(50mMNa₂HPO₄,0.3MNaCl,10mMimidazole,pH＝8.0)重悬菌体沉淀，超声破碎30min(超声2s，间隔2s)，4℃，7500rpm离心30min，收集沉淀，纯化包涵体蛋白，纯化时经包涵体洗涤液Ⅰ(Tris 50mM，NaCl100mM，EDTA2mM，0.5％TritionX-100，pH8.0)、包涵体洗涤液Ⅱ(包涵体洗涤液，1M尿素)、包涵体洗涤液Ⅲ(包涵体洗涤液Ⅰ，2M尿素)、包涵体洗涤液Ⅳ(包涵体洗涤液Ⅰ，3M尿素)、包涵体洗涤液Ⅴ(包涵体洗涤液Ⅰ，4M尿素)洗涤去除杂蛋白，重悬液(Na₂HPO₄50 mM，Tris 1mM,尿素8M，pH＝8.0)重悬沉淀，4℃静置过夜，使包涵体变性溶解，4℃7000rpm离心15min，收集上清，获得纯化蛋白。透析袋透析去除尿素，0.45μm滤器过滤，-80℃保存备用。乙蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示。

丙蛋白的制备

将编码Mccp丙蛋白基因(GenBank:CP017125.1，M1601_00615，自5’末端第106-2823位核苷酸序列，hypotheticalprotein)，密码子优化后合成至pET30a(+)限制性酶切位点NdeI和XhoI之间，表达SEQ ID No.3所示蛋白。将获得重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。将单克隆重组菌接种到LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.05mM IPTG，16℃，120rpm诱导12h，获得重组表达菌液，4℃，12000rpm高速离心收集菌体沉淀，预冷的Lysis buffer(50mMNa₂HPO₄,0.3M NaCl,10mMimidazole,pH＝8.0)重悬菌体沉淀，超声破碎30min(超声2s，间隔2s)，超声破碎后，4℃，7500rpm离心30min，收集上清，0.45μm滤器过滤上清备用。用QIAGEN公司Ni-NTA蛋白纯化树脂进行蛋白纯化，用洗脱缓冲液(50mM Na₂HPO₄,0.3M NaCl,250mM imidazole，pH＝8.0)洗脱获得目的蛋白，透析袋透析去除咪唑，0.45μm滤器过滤，-80℃保存备用。丙蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示。

丁蛋白的制备

将编码Mccp丙蛋白基因(GenBank:CP017125.1，M1601_00615，自5’末端第2862-5895位核苷酸序列，hypotheticalprotein)，密码子优化后合成至pET30a(+)限制性酶切位点NdeI和XhoI之间，表达SEQ ID No.4所示蛋白。将获得重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。将单克隆重组菌接种到LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.05mM IPTG，16℃，120rpm诱导12h，获得重组表达菌液，4℃，12000rpm高速离心收集菌体沉淀，预冷的Lysis buffer(50mMNa₂HPO₄,0.3M NaCl,10mMimidazole,pH＝8.0)重悬菌体沉淀，超声破碎30min(超声2s，间隔2s)，超声破碎后，4℃，7500rpm离心30min，收集上清，0.45μm滤器过滤上清备用。用QIAGEN公司Ni-NTA蛋白纯化树脂进行蛋白纯化，用洗脱缓冲液(50mM Na₂HPO₄,0.3M NaCl,250mM imidazole，pH＝8.0)洗脱获得目的蛋白，透析袋透析去除咪唑，0.45μm滤器过滤，-80℃保存备用。丁蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示。

戊蛋白的制备

将编码Mccp戊蛋白基因(GenBank:CP017125.1，M1601_01955,自5’末端第97-2109位核苷酸序列，hypotheticalprotein)，密码子优化后合成至pET30a(+)限制性酶切位点NdeI和XhoI之间，表达SEQ ID No.5所示蛋白。将获得重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。将单克隆重组菌接种到LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.05mM IPTG，16℃，120rpm诱导12h，获得重组表达菌液，4℃，12000rpm高速离心收集菌体沉淀，预冷的Lysis buffer(50mMNa₂HPO₄,0.3M NaCl,10mMimidazole,pH＝8.0)重悬菌体沉淀，超声破碎30min(超声2s，间隔2s)，超声破碎后，4℃，7500rpm离心30min，收集上清，0.45μm滤器过滤上清备用。用QIAGEN公司Ni-NTA蛋白纯化树脂进行蛋白纯化，用洗脱缓冲液(50mM Na₂HPO₄,0.3M NaCl,250mM imidazole，pH＝8.0)洗脱获得目的蛋白，透析袋透析去除咪唑，0.45μm滤器过滤，-80℃保存备用。戊蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示。

实施例2

将实施例1制备的甲蛋白、乙蛋白、丙蛋白、丁蛋白和戊蛋白分别免疫健康新西兰大白兔3只，制备多克隆抗体，首免时，甲蛋白、乙蛋白、丙蛋白、丁蛋白和戊蛋白分别与弗氏完全佐剂等体积混合后乳化，皮下多点免疫，每只免疫约800ug重组蛋白；2周后二免，3周后三免，5周进行四免，加强免疫使用的均为甲蛋白、乙蛋白、丙蛋白、丁蛋白和戊蛋白分别与弗氏不完全佐剂等体积混合后乳化的乳剂，每只免疫600μg重组蛋白，最后一次免疫后第7天耳缘静脉采血分离血清。制备的甲蛋白、乙蛋白、丙蛋白、丁蛋白和戊蛋白多克隆抗体1:80000稀释分别与对应重组蛋白western反应，均为阳性，结果表明，甲蛋白、乙蛋白、丙蛋白、丁蛋白和戊蛋白可诱导机体产生高水平抗体，重组蛋白多克隆抗体与Mccp全菌蛋白western反应均良好，制备的重组蛋白与Mccp感染血清和免疫血清western反应良好，表明重组蛋白具有良好抗原性和免疫原性。

实施例3

将实施例1中制备的甲蛋白，乙蛋白、丙蛋白、丁蛋白和戊蛋白等质量1:1:1:1:1无菌混合，甲蛋白，乙蛋白、丙蛋白、丁蛋白和戊蛋白在免疫蛋白组合液(27.88ml)的终浓度均为65μg/ml；加入终浓度为2.0mg/ml皂苷0.54ml，在4℃下处理24h，期间每4h摇振1次，按抗原体积总量的1％，加入1％硫柳汞水溶液0.28ml，获得抗原皂苷混合物。取ISA201 VG佐剂28.44ml，加入抗原皂苷混合物28.44ml，混合，用小型乳化机Fluko调1档(5000rpm)乳化20min，结果获得无菌略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)疫苗。

实施例4

疫苗安全性试验

将8-9月龄健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)10只，分为疫苗组和对照组，每组5只，疫苗组每只羊颈部肌肉注射2ml的实施例3制备疫苗，对照组注射等量的PBS，连续观察14d。结果表明，本发明疫苗注射后，注射羊只全部健活，羊只无咳嗽、打喷嚏等症状，注射部位无明显肿块，无明显副反应，疫苗安全。

实施例5

将8-9月龄健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)10只，分为疫苗组和对照组，每组5只，疫苗组每只羊颈部肌肉注射2ml的实施例3制备疫苗，对照组注射等量的PBS，连续观察14d。疫苗免疫后，每天观察注射羊只的反应。免疫后每周采集非抗凝血分离血清，用间接ELISA方法(M1801菌体蛋白包被)测定血清Mccp抗体水平；操作方法如下：0.05MpH9.6的碳酸盐包被液稀释M1801菌体蛋白至1.6μg/mL，每孔100μL，封口，37℃孵育1h后4℃包被过夜；每孔加入300μLPBST洗液，室温洗涤3次，拍干；每孔加入5％的脱脂奶粉100μL，37℃封闭2h，洗涤3次，拍干；孵育一抗，将待测血清用封闭液1:200稀释，设立阴阳性对照，每个样品至少两个重复，每孔100μL，37℃孵育1h后洗涤4次，拍干；将兔抗羊二抗用封闭液1:5000稀释，每孔100μL，37℃孵育1h后洗涤4次，拍干；避光条件下，加入每孔加入100μL的TMB，37℃显色10min；每孔加入2M H₂SO₄终止液100μL，溶液由蓝色变为黄色；在酶标仪读取450nm波长的OD值，检测血清抗体水平。结果，对照组Mccp抗体均为阴性，本发明提供的亚单位疫苗免疫动物可诱导产生较高水平抗体(图2，表1，其中057、059、063、073、105为动物编号)。

表1本发明亚单位疫苗免疫后山羊血清Mccp抗体水平

实施例6

疫苗的免疫保护效果

将8-9月龄健康山羊(Mccp抗体、抗原阴性)，分为灭活疫苗组、本发明亚单位疫苗组、攻毒对照组，每组5只，空白对照组4只。

灭活疫苗组：实验第0天、第14天分别经颈部肌注灭活疫苗，每只羊2ml。灭活疫苗系Mccp M1801菌株经改良MTB培养基(葡萄糖2g/L、丙酮酸钠2g/L、PPLO肉汤21g/L，质量百分含量为25％的酵母浸出液100ml/L，质量百分含量为1％的酚红2.5ml/L、马血清200ml/L、10万IU青霉素，pH值为7.4～7.6)增殖培养后，PBS缓冲液(0.01M，pH7.2～7.4)离心3次，调整浓度至300μg/mL，终浓度为2mg/mL的皂素灭活24h，与ISA 201 VG佐剂1:1.1混合后乳化，制成全菌灭活疫苗。

本发明亚单位疫苗组：实验第0天、第14天分别经颈部肌注实施例3制备疫苗，每只羊2ml。

攻毒对照组：实验第0天、第14天分别经颈部肌注PBS，每只羊2ml。

空白对照组羊正常饲养，未做处理。

实验第35d，对灭活疫苗组、本发明疫苗组、攻毒对照组试验羊进行山羊支原体山羊亚种攻毒，M1801(中国农业科学院兰州兽医研究所保存，见文献：吴娅琴，刘保红，袁婷等.山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用.中国兽医科学.2020,50(10):1257～1262)菌液，攻毒剂量为10⁹CCU/mL，攻毒方式采用连续两天鼻腔喷雾2ml，间隔2d后气管注射6mL。结果表明：攻毒后，部分山羊发热，出现咳嗽、打喷嚏、精神沉郁、饮食减少等症状。本发明疫苗免疫后能明显减轻发热和临床症状，空白对照组和本发明免疫动物100％存活，灭活疫苗组80％存活，攻毒对照组40％存活。结果表明，本发明疫苗对Mccp感染山羊有良好的保护作用，可完全抵抗Mccp强毒攻击，明显减轻羊发病和死亡。本发明疫苗能够有效降低Mccp在山羊肺部的定植。攻毒对照组羊剖检病变主要为胸腔积液、肺脏与胸壁黏连，肺脏实变，干酪样坏死，胶冻样渗出等CCPP典型病变。本发明疫苗组无羊只死亡，实验观察期结束后剖检无明显病变，仅个别羊有轻微病变。本发明疫苗和灭活苗可以明显减轻肺脏等组织病变(图3)，本发明亚单位疫苗改善肺脏病变效果优于灭活疫苗。病理组织学观察结果可以看出，攻毒对照组主要表现为肺脏组织淋巴滤泡样增生、肺泡上皮细胞增生、炎细胞浸润、纤维组织增生和纤维蛋白样渗出等病变，攻毒对照组肺脏病理损伤严重，本发明亚单位疫苗组可以明显改善肺脏病理损伤。结果表明，本发明亚单位疫苗的免疫保护效果优于灭活疫苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Lys Thr Lys Asn Gln Glu Glu Glu Ile Pro Asn Gly Asp Ala Phe

1 5 10 15

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20 25 30

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Ser Lys Lys Ala Tyr Ser Asn Asn Gln Asp Asp Phe Lys Asn Ala Ile

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65 70 75 80

Phe Phe Asn Glu Glu Leu Met Lys Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Tyr

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Glu Phe Leu Gly Glu Ala Lys Ala Glu Ser Leu Gln Pro Ala Asn Phe

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130 135 140

Leu Lys Asn Leu Ile Asp Pro Lys Lys Asn Lys Asp Asn Asn Ser Leu

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Tyr Lys Lys Ala Asn Ser Thr Asn Lys Gln Val Ile Glu Lys Tyr Leu

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210 215 220

Ser Ile Glu Tyr Ser Thr Thr Thr Thr Glu Gly Thr Ser Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ala Ile Gln Arg Thr Ser Leu Val Asp Ser Lys Ile Asn Lys Trp Trp

245 250 255

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Tyr Asn Lys Leu Lys Ile Ser Ser Asp Asn Ser Ile Ser Gln Asp Glu

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Glu Leu Asp Tyr Ile Asp Lys Val Ser Asn Lys Leu Ile Ser Ile Ile

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Met Thr Glu Ile Leu Phe Lys Lys Asp Thr Thr Asp Lys Asp His Val

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His Asn Asn Gln Ile Ser Pro Asp Asn Thr Arg Ile Val Thr Thr Asn

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<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

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Leu Glu

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<211> 909

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Glu Lys Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Glu Phe Glu Ser Tyr Asn Asn

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Val Val Ser Leu Leu Glu Gln Lys Asn Leu Thr Ser Asp Ile Leu Lys

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Leu Glu

Claims

1.一种山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合，其特征在于，包括山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊；所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ IDNo.5所示。

2.根据权利要求1所述的山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合，其特征在于，所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白甲、乙、丙、丁和戊的浓度分别为20～150μg/ml。

3.一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和佐剂。

4.根据权利要求3所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为双佐剂，所述双佐剂包括皂苷和ISA 201 VG佐剂。

5.根据权利要求4所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，其特征在于，所述皂苷的终浓度为1.0～4.0mg/ml。

6.根据权利要求4所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，其特征在于，所述ISA201VG佐剂的质量为山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗质量的50％～55％。

7.根据权利要求3所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗，其特征在于，还包括防腐剂溶液，所述防腐剂溶液的体积为所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷总体积的0.8％～1.2％，所述防腐剂溶液中防腐剂的质量百分含量为0.8％～1.2％。

8.权利要求3～7任意一项所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

2)将所述抗原皂苷混合物与ISA 201VG佐剂混合后，乳化获得山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合和皂苷混合之前还包括以下步骤：将所述山羊支原体山羊肺炎亚种免疫蛋白组合中蛋白分别溶于PBS缓冲液、混合；步骤1)所述静置后还包括将防腐剂溶液与静置后的溶液混合获得抗原皂苷混合物。

10.权利要求3～7任意一项所述的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗在制备预防和/或治疗山羊传染性胸膜肺炎的药物中的应用。