TW201437224A - 敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)毒素重組蛋白，包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位；當該抗原決定位為複數個時，各抗原決定位之間可由連接子連接。該重組蛋白進一步可包含至少一個單元的補體裂解片段C3d的胺基酸序列，且該抗原決定位與該補體裂解片段C3d的胺基酸序列可以連接子連接。本發明並關於一種編碼如上述敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的核苷酸序列，以及一種含有上述敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物。

Description

敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白及其應用
本發明係關於敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白在動物保健領域上的應用，特別是關於含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物在動物保健領域上的應用。
豬萎縮性鼻炎(Atrophic Rhinitis,AR)為豬隻呼吸系統之三大主要傳染病之一。豬萎縮性鼻炎會造成受感染的豬隻的顏面骨畸形及慢性化膿性鼻炎，而引起鼻甲介骨的萎縮。在嚴重感染時，鼻腔、頷骨、上頷骨亦會發生病變。下鼻甲骨的下游窩狀部位最常受感染。上鼻甲、下鼻甲骨、鼻中膈或篩骨等部位均會被感染。
豬萎縮性鼻炎(AR)是由支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)以及敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)A型菌(PmA)及D型菌(PmD)所引起，尤其是敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)所產生的毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)。取PMT毒素分別以肌肉、腹腔及鼻腔接種等方式接種於四週齡小豬，均可以引致鼻甲介骨萎縮的病變產生，此外也會波及全身性骨骼發育而使生長遲緩，甚至高劑量接種時，會導致肝臟受損而造成豬隻黃疸及死亡。
豬萎縮性鼻炎(AR)遍及世界各養豬地區，患豬生長緩慢，飼料利用效率降低。單獨感染時雖然死亡率不高，但污染率卻很大，而且容易誘發其他合併症或病原的感染，造成高死亡率，增加生產成本。在豬萎縮性鼻炎(AR)嚴重感染的養豬場，其經濟損失約為15-38%，且在重度感染的養豬場有較明顯的生長障礙情形，平均日增重約較正常豬隻少5-8%。因此開發有效的豬萎縮性鼻炎疫苗，以預防豬隻罹患豬萎縮性鼻炎(AR)可以說是刻不容緩且極為重要的事。
本發明於第一部份提供一種敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(recombinant PMT,rPMT)，該重組蛋白包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位(epitopes)，以誘導動物產生抗敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗體。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)可進一步含有補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列，以增加特異性免疫反應。且各個該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位之間、各個該補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列之間、以及敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位與補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列之間可進一步由連接子連接。
本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)，可以由下式所表示：(A)m-(C3d片段)n；其中每一個A代表一個獨立的敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位，每一個A係各自獨立選自於由SEQ ID NOs：2、3、4、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成的群組；其中每一個C3d片段代表一個獨立的補體裂解片段C3d的胺基酸序列，每一個C3d片段係各自獨立選自於SEQ ID NOs：6、7、8及9所組成的群組；其中m是代表從1至約30的整數；其中n是代表從0至約10的整數。
本發明於第二部份提供一種編碼一敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的核苷酸序列。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位，以及重複0至10個單元的補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列。
本發明於第三部份提供一種豬萎縮性鼻炎免疫組合物。該豬萎縮性鼻炎免疫組合物含有一敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)以及一藥學上可接受的載劑。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位(epitopes)，以及重複0至10個單元的補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列。該豬萎縮性鼻炎免疫組合物可進一步含有支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)以及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)。
本發明於第四部分中提供一種動物對抗豬萎縮性鼻炎的方法，包含使用有效量之上述免疫組合物以施予動物，以增強該動物對抗豬萎縮性鼻炎的免疫力，進而提升、改善其臨床症狀、存活率、及增重趨勢。
本發明於第五部分中提供一種抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素(PMT)的抗體，係藉由本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白 (rPMT)所製備或衍生而得；該抗體包括但不限於：單株抗體、多株抗體，以及經基因重組之抗體。
本發明於第六部分中提供一種豬萎縮性鼻炎之檢測套組，該檢測套組係用以偵測檢驗樣本是否含有敗血性巴氏桿菌D型菌毒素(PMT)或偵測檢驗樣本內是否含有抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素(PMT)的抗體。
本發明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物，與其他習用技術相互比較時，更具有下列之優點：本發明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物含有一敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位(epitopes)以及補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)遠比敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的全長胺基酸序列短，在生物表現系統中較容易表達，且重組蛋白的產率較高，可降低製造疫苗之成本。
此外，本發明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物所含的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列，因此可以增加特異性免疫反應，經試驗結果顯示，本發明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物可提高動物對抗豬萎縮性鼻炎的免疫性及效率。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
圖1為以酵素連結免疫分析(ELISA)測定抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體力價的結果；第1組為負對照組；第2組為含有實施例二所得 的支氣管敗血性博德氏桿菌、敗血性巴氏桿菌A型菌及敗血性巴氏桿菌D型的免疫組合物(B.b+PmA+PmD組)；第3組為實施例一所得的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT組)；第4組為含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT組)；第5組為市售豬萎縮性鼻炎疫苗(Bayovac組)。符號**代表兩組之間具有顯著差異(p<0.01)。
圖2為中和抗體試驗分析結果；圖2A為以含胎牛血清(FBS)之DMEM培養液培養Vero細胞的細胞形態(負對照組)；圖2B為以含4倍最小毒性劑量(MTD)的敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)處理Vero細胞的細胞形態(正對照組)，可見到細胞呈現典型的結節樣；圖2C為以免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT組)的小鼠血清稀釋40倍後與4倍最小毒性劑量(MTD)的敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)中和後，加入Vero細胞共培養的細胞形態。
圖3為以酵素連結免疫分析(ELISA)測定抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體力價的結果；第1組為負對照組；第2組為含有實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌、敗血性巴氏桿菌A型菌及敗血性巴氏桿菌D型的免疫組合物(B.b+PmA+PmD組)；第3組為含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT組)。符號**代表兩組之間具有顯著差異(p<0.01)。
本發明提供一種敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)，包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位，以誘導動物產生抗敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗體。
於一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位係分別具有如SEQ ID NOs：20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所示的胺基酸序列，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位可為1至約30個，且各抗原決定位胺基酸序列自蛋白質N端到C端的排列順序並不限於依照序列辨識號(SEQ ID NO)之順序排列。
於一較佳實施例中，分別以三段較長的抗原決定位胺基酸序列涵蓋部分上述敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位，該三段較長的抗原決定位胺基酸序列係分別如SEQ ID NOs：2、3、4所示。於一實施例中，本發明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)含有如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列所涵蓋的抗原決定位。於另一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)含有如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列所涵蓋的抗原決定位。於另一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)含有如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列所涵蓋的抗原決定位。於再一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)含有如SEQ ID NOs：2及/或3及/或4所示的胺基酸序列所涵蓋的抗原決定位。於一較佳實施例中，本發明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)含有二個以上該較長的抗原決定位胺基酸序列。此外，各抗原決定位胺基酸序列自蛋白質N端到C端的排列順序並不限於依照序列辨識號(SEQ ID NO)之順序排列。
於一較佳實施例中，當該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位及/或該較長的抗原決定位胺基酸序列為複數個(2)時，各敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位及/或該較長的抗原決定位胺基 酸序列之間可進一步由連接子(linker)連接，該連接子至少含有一個以上的甘氨酸(Glycine,Gly)，該連接子包含但不限於：Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19。於一實施例中，該連接子具有如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。然而，該複數個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位及/或該複數個較長的抗原決定位胺基酸序列之間，不必然要由連接子所連接。
於一實施例中，本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)進一步含有補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列，以增加特異性免疫反應。於一實施例中，該補體裂解片段C3d的全長胺基酸序列為小鼠補體裂解片段C3d的全長序列(mC3d)，具有如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。於一較佳實施例中，該補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列為小鼠補體裂解片段C3d第211個胺基酸至第238個胺基酸片段序列(mC3d-p28)，具有如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。於另一實施例中，該補體裂解片段C3d的全長胺基酸序列為豬補體裂解片段C3d的全長序列(pC3d)，具有如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。於另一較佳實施例中，該補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列為豬補體裂解片段C3d第201個胺基酸至第231個胺基酸片段序列(pC3d-p31)，具有如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有1至10個單元重複的上述補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列，該補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列較佳為1至重複10個單元，更佳為重複4至8個單元。
當該補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列為複數個時，各補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列之間可由連接子連接，該 連接子至少含有一個以上的甘氨酸(Gly)，該連接子包含但不限於：Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19。於一實施例中，該連接子的胺基酸序列為Gly-Ser。然而，該複數個補體裂解片段C3d的全長或部份胺基酸序列之間，不必然要由連接子所連接。
本發明的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)，可以由下式所表示：(A)m-(C3d片段)n； 式(I)其中每一個A代表一個獨立的敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位，每一個A係各自獨立選自於由SEQ ID NOs：2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成的群組；其中每一個C3d片段代表一個獨立的補體裂解片段C3d的胺基酸序列，每一個C3d片段係各自獨立選自於SEQ ID NOs：6、7、8及9所組成的群組；其中m是代表從1至約30的整數；其中n是代表從0至約10的整數。
於一實施例中，每一個A之間進一步以一個連接子連接，該每一個連接子係各自獨立選自於Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19。
於一實施例中，每一個C3d片段之間以一個連接子連接，該每一個連接子係各自獨立選自於Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19。
於部分實施態樣中，本發明所提供之敗血性巴氏桿菌毒素重 組蛋白(rPMT)與上述式(I)所表示之胺基酸序列具有至少大約80%序列同源性，較佳者，具有大約85%序列同源性，更佳者，具有大約90%序列同源性，甚至是大約91%、大約92%、大約93%、大約94%、大約95%、大約96%、大約97%、大約98%、大約99%序列同源性。
於一較佳實施例中，本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有三個分別如SEQ ID NO：2、3、4所示的胺基酸序列所涵蓋的抗原決定位，以及重複6個單元的小鼠補體裂解片段C3d第204個胺基酸至第231個胺基酸片段序列(mC3d-p28)，且各抗原決定位(epitopes)的C端以連接子(序列如SEQ ID NO：5所示)連接，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
於另一較佳實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有三個分別如SEQ ID NO：2、3、4所示的胺基酸序列所涵蓋的抗原決定位，以及重複6個單元的豬補體裂解片段C3d第201個胺基酸至第231個胺基酸片段序列(pC3d-p31)，且各抗原決定位(epitopes)的C端以連接子(序列如SEQ ID NO：5所示)連接，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
本發明並提供一種編碼本發明之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的核苷酸序列。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位，以及重複0至10個單元的補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列。該編碼本發明之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的核苷酸序列，係由本發明之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的胺基酸序列衍生而來。將本發明之敗血性巴氏桿菌毒素重 組蛋白(rPMT)胺基酸序列上的各個胺基酸置換為遺傳密碼表(genetic code table)所列之編碼該胺基酸的核苷酸序列(包含各種簡併密碼子(degenerate codons，或稱同義密碼子，synonymous codons))，即可得到本發明所提供之該核苷酸序列。例如，本發明之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)胺基酸序列上的絲胺酸(serine)可由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC等核苷酸序列所編碼。本發明之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)胺基酸序列上的各個胺基酸，可由以下各核苷酸序列所編碼：
此外，本發明亦提供一種豬萎縮性鼻炎免疫組合物。該豬萎縮性鼻炎免疫組合物含有一敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)。該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位(epitopes)，以及重複0至10個單元的補體裂解片段C3d的部份胺基酸序列。於一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。於另一實施例中，該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)具有如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
本發明所提供之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)包含但不限於由基因選殖方式或以胜肽合成儀(peptide synthesizer)合成而得；以基因選殖方式獲得該重組蛋白的方式可為，但不限於：將編碼敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的DNA序列選殖到表現載體中，各形成含有編碼敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的核苷酸序列的質體，再將該質體轉殖到生物表現宿主中，經蛋白質表現後而得到之抗原蛋白。
該表現載體系統包含但不限於pET載體系統以及pGEX載體系統等；該生物表現系統(宿主)包含但不限於：原核表現系統(如：大腸桿菌(E.coli))、真核表現系統(如：動物細胞(昆蟲細胞或哺乳類動物細胞)、植物細胞)。
於一實施例中，本發明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物進一步含有支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)以及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)。於一較佳實施例中，該支氣管 敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)以及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)由行政院農業委員會家畜衛生試驗所(台灣)分讓而來。然而，該支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)以及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)的來源不限於上述來源，其他來源的菌株亦可搭配本發明之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)，例如，該支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)亦可為如美國標準生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)編號ATCC31437，該敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)亦可為如英國國家標準生物品收藏中心(National Collection of Type Cultures,NCTC)編號NCTC 12177，以及該敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)亦可為如英國國家標準生物品收藏中心(NCTC)編號NCTC 12178等菌株，或源自野外分離所得之菌株。
本發明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物可進一步包含其他病原抗原，該病原抗原係選自由下列群組所組成者：豬環狀病毒第二型(PCV2)抗原、豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、豬黴漿菌(Mycoplasma)、豬小病毒(Parvovirus,PPV)、豬丹毒(Erysipelas)、偽狂犬病(Aujeszky's disease)，以及豬胸膜肺炎放線桿菌(actinobacillus pleuropneumonia，APP)。
另，本發明所提供的豬萎縮性鼻炎免疫組合物可進一步包含一或多種選自於下列藥學上可接受的載劑，包括：溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、界面活性劑、佐劑、生物型載體等。
該藥學上可接受的載劑包含一或多種選自於下列的試劑：溶 劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、界面活性劑(surfactant)、佐劑(adjuvant)，及其他類似或適用本發明之載劑。
該藥學上可接受的賦形劑可為適合於腸外、腸內或滴鼻施用的藥學上可接受之有機或無機載體物質，且該賦形劑不會與活性組合物產生有害的反應。適合的賦形劑包含但不限於水、鹽類溶液、蔬菜油、聚乙二醇、明膠、直鏈澱粉、乳糖、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、脂肪酸單甘酯和甘油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
該藥學上可接受的佐劑包含但不限於水性氫氧化鋁膠、明礬、Freund氏不完全佐劑、油質佐劑、水溶性佐劑、或水包油包水雙相佐劑(water-in-oil-in-water,W/O/W)；於一實施例中，該佐劑為水性氫氧化鋁膠。
進一步地，本發明提供一種動物對抗豬萎縮性鼻炎的方法，包含使用有效量之上述免疫組合物以施予動物，以增強該動物對抗豬萎縮性鼻炎的免疫力，進而提升、改善其臨床症狀、存活率、及增重趨勢。
本發明並提供一種抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素(PMT)的抗體，係藉由本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)所製備或衍生而得；該抗體包括但不限於：單株抗體、多株抗體，以及經基因重組之抗體。於一實施例中，該抗體係為經由將本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)施打於一動物體內而得到之多株抗體。本發明並提供一種豬萎縮性鼻炎之檢測套組，該檢測套組係用以偵測檢驗樣本是否含 有敗血性巴氏桿菌D型菌毒素(PMT)或偵測檢驗樣本內是否含有抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素(PMT)的抗體。該檢測套組包含但不限於：(1)一抗原，該抗原係為本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)，於一實施例中，該抗原係置於一抗原盤上；及/或(2)一抗體，該抗體係由該本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)所衍生、製備而得之單株抗體或多株抗體。
該檢測套組之形式包含但不限於：酵素連結免疫分析(enzyme-linked immuNOsorbent assay,ELISA)套組、微晶片檢驗套組(Microchip kit)、免疫螢光分析法(immuNO fluorescent assay,IFA)檢測套組、或其他藉由該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)所製得之檢測套組。於一實施例中，該檢測套組至少包含一含有本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)之抗原盤，可用以檢驗樣本中是否含有抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)之抗體。
於本發明中所使用之單數形式「一」、及「該」包含複數形式，除非文中另有清楚指明者。因此，例如，當提及「一樣本」時，包含複數個該等樣本及對該領域具有通常技藝者所知之同等物。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
本說明書中所述的所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一 敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)之構築
1. 敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白1(rPMT1)胺基酸序列的設計
首先以敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)全長胺基酸序列(如SEQ ID NO：1所示)為模板，利用抗原決定位(epitopes)預測網站(例如，但不限於BCPred(http：//ailab.cs.iastate.edu/bcpreds/))預測敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的抗原決定位。
Epi預測出的抗原決定位如表1所示(SEQ ID NOs：20-42)，將這些抗原決定位劃分為三個區段，分別編號為Epi 1、Epi 2及Epi 3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO：2、3、4所示；Epi 1、Epi 2及Epi 3分別含括了表1所示的各個抗原決定位。
接著以Epi 1、Epi 2、Epi 3不同組合的胺基酸序列設計敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)。分別在Epi1 (SEQ ID NO：2)、Epi 2(SEQ ID NO：3)、Epi 3(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列C端各加上一段連接子序列，該連接子具有如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，再由N端至C端依序連接Epi 1、Epi 2、Epi 3；並且在Epi 3的連接子序列C端加上六個mC3d-p28分子佐劑(bioadjuvant)序列(SEQ ID NO：6)，每個mC3d-p28分子佐劑序列皆以GS連接子連接；得到的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，並以合成儀合成該胺基酸序列或以基因選殖表現方式進行之。
2. 敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白2(rPMT2)胺基酸序列的設計
敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)的的抗原決定位(epitopes)的預測如上述。以Epi 1、Epi 2、Epi 3的胺基酸序列設計敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)。分別在Epi 1(SEQ ID NO：2)、Epi 2(SEQ ID NO：3)、Epi 3(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列C端各加上一段連接子序列，該連接子具有如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，再由N端至C端依序連接Epi 1、Epi 2、Epi 3；並且在Epi 3的連接子序列C端加上六個pC3d-p31分子佐劑(bioadjuvant)序列(如SEQ ID NO：7所示)，每個pC3d-p31分子佐劑序列皆以GS連接子連接；得到的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白2(rPMT2)胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，並以合成儀合成該胺基酸序列或以基因選殖表現方式進行之。
實施例二 支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)及敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)的培養
1. 支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)的培養
於本實施例中，支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)由行政院農業委員會家畜衛生試驗所(台灣)分讓而來。
先將該支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)接種於TSB固體培養基上[含5%(v/v)酵母抽出液(yeast extract)、10%(v/v)血清、大豆分解蛋白質乾酪素培養基(tryptic soy broth,TSB，BD公司，美國)]，於37℃下培養隔夜後，挑選單一菌落接種於腦心浸出液(brain heart infusion,BHI)液體培養基內(BD公司，美國)，於37℃下震盪培養隔夜；接著取菌液再接種於BHI液體培養基內，於37℃下震盪培養隔夜，並計算菌落形成單位(colony forming unit,CFU)值；最後加入甲醛(formaldehyde)，於室溫下震盪24至36小時，對菌液進行不活化作用。
2. 敗血性巴氏桿菌(P.multocida)的培養
於本實施例中，敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)由行政院農業委員會家畜衛生試驗所(台灣)分讓而來，且該敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)具有產生毒素能力。
先將敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)分別接種於TSB固體培養基上[含5%(v/v)酵母抽出液、10%(v/v)血清、大豆分解蛋白質乾酪素培養基(TSB，BD公司，美國)]，於37℃下培養隔夜後，挑選單一菌落接種於腦心浸出液(BHI)液體培養基內(BD公司，美國)，於37℃下震盪培養隔夜；接著取0.1%(v/v)菌液再接種於BHI液體培養 基內，於37℃下震盪培養隔夜，並計算菌落形成單位(CFU)值；最後加入甲醛對菌液進行不活化作用。
實施例三 含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的配製
將實施例一所得到的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)(SEQ ID NO：10或11)(最終濃度為65μg/ml)與實施例二所得到的不活化的支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)(最終濃度為1x109CFU/ml)、不活化的敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)(最終濃度為1x109CFU/ml)及不活化的敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)(最終濃度為1x109CFU/ml)以磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered solution,PBS)混和均勻，並加入鋁膠[最終濃度為30%(v/v)]作為佐劑，以配製成為豬萎縮性鼻炎免疫組合物。
實施例四 含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的免疫原性(immunogenicity)分析-小鼠免疫試驗
1. 試驗小鼠
取26隻4週齡健康的BALB/c雄性小鼠(國家實驗動物中心，台灣)作為試驗動物，所有小鼠的敗血性巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)、支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)的酵素結合免疫吸附分析(ELISA)抗體皆呈陰性。
2. 免疫計畫
將這些小鼠隨機分為5組，第1組(負對照組)有6隻小鼠，而第2至5組則每組有5隻小鼠。每隻小鼠分別以腹腔注射(intraperitoneal injection,ip.)注射0.2ml以下物質：第1組：含30%(v/v)鋁膠的PBS緩衝溶液(負對照組)；第2組：實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)(1x109CFU/ml)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)(1x109CFU/ml)及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)(1x109CFU/ml)的免疫組合物(含30%(v/v)鋁膠佐劑)(B.b+PmA+PmD組)；第3組：實施例一所得的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(序列如SEQ ID NO：10所示，濃度為65μg/ml)(rPMT組)；第4組：實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO：10所示)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT組)；以及第5組：市售豬萎縮性鼻炎疫苗(Bayovac®，台灣拜耳公司，台灣)(Bayovac組)。
每隻小鼠分別於首次免疫前24小時採血保存，首次免疫後第13天再進行採血，首次免疫後第14天以相同免疫劑量再進行第二次免疫，第二次免疫後第10天採血，並分離血液樣本中的血清，以進行毒素抗體的酵素連結免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。
3. 毒素抗體的酵素連結免疫分析(ELISA)
以商品化的敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)(Merck公司，美國) 作為抗原，並將抗原塗佈(coating)於ELISA用96孔盤(Thermo公司，美國)，於4℃下靜置16小時。去除多餘抗原後加入清洗緩衝液(wash buffer；0.9% NaCl；0.1% Tween20)，清洗3次後倒乾。接著加入阻隔緩衝液(blocking buffer；含有1% BSA的wash buffer)，於室溫下靜置1小時後，以清洗緩衝液清洗，接著將上述各組小鼠採集到的血清樣品以PBS緩衝溶液稀釋後，每孔加入稀釋的小鼠血清，於室溫下靜置1小時後，去除血清樣品，並以清洗緩衝液清洗，然後加入辣根過氧化酵素(Horseradish peroxidase,HRP)標定的山羊抗小鼠的二級抗體(goat anti-mouse conjugated HRP，Gene Tex公司，美國)，該二級抗體先以阻隔緩衝液稀釋5000倍後再加入96孔盤(100μl/孔)，於室溫下靜置1小時後，去除二級抗體，並以清洗緩衝液清洗後，每孔加入100μl 3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺二鹽酸(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB，KPL公司，美國)溶液避光呈色10分鐘，並以酵素連結免疫分析測讀儀(SpectraMax® M2/M2 ELISA Reader，Molecular Devices公司，美國)讀取波長650nm的吸光值。
酵素連結免疫分析結果如圖1所示，免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的小鼠(第4組，即B.b+PmA+PmD+rPMT組)血清中含有的抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體力價最高，其次為免疫市售豬萎縮性鼻炎疫苗(第5組，即Bayovac組)的小鼠血清；而只免疫實施例一所得的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(第3組，即rPMT組)的小鼠血清中也含有的抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體，且其所含的抗體力價高於免疫實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌、敗血性巴氏桿菌A型菌及敗血性巴氏桿菌D型菌(第2組，即B.b+PmA+PmD組)的小鼠血清。 由此可知，本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)可以在動物體內有效地誘導出抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體，具免疫原性。
4. 中和抗體力價試驗
以Vero細胞作為試驗材料，測試免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的小鼠(第4組，即B.b+PmA+PmD+rPMT組)血清中所含的抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體，是否為可中和PMT毒性的中和抗體。進行中和抗體力價測試之前，先進行Vero細胞之最小毒性劑量(minimum toxin dose，MTD)測定。
(a)Vero細胞之最小毒性劑量(MTD)測定
將Vero細胞接種於96孔培養盤中，待細胞長成單層後，去除培養液，並加入以不含血清之DMEM培養液(GIBCO公司，美國)連續2倍稀釋的PMT處理。以含胎牛血清(FBS)之DMEM培養液作為負對照組，培養後並觀察細胞的型態變化，以能誘導Vero細胞產生細胞病變(cytopathic effect，CPE)的最低PMT濃度為最小毒性劑量(MTD)。試驗結果顯示，Vero細胞的敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)之最小毒性劑量為60ng。
(b)中和抗體力價試驗
中和抗體力價試驗方法係參考Liao等人(2006)與Lee等人(2012)所提出之方法並進行適當修飾(Liao,C.M.,Huang,C.,Hsuan,S.L.,Chen,Z.W.,Lee,W.C.,Liu,C.I.,Winton,J.R.,and Chien,M.S.(2006).Immunogenicity and efficacy of three recombinant subunit Pasteurella multocida toxin vaccines against progressive atrophic rhinitis in pigs.Vaccine.24,27-35；Lee,J.,Kang,H.E.,and Woo,H.J.(2012).Protective immunity conferred by the C-terminal fragment of recombinant Pasteurella multocida toxin.Clin Vaccine Immunol.19,1526-1531.)。首先將免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的小鼠(第4組，即B.b+PmA+PmD+rPMT組)血清稀釋10倍後，再做連續兩倍的稀釋(2-1~2-6)。於96孔培養盤中，分別加入上述稀釋之小鼠血清，並於各孔中加入含4倍最小毒性劑量(MTD)的敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)，然後置於37℃中反應1小時。接著將上述反應液加入培養於96孔盤的Vero細胞中，於37℃、5% CO2培養箱中培後，並觀察該血清是否能夠抑制Vero細胞產生細胞病變(CPE)。
結果如圖2所示。以含4倍最小毒性劑量(MTD)的敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)處理Vero細胞作為正對照組，其細胞形態如圖2B所示，可見到細胞呈現典型的結節樣。相較之下，以含胎牛血清(FBS)之DMEM培養液培養Vero細胞作為負對照組，其細胞形態如圖2A所示；而以免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的小鼠(第4組，即B.b+PmA+PmD+rPMT組)血清稀釋40倍後與4倍最小毒性劑量(MTD)的敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)中和後，加入Vero細胞共培養的細胞形態如圖2C所示。圖2A與圖2C所示之細胞皆未出現如圖2B所示之典型的結節樣，顯示免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的小鼠(第4組，即B.b+PmA+PmD+rPMT組)血清中含有抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)之中和抗體。
實施例五 含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的免疫原性及保護效力分析1-台灣豬萎縮性鼻炎菌苗檢驗標準(巴氏桿菌效力試驗)
根據台灣豬萎縮性鼻炎菌苗檢驗標準，選取敗血性巴氏桿菌抗體陰性3週齡BALB/c小鼠(國家實驗動物中心，台灣)32隻，隨機分為3組，第1組為對照組(n=9)，第2組為rPMT免疫試驗組(n=12)，第3組為Bayovac®免疫試驗組(n=11)；每隻小鼠分別以腹腔注射(ip.)注射0.5ml的10倍稀釋待測物，各組分別為：第1組：含30%(v/v)鋁膠的PBS緩衝溶液(對照組)；第2組：實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO：10所示)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT組)；以及第3組：市售豬萎縮性鼻炎疫苗(Bayovac®，台灣拜耳公司，台灣)(Bayovac組)。
免疫試驗組(第2組及第3組)於免疫後第14日各分為3小組，依組序分別以具有生產毒素能力的敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)強毒菌株[同實施例二，由行政院農業委員會家畜衛生試驗所(台灣)分讓而來]1x103CFU/ml、1x104CFU/ml、1x105CFU/ml三種濃度活菌液0.1ml腹腔注射。同時對照組(第1組)12隻小鼠亦分為三小組，依組序分別以巴氏桿菌強毒菌株1x102CFU/ml、1x103CFU/ml、1x104CFU/ml三種濃度活菌液0.1ml腹腔注射。觀察10天後，各免疫試驗組與對照組分別以貝卡二氏法(Beherens-Karber)計算其LD50，且各免疫試驗組的防禦指數須高於對照組 1x100.5以上。貝卡二氏法防禦指數計算法如下：LD50=攻毒劑量的最低稀釋倍數-[(各組死亡率之總和/100)-0.5]x 1
防禦指數=【對照組攻毒劑量的最低稀釋倍數-[(各組死亡率之總和/100)-0.5]x 1】-【免疫組攻毒劑量的最低稀釋倍數-[(各組死亡率之總和/100)-0.5]x 1】。
結果如表2所示，含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(第2組，即B.b+PmA+PmD+rPMT組)確實能誘發小鼠產生保護效力，並耐過敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)強毒菌株的攻毒，且其防禦指數高達102.06，遠高於台灣檢驗標準(100.5)以及市售豬萎縮性鼻炎疫苗(Bayovac®，台灣拜耳公司，台灣)(Bayovac組)的防禦指數(101.74)。
實施例六 含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的免疫原性及保護效力分析2
選取敗血性巴氏桿菌抗體陰性、體重15~20g的BALB/c小鼠(國家實驗動物中心，台灣)65隻，隨機分為3組，第1組為對照組，共有5隻小鼠，第2、3組為免疫試驗組，每組30隻小鼠。分別將各免疫試驗再細分為3小組，每小組10隻小鼠；各組小鼠分別以腹腔注射方式注射以下物質：第1組：每隻小鼠注射0.2ml PBS緩衝溶液(對照組)；第2-1組：每隻小鼠注射0.2ml實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO：10所示)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物原液(B.b+PmA+PmD+rPMT組)；第2-2組：每隻小鼠注射0.2ml稀釋5倍的實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO：10所示)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(1/5 B.b+PmA+PmD+rPMT組)；第2-3組：每隻小鼠注射0.2ml稀釋25倍的實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO：10所示)的豬萎縮性鼻炎免 疫組合物(1/25 B.b+PmA+PmD+rPMT組)；第3-1組：每隻小鼠注射0.2ml市售豬萎縮性鼻炎疫苗原液(Bayovac®，台灣拜耳公司，台灣)(Bayovac組)；第3-2組：每隻小鼠注射0.2ml稀釋5倍的市售豬萎縮性鼻炎疫苗(Bayovac®，台灣拜耳公司，台灣)(1/5 Bayovac組)；第3-3組：每隻小鼠注射0.2ml稀釋25倍的市售豬萎縮性鼻炎疫苗(Bayovac®，台灣拜耳公司，台灣)(1/25 Bayovac組)。
免疫試驗組(第2、3組)於首次免疫後第14日進行二次免疫，劑量同首次免疫；對照組(第1組)小鼠則再次注射0.2ml PBS緩衝溶液；二次免疫後第10天進行攻毒試驗，每隻小鼠以腹腔注射方式注射0.2ml具有生產毒素能力的敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)強毒菌株[同實施例二，由行政院農業委員會家畜衛生試驗所(台灣)分讓而來]100 LD50活菌液，觀察10天記錄存活率。原液免疫組(第2-1組、第3-1組)存活率須高於80%、5倍稀釋免疫組(第2-2組、第3-2組)存活率須高於50%、25倍稀釋免疫組(第2-3組、第3-3組)存活率須高於20%，對照組則須全部死亡。
結果如表3所示，含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(第2-1組、第2-2組、第2-3組)確實能誘發小鼠產生足夠的保護效力，免疫原液疫苗的小鼠存活率為90%，符合存活率80%以上的標準，免疫稀釋5倍疫苗的小鼠存活率為50%，符合存活率50%以上的標準，免疫稀釋25倍疫苗的小鼠存活率為30%，符合存活率20%以上的標準。
實施例七 含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的免疫原性及保護效力分析3-以敗血性巴氏桿菌毒素進行攻毒的小鼠試驗
1. 敗血性巴氏桿菌粗萃毒素的製備
先將具有生產毒素能力的敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)強毒菌株[同實施例二，由行政院農業委員會家畜衛生試驗所(台灣)分讓而來]接種於腦心浸出液(BHI)液體培養基內(BD公司，美國)，於37℃下培養隔夜後，取100μl菌液平均塗佈於7%血液培養基，於37℃下培養隔夜，以PBS刮洗細菌並置於離心管中，以超音波振盪器(SONOPULS，Bandelin公司，德國)處理以將細菌擊碎，再以高速離心機(KUBOTA公司，日本)離心後，取上清液以0.45μm孔徑過濾膜(Millipore公司，美國)過濾後，此過濾液即為敗血性巴氏桿菌粗萃毒素(crude extracted PMT)，分裝後保存於-20℃備用。
2. 敗血性巴氏桿菌粗萃毒素對小鼠的半數致死劑量(LD50)試驗
取敗血性巴氏桿菌抗體陰性3週齡健康的BALB/c小鼠(國家實驗動物中心，台灣)76隻，隨機分為5組；將上述製得的敗血性巴氏桿菌粗萃毒素解凍後，依照下列毒素劑量對每組每隻小鼠注射0.5ml粗萃毒素：第1組：1x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=14)；第2組：2x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=8)；第3組：4x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=12)；第4組：6x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=20)；第5組：8x108CFU/ml萃取的毒素蛋白(n=22)； 注射粗萃毒素後，觀察小鼠10天並紀錄死亡數，以計算敗血性巴氏桿菌粗萃毒素對小鼠的半數致死劑量(LD50)，LD50是以Calcu-Syn軟體(Biosoft公司，英國)計算得出。
結果如表4所示，以上述敗血性巴氏桿菌粗萃毒素對小鼠進行攻毒的半數致死劑量(LD50)為2x108CFU/ml。
3. 小鼠免疫及以敗血性巴氏桿菌粗萃毒素攻毒試驗
取敗血性巴氏桿菌抗體陰性3週齡健康的BALB/c小鼠(國家實驗動物中心，台灣)24隻，隨機分為5組；第1組為對照組，第2至5組為免疫試驗組；各組每隻小鼠分別以腹腔注射(ip.)注射0.2ml的以下物質：第1組：含30%(v/v)鋁膠的PBS緩衝溶液(負對照組)；第2組：實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)(1x109CFU/ml)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)(1x109CFU/ml)及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)(1x109CFU/ml)的免疫組合物(含30%(v/v)鋁 膠佐劑)(B.b+PmA+PmD組)；第3組：實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT1，序列如SEQ ID NO：10所示)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT1組)；第4組：實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT2，序列如SEQ ID NO：11所示)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT2組)；以及第5組：市售豬萎縮性鼻炎疫苗(Bayovac®，台灣拜耳公司，台灣)(Bayovac組)。
每隻小鼠分別於首次免疫後第14天以相同免疫劑量再進行第二次免疫，第二次免疫後第10天取上述製得的敗血性巴氏桿菌粗萃毒素進行攻毒試驗，對每隻小鼠注射0.5ml的LD85劑量(即6x108CFU/ml)的敗血性巴氏桿菌粗萃毒素，注射粗萃毒素後，觀察小鼠10天並紀錄死亡數，以計算各組存活率。
結果如表5所示，含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT1或rPMT2)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(即第3組及第4組)確實能誘發小鼠產生保護效力，並耐過敗血性巴氏桿菌粗萃毒素的攻毒，且其存活率皆大於負對照組及僅免疫支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)的免疫組合物。
實施例八 含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的免疫原性分析-豬隻免疫試驗
1. 試驗豬隻
自一豬場(宜蘭，台灣)隨機選3~4週齡健康的哺乳豬30隻作為試驗豬隻。
2. 免疫計畫
將上述豬隻隨機分為3組，每組10隻豬，每隻豬分別於試驗 開始(第0天首次免疫)與第21天(二次免疫)各進行一次肌肉注射(2ml/隻)下列物質：第1組：含30%(v/v)鋁膠的PBS緩衝溶液(負對照組)；第2組：實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌(B.bronchiseptica)(1x109CFU/ml)、敗血性巴氏桿菌A型菌(PmA)(1x109CFU/ml)及敗血性巴氏桿菌D型菌(PmD)(1x109CFU/ml)的免疫組合物(含30%(v/v)鋁膠佐劑)(B.b+PmA+PmD組)；以及第3組：實施例三所得的含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT，序列如SEQ ID NO：11所示)的豬萎縮性鼻炎免疫組合物(B.b+PmA+PmD+rPMT組)。
每隻豬分別於首次免疫前、二次免疫前，以及在二次免疫後第14天採血保存，並且記錄體重，並分離血液樣本中的血清，以進行毒素抗體的酵素連結免疫分析(ELISA)。
3. 酵素連結免疫分析(ELISA)
以敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)(Merck公司，美國)作為抗原，並將抗原塗佈(coating)於ELISA用96孔盤(Thermo公司，美國)，於4℃下靜置16小時。去除多餘抗原後加入清洗緩衝液(0.9% NaCl；0.1% Tween20)，清洗後倒乾。接著加入阻隔緩衝液(含有1% BSA的清洗緩衝液)，於室溫下靜置1小時後，以清洗緩衝液清洗，接著將上述各組豬採集到的血清樣品以PBS緩衝溶液稀釋後，每孔加入稀釋的豬血清，於室溫下靜置1小時後，去除血清樣品，並以清洗緩衝液清洗，然後加入辣根過氧化酵素(HRP)標定的山羊抗小鼠的二級抗體(Gene Tex公司，美國)，該二級抗體先以阻隔緩衝液稀釋 1000倍後再加入96孔盤(100μl/孔)，於室溫下靜置1小時後，去除二級抗體，並以清洗緩衝液清洗6次後，每孔加入100μl 3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺二鹽酸(KPL公司，美國)溶液避光呈色10分鐘，並以酵素連結免疫分析測讀儀(Labsystem multiskan MCC/340 Microplate Reader，Labsystem公司，美國)讀取波長650nm的吸光值。
酵素連結免疫分析結果如圖3所示，在二次免疫後第14天時，免疫含有敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的豬萎縮性鼻炎免疫組合物的豬隻(第3組，即B.b+PmA+PmD+rPMT組)血清中含有的抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體力價最高，且其相較於負對照組豬隻與免疫實施例二所得的支氣管敗血性博德氏桿菌、敗血性巴氏桿菌A型菌及敗血性巴氏桿菌D型菌的豬隻(第2組，即B.b+PmA+PmD組)血清中含有的抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體力價，分別具有顯著差異(**,p<0.01)。此外，這三組豬隻之間的體重變化並無顯著差異(結果未顯示)。
由此可知，本發明所提供的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)在動物體內，特別是目標動物豬隻體內，可有效地誘導出抗敗血性巴氏桿菌毒素(PMT)抗體，而且對豬隻的生長無不良影響，具有安全性。
實施例九 抗敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)抗體之製備
1. 抗敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)之多株抗體
將實施例一所得到的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)與適用之佐劑(如：鋁膠)混合後施與動物(如：小鼠、大鼠、豬、山羊、兔) 以進行初級免疫，經適當時間間隔後(如：2~3週)，視需要可進第二次免疫。經適當時間間隔後(如：2~3週)，採集免疫動物(如：小鼠、大鼠、豬、山羊、兔)之血清，即製得抗敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)之多株抗體。
其中該抗敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)之多株抗體，可視需要與顯色劑或螢光結合。
其中該動物經施予初級免疫及第二次免疫後，可視需要增加免疫次數，以提高抗體力價。
其中施與之動物包含，但不限於：小鼠、大鼠、兔、禽(蛋)、豬、山羊、牛、水產動物。
2. 抗敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)之單株抗體
將實施例一所得到的敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)與適用之佐劑(如：鋁膠)混合後施與動物(如：小鼠、大鼠、豬、山羊、兔)以進行初級免疫，經適當時間間隔後(如：2~3週)，視需要可進第二次免疫。經適當時間間隔後(如：2~3週)，採集免疫動物(如：小鼠)之血清，用以評估適合用以採集脾臟細胞之小鼠。從該適用之小鼠採集脾臟細胞與骨髓瘤細胞(如：FO細胞株、NS細胞株)以PEG(Polyethylene Glycol，如PEG1500)進行細胞融合。從融合細胞中篩選出具分泌能力之融合瘤並單株化後，可得一適合用以產製抗敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白(rPMT)之單株抗體的融合細胞系。
經上述製備所得之抗體，可用於免疫檢測試劑、治療劑、或加入食品、飼料中使食用者具有免疫力等。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟 該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
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<313> (1086)..(1105)
<400> 42

Claims (28)

  1. 一種敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)毒素重組蛋白，包含至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位(epitopes)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位係選自於由SEQ ID NOs：2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成之群組中至少一個。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中當該至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位為複數個時，各該敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位之間由連接子連接。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該連接子係各自獨立選自於由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白進一步包含至少一個單元的補體裂解片段C3d的部分胺基酸序列或全長胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該至少一個敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位與該補體裂解片段C3d的部分胺基酸序列或全長胺基酸序列係以連接子連接。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該連接子係各自獨立選自於由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs：5、12、 13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該至少一個單元的補體裂解片段C3d的胺基酸序列為複數個時，各該補體裂解片段C3d的胺基酸序列之間由連接子連接。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該連接子係各自獨立選自於由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該補體裂解片段C3d係選自於由SEQ ID NOs：6、7、8及9所組成的群組。
  11. 如申請專利範圍第5項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白包含如SEQ ID NO：10或11所示的胺基酸序列。
  12. 一種敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)毒素重組蛋白，其係以下之式(I)表示：(A)m-(C3d片段)n； 式(I)其中每一個A代表一個獨立的敗血性巴氏桿菌毒素蛋白的抗原決定位；其中每一個C3d片段代表一個獨立的補體裂解片段C3d的胺基酸序列；其中m是代表從1至約30的整數；其中n是代表從0至約10的整數。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中每一個A係各自獨立選自於由SEQ ID NOs：2、3、4、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41及42所組成之群組。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中每一個C3d片段係各自獨立選自於由SEQ ID NOs：6、7、8及9所組成的群組。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中每一個A之間以一個連接子連接，每一個連接子係各自獨立選自於由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。
  16. 如申請專利範圍第12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中每一個C3d片段之間以一個連接子連接，每一個連接子係各自獨立選自於由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。
  17. 如申請專利範圍第12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中A與C3d片段之間以一連接子連接，該連接子係選自於由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs：5、12、13、14、15、16、17、18、19所組成的群組。
  18. 如申請專利範圍第12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白，其中該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白包含與式(I)具有至少80%序列同源性的胺基酸序列。
  19. 一種編碼如申請專利範圍第1或12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白的核苷酸序列。
  20. 一種豬萎縮性鼻炎免疫組合物，包含如申請專利範圍第1或12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白以及一藥學上可接受的載劑。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之豬萎縮性鼻炎免疫組合物，其特徵在於，該豬萎縮性鼻炎免疫組合物進一步包含一支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、一敗血性巴氏桿菌A型菌(Pasteurella multocida Type A)以及一敗血性巴氏桿菌D型菌(Pasteurella multocida Type D)。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之豬萎縮性鼻炎免疫組合物，其特徵在於，該豬萎縮性鼻炎免疫組合物進一步包含其他病原抗原，該病原抗原係選自由下列群組所組成者：豬環狀病毒第二型(PCV2)抗原、豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、豬黴漿菌(Mycoplasma)、豬小病毒(Parvovirus,PPV)、豬丹毒(Erysipelas)、豬胸膜肺炎放線桿菌(actinobacillus pleuropneumonia，APP)，以及偽狂犬病(Aujeszky's disease)。
  23. 一種動物對抗豬萎縮性鼻炎的方法，包含使用如申請專利範圍第20項所述之免疫組合物以施予一動物，以增強該動物對抗豬萎縮性鼻炎之免疫力。
  24. 一種抗敗血性巴氏桿菌D型菌毒素的抗體，係藉由如申請專利範圍第1或12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白所製備而得。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之抗體，該抗體包含至少下列其中一種： 一單株抗體、一多株抗體，以及一經基因重組之抗體。
  26. 一種豬萎縮性鼻炎的檢測試劑盒，包含一偵測單元，該偵測單元係選自於下列群組所組成中至少一者：一如申請專利範圍第1或12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白以及一藉由如申請專利範圍第1或12項所述之敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白所製備之抗體。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之檢測套組，其中該敗血性巴氏桿菌毒素重組蛋白係置於一盤上。
  28. 如申請專利範圍第26項所述之檢測套組，其中該抗體包含至少下列其中一種：一單株抗體、一多株抗體，以及一經基因重組之抗體。
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