CN109666071A - 一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备 - Google Patents

一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，采用BCA蛋白浓度方法构建标准蛋白浓度的标准曲线，通过标准曲线计算待测toxA‑N纯化蛋白的浓度，制备抗原，再进行多杀性巴氏杆菌毒素toxA‑N蛋白多克隆抗体和单克隆抗体的制备。通过生物技术方法将纯化后的toxA‑N蛋白制备成抗原，通过对大白兔的皮下注射及昆明鼠的腹腔注射，刺激机体发生免疫应答，产生对应宿主的抗体。将制备多克隆抗体进行倍比稀释，在1:6400时P/N仍然>2，而单克隆抗体因其特异性高，稀释至1:64000时P/N依旧>2.5，完全符合制备抗体的要求。

Description

一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备
技术领域
本发明属于毒素基因抗体制备领域，具体涉及一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备。
背景技术
研究发现，多杀性巴氏杆菌众多的致病因子中以多杀性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)毒性最高，且在致病过程中扮演主要作用。目前，国内关于羊感染多杀性巴氏杆菌的研究很少，相应的疫苗研究也很缺乏，临产上主要以抗生素进行预防。因此，羊巴氏杆菌病疫苗的研究迫在眉睫。
多杀性巴氏杆菌病是一种常见的人畜共患性疾病，其血清型多样，致病性复杂。通过血清型分型方法对多杀性巴氏杆菌进行分型，由荚膜抗原(K抗原)可分为A、B、D、E、F五种血清型，由脂多糖抗原(O抗原)分为16种血清型(1-16)，根据是否产多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)，分为非产毒多杀性巴氏杆菌(T-Pm)和产毒多杀性巴氏杆菌(T+Pm)。临床上，因抗原性和宿主特异性的差异，造成了多种临床症状，例如猪的萎缩性鼻炎，牛羊的出血性败血症，禽类的禽霍乱等。随着广谱抗生素的滥用，多杀性巴氏杆菌的致病率及家畜死亡率日益增高，严重危害我国养殖户的经济效益。
多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)是一种大分子蛋白，相对分子质量为146ku，具有不耐热、不耐酸等特性。PMT蛋白是一种典型的AB结构蛋白，由C端和N端两个结构域构成，中间为跨膜部位。C端与生物活性效应有关，为催化作用位点，N端与靶细胞的结合以及生物胞吞作用有关，为黏附作用位点。研究发现，PMT蛋白N端是多杀性巴氏杆菌毒素与受体结合并发挥重要作用的桥梁，然而，天然和人工合成的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白分泌量很低，不到菌体的0.5％，但通过PMT蛋白的亚克隆，却能大量获得融合蛋白。经生物信息学软件对PMT蛋白及toxA-N蛋白进行分析，发现PMT蛋白N端与亚克隆表达的toxA-N蛋白的具有一些相同特性，例如空间结构、抗原表位、氨基酸构成等。因此，通过对toxA-N蛋白的生物学研究来揭示多杀性巴氏杆菌毒素的致病机理以及信息传递通路。
发明内容
本发明的目的是提供一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，通过将toxA-N蛋白制备成抗原，制备出特异性高的多克隆抗体和单克隆抗体。
本发明所采用的技术方案是：一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，具体按照以下步骤实施：
步骤1，多杀性巴氏杆菌toxA-N蛋白抗原的制备：
步骤1.1：待测toxA-N纯化蛋白浓度的测定
采用BCA蛋白浓度测量方法，构建标准蛋白溶液浓度的标准曲线，取实验室制备的已纯化的待测多杀性巴氏杆菌toxA-N蛋白，通过标准曲线法计算待测toxA-N纯化蛋白的浓度；
步骤1.2：抗原的制备
用灭菌后的生理盐水稀释步骤1.1中已知浓度的toxA-N蛋白，并使其终浓度为1ug/μL，将稀释后的toxA-N蛋白按1：1的比例与相应的弗氏佐剂进行乳化，用注射器快速吹打混合，直至乳化液滴到静止的水面上不扩散为止，即乳化完全，抗原制备成功；
步骤2，多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白多克隆抗体的制备：
将步骤1制备好的抗原免疫兔子，通过三次免疫刺激机体产生相应抗体，经效价检测，获取高效价血清，并将获得的血清，经间接ELISA及Westernblot进行验证；
步骤3：多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白单克隆抗体的制备
以步骤1中制备的抗原，免疫BALB/c小鼠作为饲养细胞，依次通过细胞融合、筛选、单克隆抗体鉴定获得抗体，并将获得的单克隆抗体进行鉴定。
本发明的特点还在于，
步骤1.1中toxA-N纯化蛋白标准曲线的建立按照步骤如下：
1.1.1，取一块酶标板，先将酶标板孔依次编号为0、1、2、3、4、5、6、7，再在酶标板中依次加入蛋白标准溶液0、1、2、4、8、12、16、20μL，补充去离子水使每个酶标板中液体体积均为20μL，最后往酶标板中依次加入对应蛋白0、0.5、1、2、4、6、8、10μg，每组实验重复3次；
步骤1.1.2，在酶标板每孔中加入BCA工作液200μL，充分混匀，于37℃放置30min；
步骤1.1.3，提前15min打开酶标仪，将步骤1.1.2中的酶标板依次放入酶标仪中测定吸光值，测定波长为562nm；
步骤1.1.4，根据步骤1.1.3中测量的数据绘制标准曲线；
步骤1.1.5，将待测toxA-N蛋白样进行1：100稀释，稀释后总体积为20μL，再加入BCA工作液200μL，37℃放置30min，以标准曲线0号管作为对比，记录吸光值：
步骤2具体按照以下步骤进行：
步骤2.1：阴性血清的采集
取两只兔子，于兔耳缘静脉进行血液采集，每只兔子采集5mL，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上清液并与-80℃保存，以备后续实验；
步骤2.2：初免
将稀释toxA-N蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫步骤2.1中的两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；
步骤2.3：次免
初免后14天后进行次免实验，稀释toxA-N蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；
步骤2.4：三免
次免后14天后进行三兔实验，稀释蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；
步骤2.5：采集免疫后血清
于三免后10天采集全血，每只兔采集不低于15mL血液，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上层抗体血清，-80℃保存，即制备出多克隆抗体；
步骤2.6：多克隆抗体的鉴定
(1)间接ELISA效价鉴定：
对步骤2.5制备的血清用间接ELISA进行测定，于96孔板中加入每孔200ng抗原/100μl包被液，骨髓瘤细胞做梯度稀释，测定过程中以阴性血清作为阴性对照，以PBST稀释液作为空白对照；
(2)Western blot鉴定：
将步骤1制备的抗原作为目标蛋白进行Western blot，经SDS-PAGE跑胶后，以恒定电流200mA以及低温的条件下进行转膜2h，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，一抗为1:2000稀释的兔血清，二抗为1：5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体，经ECM显色、拍照。
步骤3中具体实施步骤为：
步骤3.1：动物免疫
将步骤1制备的抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，初免后每隔两周免疫一次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次；
步骤3.2：细胞准备及杂交瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞的准备：于融合前两周复苏骨髓瘤细胞，将复苏的骨髓瘤细胞置于5％CO2、37℃恒温培养箱中传代培养。培养的过程中在培养液中加入浓度为20ug/ml的8-氮鸟嘌吟，连续处理3次，使骨髓瘤细胞对HAT培养液更加敏感，融合前一天传代一次，使融合当天的骨髓瘤细胞处于对数生长期；
饲养细胞的准备：在细胞融合前一天，取3～4周龄的健康BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度至l～5×105个/mL，按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中；
免疫脾细胞的准备：取三天前加强免疫的小鼠，无菌摘取脾脏，收集脾细胞悬液，脾细胞计数后备用；
杂交瘤细胞的制备：将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞悬液混匀，使用聚乙二醇融合细胞，然后转入96孔细胞培养板中，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养；
步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选、亚克隆和扩大培养
根据步骤3.2制备出的杂交瘤细胞，注意观察杂交瘤细胞的生长状况，待细胞长到孔底的1/4～1/3时吸出上清进行间接ELISA检测，以P/N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照，对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养；
克隆化培养时，待细胞长到孔底的l/4～1/3时，对细胞上清进行间接ELISA检测，选择克隆数少、OD450nm值高的阳性孔，将其再次克隆，经3～4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存；
单克隆细胞株经过几次克隆至其阳性率达到100％，将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养，扩大培养后的杂交瘤细胞即为制备的单克隆抗体，其采用液氮冻存；
步骤3.4：单克隆抗体的鉴定
(1)单克隆抗体间接ELISA效价鉴定：
对步骤3中制备的细胞上清效价用间接ELISA进行测定，于96孔板中加入每孔200ng抗原/100μl包被液，上清液做梯度稀释，测定过程中以阴性小鼠血清作为阴性对照，以抗体稀释液作为空白对照，以融合小鼠血清作为阳性对照；
(2)Western blot鉴定：
将步骤1制备的抗原作为目标蛋白进行Western blot，经SDS-PAGE跑胶后，以恒定电流200mA以及低温的条件下进行转膜2h，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，一抗为1:2000稀释的鼠源单克隆抗体，二抗为1：5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，经ECM显色、拍照。
步骤3.1中初次免疫时选用弗氏完全佐剂与稀释toxA-N蛋白混合，次免及三免均选用弗氏不完全佐剂与稀释toxA-N蛋白混合。
步骤3.3中克隆化培养采用有限稀释法。
本发明的有益效果是：通过生物技术方法将纯化后的toxA-N蛋白制备成抗原，通过对兔子的皮下注射及鼠的腹腔注射，刺激机体发生免疫应答，产生对应宿主的抗体。将制备多克隆抗体进行倍比稀释，在1：6400时P/N仍然>2，而单克隆抗体因其特异性高，稀释至1：64000时P/N依旧>2.5，完全符合制备抗体的要求。
附图说明
图1是本发明一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备的流程图；
图2是本发明pET28a-toxA-N融合蛋白的Western blot分析图；
图3是本发明多克隆抗体的Western blot分析图；
图4是本发明单克隆抗体的Western blot分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
如图1所示，是本发明一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备的流程图，具体按照以下步骤实施：
步骤1，多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白抗原的制备：
步骤1.1，待测toxA-N纯化蛋白浓度的测定
采用BCA蛋白浓度测量方法，通过对标准蛋白溶液的浓度进行测量OD562nm处的吸光度，构建标准蛋白浓度的标准曲线，取实验室制备的已纯化的待测多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白，通过标准曲线法计算待测toxA-N纯化蛋白的浓度。
1.1.1，取一块酶标板，按照表1顺序加入试剂，每组实验重复3次。
表1
步骤1.1.2，在酶标板每孔中加入BCA工作液200μL，充分混匀，于37℃放置30min，(BCA工作液由试剂A：试剂B＝50：1进行配置)；
步骤1.1.3，提前15min打开Multiskan FC酶标仪，将步骤1.1.2中的酶标板依次置于酶标仪中，于562nm处测定吸光值；
步骤1.1.4，根据步骤1.1.3中测量的数据绘制标准曲线，标准曲线如图2所示；
步骤1.1.5，取实验室制备的已纯化的待测多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白，将待测toxA-N蛋白样进行1:100稀释，稀释后总体积为20μL，再加入BCA工作液200μL，37℃放置30min，以标准曲线0号管作为对比，记录吸光值：
每次待测样品浓度的测定都需进行标准曲线的绘制。
步骤1.2，抗原的制备：
用灭菌后的生理盐水稀释步骤1.1.5中已知浓度的toxA-N蛋白，并使其终浓度为1ug/μL。将稀释后的toxA-N蛋白按1:1的比例与相应的弗氏佐剂进行乳化，用1mL注射器快速吹打混合，直至乳化液滴到静止的水面上不扩散为止，即乳化完全，抗原制备成功。
步骤2：多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白多克隆抗体的制备
步骤2.1：阴性血清的采集
取2只兔子，于兔耳缘静脉进行血液采集，每只兔子采集5mL，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上清液于1.5mL EP管中，-80℃保存，以备后续实验。
步骤2.2：初免
将稀释toxA-N蛋白与弗氏完全佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫大白兔，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液。
步骤2.3：次免
初免后14天后进行次免实验，稀释toxA-N蛋白与弗氏不完全佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫大白兔，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液。
步骤2.4：三免
次免后14天后进行三兔实验，稀释toxA-N蛋白与弗氏不完全佐剂混合，两种蛋白分别配制4mL，乳化完全后分别免疫大白兔，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液。
步骤2.5：采集免疫后血清
于三免后10天采集全血，每只兔采集不低于15mL血液，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上层抗体血清，-80℃保存，即制备出多克隆抗体。
步骤2.6：多克隆抗体的鉴定
(1)间接ELISA效价鉴定：
对步骤2.5制备的血清用间接ELISA进行测定，于96孔板中加入每孔200ng抗原/100μl包被液，PBST做梯度稀释，测定过程中以阴性血清作为阴性对照，以PBST稀释液作为空白对照。如表2所示，是多克隆抗体间接ELISA效价鉴定结果，血清样品按1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200倍比稀释于抗体稀释液中，按照效价参数P/N>2，在稀释6400倍时，雄兔依然能够达到2.68，雌兔为15.58，说明制备的多克隆抗体具有很高的抗体效价。
表2
(2)Western blot鉴定：
将步骤1制备的抗原作为目标蛋白进行Western blot，经SDS-PAGE跑胶后，以恒定电流200mA以及低温的条件下进行转膜(PVDF)2h。用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，一抗为1:2000稀释的兔血清，二抗为1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体。经ECM显色、拍照。如图3所示，是本发明多克隆抗体的Western blot分析，在60ku处有条大小与预期结果一致的特异性条带。
步骤3：多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白单克隆抗体的制备
步骤3.1：动物免疫
将步骤1制备的抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，初免后每隔两周免疫一次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次。
步骤3.2：细胞准备及杂交瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞(Sp2/0)的准备：于融合前两周复苏骨髓瘤细胞，将复苏的骨髓瘤细胞置于5％CO2、37℃恒温培养箱中传代培养。培养的过程中在培养液中加入浓度为20ug/ml的8-氮鸟嘌吟，连续处理3次，使骨髓瘤细胞对HAT培养液更加敏感。融合前一天传代一次，使融合当天的骨髓瘤细胞处于对数生长期。
饲养细胞的准备：在细胞融合前一天，取3～4周龄的健康BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度至l～5×105个/mL，按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中。
免疫脾细胞的准备：取步骤3.1中三天前冲击免疫的小鼠，无菌摘取脾脏，收集脾细胞悬液，脾细胞计数后备用。
杂交瘤细胞的制备(即细胞融合)：将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞悬液混匀，使用聚乙二醇融合细胞，然后转入96孔细胞培养板中，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。
步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选、亚克隆和扩大培养
根据步骤3.2制备出的杂交瘤细胞，注意观察杂交瘤细胞的生长状况，待细胞长到孔底的1/4～1/3时吸出上清进行间接ELISA检测。以P/N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照。对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养。
克隆化培养采用有限稀释法，待细胞长到孔底的l/4～1/3时，对细胞上清进行间接ELISA检测。选择克隆数少、OD450nm值高的阳性孔，将其再次克隆。经3～4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗体的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存。
单克隆细胞株经过几次克隆后，阳性率达到100％。这时将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养。
杂交瘤细胞扩大培养后，一部分进行小鼠的腹腔注射，进行体内生产腹水，获得单一免疫细胞，免疫细胞即可分泌单克隆抗体。
步骤3.4，单克隆抗体的鉴定
(1)间接ELISA效价鉴定：
对步骤3.3制备的单克隆抗体效价用间接ELISA进行测定：于96孔板中加入每孔200ng抗原/100μl包被液，上清液做梯度稀释，测定过程中以阴性小鼠血清作为阴性对照，以抗体稀释液作为空白对照，以融合小鼠血清作为阳性对照。如表3所示，是本发明单克隆抗体的间接ELISA效价鉴定结果，效价测定时，将单克隆抗体进行倍比稀释，在1:64000稀释倍数时，P/N值达到2.5，表明产生的单克隆抗体敏感性高。
表3
(2)Western blot鉴定:
将步骤1制备的抗原作为目标蛋白进行Western blot，经SDS-PAGE跑胶后，以恒定电流200mA以及低温的条件下进行转膜(PVDF)2h。用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，一抗为1：2000稀释的鼠源单克隆抗体，二抗为1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。经ECM显色、拍照。如图4所示，是单克隆抗体的Western blot分析图，与预期结果一致，在60ku处见清楚的特异性条带，说明办发明制备的抗体制备成功。

Claims (6)

1.一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白抗原的制备：
步骤1.1：待测toxA-N纯化蛋白浓度的测定
采用BCA蛋白浓度测量方法，构建标准蛋白溶液浓度的标准曲线，取实验室制备的已纯化的待测多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白，通过标准曲线法计算待测toxA-N纯化蛋白的浓度；
步骤1.2：抗原的制备
用灭菌后的生理盐水稀释步骤1.1中已知浓度的toxA-N蛋白，并使其终浓度为1ug/μL，将稀释后的toxA-N蛋白按1：1的比例与相应的弗氏佐剂进行乳化，用注射器快速吹打混合，直至乳化液滴到静止的水面上不扩散为止，即乳化完全，抗原制备成功；
步骤2，多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白多克隆抗体的制备：
将步骤1制备好的抗原免疫兔子，通过三次免疫刺激机体产生相应抗体，经效价检测，获取高效价血清，并将获得的血清，经间接ELISA及Western blot进行验证；
步骤3：多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白单克隆抗体的制备
以步骤1中制备的抗原，免疫BALB/c小鼠作为饲养细胞，依次通过细胞融合、筛选、单克隆抗体鉴定获得抗体，并将获得的单克隆抗体进行鉴定。
2.如权利要求1所述的一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，所述步骤1.1中toxA-N纯化蛋白标准曲线的建立按照步骤如下：
1.1.1，取一块酶标板，先将酶标板孔依次编号为0、1、2、3、4、5、6、7，再在酶标板中依次加入蛋白标准溶液0、1、2、4、8、12、16、20μL，补充去离子水使每个酶标板中液体体积均为20μL，最后往酶标板中依次加入对应蛋白0、0.5、1、2、4、6、8、10μg，每组实验重复3次；
步骤1.1.2，在酶标板每孔中加入BCA工作液200μL，充分混匀，于37℃放置30min；
步骤1.1.3，提前15min打开酶标仪，将步骤1.1.2中的酶标板依次放入酶标仪中测定吸光值，测定波长为562nm；
步骤1.1.4，根据步骤1.1.3中测量的数据绘制标准曲线；
步骤1.1.5，将待测toxA-N蛋白样进行1：100稀释，稀释后总体积为20μL，再加入BCA工作液200μL，37℃放置30min，以标准曲线0号管作为对比，记录吸光值：
3.如权利要求1所述的一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，所述步骤2具体按照以下步骤进行：
步骤2.1：阴性血清的采集
取两只兔子，于兔耳缘静脉进行血液采集，每只兔子采集5mL，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上清液并与-80℃保存，以备后续实验；
步骤2.2：初免
将稀释toxA-N蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫步骤2.1中的两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；
步骤2.3：次免
初免后14天后进行次免实验，稀释toxA-N蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；
步骤2.4：三免
次免后14天后进行三兔实验，稀释蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；
步骤2.5：采集免疫后血清
于三免后10天采集全血，每只兔采集不低于15mL血液，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上层抗体血清，-80℃保存，即制备出多克隆抗体；
步骤2.6：多克隆抗体的鉴定
(1)间接ELISA效价鉴定：
对步骤2.5制备的血清用间接ELISA进行测定，于96孔板中加入每孔200ng抗原/100μl包被液，骨髓瘤细胞做梯度稀释，测定过程中以阴性血清作为阴性对照，以PBST稀释液作为空白对照；
(2)Western blot鉴定：
将步骤1制备的抗原作为目标蛋白进行Western blot，经SDS-PAGE跑胶后，以恒定电流200mA以及低温的条件下进行转膜2h，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，一抗为1:2000稀释的兔血清，二抗为1：5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体，经ECM显色、拍照。
4.如权利要求1所述的一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，所述步骤3中具体实施步骤为：
步骤3.1：动物免疫
将步骤1制备的抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，初免后每隔两周免疫一次，细胞融合前3天将小鼠再冲击免疫一次；
步骤3.2：细胞准备及杂交瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞的准备：于融合前两周复苏骨髓瘤细胞，将复苏的骨髓瘤细胞置于5％CO2、37℃恒温培养箱中传代培养。培养的过程中在培养液中加入浓度为20ug/ml的8-氮鸟嘌吟，连续处理3次，使骨髓瘤细胞对HAT培养液更加敏感，融合前一天传代一次，使融合当天的骨髓瘤细胞处于对数生长期；
饲养细胞的准备：在细胞融合前一天，取3～4周龄的健康BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度至l～5×105个/mL，按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中；
免疫脾细胞的准备：取三天前加强免疫的小鼠，无菌摘取脾脏，收集脾细胞悬液，脾细胞计数后备用；
杂交瘤细胞的制备：将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞悬液混匀，使用聚乙二醇融合细胞，然后转入96孔细胞培养板中，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养；
步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选、亚克隆和扩大培养
根据步骤3.2制备出的杂交瘤细胞，注意观察杂交瘤细胞的生长状况，待细胞长到孔底的1/4～1/3时吸出上清进行间接ELISA检测，以P/N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照，对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养；
克隆化培养时，待细胞长到孔底的l/4～1/3时，对细胞上清进行间接ELISA检测，选择克隆数少、OD450nm值高的阳性孔，将其再次克隆，经3～4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存；
单克隆细胞株经过几次克隆至其阳性率达到100％，将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养，扩大培养后的杂交瘤细胞即为制备的单克隆抗体，其采用液氮冻存；
步骤3.4：单克隆抗体的鉴定
(1)单克隆抗体间接ELISA效价鉴定：
对步骤3中制备的细胞上清效价用间接ELISA进行测定，于96孔板中加入每孔200ng抗原/100μl包被液，上清液做梯度稀释，测定过程中以阴性小鼠血清作为阴性对照，以抗体稀释液作为空白对照，以融合小鼠血清作为阳性对照；
(2)Western blot鉴定：
将步骤1制备的抗原作为目标蛋白进行Western blot，经SDS-PAGE跑胶后，以恒定电流200mA以及低温的条件下进行转膜2h，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭2h，一抗为1:2000稀释的鼠源单克隆抗体，二抗为1：5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，经ECM显色、拍照。
5.如权利要求3所述的一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，所述步骤3.1中初次免疫时选用弗氏完全佐剂与稀释toxA-N蛋白混合，次免及三免均选用弗氏不完全佐剂与稀释toxA-N蛋白混合。
6.如权利要求4所述的一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，所述步骤3.3中克隆化培养采用有限稀释法。
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