CN113563466A - P.multocida抗体的单克隆抗体制备方法、检测试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

P.multocida抗体的单克隆抗体制备方法、检测试剂盒、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种分泌牛多杀性巴氏杆菌单克隆抗体制备方法，主要包括如下步骤：S1牛多杀性巴氏杆菌C45‑2株的制备与灭活；S2融合细胞的制备；S3细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选；S4单克隆抗体腹水的制备；S5单克隆抗体腹水的纯化。此方法制备的抗体特异性好，且不与牛血清蛋白等其他蛋白有交叉反应；既避免了间接ELISA出现的假阳性，又避免了荧光PCR检测出现的气溶胶污染问题。还提供了一种牛多杀性巴氏杆菌抗体ELISA检测试剂盒，为我国牛多杀性巴氏杆菌病的快速检测提供技术支持。

Description

P.multocida抗体的单克隆抗体制备方法、检测试剂盒、检测 方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种传染病的检测，特别是涉及一种P.multocida抗体的单克隆抗体制备方法、检测试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
牛多杀性巴氏杆菌病是由牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida,P.multocida）感染引起的一种严重危害我国乃至世界养牛业的重大疾病，该病可分为肺炎型和败血型，肺炎型由血清A型P.multocida引起，以纤维素性大叶性胸膜肺炎为特征；败血型巴氏杆菌病由血清B型或E型P.multocida感染所致，呈急性、致死的败血症状，通称“出血性败血病（Haemorrhagicsepticaemia,HS）。由于该病多散发或呈地方性流行，已成为危害我国养牛业的主要传染病之一。然而，目前尚未有商品化的牛多杀性巴氏杆菌检测试剂盒。因此，制备简便，稳定的牛多杀性巴氏杆菌抗体ELISA检测试剂盒显得尤为重要和迫切。
由于牛多杀性巴氏杆菌病具有发病急、传染快、危害大的特点，往往来不及救治牛便死亡，为此，接种疫苗是预防该菌感染的主要途径。目前，我国商品化的牛多杀性巴氏杆菌病疫苗为血清B型P.multocida灭活后制备，在预防该病方面起到了重要作用。然而，由于缺乏相关的牛多杀性巴氏杆菌血清学检测方法，导致阴性动物的筛选成为了牛多杀性巴氏杆菌病疫苗研究和效力评价中的难题。此外，该商品化疫苗的效力检验方法只能采用操作繁琐的攻毒保护实验。综上所述，建立牛多杀性巴氏杆菌抗体ELISA检测技术，不仅能够确保牛多杀性巴氏杆菌病疫苗研发和效力检验过程中阴性动物的筛选，更能为牛多杀性巴氏杆菌病疫苗效力检验的替代方法研究提供重要基础。
近年来，分子生物学诊断技术有了较快的发展，该类诊断技术主要包括PCR技术、荧光定量PCR（FQ-PCR）、环介导等温扩增（LAMP）技术等。PCR技术是一种高效、快速的诊断方法，但结果容易出现假阳性等问题。荧光定量PCR技术广泛用于基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测，但该方法操作技术要求高，需要特殊的仪器设备，且成本较高，限制了其广泛应用。环介导的等温扩增(LAMP)技术是一种新型快速、准确、经济的基因扩增方法，但该方法最大的缺点是气溶胶污染。如果在同一个空间内重复多次试验，可能影响后续试验结果的准确性。而本发明利用了抗原抗体反应的生物免疫学原理，借助实验室中普通的温箱和酶标仪即可完成实验检测。而且准确率高，特异性强，稳定性好。即避免了上述的假阳性，又避免了气溶胶污染问题，而且不需要特别贵重的仪器设备和专业操作人员，更适合普通实验室推广使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种P.multocida抗体的单克隆抗体制备方法、检测试剂盒、检测方法及其应用，以得到准确率高、特异性强、稳定性好的单克隆抗体。
为实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
研发一种P.multocida单克隆抗体制备方法，包括如下步骤，
S1牛多杀性巴氏杆菌C45-2株的制备与灭活：用裂解血细胞全血马丁肉汤培养购自中国兽医药品监察所，菌株编号为CVCC44502的多杀性巴氏杆菌C45-2株菌种得到含有多杀性巴氏杆菌C45-2株菌的菌种液，向该菌种液中加入甲醛溶液，离心10min，得重悬菌体；
S2融合细胞的制备：将步骤S1得到的重悬菌体加等体积弗氏完全佐剂为免疫抗原注射至6～8周龄小鼠颈背部多点皮下注射途径免疫小鼠，此后间隔每次间隔2周，重悬菌体加等体积弗氏不完全佐剂，共4次免疫，第三次免后7～10天，尾部小量采血，将灭活的多杀性巴氏杆菌以1*106CFU/孔包被酶标板，用间接ELISA法测定血清效价，选取效价高于1：10000的小鼠在融合前三天加强免疫，直接用多杀性巴氏杆菌腹腔注射，剂量为1*108CFU/只；第四次免疫后3～5天小鼠脾细胞用于细胞融合；
S3细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选：取生长状态良好的骨髓瘤细胞与步骤S3中得到的免疫后的小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用以多杀性巴氏杆菌为包被抗原的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆后，得三株杂交瘤细胞株；
S4单克隆抗体腹水的制备：选用6～8周龄经产BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5mL/只，7d后注射杂交瘤细胞；收集步骤S3中得到的三株杂交瘤细胞株和SP2/0细胞调整细胞密度后分别注射至小鼠腹腔，7～14天后，待小鼠腹部明显鼓胀时，用注射器的针头无菌刺入小鼠腹部下围鼓胀处，轻轻揉压，使腹水流出或滴出，离心后得到对应杂交瘤细胞以及骨髓瘤细胞SP2/0的腹水对照，分装后置于-20℃保存备用；
S5单克隆抗体腹水的纯化：选用ProteinA亲和柱纯化方法进行纯化。
一种P.multocida抗体阻断ELISA检测试剂盒，包括包被牛多杀性巴氏杆菌抗原的酶标板和分泌牛多杀性巴氏杆菌抗体的杂交瘤细胞胞外产生的单克隆抗体；所述包被牛多杀性巴氏杆菌抗原的酶标板是用的pH7.4～10.5碳酸钠缓冲液将牛多杀性巴氏杆菌C45-2株稀释到0.5μg/mL～2.5μg/mL浓度包被酶标板。
优选的，所述单克隆抗体是由灭活的牛多杀性巴氏杆菌C45-2株为免疫原获得。
优选的，所述试剂盒还包括抗鼠的酶标二抗、阴性对照、阳性对照、稀释液、TMB显色液、洗涤液和终止液；所述的抗鼠的酶标二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG。
优选的，所述阴性对照为血清B型牛多杀性巴氏杆菌阴性血清；所述阳性对照为血清B型牛多杀性巴氏杆菌阳性血清；所述稀释液为含有5％脱脂乳的PBS缓冲液；所述洗涤液为PBS缓冲液。
优选的，所述血清B型牛多杀性巴氏杆菌为牛多杀性巴氏杆菌C45-2株、C46-2株和C47-2菌株中的至少一种。
一种牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测试剂盒在传染性牛多杀性巴氏杆菌病的快速检测检测中的应用。
一种杂交瘤细胞株建立的P.multocida抗体阻断ELISA检测方法，包括如下步骤：
1)从试剂盒中取出已包被牛多杀性巴氏杆菌的抗原包被板，分别将待检牛血清、阴性对照、阳性对照一定倍数稀释后各取100μl加入抗原包被板，振荡混匀，37℃孵育1h～2h；
2)洗板3～5次后，在吸水材料上拍干；
3)加入1:2000～1:5000稀释后的检测单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育1h～2h；
4)洗板3～5次，吸板后在吸水材料上拍干；
5)加入1:2000～1:5000稀释后的HRP标记的羊抗鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育1h～2h；
6)洗板3～5次，吸板后在吸水材料上拍干；
7)加入TMB显色液，50μL/孔，反应时间为9～11min；
8)每孔加入50μL终止液终止显色，测在450nm下OD值。
为此，本发明将我国商品化牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的效力检验攻毒菌株C45-2株（购自中国兽医药品监察所，菌株编号为CVCC44502）灭活后，作为免疫原免疫小鼠，进行牛多杀性巴氏杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选，从而制备牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测试剂盒，并通过阻断率大小来判断待检测血清中抗体的数量，同时验证该方法的敏感性、特异性和重复性。阻断率数值越小表示抗体效价越高（抗体数量越多），阻断率=（N-S）/N*100%，N表示阴性对照的数值，S表示待检样品的数值。
本发明制备了一种灵敏、特异、高通量的牛多杀性巴氏杆菌抗体ELISA检测试剂盒，一方面为我国牛多杀性巴氏杆菌病的快速检测提供技术支持；另一方面为牛多杀性巴氏杆菌病疫苗的研究和效力检验提供保障，从而为我国养牛业的健康发展提供重要保障。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明是建立P.multocida单克隆抗体制备方法，将牛多杀性巴氏杆菌C45-2株加入甲醛溶液，得重悬菌体，并将此菌体免疫小鼠，最终得到三株杂交瘤细胞株，腹腔注射杂交瘤细胞，得到牛多杀性巴氏杆菌抗体；此抗体分泌的单抗既可与原核表达的蛋白反应，又可与毒株反应，得到的单克隆抗体的效价高达1:8W～1:10W，且特异性好，不与牛血清蛋白等其他蛋白有交叉反应。本发明利用了抗原抗体反应的生物免疫学原理，借助普通的温箱和酶标仪即可完成实验检测。而且准确率高（准确性高达97%以上），特异性强，稳定性好。即避免了出现假阳性，又避免了气溶胶污染问题，而且不需要特别贵重的仪器设备和专业操作人员，更适合普通实验室推广使用。效价也可以认为是单位体积中活性抗体的多少，一般检测方法是，将纯化后的单抗倍比稀释，当到达某一稀释度时，用现有方法或者试剂盒检测为阴性的时候，上一个稀释度即为效价。即单克隆抗体最大稀释倍数仍然为阳性时，此时的稀释倍数即为效价。
2.利用牛多杀性巴氏杆菌C45-2株作为免疫原和包被抗原来制备P.multocida单克隆抗体的方法具有以下优点：
（1）通过大肠杆菌原核表达系统表达蛋白免疫小鼠是制备单克隆抗体的常用方法，但由于对牛多杀性巴氏杆菌的菌体结构以及相关免疫蛋白的了解十分有限，本发明利用完整的灭活牛多杀性巴氏杆菌作为免疫原来免疫小鼠，从而更有利于筛选到特异性高、敏感性强的P.multocida单克隆抗体。
（2）牛多杀性巴氏杆菌培养条件成熟且简单，只需要利用含0.1%裂解全血的马丁肉汤培养24h，即可获得2*109CFU/mL的牛多杀性巴氏杆菌培养液，避免了相关单一免疫原的繁琐纯化过程。
（3）本发明选用灭活的C45-2株作为免疫原和包被抗原而制备的牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测试剂盒，能够最大程度地为相关疫苗的研制和实际应用提供技术支持。
3.本发明采用的腹水纯化的方法，具有方法简单，效价高，损失小的特点。
4.首次获得牛多杀性巴氏杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，并在此基础上首次制备了牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测试剂盒，应用此试剂盒能够解决以下几个难题：
（1）解决牛多杀性巴氏杆菌病疫苗研究和疫苗效力检验过程中筛选阴性动物的难题。由于缺乏相关的牛多杀性巴氏杆菌血清学检测方法，导致无法确保牛多杀性巴氏杆菌血清阴性的实验动物，从而影响相关的研究和检验。
（2）解决了牛多杀性巴氏杆菌病快速、准确检测的难题。
与以上分子生物学诊断技术相比，本发明制备的牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测试剂盒具有操作简便、成本低廉、灵敏度高、特异性强等特点，适合大批量的临床检验。
附图说明
图1为本发明的经纯化获得的单克隆抗体SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。所涉及的原料如无特别说明，均为市售常规工业原料；所涉及的加工制作方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1一种牛多杀性巴氏杆菌单克隆抗体制备方法，包括如下步骤，
S1牛多杀性巴氏杆菌C45-2株的制备与灭活：用裂解血细胞全血马丁肉汤培养购自中国兽医药品监察所，菌株编号为CVCC44502的多杀性巴氏杆菌C45-2株菌种得到含有多杀性巴氏杆菌C45-2株菌的菌种液，向该菌种液中加入甲醛溶液，离心10min，得重悬菌体；
S2融合细胞的制备：将步骤S1得到的重悬菌体加等体积弗氏完全佐剂为免疫抗原注射至6～8周龄小鼠颈背部多点皮下注射途径免疫小鼠，此后间隔每次间隔2周，重悬菌体加等体积弗氏不完全佐剂，共4次免疫，第三次免后7～10天，尾部小量采血，将灭活的多杀性巴氏杆菌以1*106CFU/孔包被酶标板，用间接ELISA法测定血清效价，选取效价高于1：10000的小鼠在融合前三天加强免疫，直接用多杀性巴氏杆菌腹腔注射，剂量为1*108CFU/只；第四次免疫后3～5天小鼠脾细胞用于细胞融合；
S3细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选：取生长状态良好的骨髓瘤细胞与步骤S3中得到的免疫后的小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用以多杀性巴氏杆菌为包被抗原的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆后，得三株杂交瘤细胞株；
S4单克隆抗体腹水的制备：选用6～8周龄经产BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5mL/只，7d后注射杂交瘤细胞；收集步骤S3中得到的三株杂交瘤细胞株和SP2/0细胞调整细胞密度后分别注射至小鼠腹腔，7～14天后，待小鼠腹部明显鼓胀时，用注射器的针头无菌刺入小鼠腹部下围鼓胀处，轻轻揉压，使腹水流出或滴出，离心后得到对应杂交瘤细胞以及骨髓瘤细胞SP2/0的腹水对照，分装后置于-20℃保存备用；
S5单克隆抗体腹水的纯化：选用ProteinA亲和柱纯化方法进行纯化。
实施例2一种牛多杀性巴氏杆菌单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：
S1牛多杀性巴氏杆菌C45-2株的制备与灭活：
1）用1ml含0.1%裂解血细胞全血马丁肉汤溶解1支多杀性巴氏杆菌C45-2株菌种后，取0.5ml接种于10ml含0.1%裂解血细胞全血马丁肉汤1支，37℃培养24小时；
2）将上述培养物划线接种含0.1%裂解血细胞全血及4%血清马丁琼脂平板1付，37℃培养48h；
3）从上述培养物上挑取肉眼观察，表面光滑，呈微蓝色，在低倍显微镜下45度折光观察，结构粗细不等，边缘整齐，呈鲜明的蓝绿色虹彩，边缘的一部分有狭窄的红黄光带的菌落，接种含0.1%裂解血细胞全血马丁肉汤10ml，37℃培养24小时；
4）将上述培养物按照2%的接种量接种到含0.1%裂解血细胞全血马丁肉汤，37℃培养24h；
5）将上述马丁肉汤进行10倍系列稀释后接种含0.1%裂解血细胞全血及4%血清马丁琼脂平板，37℃培养24h后进行活菌计数，获得的多杀性巴氏杆菌C45-2株浓度可到达2*109CFU/mL；
6）将以上获得的C45-2株菌液按照菌液总量的0.4%加入甲醛溶液，37℃灭活12h后用马丁琼脂进行灭活检验，菌体灭活后，5000r/min，离心10min，弃掉上清，用适宜体积的PBS重悬菌体，置于4℃，备用。
融合细胞的制备：
将步骤S1得到的重悬菌体加等体积弗氏完全佐剂为免疫抗原注射至6～8周龄小鼠颈背部多点皮下注射途径免疫小鼠，首次免疫用菌体加等体积弗氏完全佐剂，乳化后，经颈背部多点皮下注射途径免疫小鼠，1*108CFU/只；此后免疫则将佐剂换成弗氏不完全佐剂，其他与首免相同；三免后7～10天，尾部小量采血，将灭活的多杀性巴氏杆菌以1*106CFU/孔包被酶标板，用间接ELISA法测定血清效价，选取效价高于1：10000的小鼠在融合前三天加强免疫，直接用多杀性巴氏杆菌腹腔注射，剂量为1*108CFU/只。最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合；
S3细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选：
取生长状态良好的骨髓瘤细胞与步骤S3中得到的免疫后的小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用以多杀性巴氏杆菌为包被抗原的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆后，得三株杂交瘤细胞株；
S4单克隆抗体腹水的制备：
选用6～8周龄经产BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5mL/只，7d后注射杂交瘤细胞；收集步骤S3中得到的三株杂交瘤细胞株和SP2/0细胞调整细胞密度后分别注射至小鼠腹腔，7～14天后，待小鼠腹部明显鼓胀时，用注射器的针头无菌刺入小鼠腹部下围鼓胀处，轻轻揉压，使腹水流出或滴出，离心后得到对应杂交瘤细胞以及骨髓瘤细胞SP2/0的腹水对照，分装后置于-20℃保存备用；
S5单克隆抗体腹水的纯化：
选用ProteinA(GEHealthcare17-5079-01)亲和柱纯化方法进行纯化，纯化步骤如下：
样品预处理：用偶联缓冲液（20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0）以1:3稀释腹水，12000rpm4℃离心10min后，选用0.22µm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。
平衡：用5-10倍柱体积的偶联缓冲液平衡柱子，保持流速为2s/滴。
上样：用注射器把样品注入柱子上端接口，收集流出液于50ml离心管中，保持流速为4s/滴。
洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为2s/滴。
洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液（0.1M柠檬酸钠缓冲液，PH9.0）洗脱抗体，收集于上述EP管中，保持流速为4s/滴。
样品的检测：对纯化获得的单克隆抗体进行SDS-PAGE鉴定，结果如图1所示，经ProteinA亲和柱纯化的方法获得了纯度很高的单克隆抗体；采用BCA法进行单克隆抗体浓度的测定，其浓度可达2.1mg/mL，从10mL腹水中共获得8.4mg。
将以上获得的C45-2株菌液按照菌液总量的0.4%加入甲醛溶液，37℃灭活12h后用马丁琼脂进行灭活检验，菌体灭活后，5000r/min，离心10min，弃掉上清，用适宜体积的PBS重悬菌体，置于4℃，备用。
实施例3：一种牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测试剂盒，包括包被牛多杀性巴氏杆菌抗原的酶标板和分泌牛多杀性巴氏杆菌抗体的杂交瘤细胞胞外产生的单克隆抗体；所述包被牛多杀性巴氏杆菌抗原的酶标板是用的pH7.4～10.5碳酸钠缓冲液将牛多杀性巴氏杆菌C45-2株稀释到0.5μg/mL～2.5μg/mL浓度包被酶标板。
其中，所述单克隆抗体是由灭活的牛多杀性巴氏杆菌C45-2株为免疫原获得。所述试剂盒还包括抗鼠的酶标二抗、阴性对照、阳性对照、稀释液、TMB显色液、洗涤液和终止液；所述的抗鼠的酶标二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG。所述阴性对照为血清B型牛多杀性巴氏杆菌阴性血清；所述阳性对照为血清B型牛多杀性巴氏杆菌阳性血清；所述稀释液为含有5％脱脂乳的PBS缓冲液；所述洗涤液为PBS缓冲液。所述血清B型牛多杀性巴氏杆菌为牛多杀性巴氏杆菌C45-2株、C46-2株和C47-2菌株中的至少一种。
实施例4：一种基于单克隆抗体的牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测方法
1、抗牛多杀性巴氏杆菌多克隆抗体的制备：
选取新西兰大白兔作为免疫动物，利用商品化的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗作为抗原皮下注射1.0mL，间隔两周免疫一次，二次免疫后耳源静脉采血，分离血清，备用。
2、一种牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测方法条件的确定
2.1兔抗牛多杀性巴氏杆菌多克隆抗体和单克隆抗体的最佳工作浓度
（1）用PBS将灭活的多杀性巴氏杆菌稀释至以1*107CFU/Ml后，包被酶标板，100μL/孔，4℃包被12h后，用PBST洗涤三次后，加入含5％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液200μL/孔，37℃封闭2h；
（2）用PBST溶液洗涤3次后将96孔酶标板拍干，置于-20℃保存备用。
（3）从-20℃冰箱取出包被好96孔酶标板，置于室温30min，加入获得的抗牛多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，稀释液选用PBS，稀释度依次为原液、1∶10、1∶50，100μL/孔，同时加入相应稀释度的阴性血清，37℃孵育1h。
（4）用PBST溶液洗涤3次，加入单克隆，稀释液选用PBS，浓度依次为1：2000、1：6000和1：8000，100μL/孔，37℃孵育1h。
（5）加入用PBS缓冲液1:5000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，PBST溶液洗涤3次；
（6）最后加入可溶性TMB底物显色液50μL/孔，室温条件避光反应15min，用2MH2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值。
表1为单克隆抗体和兔抗多杀性巴氏杆菌多克隆抗体血清工作稀释度确定
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
由表1所示，单克隆抗体的工作稀释度为1：6000、多克隆抗体稀释度为原液时OD450数值及阻断率均较高。
2.2最佳检测条件的优化
以表1中的试验数据作为本发明的为预试验，后期一方面将继续利用商品化的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗免疫家兔，从而获得效价更高的抗牛多杀性巴氏杆菌病的多克隆抗体；另一方面对单克隆抗体的最佳反应条件进行优化，从而确定最终的反应条件。
2.3结果判定标准的确定
运用建立的抗体阻断ELISA检测份血清样品，同时设阳性和阴性对照，测定OD450，计算阻断率（PI）、平均值（
Figure 967431DEST_PATH_IMAGE002
）和标准差（S）。阻断率计算公式PI=（N-S）/N*100%，其中N为阴性对照的平均OD值，S为待检样品的OD值，当样品阻断率PI≥
Figure 102877DEST_PATH_IMAGE002
+3s，则血清判为阳性；当PI≤
Figure 712850DEST_PATH_IMAGE002
+2s，则为阴性，对于介于二者间的判为可疑，需要重检一次，如仍为可疑则判为阳性。
2.牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA试剂盒的特异性检测
以抗A型牛多杀性巴氏杆菌血清（表3中的S1）、抗BVDV血清（表3中的S2）、抗IBR血清（表3中的S3）、抗产气荚膜梭菌血清（表3中的S4）、抗腐败梭菌血清（表3中的S5）、抗气肿疽梭菌血清（表3中的S6）以及诺抗肉毒梭菌的血清（表3中的S7）、Control：空白对照组；N：阴性牛血清对照；P：牛多杀性巴氏杆菌抗体阳性牛血清对照进行ELISA检测。
表2牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA试剂盒的特异性试验布局表
Figure DEST_PATH_IMAGE004AAA
。
表3牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA试剂盒的特异性试验的OD值
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
。
表4牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA试剂盒的特异性试验的阻断率
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
。
注：阻断率计算公式PI=（N-S）/N*100%；
由表2-4可知，以上7种特异性血清OD值与牛多杀性巴氏杆菌抗体阳性牛血清的OD值差异都非常大，7种特异性血清在的阻断率均小于50%，由此可知本发明细胞株分泌的抗体、包括初步制作的试剂盒与另外其他阳性血清无交叉反应。
3、牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA试剂盒的敏感性试验
将已知牛多杀性巴氏杆菌抗体阳性血清按照2倍系列倍比稀释，从原液一直稀释到1:1024，测其在OD450的值，并计算相对应的稀释度所对应的阻断率。
表5牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA试剂盒的敏感性试验
Figure 338741DEST_PATH_IMAGE010
。
由表5可知，将已知阳性血清按照2倍系列倍比稀释，从原液一直稀释到1:1024，当稀释到256倍的时候，阻断率为52.02%，稀释度为512倍的时候，阻断率为16.28%；1:128和1:512这两个稀释度OD值从0.784直接跳跃变成1.368差异显著，间接说明本发明的试剂盒对阳性血清的敏感度可达到1:256。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims (8)

1.一种P.multocida单克隆抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1牛多杀性巴氏杆菌C45-2株的制备与灭活：用裂解血细胞全血马丁肉汤培养购自中国兽医药品监察所，菌株编号为CVCC44502的多杀性巴氏杆菌C45-2株菌种得到含有多杀性巴氏杆菌C45-2株菌的菌种液，向该菌种液中加入甲醛溶液，离心10min，得重悬菌体；
S2融合细胞的制备：将步骤S1得到的重悬菌体加等体积弗氏完全佐剂为免疫抗原注射至6～8周龄小鼠颈背部多点皮下注射途径免疫小鼠，此后间隔每次间隔2周，重悬菌体加等体积弗氏不完全佐剂，共4次免疫，第三次免后7～10天，尾部小量采血，将灭活的多杀性巴氏杆菌以1*106CFU/孔包被酶标板，用间接ELISA法测定血清效价，选取效价高于1：10000的小鼠在融合前三天加强免疫，直接用多杀性巴氏杆菌腹腔注射，剂量为1*108CFU/只；第四次免疫后3～5天小鼠脾细胞用于细胞融合；
S3细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选：取生长状态良好的骨髓瘤细胞与步骤S3中得到的免疫后的小鼠脾细胞利用PEG1500进行化学法融合，运用以多杀性巴氏杆菌为包被抗原的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行3～5次亚克隆后，得三株杂交瘤细胞株；
S4单克隆抗体腹水的制备：选用6～8周龄经产BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5mL/只，7d后注射杂交瘤细胞；收集步骤S3中得到的三株杂交瘤细胞株和SP2/0细胞调整细胞密度后分别注射至小鼠腹腔，7～14天后，待小鼠腹部明显鼓胀时，用注射器的针头无菌刺入小鼠腹部下围鼓胀处，轻轻揉压，使腹水流出或滴出，离心后得到对应杂交瘤细胞以及骨髓瘤细胞SP2/0的腹水对照，分装后置于-20℃保存备用；
S5单克隆抗体腹水的纯化：选用ProteinA亲和柱纯化方法进行纯化。
2.一种P.multocida抗体阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被牛多杀性巴氏杆菌抗原的酶标板和分泌牛多杀性巴氏杆菌抗体的杂交瘤细胞胞外产生的单克隆抗体；所述包被牛多杀性巴氏杆菌抗原的酶标板是用的pH7.4～10.5碳酸钠缓冲液将牛多杀性巴氏杆菌C45-2株稀释到0.5μg/mL～2.5μg/mL浓度包被酶标板。
3.根据权利要求2所述的P.multocida抗体阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体是由灭活的牛多杀性巴氏杆菌C45-2株为免疫原获得。
4.根据权利要求2所述的P.multocida阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗鼠的酶标二抗、阴性对照、阳性对照、稀释液、TMB显色液、洗涤液和终止液；所述的抗鼠的酶标二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG。
5.根据权利要求2所述的P.multocida阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为血清B型牛多杀性巴氏杆菌阴性血清；所述阳性对照为血清B型牛多杀性巴氏杆菌阳性血清；所述稀释液为含有5％脱脂乳的PBS缓冲液；所述洗涤液为PBS缓冲液。
6.根据权利要求5所述的P.multocida抗体阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述血清B型牛多杀性巴氏杆菌为牛多杀性巴氏杆菌C45-2株、C46-2株和C47-2菌株中的至少一种。
7.一种牛多杀性巴氏杆菌抗体阻断ELISA检测试剂盒在传染性牛多杀性巴氏杆菌病的快速检测检测中的应用。
8.一种杂交瘤细胞株建立的P.multocida抗体阻断ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)从试剂盒中取出已包被牛多杀性巴氏杆菌的抗原包被板，分别将待检牛血清、阴性对照、阳性对照一定倍数稀释后各取100μl加入抗原包被板，振荡混匀，37℃孵育1h～2h；
2)洗板3～5次后，在吸水材料上拍干；
3)加入1:2000～1:5000稀释后的检测单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育1h～2h；
4)洗板3～5次，吸板后在吸水材料上拍干；
5)加入1:2000～1:5000稀释后的HRP标记的羊抗鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育1h～2h；
6)洗板3～5次，吸板后在吸水材料上拍干；
7)加入TMB显色液，50μL/孔，反应时间为9～11min；
8)每孔加入50μL终止液终止显色，测在450nm下OD值。
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