CN101496899A - 猪进行性萎缩性鼻炎的预防、治疗与检测 - Google Patents

Abstract

本发明揭示针对进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的动物用疫苗的制造方法，其包含将编码三种各自具有的氨基酸序列是对应于多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)蛋白质的2－486、486－986或986－1281氨基酸残基的多肽的核酸片段分别于大肠杆菌中大量表达，将这些多肽分离出并用于制备可激发对抗多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，与进行性萎缩性鼻炎有关联)的抗体的生成的疫苗。本发明也揭示能防治至少PAR的动物用多价疫苗的制造方法，其包含将上述方法制得的三种针对PAR的多肽与至少一种与其它的动物疾病有关联的病原性抗原或其抗原表位定位混合而得。

Description

猪进行性萎缩性鼻炎的预防、治疗与检测

本申请为申请日为2004年8月20日、申请号为200410057590.8、发明名称为“猪进行性萎缩性鼻炎的预防、治疗与检测”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophicrhinitis，PAR)的动物用疫苗的制造方法，其中多杀巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)的三种亚基被使用作为进行PAR的预防、治疗与检测的活性组份。本发明也涉及能防治至少PAR的动物用多价疫苗的制造方法，该疫苗包含三种针对PAR的PMT亚基以及至少一种与其它的动物疾病有关联的病原性抗原或其抗原表位来作为疫苗的活性组份。

背景技术

猪萎缩性鼻炎(atrophic rhinitis，AR)，又称猪进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)，是猪常见的上呼吸道细菌性疾病，它会造成猪鼻甲介骨萎缩与鼻吻变形以及影响全身骨骼发育，进而导致猪生长迟缓，且致使猪容易染患继发复合性肺炎，而造成养猪业者的莫大损失。

PAR的病因曾引起诸多的争议，直到de Jong等人(deJong MF，Oei HL，Terenburg JG.AR-pathogenicity-tests forPasteurella multocida isolates.IPVS 6th Congress，211，1980)以及Rutter与Rojas(Vet.Rec.，110：531-535，1982)证实PAR主要是由多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型产毒株感染所引起。多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)存在于猪上呼吸道的常驻菌群内，在不论是否罹患有PAR的猪身上皆可分离到此细菌，而依据荚膜抗原在血清学上可区分为A、B、D、E与F等五种血清型(R.B.Rimler and K.R.Rhoades(1987)，J.Clin.Microbiol.，25：615-8)，其中A型菌株的荚膜中含有透明质酸(hyaluronic acid)而使得菌落呈粘液状，而D型菌株的荚膜所含透明质酸则较少。此外，D型菌株被发现会与吖啶黄(acriflavine)产生凝集反应(G.R.Carter and P.Subtonto(1973)，Am.J.Vet.Res.，34：293-294)。但是，仅有在罹患PAR的猪体内才可分离到产毒株(Brim et al.(1986)，I.P.V.S.9th Congress，p.237；Lariviere et al.(1992)，J.Clin.Microbiol.，30：1398-1401；Nielsen et al.(1986)，I.P.V.S.9thCongress，p.239)。

D型多杀巴斯德氏菌的毒素基因已被克隆、测序以及表达，并被命名为toxA基因(S.K.Petersen et al.(1989)，Infect.Immun.，57：3907-3913)(SEQ ID NO：1)，且完整的毒素基因被发现包含4,380个核苷酸序列(nucleotide sequence)，G+C％为34.6％，而起始密码子(start codon)位于第219个核苷酸，且于PMT基因的上游可能存在有一个转录抑制子(TxaR)来调控toxA基因的表达(S.K.Petersen(1990)，Mol.Microbiol.，4：821-830)。Kamps等人利用根据部分PMT基因序列所制造的探针来进行Southern印迹分析(Southern Blottinganalysis)，所得结果显示非产毒株也呈现有微弱的反应，因而认为非产毒株也可能具有部分或不完整的毒素基因(Kamps AMIE et al.(1990)，J.Clin.Microbiol.，28：1858-1861)。Nagai等人利用PCR方法来鉴别多杀巴斯德氏菌分离株，而认为D型产毒株与非产毒株的差异应在于PMT基因的有无(S.Nagai et al.(1994)，J.Clin.Microbiol.，32：1004-1010)。

但是，除D型多杀巴斯德氏菌外，A型多杀巴斯德氏菌也常在罹患PAR猪中被分离出来(T.Sakano et al.(1992)，J.Vet.Med.Sci.，54：403-7)。Foged以胎牛肺脏细胞及单克隆抗体来检测A型与D型分离株而发现这两种血清型的毒素蛋白质皆可产生相似的细胞病变(Infect.Immun.，56：1901-1906，1988)，而Frandsen等人也发现A型多杀巴斯德氏菌可产生分子量相近的毒素蛋白质产物(J.Vet.Med.，38：344-452，1991)，这显示A型与D型多杀巴斯德氏菌所产生的PMT毒素性质应极为相似，因此A型产毒株也常被提及是造成PAR的病原当中的一种(T.Sakano et al.(1992)，J.Vet.Med.Sci.，54：403-7)。

但是，A型与D型多杀巴斯德氏菌所产生的PMT毒素及其编码基因的异同性仍未被证实。此外，不论是A型或D型多杀巴斯德氏菌，它们有许多野外分离株经重复的猪感染实验后并无法导致任何典型的PAR病变，这引起PMT产毒株与非产毒株的争议，而导致目前在PMT毒素蛋白质与编码基因的研究上仍存在有诸多疑点，也即从某些多杀巴斯德氏菌分离株所提取出的蛋白质产物即使以极高浓度被加入时也不会导致任何的细胞病变，而这些非产毒株究竟是否在PMT基因的上游具有调控因子而因此抑制PMT的表达，抑或是因为完全不具有PMT基因，或者是因为基因缺损不全而导致无法制造完整的PMT，迄今这些推论都未获得证实。

多杀巴斯德氏菌A型与D型产毒株间的PMT基因与蛋白质序列的相似程度仍然未知，而目前已被登录于Genbank的PMT基因序列皆为D型产毒株，因此目前有关A型与D型产毒株的PMT基因序列的比对并无完整的报告。此外，多杀巴斯德氏菌也为许多动物的呼吸道内的常在菌当中的一种，也是造成家禽的禽霍乱的一个主要病原。因此，无论是在多杀巴斯德氏菌的快速检验或其它实验研究上，针对所分离出的菌株若能建立一快速精确的鉴别系统以供菌株类型的区别以及PMT生成与否的确认，实存在有一迫切需要。

一分子量约为146kDa的多杀巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)已从D型多杀巴斯德氏菌被提取出(Rutter and Mackenzie(1984)，Vet.Rec.，114：89-90)，该毒素经肌肉注射可引发猪呈现典型的PAR病变，因而PMT毒素被证实是造成鼻甲骨萎缩变形的致病因子(N.Chanter et al.(1986)，J.Gen.Microbiol.，132：1089-1097)。经纯化的PMT是一单一的多肽(N.T.Foged(1988)，Infect.Immun.，56：1901-1906)，其经测序分析被确认含有1,285个氨基酸，分子量为146kDa(R.Felix et al.(1992)，Infect.Immun.，60：4984-4988)，且该毒素的氨基酸组成是以谷氨酸(glutamic acid)、天冬氨酸(aspartic acid)、甘氨酸(glycine)、脯氨酸(prolin)、丙氨酸(alanine)与亮氨酸(leucine)占较大的比例(T.Nakai et al.(1984)，Infect.Immun.，46：429-434)。

PMT的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)可从NCBI网站查得，登记号(accession number)为CAA35885。

若将纯化的毒素保存于去离子水(DW)中，或予以置放于高于pH10或低于pH4的溶液中，皆会使毒素不稳定。因此传统用于预防猪萎缩性鼻炎的疫苗抗原是利用福尔马林(formaldehyde)将PMT不活化，以使PMT成为失去毒性但保有抗原性的类毒素(toxoid)，以供作为PAR疫苗的主要抗原组份。但是，生产PMT类毒素的制程耗时繁复，首先，需于37℃下以血液培养基来培养多杀巴斯德氏菌产毒株历时26小时，或是以脑心浸出物肉汤培养基(brain heart infusionbroth，BHI broth)予以培养历时72小时，然后进行PMT的提取与浓缩，所收获的毒素于37℃下以1％福尔马林予以灭活处理4天之后，才能得到低毒性但仍具抗原性的类毒素。因此，除了制程繁复以外，传统PAR类毒素疫苗所需的生产成本极高，因而成为台湾地区目前自国外进口的猪用细菌性疫苗(swine bacterial vaccines)中单价最为昂贵的种类。

此外，由于PMT类毒素在制造过程中需使用福尔马林予以长时程处理，而可能使该毒素的抗原性产生一些无法预估的化学结构性变化，进而影响到疫苗的效力，因此在台湾农民使用PAR疫苗的意愿并不高。另外，多杀巴斯德氏菌本身的抗药性极高，诸多抗生素药物已无法有效控制PAR，造成此病的罹患率在台湾境内一直居高不下。因此，对于获得一种具有生产时间短、效率高、生产成本低廉、无毒性、高安全性及高免疫保护效力特点的PAR疫苗，存在有一迫切需求。

另外，假性狂犬病(pseudorabies，PR)也是猪的一种高传染性与致死性疾病，哺乳仔猪及离乳幼猪感染此病后的死亡率甚至可高达100％，而即使耐过此病的猪也会因生长迟缓而导致换肉率变差，而怀孕母猪若感染本病则会造成流死产(H.J.Nauwynck(1997)，Vet.Microbiol.，55：3-11)。为扑灭此疾病，台湾规定需使用gE基因缺损的病毒来作为制造疫苗的病毒株，而因为此病毒株的gE基因被完全去除而使得该病毒在复制时，不能产生gE糖蛋白，以致于所生成的病毒外套上缺少gE糖蛋白。于是，以此种疫苗予以免疫的猪将不会产生对抗gE糖蛋白的抗体(van Oirschot，J.T.et al.(1986)，J.Gen.Virol.，67：1179-82)，配合针对gE的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的检测，即可与因感染野生型病毒而于体内产生有抗gE抗体的阳性猪作明显区别，而后将gE抗体阳性猪淘汰，而达到扑灭PR的目的(P.C.Yang(1996)，J.Chin.Soc.Vet.Sci.，22：323-30)。

多价疫苗(multi-valent vaccine)为现今疫苗发展的主要趋势，其优点是经免疫后能同时预防多种疾病的感染，并可大幅降低因免疫多种疫苗所导致的多重压力(multiple stress)以及减少接种疫苗的人工成本。由于年龄越小的猪在感染PAR和/或PR后所产生的症状会越严重，而以这两种疾病的疫苗来免疫怀孕母猪的时机是相接近的，为了避免怀孕母猪因多次免疫而产生压力进而造成流产，若能开发出针对PAR与PR的双价疫苗并通过免疫怀孕母猪后所产生的移行抗体，将能有效达到保护仔猪免于这两种疾病的早期感染的目的。此外，疫苗的价格、疫苗用于猪身上的安全性以及能否在猪体内激起良好的抗体保护效力等，也都是良好疫苗所必须满足的条件。

PMT是一种非分泌型的内毒素，而且对热敏感。由于致病所需PMT的量十分的低，而且PMT的免疫原性低，自然感染下不易引发宿主对PMT的免疫反应，因而在感染PAR的猪身上难以测得大量的中和抗体。

PMT的检测方式有多种，就细菌的分离而言，可利用小白鼠致死实验(mouse lethal test，MLT)、天竺鼠皮肤坏死实验(GPST)、EBL细胞与非洲绿猿肾脏细胞株(Vero cell line)的细胞病变(CPE)、三明治ELISA(N.T.Foged et al.(1988)，J.Clin.Microbiol.，26：1419-1420)、PCR(S.Nagai et.al.(1994)，J.Clin.Microbiol.，32：1004-1010)等方法来作检测，由此检测PAR产毒株的存在与毒力。

关于监测PAR疫苗的免疫效力以及进行猪群感染时的监控，用来检测血清中和抗体效价的传统方法是利用PMT对EBL细胞(E.M.Kamps et.al.(1987)，Vet.Microbiol.，13：235-248)与Vero细胞(A.M.Pennings and P.K.Storm(1984)，Vet.Microbiol.，9：503-508)的细胞病变(CPE)或是小鼠致死试验(MLT)。由于EBL细胞并非细胞株，这造成检测上的一大限制。Vero细胞虽为细胞株，但培养细胞的步骤耗时且繁琐，所需要的操作时间及费用均高，而且在判定上易受人为主观及细胞状态的影响。使用小鼠致死试验(MLT)时，需要注射待测血清和PMT的混合液至小鼠身上，因而操作时间长且必须牺牲动物，故也有不利的地方。

因此，若能建立一快速检验方法来检测抗-PMT抗体，将可解决在PAR感染时以及免疫后抗体效价的检测问题，而有利于评估猪群的免疫状况。

此外，佐剂(adjuvant)在疫苗的制备上可能扮演一重要角色。佐剂是非抗原性物质，其可以显着提升抗原的免疫能力，其中所涉及的作用机制可能是佐剂会改变蛋白质分子上的抗原表位(epitopes)的电荷或构造因而增加蛋白质分子的抗原性。佐剂还能延缓抗原被吸收及释出的速率以及促使抗原与免疫细胞结合，由此而提升免疫者的免疫反应(R.Edelman(1980)，Rev.Infect.Dis.，2：370-383)。佐剂也能促使少量抗原产生高效力且长时效的免疫反应，由此降低疫苗的生产成本(R.K.Gupta and G.R.Siber(1995)，Vaccine，13：1263-76)。

佐剂依来源可分成四种，第一种为植物源性，如植物皂素(saponin)或葡聚糖(glucan)提取物；第二类为细菌源性，如trehalose dymicolate、霍乱毒素(choleric toxin)、单磷酰基脂质A(monophosphoryl lipid A)、脂多糖(lipopolysaccharides)及其衍生物；第三类为化学物质，如氢氧化铝(aluminum hydroxide)、表面活性剂(surfactants)以及乳剂(emulsions)；第四类则包含细胞因子(IFN或GM-CSF)与性激素二羟表雄甾酮(dihydroxyepiandrosterone，DHEA)(F.M.AudibertandL.D.Lise(1993)，Immunol.Today，14：281-4)。

在疫苗制造上惯用的佐剂包括：铝化合物[Aluminumcompounds，又称铝胶(aluminumgel)]，其中以氢氧化铝(aluminum hydroxide，Al(OH)₃)与磷酸铝(aluminumphosphate，AlPO₄)最为常见，此外还有硫酸铝钾盐(potassiumaluminum sulfate，KAl(SO₄)₂·12H₂O)等铝化合物(D.E.S.Stewart-Tull(1996)，Aluminum adjuvants.In Vaccineprotocols，Robinson，A.，G.H.，andC.N.Wiblin，FarrarHuman Press.Totoga，New Jersey，USA.pp.135-139)；弗氏完全佐剂(Freund｀s complete adjuvant，FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund｀s incomplete adjuvant，FIA)；油包水型(water-in-oil，W/O)乳剂以及水包油型(oil-in-water，O/W)乳剂等。

刀豆素A(Concanavalin A，Con A)是一种有效的免疫反应刺激物，它可以活化T淋巴球并使其产生增殖与活化，而经活化的T淋巴球会分泌IL-2以及其它细胞因子进而启动相关的免疫反应。李玲玟等人从白凤豆(Canavalia ensifomis)中提取出Con A，并在小白鼠接种癌细胞之时或之后给予连续口服Con A，结果有口服Con A的小白鼠身上的癌细胞面积均显着小于未给予Con A的对照组，因而白凤豆所含的Con A被推测可活化免疫系统而具有抗癌效果(李玲玟等人(1995)，中华癌医学会杂志，11：27-34)。

另外，已知β-葡聚糖(β-glucan)可以和白血球上的受体结合，具有使白血球活化进而调节免疫与防卫能力(T.Miura，etal.(1997)，Biol.Pharm.Bull.，20：1103-1107；J.SoltysandM.T.Quinn(1999)，Am.Sci.Microbiol.，67：244-252)，可增加巨噬细胞的吞噬作用，以及在感染状态下也可以抑制炎症早期细胞素的生成而降低疾病造成的死亡率(J.W.Hadden(1993)，Immunol.Today，14：275-280；Roitt，I.M.，J.Brostoff，and D.K.Male.1998.Immunology，5th ed.，Mosby Company，Tavistock Square，London，UK)。由于β-葡聚糖可以有效刺激非专一性免疫反应，它已被广泛使用于佐剂、抗肿瘤、抗感染等方面(Hadden(1993)，如上述；Roitt et al.(1998)，如上述；I.Suzuki et al.(1990)，Int.J.Immunopharmacol.，12：675-684)。

因此，基于佐剂确实具有增强抗原的免疫原性的效用，若一抗原在免疫后所激发的中和抗体效价不够高，但在攻击后能产生出高效价的中和抗体，这时即可以考虑使用佐剂来加强该抗原的免疫原性。

基于以上所述，提供具有生产时间短、生产成本低廉、无毒性、高安全性以及高免疫保护效力等特点的猪用疫苗以及用以监控PAR的快速检测工具，由此解决肉畜市场以及养猪工业上长久以来因PAR所蒙受的重大损失，存在有一迫切需要。

发明内容

于是，在第一个方面，本发明提供一种针对进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的动物用疫苗，其包含：

(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于多杀巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)蛋白质的2-486氨基酸残基；

(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的486-986氨基酸残基；以及

(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的986-1281氨基酸残基。

在第二个方面，本发明提供一种能防治至少进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的动物用多价疫苗，其包含：

(i)与进行性萎缩性鼻炎有关的抗原组份：

(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于多杀巴斯德氏菌毒素(PMT)蛋白质的2-486氨基酸残基；

(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的486-986氨基酸残基；以及

(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的986-1281氨基酸残基；以及

(ii)至少一种与其它的动物疾病有关联的病原性抗原或其抗原表位。

附图说明

下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其它目的与特征，可通过参照下文的描述、随附的权利要求书和附图而变得更为明显，附图中：

图1与2分别显示9个多杀巴斯德氏菌分离株的PMT蛋白质电泳及Western印迹分析结果，其中道M：标记；道1：ATCC 12945；道2：PMA 33；道3：PMA2；道4：PMA10；道5：PMD 20；道6：ATCC 7707；道7：PMD21；道8：PMD 48；以及道9：NCTC 12178；

图3与图4分别显示使用HhaI来消化多杀巴斯德氏菌分离株的染色体DNA所进行的限制片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)结果以及多杀巴斯德氏菌分离株的PMT编码基因的Southern杂交反应结果，其中道M：标记；道1：ATCC 12945；道2：PMA33；道3：PMA2；道4：PMA10；道5：PMD27；道6：PMD20；道7：PMD48；以及道8：NCTC 12178；

图5显示通过PCR方法使用不同的引物来检测PMT编码基因的结果，其中道M：标记；道1：J1J2(1227bp)；道2：A3B2(3869bp)；道3：A3B1(1588bp)；道4：A2B3(1949bp)；道5：A4B2(1768bp)；道6：A1B4(2135bp)；以及道7：A1B1(1587bp)；

图6显示于42℃下使用引物A3B2来鉴定多杀巴斯德氏菌分离株的PMT编码基因的结果，其中道M：标记；道1：PMA33；道2：ATCC 12945；道3：PMA2；道4：PMA10；道5：PMD 27；道6：PMD 20；道7：ATCC 7707；道8：PMD21；道9：PMD48；以及道10：NCTC 12178；

图7显示使用所设计的J1J2引物以1％琼脂糖凝胶电泳来进行多杀巴斯德氏菌分离株的PMT编码基因PCR分析的结果，其中道M：1kb标记；道1：PMA 33；道2：PMA 59；道3：PMA 2；道4：PMA 10；道5：PMD 20；道6：PMD 27；道7：PMD 48；以及道8：PMD 21；

图8显示使用J-20随机引物来进行多杀巴斯德氏菌分离株的随机扩增的多态性DNA(Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)分析的结果，其中道M：1kb标记；道1：PMA 33；道2：PMA 59；道3：PMA 2；道4：PMA 10；道5：PMD 20；道6：PMD 27；道7：PMD 48；以及道8：PMD 21；

图9显示使用

的MegAlign program来进行台湾本土的多杀巴斯德氏菌分离株与D型多杀巴斯德氏菌(NCTC 12178)的PMT编码基因的核苷酸序列比较；

图10示意说明依据本发明所克隆出的编码PMT亚基的DNA片段分别对应于PMT编码基因的所在位置；

图11显示携带有依据本发明所克隆出的编码PMT亚基的DNA片段的线形重组型载体的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中道1：NEB 1kb标记；道2：对照组载体(空载体pET 32a，5900bp)；道3：重组型载体Tox1(7326bp)；道4：重组型载体Tox2(7408bp)；道5：重组型载体Tox7(6790bp)；道6：对照组载体(空载体pET25b，5547bp)；以及道7：重组型载体Tox6(9356bp)；

图12显示由本发明所得到的重组型载体克隆株的表达而收获的重组型PMT亚基的SDS-PAGE结果，其中道1：BIO-RAD广范围标记(BIO-RAD Broad Range Standards)；道2：Tox1重组型蛋白质(86kDa)；道3：Tox2重组型蛋白质(86kDa)；道4：Tox7重组型蛋白质(55.4kDa)；道5：Tox6重组型蛋白(158kDa)；道6：天然PMT蛋白(155kDa)；以及道7：pET 32b/BL21(DE3)；

图13与图14分别显示由本发明所得到的重组型载体克隆株的表达而收获的重组型PMT亚基在使用抗-PMT单克隆抗体7-10A与多克隆抗体下的Western印迹分析结果，其中道1：BIO-RAD广范围标记；道2：Tox1重组型蛋白质(86kDa)；道3：Tox2重组型蛋白质(86kDa)；道4：Tox7重组型蛋白质(55.4kDa)；道5：Tox6重组型蛋白质(158kDa)；道6：天然PMT蛋白质(155kDa)；以及道7：pET32b/BL21(DE3)；

图15-17显示由本发明所得到的重组型载体克隆株的表达而收获的重组型PMT亚基对于非洲绿猴肾纤维细胞(Verocell)的细胞毒性，其中图15：Vero细胞的正常细胞型态；图16：使用天然PMT蛋白质的最小毒性剂量(140ng/ml)来处理Vero细胞后造成结节细胞病变；以及图17：以Tox1重组型蛋白质(1mg/ml)来处理Vero细胞，并没有产生结节细胞病变；

图18是养于一没有PAR病例的一贯作业猪场内的母猪，于怀孕第85天时以rsPMT细菌疫苗予以免疫，并于分娩时采集其初乳及血清来进行中和效价分析的结果；

图19是养于一有PAR病例的一贯作业猪场内的母猪，于怀孕第85天时以rsPMT细菌疫苗予以免疫，并于分娩时所采集的血清与初乳的中和抗体效价分析结果；

图20是图19中所检测的母猪所产下的仔猪分别于4与6周大时，以以rsPMT细菌疫苗予以免疫，并于疫苗接种的12与18个月之后，于宰杀后取猪头来进行鼻甲介骨肉眼检查的结果；

图21显示兔子在以本发明的PAR-PR双价疫苗来免疫之前与之后的血清PMT中和抗体变化情形，其中横轴为免疫次数，而纵轴为中和抗体效价(Log₂)；

图22显示兔子在以本发明的PAR-PR双价疫苗来免疫之前与之后的血清PR中和抗体变化情形，其中横轴为免疫次数，而纵轴为中和抗体效价(Log₂)；

图23显示怀孕母猪在以本发明的PAR-PR双价疫苗来免疫之前与之后的血清PMT中和抗体变化情形，其中横轴为抗体效价，而纵轴为母猪头数；以及

图24显示怀孕母猪在以本发明的PAR-PR双价疫苗来免疫之前与之后的血清PR中和抗体变化情形，其中横轴为抗体效价，而纵轴为母猪头数。

具体实施方式

在临床上，由PAR病猪鼻腔分离病原时，除了多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型菌株以外，常常会分离到许多A型菌株，而这些A型菌株常造成鉴别上与判定是否也是PMT产毒株的困扰。

在多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)A型及D型菌株的传统鉴别方法中，若单以血清学进行凝集试验时，在A型及D型菌株之间常会有抗原交叉反应而无法正确区别，若是仅利用透明质酸酶抑制试验进行鉴定A型菌株时，虽可观察到某些程度上的抑制结果但是不易区分。而若进行吖啶黄(acriflavine)凝集试验来鉴定D型菌株时，又常会因细菌浓度不同或细菌太老等因素而有假阳性或假阴性的情形，因此，若只单纯应用生化鉴定结果常会导致在判读上的困扰，特别是因操作或判读人员不同时更常导致不同判定结果。此外，在猪鼻道间也常分离到许多非产毒株或其它呼吸道常在细菌，因而增加许多诊断分析上的困扰。

因此，申请人于本发明中尝试利用RFLP及RAPD-PCR方法来建立多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)A型与D型菌株的不同基因型别，由此于未来能利用所建立的分子差异性比对来快速鉴定多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的菌株类型。

申请人在RFLP实验结果中发现，当以HhaI对所提取的多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)染色体DNA进行RFLP分析后，可利用所呈现的主要7kb的切割片段来区分D型与A型菌株。此外，当以DNA探针进行杂交反应，更发现所有PMT产毒株经HhaI作用后在2kb及9kb处也会呈现特异性的切割片段，而可由此来进一步区分产毒株与非产毒株。而在分析PMT基因上的HhaI切割位时，发现PMT基因上存有3个HhaI的切割位(分别位在2219、2393、4331残基处)，所以PMT基因经切割后应会有174bp、1938bp及另一未知长度的片段。申请人另由Southern杂交反应结果得知，该未知长度的片段大小为9kb，因此，申请人推论在PMT基因的上游约7kb处应有另一HhaI切割位，故会形成约9kb与2kb的基因反应片段。

为更客观防止基因组DNA(genomic DNA)常因提取纯度不一而有酶切割不全的困扰，进而影响到RFLP的呈现与判读结果，申请人另外于实验中再应用8-10聚体的随机引物(random primers)来进行RAPD筛检，实验并利用相同提取的DNA同时以RFLP进行双重验证，由此更客观评估D型与A型菌株的区分比对的准确性。结果发现，若以随机引物J-20(aagcggcctc)(SEQ ID NO：13)来进行RAPD后，D型菌株可于2.8kb大小处产生一段与A型菌株具明显鉴别性的扩增产物(amplicon)。

综合以上分子鉴别结果，当从猪鼻腔分离出疑似多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)菌落后，可应用此快速又简便的方法取代传统鉴别A型及D型的生化试验，且更可利用J-20随机引物进行RAPD-PCR来再次确定其血清型别。

申请人又尝试确认，多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)不管是A型或D型菌株，其会是产毒株是否取决有无具有一PMT毒素基因。于是，申请人针对本身实验室所分离鉴别出的多株包含多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)D型及A型的野外分离株以及标准菌株，利用小白鼠致死试验、天竺鼠皮肤坏死试验、Vero细胞毒性试验、PMT毒素蛋白质电泳分析与Western印迹法分析，来进行这些菌株是否会产生毒素以及是否有PMT基因存在的重复交叉比对试验。

结果显示，在所选择10株受测菌株中，共有3株菌株(PMA 2、PMD 20及PMD 21)与传统测试结果不符合。关于PMD20，其在小白鼠接种未直接导致小白鼠死亡，但在天竺鼠皮肤坏死性试验中所造成的红肿病变已超出阳性的判定标准，故应予以判定为D型产毒株；但是，若经由Vero细胞毒性试验、蛋白质电泳分析、Western印迹法分析、RFLP及PCR检测PMT基因的结果，它应被判定为非产毒株。

另外，PMA 2及PMD 21原本在小白鼠致死性试验以及天竺鼠皮肤坏死性试验中皆无法造成死亡或明显病变，故以往被归纳为非产毒株，但若以Vero细胞毒性试验、蛋白质电泳分析、Western印迹法分析、RFLP及PCR检测PMT基因的结果，则应判定为产毒株。

由上述结果可知，若单纯利用传统小白鼠致死性试验以及天竺鼠皮肤坏死性试验鉴定产毒株，则很可能由于人为操作上的疏失或敏感性不够等原因，而造成假阴性或假阳性的结果。相对地，若利用Vero细胞毒性试验、PMT毒素蛋白质电泳分析以及利用PCR来检测PMT基因，所得结果皆能精确地相互符合，且皆具高专一性。但若以操作简便及快速诊断而言，则应以利用PCR来直接检测PMT基因最为实用，此法可于分离到疑似菌落后数小时内即得知初步检验结果，并能正确判定该菌株是否具有PMT基因。

为更明了非产毒株无法制造PMT毒素的原因，除直接不具有毒素基因外，抑或是由于其基因有调控因子在控制其基因的表达，申请人根据Petersen所发表的PMT基因(S.K.Petersen(1990)，如前述)而设计出多组专一性引物(参见下面实施例1中的表1)，以PCR的方法来进行毒素基因的扩增检测，结果D型与A型产毒株皆可扩增出预期大小的PCR产物，而非产毒株即使降低引物的粘合温度至40℃，也无预期大小的PCR扩增产物生成。

为验证非产毒株是否仍具有部份PMT毒素基因的可能性，申请人又以完整的PMT基因作为模板，再以Hexamers的随机引物来制造同位素标定的探针，并利用它们来进行Southern杂交反应，由此检测非产毒株是否具有部分的毒素基因存在。结果发现，仅有产毒株有杂交反应讯号产生，而在Vero细胞中毫无细胞病变的非产毒株则完全无杂交反应。

综合以上结果验证得知，不论D型与A型产毒株与非产毒株的主要差异应在于PMT基因的有无，且只有多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)产毒株才具有PMT基因并且会导致PAR的临床病征，而D型与A型的非产毒株则完全不具有完整或部分的PMT基因也无法产生PMT毒素，此一结果排除了非产毒株是受其它因子的调控，而使PMT基因不能表达进而无法制造出足量的PMT毒素造成病害。此结论不同于Kamps等人所提出者(Kamps，AMIE et al.(1990)，J.Clin.Microbiol.，28：1858-1861)，但与Nagai等人的推论结果较为一致(S.Nagai et al.(1994)，J.Clin.Microbiol.，32：1004-1010)。

申请人复利用J1J2引物(参见下面实施例1中的表1)，以PCR反应来检测10株分离自禽类的多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，结果也同时证实禽类来源的多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)A型菌株皆完全不具有PMT基因。

为进一步探讨多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型与A型产毒株的PMT基因的同源相似性，申请人再选取D型及A型产毒株各三株，以PCR产物进行自动测序分析，并利用已发表的D型PMT基因序列进行比对分析。结果发现，在被测序出的4206核苷酸残基(由114到4319核苷酸残基)中，在台湾本土所分离的D型及A型产毒株的PMT基因序列100％完全相同，且与Laxs等人(AJ Lax et al.(1990)，J.Gen.Microbiol.，136：81-87)以及Buys等人(WE Buys et al.(1990)，Nucleic Acids Res.，18：2815-2816)在国外不同区域所分离的菌株的PMT基因序列也完全相同。再经与ATCC标准产毒株(NCTC 12178)的PMT基因序列(SEQ ID NO：1)比较后发现也仅有一个氨基酸残基的改变。由此可知，PMT基因是一个十分安定的基因，且不论是分离自台湾本土或其它国家，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型或A型产毒株的PMT基因序列几乎完全相同，显示没有任何重组或基因变异的情形发生。

由此推断，实验上所合成的对PMT基因具专一性的各组引物，若被应用在PCR以供检测PMT基因的专一性(specificity)及再现性(reproducibility)上，应无分离株血清型别及地域差异性的疑虑。

PMT的分泌量非常微量，约只占多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的总细菌蛋白质的1％，故传统疫苗需培养极大量的细菌才能提取足够浓度的PMT以制成具保护效力的类毒素疫苗。目前对于PAR的防治虽已有商品化疫苗上市，但大多由国外进口，且对PAR的防治只有基本的保护效果，更因价格高昂而仍无法普及使用。

于是，本发明提供一种针对进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的动物用疫苗，其包含：

(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于多杀巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)蛋白质的2-486氨基酸残基；

(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的486-986氨基酸残基；以及

(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的986-1281氨基酸残基。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗是供用于防治猪的进行性萎缩性鼻炎。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的三种多肽组份是衍生自多杀巴斯德氏菌A型分离株的PMT蛋白质。

在另一优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的三种多肽组份是衍生自多杀巴斯德氏菌D型分离株的PMT蛋白质。在一更优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的三种多肽组份是衍生自多杀巴斯德氏菌D型分离株PMD 48的PMT蛋白质。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的三种多肽组份是合成产物，它们可根据PMT的已知氨基酸序列(例如，序列表中的SEQ ID NO：2所示者)而通过，例如氨基酸序列合成仪，来予以分别地生成。

在另一优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的三种多肽组份是重组型产物。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的多肽组份(a)为一第一DNA片段所编码，该第一DNA片段具有一核苷酸序列是实质地对应于以PMT编码基因作为模板(template)并以下面正向引物(forward primer)A1与反向引物(reverse primer)B2来进行PCR后所得到的PCR扩增产物以限制酶BamHI与HindIII切割后所形成的一个1456bpBamHI-HindIII片段所具有的核苷酸序列：

正向引物

A1：5′-agaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3′(SEQ ID NO：3)

反向引物

B2：5′-ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3′(SEQ IDNO：10)。

在一优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌A型分离株的PMT编码基因。

在另一优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌D型分离株的PMT编码基因。在一更优选实施方案中，该PMT编码基因具有序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。在另一更优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌D型分离株PMD 48的PMT编码基因(参见图9)。

在一优选实施方案中，编码该多肽组份(a)的该第一DNA片段被插入于一载体内而形成一第一重组型载体。在一更优选实施方案中，该第一重组型载体是重组型载体Tox1。

在一优选实施方案中，该第一重组型载体被转化至大肠杆菌细胞内，因而形成能生成该多肽组份(a)的经转化的大肠杆菌细胞。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的该多肽组份(b)为一第二DNA片段所编码，该第二DNA片段具有一核苷酸序列是实质地对应于以PMT编码基因作为模板并以如上所述的正向引物A1与反向引物B2来进行PCR后所得到的PCR扩增产物以限制酶HindIII切割后所形成的一个1502bp HindIII-HindIII片段所具有的核苷酸序列。

在一优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌A型分离株的PMT编码基因。

在另一优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌D型分离株的PMT编码基因。在一更优选实施方案中，该PMT编码基因具有序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。在另一更优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌D型分离株PMD 48的PMT编码基因(参见图9)。

在一优选实施方案中，编码该多肽组份(b)的该第二DNA片段被插入于一载体内而形成一第二重组型载体。在一更优选实施方案中，该第二重组型载体是重组型载体Tox2。

在一优选实施方案中，该第二重组型载体被转化至大肠杆菌细胞内，因而形成能生成该多肽组份(b)的经转化的大肠杆菌细胞。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗当中所包含的该多肽组份(c)为一第三DNA片段所编码，该第三DNA片段具有一核苷酸序列是实质地对应于以PMT编码基因作为模板并以上所述的正向引物A1与反向引物B2来进行PCR后所得到的PCR扩增产物以限制酶HindIII与NheI切割后所形成的一个883bp HindIII-NheI片段所具有的核苷酸序列。

在一优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌A型分离株的PMT编码基因。

在另一优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌D型分离株的PMT编码基因。在一更优选实施方案中，该PMT编码基因具有序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。在另一更优选实施方案中，该PMT编码基因是多杀巴斯德氏菌D型分离株PMD 48的PMT编码基因(参见图9)。

在一优选实施方案中，编码该多肽组份(c)的该第三DNA片段被插入于一载体内而形成一第二重组型载体。在一更优选实施方案中，该第二重组型载体是重组型载体Tox7。

在一优选实施方案中，该第三重组型载体被转化至大肠杆菌细胞内，因而形成能生成该多肽组份(c)的经转化的大肠杆菌细胞。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗进一步包含下列的至少一者：PMT类毒素、A型多杀巴斯德氏菌细胞、D型多杀巴斯德氏菌细胞以及支气管炎博德特氏菌细胞。

在一优选实施方案中，该动物用疫苗进一步包含一选自于下列一组中的佐剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝胶、油质佐剂(W/O/W型)、油包水型(W/O)乳剂、水包油型(O/W)乳剂、刀豆素A(Con A)、β-葡聚糖，以及它们的组合。

除非另有指明，一核酸序列除了于本文中所显示的特测序列外，也涵盖其互补序列(complementary sequences)以及保守性类似物(conservative analogs)，例如具有简并性密码子取代(degenerative codon substitutions)的同源性序列(homologous sequences)。特别地，简并性密码子取代可以经由，例如，在一核酸序列中的一或多个被选定的密码子的第3位置处替换以其它的核苷酸残基而被产生。

如本文中所用的，“多肽”、“肽”和“蛋白质”等术语可被相互交换使用，且意指一种由氨基酸残基所构成的聚合物，其中一或多个氨基酸残基是天然存在的氨基酸(naturallyoccurring amino acids)或人造化学仿效物。

如本文中所用的，“细胞”、“宿主细胞(host cell)”、“转化宿主细胞(transformed host cell)”与“重组型宿主细胞(recombinant host cell)”等术语可被互换使用，而且不仅指特定的个体细胞(individual cells)还包括继代培养的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。子代细胞可能在后续世代中因为突变作用或环境影响而发生特定的遗传修饰(genetic modification)，而致使子代细胞事实上可能与母细胞并不相一致，但子代细胞仍被涵盖在本文中所用的术语的范畴内。

适用于进行DNA重组技术的宿主细胞的适当培养基以及培养条件，在生物技术领域中已被详知。例如，可将宿主细胞培养在本领域中所惯用的发酵生物反应仪、摇动烧瓶、试管、微滴盘与平浅培养皿中，且该培养可在适合于重组型宿主细胞生长的温度、pH值及氧含量下进行。

如本文中所用的，“重组型载体”此术语意指任一种重组型表达系统，其可在任一胜任的宿主细胞(competent hostcell)内组成性地(constitutively)或诱导性地(inducibly)表达依据本发明的该第一DNA片段、该第二DNA片段或该第三DNA片段。该重组型载体可为一线性或环形表达系统，且涵盖保持游离基因形式或是被整合至宿主细胞的基因组内的表达系统。该重组型表达系统可具有或不具有自我复制的能力，它可能只会驱使宿主细胞的瞬时表达。

根据本发明，术语“转化(transformation)”可与术语“转染(transfection)”交替地使用，并且泛指将一核酸分子被引进一选定的宿主细胞内的方式。依据本领域中已知的技术，一核酸分子(例如，一重组型DNA建构物或一重组型载体)可通过多种技术而被引入至一选定的宿主细胞内，例如磷酸钙或氯化钙介导的转染作用(transfection)、电穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞击法(particle bombardment)、脂质体介导的转染作用(liposome-mediated transfection)、利用细菌噬菌体的转染作用或其它方法。

另外，现今有关动物疫苗的制造，相关研究人员也有尝试开发能有效防治至少一种标的疾病的多价疫苗。以猪常见的疾病而言，除了进行性萎缩性鼻炎(PAR)以外，尚有假性狂犬病、猪口蹄疫(porcine foot-and-mouth disease)等等。

于是，申请人于本发明中也提供一种能防治至少进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的动物用多价疫苗，其包含：

(i)与进行性萎缩性鼻炎有关的抗原组份：

(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于多杀巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocidatoxin，PMT)蛋白质的2-486氨基酸残基；

(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的486-986氨基酸残基；以及

(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大体上对应于PMT蛋白质的986-1281氨基酸残基；以及

(ii)至少一种与其它的动物疾病有关联的病原性抗原或其抗原表位。

在一优选实施方案中，该动物用多价疫苗所包含的组份(i)(a)、(i)(b)与(i)(c)的特征是如前面就多肽组份(a)、(b)与(c)所描述的。

在一优选实施方案中，该动物用多价疫苗所包含的组份(ii)是灭活的假性狂犬病gE缺损病毒(inactivatedpseudorabies gE defective virus)，以供防治假性狂犬病。

本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明用，而不应被解释为本发明实施上的限制。

实施例

实施例1.A型与D型多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的分子级鉴定以及PMT编码基因的核苷酸序列比对

I、材料与方法：

A、菌株来源：

申请人以台湾中部的台中市、台中县、彰化县与南投县这四个县市的监控猪场内所淘汰的保育猪为对象，进行猪萎缩性鼻炎疫情调查、采样与病理学检查，在经生化鉴定为多杀巴斯德氏菌的分离株中，利用Vero细胞的CPE效应试验而选取出D型产毒株(PMD 14、PMD 21、PMD 48)、D型非产毒株(PMD 20、PMD 27)、A型产毒株(PMA 2、PMA 10、PMA 23)以及A型非产毒株(PMA 33、PMA 59)共10个分离株，并另外采用标准参考菌株(D型产毒株NCTC 12178为购自食品工业发展研究所菌种中心，而A型非产毒株ATCC12945以及D型非产毒株ATCC 7707是购自于美国菌种保存中心)来进行多杀巴斯德氏菌的分子鉴别。

B、PMT蛋白质的制备：

将试验菌株以1 x 10⁷菌落数培养于含7％去纤维蛋白原绵羊血的血液培养基上，于37℃培养24小时后，加入2mLPBS(pH7.2)以将细菌刮洗下来。另一方式是，于37℃下将细菌培养于HI肉汤培养基内历时26小时，之后以离心来收集菌块，并以十分之一培养体积的PBS(pH7.2)予以悬浮。

以超声波(Misonix XL2020，Heat Systems Inc.，输出功率20％，作用30分钟)将细菌击碎后，以10,000xg进行高速离心历时30分钟。取上清液，以孔径为0.45μm及0.22μm的过滤膜来过滤，而经两次过滤的过滤液即为粗制的多杀巴斯德氏菌毒素(crude PMT)。以Bio-Rad protein assay来测定蛋白质浓度，并分装保存于-20℃冰箱内备用。

C、天竺鼠皮肤试验及小鼠致死试验(MLT)：

取体重约400g成熟的天竺鼠，并参考de Jong等人的方法(de Jong MF，Oei HL，Terenburg JG.AR-pathogenicity-tests for Pasteurella multocidai solates.IPVS 6^th Congress，211，1980)来进行天竺鼠皮肤试验。先将天竺鼠背部两侧的毛剔除，再取0.2mL的上述制备的粗制PMT来进行皮内注射，于注射后48小时观察皮肤病变的大小及程度，病变区域的直径大于1厘米者判定为阳性。

关于BALB/c小鼠致死性试验，取0.5mL的上述制备的粗制PMT来进行腹腔注射，每组6只，于注射后10天死亡数多于3只者即判定为阳性。

D、PMT蛋白质对于非洲绿猿肾脏细胞株(Vero cell)的细胞致病效应(CPE)与最小毒性剂量(minimum toxin dose；MTD)的测定：

Vero细胞的CPE测定方法主要是参考de Jong等人的方法(de Jong MF，Oei HL，Terenburg JG.AR-pathogenicity-tests for Pasteurella multocida isolates.IPVS 6th Congress，211，1980)并稍做修改后进行。先将Vero细胞浓度调成2 x 10⁵细胞/mL，以每孔100μL的数量予以加入至96孔组织培养盘中，并于被设定为37℃并含有5％CO₂的培养箱中进行培养24～48小时，待有细胞单层(monolayerof cells)形成后，移除培养液并予以加入以不含胎牛血清的杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco modified Eaglemedium，DMEM)，继而将经2倍连续稀释的上述制备的粗制PMT分别以100μL的数量置入各孔内，每个稀释倍数的粗制PMT各进行四个重复试验，并以只含2％胎牛血清的DMEM作为对照组。培养细胞历时5天并于每日观察细胞的形态变化，将最高稀释倍数但仍可造成所有四孔细胞皆呈现病变的毒素浓度定为最小毒性剂量(minimal toxicity dose，MTD)。

E、PMT蛋白质的SDS-PAGE分析以及Western印迹分析：

制备10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)，将1mg/mL的上述制备的粗制PMT加入等体积的2X样品缓冲液(sample buffer)，所形成的混合物在煮沸历时5分钟后被装填至备妥的凝胶上，在以80伏特进行电泳后，胶以固定液(45％甲醇、10％乙酸、45％去离子水)予以固定历时10分钟，继而以含0.1％考马斯亮蓝R-250(Coomassie brilliantblue R-250)的染色液进行染色。

另外进行相同的凝胶电泳处理但不予染色，所得到的电泳胶片利用转渍半干式电泳槽(TRANS-BLOT SD，semi-drytransfer cell；Bio-Rad)，以120mA予以转印到硝基纤维素膜(nitrocellulose membrane，NC membrane)上。以5％脱脂乳(skimme dmilk)进行封阻处理(blocking)历时30分钟后，加入抗-P MT单克隆抗体1B2A3(得自ATCC)，并于室温下作用1小时，继而以PBST(0.5％ Tween 20 in PBS)清洗，再加入结合有碱性磷酸酶的第二抗体(secondary antibody conjugatedwith alkaline phosphatase)，最后加入底物(NBT/BCIP，Tris缓冲液)来进行呈色反应。

F、染色体DNA的提取及浓度测定：

此实验是参照Short protocols in molecular biology II的方法(Moore DD.Preparation and analysis of DNA.In：Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Seidman JG，Smith JA，Struhl K，ed.Short protocols in molecular biologyII.John Wiley & Sons，New York，2.10-2.11，1992)来进行。

将各实验菌株培养于5mLBHI肉汤培养基(BHI broth)中，于37℃下培养历时14～18小时后，于4℃下以5,000xg进行离心历时5分钟。在去除上清液后，予以加入100μL TE缓冲液(Tris 10mM；EDTA 1mM，pH8.0)以及10μL溶菌酶(lysozyme)(200mg/mL)，令混合物混合均匀并于37℃下作用30分钟，然后加入315μL TEN(Tris 10mM；EDTA 1mM，pH8.0；NaCl 100mM)、50μL 10％ SDS、25μL RNaseA(10mg/mL)并于56℃下作用历时1小时，之后再加入5μL蛋白酶K(proteinase K)(10mg/mL)并于56℃下作用历时2小时，然后以酚/氯仿(phenol/chloroform)以及氯仿进行提取，以含0.3M醋酸钠的绝对乙醇来沉淀DNA，以100μL灭菌水来溶解被沉淀的DNA，并以吸光值A_260/280来测定DNA的浓度与纯度。

G、限制片段长度多态性分析(Restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)：

取各为10μg的DNA样品，分别加入不同的限制酶(BamHI、EcoRI、HindIII、ClaI及HhaI)并于37℃下作用历时4小时。以1％琼脂糖凝胶(agarose gel)进行电泳，经溴化乙啶(ethidium bromide)染色后，置于波长312nm的紫外光显像器(VILBER LOURMAT)上观察并照相。

H、PMT编码基因的聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)：

Petersen所发表的多杀巴斯德氏菌(P.multocida)NCTC12178分离株的PMT编码基因具有序列表中的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(参见Petersen SK.Mol Microbiol 4：821-830，1990；NCBI accesson no.X51512)。在此实验中，根据该核苷酸序列设计出如表1中所示的引物来进行聚合酶链反应，反应条件如下：在100μL反应溶液中含有模板DNA0.2μg、2UTaq聚合酶、1X反应缓冲液、2.5mM MgCl₂、0.25mM dNTPs以及20pmole引物，将反应溶液置入聚合酶链反应仪(Omnigene Temperature Cycler；Hybaid)中，反应条件设定为95℃ 40秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟，进行30次循环；在反应结束后，以1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳胶片以溴化乙啶染色观察并照相分析。

表1.被设计用来进行PMT编码基因的PCR扩增反应的引物

I、Southern杂交反应(Southern hybridization)：

杂交反应用的探针是以PCR合成完整的PMT编码基因开放阅读框(ORF，213bp-4076bp)的片段作为模板，利用Hexamers的随机引物(random primers)以及Klenow片段(Klenow fragment)来进行³²P-DNA探针的合成。杂交反应简述如下：将以限制酶切割的DNA电泳后，胶片先以0.5NNaCl及0.5N Tris-HCl各处理15分钟，再以转渍缓冲液(blotting buffer，10X SSC)将DNA转渍至NC膜上，并以紫外线进行交叉连结反应后阴干。在NC膜经预杂交处理(pre-hybridization treatment)后予以加入³²P-DNA探针，并于42℃下进行杂交反应至隔夜，之后以水清洗多次，再以X光底片压片显影。

J、随机扩增的多态性DNA分析(Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)：

利用OPERON公司合成的10聚体引物(10-mer primers)来进行聚合酶链反应，操作方式如上述G项中所述，但是将引物改用一随机引物10pmol、反应总体积改为50μL以及将反应条件改为在95℃40秒、42℃30秒、72℃1分钟的状态下进行30次循环。

K、PMT基因自动化测序分析(Automatic sequencing)：

测序用DNA模板的制作：选取D型产毒株及A型产毒株各3株(PMA 2、PMA 10、PMA 23、PMD 14、PMD 21、PMD 48)来进行PMT编码基因测序。以所设计的引物来进行PCR反应以制备测序分析用的DNA模板。PCR反应条件如前述，惟独反应条件改为进行25次循环。被收集的PCR产物以PEG-8,000进行DNA沉淀，以100μL灭菌水来溶解被沉淀的DNA，并以吸光值A₂₆₀测定DNA的浓度。

测序PCR反应及自动化测序分析是依照ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Core Kit(PERKIN ELMER)的操作手册来进行实验。取5X测序缓冲液(sequencing buffer)160μL、dNTP mix 40μL、各20μL的dNTP染料终止剂(dyeterminator)(A--绿色、T--红色、C--蓝色、G--黑色)、AmpliTaqDNA聚合酶以及F.S40μL来混合配制成反应预混物(reaction premix)。取模板DNA(经纯化的PCR产物)90ng、适当的测序用引物(参见表1)10pmole以及8μL反应预混物，最后加入灭菌水至总体积为20μL。以GeneAmp PCRSystem 9600 DNA Thermal Cycler(Applied Biosystems Prims)来进行PCR反应，于96℃10秒、50℃5秒、60℃4分钟的情况下进行25次循环。反应结束后立刻将所形成的产物置于冰上，并予以加入2μL 3M CH₃COONa及50μL 95％乙醇，静置于冰上历时10分钟以沉淀DNA，再于室温下以13,500rpm来离心历时15分钟，将乙醇吸干净，再用70％乙醇及95％乙醇各润湿一次，最后于室温中倒置待乙醇蒸干。以2.2μL EDTA/甲酰胺(formamide)来溶解沉淀丸(pellet)，于90℃加热2分钟后置于冰上备用。配制4％ TBE-聚丙烯酰胺凝胶，并装填以测序用的反应产物，在2,500V、40mA、40W下进行电泳，使用自动化测序仪(automaticsequencer，Applied Biosystems 373 DNA sequencer，STRETCH)，并以镭射感应器扫瞄，以及通过ABI PRISMFactuare software来进行资料分析，而得到自动记录的原始数据(raw data)，再将原始数据输入Mac Vector software以进行分析比对。

II、结果：

A、Vero细胞的CPE试验、天竺鼠皮肤坏死性试验以及小鼠致死试验的比较

各试验菌株对Vero细胞的最小毒性剂量(MTD)被显示于表2，其中ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27及PMA 33即使加入1mg/mL的粗制PMT，也无法造成结节样的CPE，因此判定NCTC 12178、PMD 48、PMD 21、PMA2、PMA 10及PMA 59为产毒株，而ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27及PMA 33为非产毒株。

表2.A型与D型多杀巴斯德氏菌的产毒株与非产毒株之间的小鼠致死试验(MLT)、天竺鼠皮肤坏死性试验、Vero细胞MTD试验以及用于PMT编码基因的检测的Western印迹分析与PCR结果的比较

“+”：阳性反应；“—”：阴性反应；“ND”：未测定；“H”：出血(hemorrhage)。

比较Vero细胞的CPE试验、天竺鼠皮肤坏死性试验以及小鼠致死试验的结果，发现PMD 20、PMA 2及PMD 21的检验结果不一致：PMA 2及PMD 21依小鼠致死性试验及天竺鼠皮肤坏死性试验结果应判定为非产毒株，而依Vero细胞的CPE验则判定为产毒株；另外，PMD 20原本判定为产毒株，而依Vero细胞的CPE试验则判定为非产毒株。B、蛋白质电泳及We stern印迹分析：

参见图1，NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、PMD 21及PMD 48在146kDa处可看见有明显的蛋白质带，而ATCC7707、ATCC 12945、PMD 20、PMA 33等菌株在146kDa处并无蛋白质带，此结果与Vero细胞的CPE试验的结果相符合。浓缩粗制PMT的蛋白质电泳结果也相同。另外，以抗-PMT单克隆抗体1B2A3进行西方杂交反应，结果发现NCTC12178、PMD 48、PMD 21、PMA 2及PMA 10在146kDa处的蛋白质带可明显地被单克隆抗体1B2A3所辨识，而ATCC7707、ATCC 12945、PMD 20、PMA 33等在146kDa处并未出现有可被单克隆抗体1B2A3所辨识的蛋白质带(图2)。

C、染色体DNA酶切割图谱分析：

选用BamHI、EcoRI、HindIII、ClaI及HhaI等限制酶来进行染色体DNA酶切割图谱(图3)比较时发现，以使用HhaI进行切割后的电泳图谱具优选区分性。在HhaI切割后的电泳图上可见约于5kb以下的酶切割片段大致相同，而在6kb以上即可看到具鉴别性的片段，其中D型多杀巴斯德氏菌(NCTC 12178、PMD 20、PMD 27及PMD 48)于7kb处较A型的菌株(ATCC 12945、PMA 2、PMA 10及PMA 33)多了一条酶切割片段；此外，D型及A型的产毒株(NCTC 12178、PMD 48、PMA 2及PMA 10)则于9kb处较非产毒株(ATCC12945、PMD 20、PMD 27及PMA 33)多了一条酶切割片段。而在使用BamHI等其它限制酶进行切割时，于电泳图上则无法看到可明显具鉴别性的酶切割片段。因此，使用HhaI进行多杀巴斯德氏菌的染色体DNA酶切割后的电泳图谱可作为区别A型与D型及产毒株与非产毒株的依据。

D、Southern杂交反应：

将以HhaI进行染色体DNA切割进行电泳后，转渍到硝基纤维素膜(NC membrane)上，核酸探针的制作是以标准产毒株NCTC 12178的A3B2 PCR产物[包含整段PMT基因的开放阅读框(open reading frame)]为模板，以³²P标定后制作成³²P-DNA探针(probe)，于42℃下进行杂交反应。结果显示D型及A型的产毒株(NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、PMD48)皆有二个明显的杂交反应带分别位于2kb及9kb处，而非产毒株(ATCC 12945、PMD 20、PMD 27、PMA 33)则无任何的杂交反应(图4)，这显示只有产毒株才具有PMT基因。E、PMT基因的聚合酶链反应(PCR)：

根据Petersen发表的多杀巴斯德氏菌(NCTC 12178)PMT编码基因核苷酸序列(S.K.Petersen(1990)，如前述)而合成的10个引物(表1)分别配对成A1B1、A1B4、A4B2、A2B3、A3B1、A3B2、J1J2等7组来进行PCR，其中A1B1的PCR产物为1587个碱基对(base pairs)、A1B4为2135个碱基对、A4B2为1768个碱基对、A2B3为1949个碱基对、A3B1为1588个碱基对、A3B2为3869个碱基对(包含整段PMT基因的开放阅读框)、J1J2为1227个碱基对(图5、图7)，如下面表3所示：

表3.PMT的PCR产物大小

 

PCR引物对	PCR产物(bp)
		A1B1	1587
A1B4	2135
		A4B2	1768
A2B3	1949
		A3B1	1588
A3B2	3869
		J1J2	1227

结果发现，产毒株NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、PMD21及PMD 48在各组均有预期大小的PCR扩增产物被生成，而非产毒株(ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27和PMA 33)即使在引物的粘合温度被降低至42℃下，也无预期大小的PCR扩增产物被生成(图6)。

F、随机扩增的多态性DNA(Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)：

在利用随机引物PCR来区分D型多杀巴斯德氏菌(NCTC 12178、PMD 20、PMD 27及PMD 48)以及A型多杀巴斯德氏菌(ATCC 12945、PMA 2、PMA 10及PMA 33)时，在筛选过大约200个随机引物后发现，以J-20(aagc ggcctc)(SEQ ID NO：13)来进行RAPD-PCR时，各菌株大约在1kb、2kb以及2.5kb处均有近似大小的扩增产物，但是于2.8kb附近，D型菌株可产生一条与A型菌株具鉴别性的PCR扩增产物电泳带(图8)。

G、自动化测序分析：

将台湾境内分离的D型产毒株及A型产毒株各3株的PMT编码基因直接以PCR产物进行自动化测序，结果PMA(多杀巴斯德氏菌A型)共定出4214个核苷酸序列(由核苷酸残基106到4319，图9)，而PMD(多杀巴斯德氏菌D型)共定出4206个核苷酸序列(由核苷酸残基114到4319，图9)。

就所定出的核苷酸序列，经由网路搜寻并与Genbank中Petersen所发表的多杀巴斯德氏菌(NCTC 12178)的PMT编码基因核苷酸序列相比较，结果台湾本土所分离出的D型产毒株及A型产毒株与NCTC 12178的PMT编码基因的核苷酸序列大致相同，只有在核苷酸残基1128-1129处有不同(由cg改变为gc)，而氨基酸残基由精氨酸(Arginine)改变为丙氨酸(Alanine)，而且PMA10在核苷酸残基108处[在起始密码子(start coden)前的第111个核苷酸残基]尚多了一个胞嘧啶(cytosine)。

在分析PMT基因上的HhaI切割位时，发现PMT基因上有3个HhaI的切割位(分别位在2219、2393、4331核苷酸残基处)，所以PMT基因经切割后应会出现有174bp、1938bp(2kb处的杂交反应带)及另一未知长度的片段，而由多杀巴斯德氏菌分离株的染色体DNA的Southern杂交反应结果得知该未知长度的片段大小为9kb。由此推论在PMT基因的上游约7kb处应该还有另一个HhaI切割位，故会形成约9kb与2kb的基因反应片段，这与实验结果相符。

于本实施例中，申请人尝试利用RFLP及RAPD-PCR方法来建立A与D型多杀巴斯德氏菌的不同基因型别的分子级差异性比对，俾供用于未来快速诊断鉴定多杀巴斯德氏菌分离株。而在RFLP实验结果中发现，当以HhaI对所提取的多杀巴斯德氏菌染色体DNA进行RFLP分析后，可利用所呈现的主要7kb的切割片段来区分D型与A型菌株，并可利用所呈现的主要9kb的切割片段来区分产毒株与非产毒株。此外，当以DNA探针进杂交反应，更发现所有PMT产毒株经HhaI作用后在2kb及9kb处也会呈现专一性的切割片段，也可进一步正确区分产毒株与非产毒株。

为更客观防止基因组DNA(genomic DNA)常因提取纯度不一而有酶切割不全的困扰，进而影响到RFLP的呈现与判读结果，于实验中再应用8-10聚体的随机引物来进行RAPD筛检，并且相同的DNA提取物同时以RFLP进行双重验证，此目的旨在能更客观地评估区分D型与A型菌株比对的准确性。结果发现，若以随机引物J-20(aagcggcctc)(SEQ ID NO：13)进行RAPD后，D型菌株可于2.8kb大小处产生一段与A型菌株具明显鉴别性的扩增产物(amplicon)。

综合以上分子鉴别结果，当从猪鼻腔分离出疑似多杀巴斯德氏菌菌落后，可应用此快速又简便的方法取代传统鉴别A型及D型的生化试验，且更可利用J-20随机引物来进行RAPD-PCR以再次确定其血清型别。此外，一旦再配合PMT编码基因的专一性引物(诸如J1J2等)来进行检测毒素基因的PCR反应后，将可同时在极短时间内快速鉴别分离菌株的血清型以及是否为PMT的产毒株。而日后若再配合抗-PMT单克隆抗体即可以进一步开发出ELISA检测方式，而将可大幅提高诊断精确性与缩短诊断所需的时间，也可做为未来研究多杀巴斯德氏菌上的准确分析方法。

从以上结果也归纳出：在能导致Vero细胞产生特异性细胞病变的分离株中，不论A型或D型的分离株皆具有完整的PMT基因，但不会造成细胞病变的菌株则不具有PMT基因，也不会导致实验BALB/c小鼠死亡及猪的临床病征。而A型及D型PMT的基因序列的比较进一步显示出台湾本土的这两种血清型的产毒株所具PMT核酸序列完全相同，而当与Genbank登录的D型PMT基因相比较也仅出现一个氨基酸的差异，这显示PMT编码基因是一稳定而不易变异的毒素基因，而于分析过程中所提取的这两型PMT毒素在细胞与动物实验上的性状也相当一致，而且在测试方法上以Vero细胞毒素测定最为敏感，而可做为判定猪中和抗体效价的依据。

因PMT为单一毒素的细胞作用机制且PMT编码基因的同源性高，在目前的PAR防治上，养猪业者可经由以PMT的类毒素蛋白来进行免疫而在猪体内激发具良好保护性的中和抗体的生成，并可通过母猪移行抗体而保护小猪在出生2-4周间的易感染期。但实际上，因PMT在自然多杀巴斯德氏菌菌体内的产量极低，例如在液态培养液中PMT约仅占多杀巴斯德氏菌本身所产生的总蛋白量的0.05-0.1％，实不敷成本以制造有效的高浓度类毒素蛋白来供疫苗的制造使用。因此，若能克隆PMT基因并进行大量表达后，将可作为日后研究PMT的致病机转与进行亚基疫苗防治上的应用。

于下面实施例中，本发明使用所鉴定出的D型多杀巴斯德氏菌分离株PMD-48来进行编码PMT亚基的DNA克隆株的建立以及各项试验与检测。

实施例2.编码PMT亚基的DNA克隆株的建立

A、PMT编码基因的克隆：

PMT编码基因的PCR反应：

依照实施例1中的I、材料与方法中的F项、染色体DNA的提取及浓度测定，而从D型多杀巴斯德氏菌PMD-48菌株培养物中得到DNA总提取物，并以吸光值A_260/280测定DNA的浓度与纯度。

在进行PMT编码基因的克隆时，以上述所得的DNA总提取物作为模板，并使用一组示于表1中的引物对A1B2来进行PCR：

正向引物

A1：5′-agaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3′(SEQ ID NO：3)

BamHI

反向引物

B2：5′-ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3′(SEQ IDNO：10)

NheI

由于PMT编码基因序列内不具BamHI与NheI限制酶切割位，在设计正向引物A1(对应于toxA的核苷酸残基206～236)与反向引物B2(对应于toxA的核苷酸残基4068～4036)时，乃分别引入BamHI与NheI的限制酶切割位，即为以底线标记的部分。利用A1B2引物对可得到一长度约为3.8kb的PCR扩增产物。

PMT编码基因的PCR反应条件如下：在100μL反应溶液中，以取自上述所提取得到的DNA做为模板(0.2μg)，其中加入以2U Taq聚合酶、1倍反应缓冲液、2.5mM MgCl₂、0.25mM dNTPs以及各20pmoles的引物(A1B2)。反应溶液被置入于聚合酶链反应仪(Omnigene Temperature Cycler；Hybaid)中，反应条件设定为：95℃，40秒；55℃，30秒；以及72℃，1分钟，并作30次循环。

PCR反应产物的回收：

取上述PCR扩增产物10μL并加入2μL DNA染剂予以混合均匀后，再使用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳后将两侧含标记的凝胶切下，先经溴化乙啶(0.5μg/ml)染色10秒钟，再予以水洗脱色历时5分钟。之后，将未染色的胶片与已呈色的标记(marker)共置于紫外线照明箱上对齐，利用刀片将分子量对应于3.8kb的PCR扩增产物切下，并置于干净的微量离心管中以回收琼脂糖凝胶中的DNA片段。首先将胶片称重，以1g当作1mL的方式加入3倍体积的QG溶液，再加入1倍体积的异丙醇(isopropanol)；将此溶液加入QIAquick spin column(QIAquick^TM凝胶提取试剂盒，Qiagen公司)中，以10,000rpm来离心历时1分钟，丢弃滤液；将750μl PE缓冲液加入至管柱中并进行清洗，于室温下静置5分钟；以10,000rpm来离心历时1分钟，丢弃滤液，再次离心2分钟以避免乙醇残留，之后将管柱置于新的微量离心管上，加入30μl洗脱缓冲液(elution buffer)并静置1分钟，再以12,000rpm离心历时1分钟。收集滤液并保存于-20℃中备用。之后进行限制酶切割及接合反应。

限制酶切割：

经回收的PCR产物(25μL)，加入5μL的10倍BamHI反应缓冲液，加灭菌去离子水(DDW)至48μL，再加入BamHI20U(10U/μL)，于37℃水浴进行限制剪切反应至隔夜。待限制剪切作用完成后，回收DNA片段的步骤同前述，最后将其溶于25μL DDW内。另外加入5μL的10倍NheI反应缓冲液，加DDW至46μL，再加入NheI 20U(5U/μL)，于37℃水浴进行反应2小时至隔夜。而如此所回收得到的分子量约为3.8kb的DNA片段最后被溶于DDW内。

克隆载体的切割与接合反应：

取1μg表达载体pET25b(+)(5574bp，Novagen)以BamHI及NheI(New England Biolabs)来分别剪切，并从琼脂糖凝胶中回收呈线形的载体pET25b(+)DNA。将回收的载体DNA(100ng)及3.8kb的PMT编码DNA克隆片段(300ng)予以混合后，加入2μL的10倍的接合缓冲液及0.8μL T4DNA接合(400U/μL)，最后补灭菌去离子水至总体积为20μL，于16℃水浴中进行反应，作用时间约16小时。

转化作用：

取已培养好的大肠杆菌胜任细胞(NovaBlue strain，Novagen)，经低温离心使菌块沉淀，再加入转化溶液(60mMCaCl₂；15％甘油；10mM HEPES，pH7.0)并置于冰上15分钟。取5μL已完成接合的接合产物加入至100μL已处理过的大肠杆菌胜任细胞均匀混合，再于冰上静置30分钟。之后利用42℃、2分钟的热休克(heat shock)方式，将所形成的重组型载体转化至大肠杆菌中。于冰上静置5分钟后，加入0.8ml LB肉汤培养基来作混合，并于37℃下以250rpm震荡培养历时1小时。之后，取出150μL培养菌液，并使用灭菌玻棒将菌液涂布于含氨苄青霉素(ampicillin，100μg/ml)的LB肉汤培养基上，于37℃中培养历时12～16小时，之后挑选单一菌落进行筛选。

重组型载体的筛选：

挑选单一菌落接种至2ml LB肉汤培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)，于37℃下以250rpm震荡培养隔夜。菌液离心后去除上清液，以 Miniprep kit进行重组型载体的提取。首先将细菌以250μL P1缓冲液悬浮，然后以250μLP2缓冲液将细菌溶解，再以350μL N3缓冲液进行中和，以10,000rpm离心历时10分钟，取上清液加入至QIAprep管柱中，以10,000rpm离心历时1分钟，丢弃滤液，加入750μL PE缓冲液至管柱中进行清洗，以10,000rpm离心历时1分钟，丢弃滤液，再次离心2分钟以避免乙醇残留。之后，将管柱置于新的微量离心管上，加入50μL EB缓冲液并静置1分钟，再以10,000rpm离心历时1分钟，收集滤液即为重组型载体DNA溶液。

取一部分的重组型载体(1μg)以Bam HI的限制酶切割成线状，并以琼脂糖凝胶电泳来分析其分子量是否与所预期者相符合。

核酸测序：

将经限制酶及PCR确认后的转型载体进行核酸测序，取得的序列以DNA star软体进行序列比对及开放阅读框(openreading frame)分析，经上述方式确认后的重组型载体被命名为Tox6，并做为进行下面克隆编码PMT亚基的DNA片段时的基础DNA模板克隆株。重组型载体Tox6携带有一编码PMT的3844bp的DNA片段。

编码PMT亚基的DNA片段的克隆：

取上面所得的重组型载体Tox6 2μg，分别以BamHI、HindIII于37℃水浴进行反应至隔夜后，对所得到的反应溶液(10μL)予以加入2μL的装填染料(loading dye)，混合均匀后以0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳后，将两侧含标记片段的凝胶切下，先经溴化乙啶(0.5μg/ml)染色10秒钟，再水洗脱色5分钟。将未染色的胶片与已染色的标记共置于紫外线照明箱上对齐，尽快用刀片分别将内有对应于分子量1456bp及1502bp的DNA片段的凝胶区切下，置于干净的微量离心管中称重并回收琼脂糖凝胶中的DNA片段，回收方式如上所所述。取回收的1456bp及1502bp的DNA片段300ng，分别与100ng表达载体pET32b与pET32a DNA进行接合反应后，并进行载体的转化、筛选及测序等确认，方法如上所述。于此所得到的重组型载体经确认后分别被命名为Tox1与Tox2。

另外取重组型载体Tox6，分别以HindIII及NheI于37℃水浴进行反应至隔夜后，回收883bp kb的DNA片段并与pET32b表达载体DNA进行接合反应，经载体的转化、筛选及测序后所得到的重组型载体被命名为Tox7。

上述所得到的重组型载体Tox6、Tox1、Tox2与Tox7所携带的多杀巴斯德氏菌PMT编码DNA片段对应于PMT编码基因的所在位置被示意地显示于图10中。而且，在与D型产毒株NCTC 12178的PMT编码基因作一比对后，上述所得到的3844bp、1456bp、1502bp以及883bp DNA片段被推算出分别编码基本上由对应于NCTC 12178的PMT蛋白质的2-1281、2-486、486-986以及986-1281氨基酸残基所构成的胜。

于是，于后文中，由上述重组型载体Tox6、Tox1、Tox2、Tox7所携带的多杀巴斯德氏菌PMT编码DNA片段所表达出来的重组型蛋白质即依各载体的名称而予以称为Tox6、Tox1、Tox2、Tox7重组型蛋白质。

另外，上面所得到的重组型载体Tox6、Tox1、Tox2与Tox7被进行线状重组型载体琼脂糖凝胶电泳分析，所得结果被示于图11中。

重组型载体克隆株的表达：

将上面所得到的重组型载体Tox6、Tox1、Tox2与Tox7克隆株的单一菌落分别接种至10mL LB肉汤培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)，分别于37℃、250rpm/min培养至隔夜，取2mL隔夜培养的菌液加入100mL新鲜的LB肉汤培养基，于37℃、250rpm/min培养至吸光值(波长600nm)为大约0.6时，再加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside，IPTG)使其浓度达1mM，于同样温度下培养历时6小时，收集菌体并悬浮于10mL的PBS中，以供后续的分析所用。

另将多杀巴斯德氏菌PMD48的单一菌落接种至10mLBHI肉汤培养基，分别于37℃，250rpm/min培养一夜，取2mL隔夜培养的菌液加入100mL新鲜的BHI肉汤培养基，于37℃、250rpm/min培养历时26小时，收集菌体并悬浮于10mL的PBS中，以供作为后面进行毒性及免疫原性分析的阳性对照组。

多克隆抗体的制备：

取粗制PMT以0.1％福尔马林不活化之后，加入等量的弗氏完全佐剂，以肌肉注射方式给于猪，每14天免疫一次，经多次免疫后采其血清进行中和抗体的测试，确定其具有高中和抗体效价，此即为多克隆抗体的来源。

蛋白质电泳分析及Western印迹反应：

配制10％的SDS-PAGE，将待分析样品加入等量的2X样品缓冲液(sample buffer)，以100℃煮沸15分钟后进行装填(loading)；并以Tris-甘氨酸(glycine)缓冲液(pH8.3)为电泳液，以100伏特进行电泳。当指示染剂至胶片末端时，关掉电源并取出胶片，以固定液(45％甲醇，10％乙酸)固定10分钟；继而以含0.1％考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R-250的染色液染色历时10分钟，随后再用脱色液(10％乙酸)脱色，直到各蛋白质带清楚可见为止，利用AlphaImager^TM2200(Alpha Innotech Corporation)估计各个重组型亚基毒素蛋白质克隆株的表达量。重组型亚基毒素蛋白质的蛋白质电泳结果被示于图12。

另外进行相同的凝胶电泳处理但不予染色，所得到的电泳胶片利用转渍半干式电泳槽(TRANS-BLOT SD，semi-drytransfer cell；Bio-Rad)，以120mA转渍到硝基纤维素膜(nitrocellulose membrane，NC membrane)上。加入含5％脱脂乳的封阻缓冲溶液(blocking buffer)，于室温下作用30分钟后，加入抗PMT的单克隆抗体(7-10A，申请人的实验室所自行制备者)或猪抗PMT多克隆抗体，于室温下作用1小时，经PBST(0.05％ Tween 20 in PBS)清洗后，再加入结合有碱性磷酸酶的第二抗体(兔抗-猪IgG以及山羊抗-小鼠IgG)，最后加入底物(NBT/BCIP，Tris buffer)来进行呈色。Western印迹分析结果被示于图13与图14，而各个重组型亚基毒素蛋白质克隆株的表达量分析结果被示于表4。

表4.以AlphaImager^TM 2200影像系统分析各个重组型亚基

实施例3.PMT重组型亚基(rsPMT)的毒力试验

Vero细胞毒力试验：

将以IPTG诱导表达后的rsPMT克隆菌株以5,000xg离心历时10分钟以收集细菌，再以无菌PBS来反复冲洗以使细菌悬浮，以超声波(输出功率20％，作用30分钟；MisonixXL2020，Heat Systems Inc.)将细菌击碎，继而以10,000xg高速离心历时30分钟。取上清液，经孔径0.45μm及0.22μm过滤膜过滤，此过滤两次的过滤液即为表达产物粗制可溶性蛋白质，以此来进行Vero细胞毒力试验，实验方式为依照实施例1中的I、材料与方法中的D项、PMT蛋白质对于非洲绿猿肾脏细胞株(Vero cell)的细胞致病效应(cytopathiceffect，CPE)的测定。Vero细胞毒性分析结果被示于图15-17中。

本实验是以多杀巴斯德氏菌PMD48所表达的粗制PMT毒素蛋白质作为对照组，并以仅含2％胎牛血清的DMEM作为空白试验。所有实验组、对照组以及空白试验在培养七日后进行细胞致病效应(CPE)的观察，其中将最高稀释倍数但仍可造成所有四孔中的细胞皆呈现病变的毒素浓度订定为最小毒性剂量(minimum toxin dose，MTD)。

于此实验中，由重组型载体Tox1、Tox2、Tox6以及Tox7所表达的各个重组型蛋白质所测得的MTD值分别为1.21mg/ml、1.00mg/ml、2.81mg/ml以及2.36mg/ml，且皆不会诱导Vero细胞产生CPE现象。相对地，粗制PMT蛋白质对照组即使在低至140ng/ml的浓度下仍会诱导Vero细胞产生CPE现象。

当以显微镜观察细胞型态时发现，以粗制PMT蛋白质(140ng/ml)处理Vero细胞时会造成节结样的病变(图15)，而以rsPMT(Tox1)处理时，即使所加入的重组型蛋白质的浓度高于1mg/ml时，也不会造成典型节结样的病变(图17)。

小鼠半致死剂量(50％ Lethal Dose；LD₅₀)试验：

以上述所制备的可溶性重组型蛋白质与天然PMT蛋白(PMD-48所产生的)来进行小鼠LD₅₀的测定。所用的小鼠为无特定病原(sepcifi cpathogen free，SPF)的BALB/c小鼠，每实验组各有6只小鼠，于4周龄时每只鼠以0.5mL的剂量行腹腔注射。注射后观察10天并记录是否有死亡或临床症状，并以Behrens-Karber方程式来计算各组的LD₅₀。

Behrens-Karber方程式：

差距＝(次高于累计死亡50％的剂量-次低于累计死亡50％的剂量)x[(50％-次低于50％的累计死亡)/(次高于50％的累计死亡-次低于50％的累计死亡)]

LD₅₀＝(次低于累计死亡50％的剂量)+差距

10天内死亡或第10天仍未死亡者于安乐死后进行解剖，以肉眼检查并将各脏器组织的采样标本以10％中性福尔马林溶液固定，各标本再以石蜡包埋，以石蜡切片机制成5毫米切片，经苏木紫-伊红(Hematoxylin-Eosin，H&E)染色后进行组织病理学检查。

结果：

由上述公式所计算出的粗制PMT蛋白质与PMT亚基的重组型蛋白质对小鼠的半致死剂量(LD₅₀)结果被示于表5。表5.粗制PMT蛋白质与PMT重组型亚基对于小鼠的半致死剂量

在试验进行第10天后，将仍未死亡的小鼠进行安乐死牺牲，并与10日内已先行死亡的小鼠一起进行解剖。除了以肉眼检查各脏器组织外，并以10％中性福尔马林溶液来固定所采样的标本。

实施例4.小鼠抗-PMT重组型亚基抗体的制备与测试

小鼠的免疫及其脾脏单核细胞(mononuclear cells，MNCs)的分离：

将上述所制备的可溶性rsPMT蛋白质进行小鼠免疫。所用的小鼠为SPF BALB/c小鼠，于6及8周龄时进行各免疫一次，每只小鼠免疫的剂量为100μg/0.5mL，第1次免疫所使用的佐剂为弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，Gibco，Grand Island，NY，USA)，而进行第2次免疫(100μg/0.5ml)时则改用为弗氏不完全佐剂(Freund’s incompleteadjuvant)。第2次免疫后以致死剂量(2μg)的天然PMT毒素行腹腔注射攻击。每组小鼠于第2次免疫后及攻击后14天取其脾脏以分离MNCs。脾脏分离MNCs后以红血球溶解缓冲溶液(RBC lysis buffer；0.17M NH₄Cl、0.01M KHCO₃)来溶解红血球，并以无菌PBS清洗细胞3次，最后将MNCs悬浮于含10％胎牛血清的RPMI 1640(Gibco，Grand Island，NY，USA)中备用。

抗体分泌细胞分析(antibody-secreting cells；ASCs)：

以酶斑点分析法(enzyme-linked immunospot；ELISPOT)来进行抗体分泌细胞的检测。首先，将上述所制备的可溶性rsPMT蛋白质(20μg/ml，50μl/孔)涂覆至96孔的微量硝基纤维素平板(96-well nitrocellulose bottomed plates，MillititerHA，Millipore Corp，Bedford，Mass，USA)上，于4℃下静置过夜后，以PBST水洗三次，然后加入封阻缓冲液(1％BSA)并于37℃下反应历时1小时。以PBST水洗二次后，加入不同稀释浓度的待测单核细胞细胞液100μL，并于37℃、5％CO₂培养箱中培养6小时。以PBST水洗三次后，加入100μL以封阻缓冲液稀释1000倍的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体(goat anti-mouse IgG antibody)(Sigma)，并于37℃下反应历时1小时。以PBST水洗五次后，加入100μL底物(NBT/BCIP，Tris缓冲液)并于37℃下反应历时15分钟以便产生呈色，以解剖显微镜计数ASCs的数目。小鼠的抗体分泌细胞分析结果如表6所示。

于小鼠第二次免疫后以及以粗制PMT毒素攻击后14天，由各组小鼠取其脾脏，并且分离脾脏中的单核细胞进行ASCs的分析，在2次免疫后各组小鼠的脾脏呈显明显肿大，但在攻击后，以Tox1及Tox2免疫组的小鼠脾脏则有明显萎缩的现象，但各组小鼠均无死亡。在免疫2次后，由Tox2免疫组的小鼠脾脏脾脏单核细胞中所测得的ASCs最高(在10⁶个单核细胞中有2993.33±200.33个细胞为专一性的ASCs)，而以传统类毒素免疫组的ASCs最低(在10⁶个单核细胞中有1386.67±477.21个细胞为专一性的ASCs)。

在粗制PMT毒素攻击后各免疫组小鼠的ASCs也呈明显扬升的现象，其中以Tox1免疫组的小鼠最为明显，其攻击后的ASCs数目为10233.33±850.49/10⁶单核细胞。此等结果显示，依据本发明的rsPMT蛋白质能在小鼠体内激发有效的保护力，使小鼠能承受高量粗制PMT毒素的攻击。虽然部分免疫组小鼠在攻击后脾脏呈现明显萎缩现象，仍无损于体液性免疫反应的产生。

表6.小鼠抗体分泌细胞的酶斑点分析

表中所示为每1 x 10⁶个单核细胞(MNCs)中对PMT具专一性的抗体分泌细胞数量。变方分析的组间差异性以a、b、c来表示。

细胞性免疫反应：

于96孔平底组织培养盘上，每孔分别加入50μL(2 x 10⁵细胞/孔)的经分离的单核细胞，再以3个重复的方式加入50μL天然PMT(10X MTD)作为刺激原，并以RPMI 1640细胞培养液作为阴性对照，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养4天。于培养的最后16小时，加入0.5μCi ³H-胸腺嘧啶(³H-thymidine，Amersham Life science)以标记细胞，并以多重式细胞收获器(multiple cell harvester，Minimash 200，Dynatech)分别将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，于56℃烘箱干燥2小时，置入闪烁计数瓶中，加入2mL的闪烁计数液(Ecoscint^TMH，Pational diagnostics)，于液态闪烁计数仪(Beckman liquid scintillation system model LS8000)测其CPM(count per minute)以计算淋巴细胞增殖反应情形。

淋巴细胞增殖反应情形以刺激指数(stimulation index；SI)表示，其中SI＝PMT刺激组的CPM/PMT未刺激组的CPM。参照van Diemen等人的研究(Vet Immunol Immunopathol.，41：307-321，1994)，当SI大于2时即判定淋巴细胞有增殖反应情形产生。

小鼠的细胞性免疫反应结果被示于表7。所有免疫组小鼠于第2次免疫后显示出其脾脏单核细胞对粗制PMT毒素具有增殖反应，Tox1免疫组的SI为2.11±0.27、Tox2免疫组的SI为3.31±0.95、Tox7免疫组的SI为2.31±0.26、类毒素免疫组的SI则为6.02±0.68，这显示小鼠经2次免疫后有明显细胞性免疫反应被活化的现象。但是，于攻击后只有Tox7及PMT类毒素免疫组对粗制PMT毒素仍有增殖反应，而Tox1及Tox2免疫组则对粗制PMT毒素的刺激增殖反应明显降低，这显示粗制PMT毒素的攻击有可能会部分地抑制细胞性免疫反应的活化。

表7.小鼠的细胞性免疫反应分析^*

 

组别	疫苗接种后的SI值	攻击后的SI值
			对照组	0.99±0.26	1.66±0.49
Tox1	2.11±0.27	1.06±0.49
			Tox2	3.31±0.95	0.96±0.19
Tox7	2.31±0.26	2.8±0.37
			PMT蛋白	6.02±0.68	8.07±4.13

^*：于疫苗接种后14天以及攻击后14天进行分析，所

用的刺激原为PMT粗制毒素(10X MTD，220ng)。

血清中和抗体效价试验(Serum Neutralization AntibodyTiter Test，SN Test)：

于96孔组织培养盘内，将所有实验小鼠的血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍连续稀释。在每孔内加入50μL经稀释的待测血清，继而于各孔中加入50μL含5倍MTD的天然PMT蛋白质(5X MTD，100ng)，然后将培养盘置于37℃下历时1小时。之后，于各孔中加入2 x 10⁴细胞/孔的Vero细胞，然后将培养盘置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱中。在培养至7天后，观察能够抑制CPE出现的血清最高稀释倍数，该稀释倍数为血清的中和抗体效价。小鼠的血清中和抗体效价试验结果被示于表8。

表8.小鼠的中和抗体效价分析^*

 

组别	免疫接种后的抗体倍数	攻击后的抗体倍数
			Tox1	<4	32
Tox2	<4	<4
			Tox7	8	256
粗制PMT毒素蛋白	<4	<4

^*：于疫苗接种后14天以及攻击后14天进行分析，表中所示数值即为所测得的SN值。

由上述结果得知，经Tox1、Tox2及Tox7重组型蛋白质对猪进行免疫后，可有效诱导小鼠对粗制PMT蛋白质产生具有保护性的中和抗体，且在攻击后于小鼠体内所激起的抗体具有一定有效效价，其中使用Tox1作为疫苗时，所测SN值至少有32，Tox7作为疫苗时，所测SN值至少有256。

小鼠抗-PMT单克隆抗体的制备：

有关小鼠抗-PMT单克隆抗体的制备为参考Antibodies，Cold Spring Harbar Laboratory，1988中所描述的一般操作技术来进行。

取Tox7重组型蛋白70μg以及等量的弗氏完全佐剂相混合，并以0.5ml的数量经腹腔免疫注射至BALB/cByJ小鼠体内。之后，每隔14日予以补强一次。第一次补强是再取Tox7重组型蛋白质70μg加入等量的弗氏不完全佐剂。第二次补强则以不加佐剂的Tox7重组型蛋白经静脉注射至小鼠体内。在确定小鼠已有抗体产生时，取出小鼠脾脏，并进行浆细胞(Plasma cell)的分离。

接着进行浆细胞与小白鼠骨髓癌细胞NS-1的融合，培养并观察经融合的细胞的生长，待细胞长成细胞团块时，以ELISA来进行抗体分泌的筛选。所选出能分泌抗体的细胞团块再进一步供以后续的融合瘤单克隆化筛选。经反复筛选后所得的单克隆化融合瘤，是以Western印迹法来确定抗体的专一性。

将所得到的融合瘤细胞大量培养于含2％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液内，并收取被分泌至培养基上清液中的单克隆抗体以供实验所用。于是，一针对Tox7重组型蛋白质的单克隆抗体被得到，其被命名为“7-10A”。

实施例5.PMT重组型亚基对于猪的免疫效力

以PMT重组型亚基来免疫猪的中和抗体效价分析：

以上述所制备的可溶性rsPMT蛋白质来进行猪免疫。所使用的猪为购自一无PAR病例的一贯作业猪场，猪于5周龄及7周龄时分别以每剂量含1mg rsPMT蛋白质混合等体积的弗氏佐剂来进行免疫，每次于颈部接种一剂量，并于每次免疫后2周采其血清进行中和抗体分析，中和抗体效价测定方式如下面实施例5中的血清中和抗体效价试验所述。结果被示于表9。

表9.PMT重组型亚基对于猪的中和抗体效价分析

 

组别	免疫接种后的SN值	攻击后的SN值
			Tox1	32	256
Tox2	8	32
			Tox7	4	128

经由上述结果得知，以Tox1、Tox2及Tox7重组型蛋白质对猪进行免疫后，可有效诱导猪对rsPMT蛋白质产生具有保护性的中和抗体，且在攻击后于猪体内所激起的抗体具有一定有效效价，其中使用Tox1作为疫苗时，所测SN值至少为256，Tox7作为疫苗时，所测SN值至少有128，而Tox2作为疫苗时，所测SN值至少为32。

保护性试验：

自无严重AR临床症状一贯作业猪场采其怀孕母猪血清进行中和抗体效价测定，选取中和抗体效价低于4倍的怀孕母猪50头，依照下表所示的疫苗成份，随机分成rsPMT细菌疫苗(bacterin)[Tox1、Tox2、Tox7、多杀巴斯德氏菌A型与D型以及支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]、rsPMT疫苗(Tox1、Tox2、Tox7)、市售AR疫苗及类毒素细菌疫苗[类毒素、多杀巴斯德氏菌A型与D型以及支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]与阴性对照组等5组，分别与氢氧化铝胶混合后于母猪分娩前5周及3周时各进行一次免疫，母猪于分娩时收集初乳及3日龄新生仔猪血清，测定其中和抗体效价。

表10.用于保护性试验的疫苗的组成成份

 

RsPMT细菌疫苗*	To x 1(0.7mg)、To x 2(0.7mg)、To x 7(0.7mg)、多杀巴斯德氏菌A型(109CFU)与D型(109CFU)以及支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)(109CFU)
		rsPMT疫苗	To x 1(0.7mg)、To x 2(0.7mg)以及To x 7(0.7mg)
市售AR疫苗**	Boehringer ingelheim aminal health，BIAH出品
		类毒素细菌疫苗	类毒素(2mg)、多杀巴斯德氏菌A型(109CFU)与D型(109CFU)以及支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)(109CFU)

^*：所使用的多杀巴斯德氏菌A与D型细菌是以BHI肉汤培养基培养26小时后，于37℃下以0.3％中性福尔马林予以灭活历时2天。

^**：市售疫苗的用量为每剂量2ml。

待母猪生产后，随机从各组挑出5头仔猪，于仔猪21日龄时以致死剂量的PMT毒素(1mg)，以肌肉注射方式进行攻击，并且观察其临床症状及存活率。此外，于每次免疫及攻击前采血，测定其血清中和抗体效价，实验期间采取任食。保护性试验结果被示于表11。

表11.具PMT亚基疫苗保护的仔猪经PMT毒素攻击后的存活率

 

组别	存活率(n＝10)
		RsP MT细菌疫苗	100％
RsPMT疫苗	100％
		类毒素细菌疫苗	100％
市售AR疫苗	0％
		对照组	0％

^*：对照组为一未以任何疫苗免疫的母猪所生的仔猪。

仔猪增重试验：

本试验是在母猪生产后随机从上述保护性试验的各组分别挑选出10头仔猪来进行。试验时，是将所选出的仔猪分成攻击组和未攻击组，攻击组是在仔猪18日龄时以肌肉注射方式将低剂量的PMT毒素(0.2mg)投予仔猪来进行攻击，于攻击前及攻击后3周测其体重，并且观察其临床症状及增重情形和抗体的变化，实验期间采取任食。仔猪增重的结果如下列表12所示：

表12.抗PAR的仔猪的增重试验结果

注：实验结果以t-试验(t-test)来进行分析，^*表示具有显着性差异(p<0.05)

田间试验：

先选定有发生PAR临床病例及无发生PAR临床病例的一贯作业猪场各一场，作为实验猪场，于实验开始时所有母猪群以rsPMT细菌疫苗[Tox1、Tox2、Tox7、多杀巴斯德氏菌A型与D型以及支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]统一进行免疫一次，并于母猪分娩前5周及3周时各进行一次免疫。在无发生PAR临床病例的一贯作业猪部分于疫苗使用12个月后，进行母猪分娩时的血清与初乳中和抗体的分析，结果如图18所示。在有发生PAR临床病例的猪场部分则进行母猪分娩时的血清中和抗体的分析，结果如图19所示。

此外，所有仔猪分别于4及6周龄时也以rsPMT细菌疫苗[To x 1、To x 2、To x 7、多杀巴斯德氏菌A型与D型以及支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]来进行免疫，于疫苗使用12及18个月后，于肉猪出售时自屠宰场取回猪头，进行鼻甲介骨肉眼检查，以评估疫苗的效力，鼻甲介骨萎缩程度的判定标准如图20所示。鼻甲介骨的萎缩程度等级的评分(Score)是依据病变程度的轻重分为—、+/—、+、++、+++、++++等六级，其中—表示正常的鼻甲介骨，是以鼻甲的背侧窝卷由外侧旋转卷曲约1.5圈以及其腹侧窝卷由外侧旋转卷曲约1.25圈来判定，评分时为得10分；+/—是以鼻甲的背侧窝卷正常以及其腹侧窝卷萎缩达1/4以下来判定，评分时为得8分；+是以鼻甲的背侧窝卷轻微萎缩以及其腹侧窝卷萎缩达1/4以下来判定，评分时为得6分；++是以鼻甲的背侧窝卷萎缩1/4以下以及其腹侧窝卷萎缩达1/2以下来判定，评分时为得4分；+++是以鼻甲介骨的背侧窝卷显着萎缩以及鼻中膈已受波及来判定，评分时为得2分；++++是指鼻甲介骨已完全萎缩，评分时为得0分。

该养猪场于疫苗使用之前其临床发生比例为60％，及评分之后其得分为57，其中有30％以上的鼻甲介骨为+++与++++，于免疫后12及18个月后其鼻甲介骨萎缩程度主要为—、+/—，经评分后的得分分别为94及90，二次的得分与免疫前呈现显着的差异(p<0.005)，这显示依据本发明的rsPMT细菌疫苗在现场具有极良好的保护效力。

申请人应用聚合酶链反应(PCR)进行全段与亚基PMT毒素基因的克隆，并以核酸测序等方式确认并比对基因序列后，进行各克隆株重组型亚基PMT毒素蛋白的表达，且其表达量可达转殖细菌总蛋白量浓度的20％以上，相较于天然PMT只占细菌总蛋白量的0.5-1％以下，显示可大幅提升抗原蛋白制备的效率。

其次，表达蛋白以Western印迹法(Western blotting)来确认其抗原性，而结果显示所有克隆表达的重组型亚基PMT毒素蛋白皆能被小鼠抗PMT单克隆抗体或猪抗PMT多克隆抗体所辨识，这显示依据本发明的rsPMT蛋白能涵盖与天然PMT相类似的抗原表位(epitopes)。

此外，经利用Vero细胞、小鼠及实验猪等进行rsPMT蛋白的毒性比较试验，结果显示天然PMT于140ng/ml的浓度下即可导致Vero细胞产生典型的结节样(knot)细胞病变(CPE)，但所有重组型亚基毒素蛋白即使在>1mg/ml的高浓度下，Vero细胞仍不会产生典型的结节样细胞病变，这证实依据本发明的rsPMT蛋白不具有任何细胞毒性，且于动物毒性试验中也显示这些重组型亚基毒素蛋白即使在高浓度下对小鼠及实验猪皆不具任何生物毒性，也即依据本发明的rsPMT蛋白皆具有高度的安全性。除此以外，经以小鼠及猪进行免疫原性的测试中，通过检测免疫动物所产生的中和抗体效价与其脾脏内所产生的专一性抗-PMT抗体分泌细胞的数量，并进行实验动物体液性与细胞性免疫反应的分析，以及以攻击试验评估疫苗保护效力的测试，结果显示，涵盖部分PMT氨基端或羧基端亚基(amino or carboxyl terminalsubunit)的本发明rsPMT蛋白，皆能在小鼠及猪身上产生良好的免疫保护效益。

由上述结果得知，依据本发明的rsPMT蛋白具有生产时间短、效率高、生产成本低廉、无毒性、高安全性及高免疫保护效力的特点，必能有效取代传统PMT类毒素成为新一代PAR疫苗的主要抗原成分。

实施例6.对抗进行性萎缩鼻炎与假性狂犬病(PAR-PR)的双价疫苗(Bivalent vaccine)的制备及其免疫效力试验

基于进行性萎缩鼻炎(PAR)与假性狂犬病(PR)皆为猪的高传染性与致死性疾病，申请人进一步尝试将由实施例2所建立的克隆菌株所表达出的To x 1、To x 2、To x 7重组型蛋白来与gE-删除的灭活假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)组合，由此制造能对进行性萎缩鼻炎(PAR)与假性狂犬病(PR)产生良好保护效用的双价疫苗。

A、多杀巴斯德氏菌毒素(PMT)的制备

本实施例中所用的多杀巴斯德氏菌毒素(PMT)是参照实施例1的实验操作程序“B、PMT蛋白质的制备”中所述而被制得。在依照实施例1中所述以Vero细胞检测最小毒性剂量(MTD)后，将粗制PMT分装并保存于-20℃冰箱内备用。于本实验中所用的粗制PMT，经Vero细胞的CPE试验所测得的MTD为1024倍。

B、含PMT重组型亚基与PMT类毒素的PAR疫苗的制备

将实施例2中所建立的克隆株To x 1、To x 2及To x 7，分别取单一菌落接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，于37℃下振荡隔夜培养。经两次继代后，再取2ml的菌液加入至98ml的LB肉汤培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，置于37℃下振荡培养历时约3小时。之后，加入1ml IPTG(100mM)至最终浓度为1mM。在诱导表达6小时后，收集菌液并以12,000rpm离心以去除上清液。以PBS(pH7.2)反复冲洗以使细菌悬浮，并以超声波(Misonix XL2020，Heat Systems Inc.，输出功率20％，作用30分钟)将细菌击碎。之后，以10,000xg高速离心30分钟，将收取的上清液经孔径0.45μm及0.22μm过滤膜来过滤，此经两次过滤的过滤液即为表达产物粗制可溶性蛋白质。利用Bio-Rad蛋白质分析来测定蛋白质浓度，并以AlphaImager^TM来估计表达数量以调整蛋白质浓度。

另外，将D型多杀巴斯德氏菌PMD-48与A型多杀巴斯德氏菌PMA-8的单一菌落分别接种于BHI肉汤培养基中，于37℃恒温箱中振荡培养历时18～24小时。之后，取1ml菌液进行细菌数的计数，结果以菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)来表示。其余菌液加入福尔马林(formalin)至最终浓度为0.2％(v/v)，并于37℃恒温箱中作振荡灭活(inactivation with shaking)历时24～36小时。

将上述所得到的包含Tox1、Tox2及Tox7重组型蛋白的产物(各取0.7mg)以及灭活的A与D型多杀巴斯德氏菌(各取1 x 10⁹CFU的数量)混合(占疫苗总量的70％)，再加入已灭菌的铝胶(占疫苗总量的30％)(抗原与佐剂的用量比例为70：30，v/v)，予以混和均匀以形成每剂量2ml的含PMT重组型亚基与PMT类毒素的PAR疫苗，于下文中简称为“PAR疫苗”。

C、多杀巴斯德氏菌半致死剂量(LD₅₀)的测定：

自野外临床病例所分离的多杀巴斯德氏菌PMD-48以不同细菌浓度对BABL/c小鼠进行LD₅₀测定。实验共分为4组，每组各有10只小鼠，第1组至第4组分别以每0.5ml含1.44 x 10⁶、1.44 x 10⁵、1.44 x 10⁴以及1.44 x 10³CFU来进行腹腔注射。注射后连续观察10天，并记录小鼠的死亡时间，最后再以Behrens-Karber方程式来计算LD₅₀。所测得的LD₅₀结果为2.1×10³CFU/0.5ml。

D、假性狂犬病毒(Pseudorabies virus)的制备：

将兔肾细胞株(Rabbit kidney cell line，RK-13细胞)[购自于食品工业发展研究所(FIRDI)，台湾省300新竹市食品路331号，寄存编号为CCRC 60010]培养于含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM内，当生长成单层细胞后，予以加入0.05MOI[传染的多重性(multiplicity of infection)]的PR病毒(TNL株)(由高生制药股份有限公司所提供)以感染RK-13细胞，并置于37℃、5％ CO₂培养箱内培育历时1小时。之后，将细胞培养于含2％ FBS的DMEM中，当细胞致病效应(CPE)达80～90％时，将细胞连同细胞培养液进行两次的冷冻-解冻过程(freeze-thawing process)，接而于1,000rpm与4℃下离心历时20分钟。收集上层液，即为PR病毒原液，将PR病毒原液再以上述方式进行2次增殖后，收取病毒液并依下面所述方法来检测病毒效价，而后予以分装并保存于-70℃冰箱内备用。

E、假性狂犬病毒效价测定：

50％组织培养物感染效价(50％ tissue culture infectiondose，TCID₅₀)：

取1.5ml试管12支，每管加入0.9ml不含胎牛血清的DMEM，取待测病毒液0.1ml，加入第1管后充份混合均匀，再由第1管混合均匀的病毒液吸取0.1ml至第2管，再次混合均匀，依上述方法连续稀释至第12管。在96孔平底细胞培养盘中，将每个稀释倍数的病毒液以每孔100μl的数量各接种8孔，接而加入100μl的兔肾细胞RK-13(以含5％胎牛血清的DMEM予以稀释至2 x 10⁵细胞/ml)，并置于37℃、5％CO₂恒温箱中反应历时72小时。之后，判读细胞病变(CPE)的产生情形，并以李德-穆克方法(Reed-Muench Method)来计算TCID₅₀病毒效价，俾供后续实验的使用。

F、假性狂犬病gE缺损病毒的制备：

本实施例中所用的PR疫苗病毒是由高生制药厂所提供，病毒来源是于民国七十八年(公元1989年)由桃园某养猪场罹患PR的病猪所分离出的强毒株(LC株)，该病毒经DNA杂交、兔子接种试验、抗体染色以及gE、gB糖蛋白分析后，被确定为PR病毒，然后再以遗传工程方式将此PR病毒构筑成gE糖蛋白基因缺损的PR病毒株，并以gE单克隆抗体作免疫染色而证明不具有gE糖蛋白，接而再以细胞培养来增殖病毒，而使每ml病毒液中所含病毒效价约为10⁸TCID₅₀以上，再加入0.1M二元次乙亚胺(Binary ethylenimine，BEI)至最终浓度为0.2％，并于37℃下进行灭活作用历时10小时。

高生药厂使用此病毒所制造的PR gE缺损灭活油剂(W/O/W)疫苗(病毒数量为≥10⁸TCID₅₀)，经免疫于无PR抗体的兔子或猪后，均可产生抗PR野外株的中和抗体，但不会产生抗gE糖蛋白抗体。

G、PAR-PR双价疫苗的制备：

将前述所制备的PAR疫苗抗原(含2.1mg PMT重组型亚基蛋白质、1 x 10⁹CFU的灭活A型多杀巴斯德氏菌以及1 x 10⁹CFU的灭活D型多杀巴斯德氏菌)以及gE缺损灭活PR病毒株(10⁸TCID₅₀)依等比例混和均匀，再加入已灭菌的油质佐剂(W/O/W型)(由高生制药股份有限公司提供)，制成每剂量2ml的油剂PAR-PR双价疫苗。

H、血清中和试验(serum neutralization test，SN test)：

PMT血清中和试验：

于96孔平底细胞培养盘内，将已灭活(56℃，30分钟)的待测血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍连续稀释。在每孔内加入50μL经稀释的待测血清，继而于各孔内加入50μl的PMT(5X MTD)，然后将培养盘置于37℃、5％CO₂恒温箱中反应历时1小时。每个待测血清均作二个重复试验。之后，于各孔中加入100μl Vero细胞(以含2％胎牛血清的DMEM调成3 x 10⁵细胞/ml)，并将培养盘置于37℃、5％ CO₂恒温箱中反应历时7天，而后以倒立显微镜来作观察。能够抑制节结样细胞病变(CPE)出现的最高血清稀释倍数，即为该血清的中和抗体效价。

PR血清中和试验：

于96孔平底细胞培养盘内，将已灭活的待测血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍连续稀释。在每孔内加入50μL经稀释的待测血清，继而于各孔中加入50μl含100 TCID₅₀(即2 x 10³TCID₅₀/ml)浓度的病毒液，并将培养盘置于37℃的恒温箱中反应历时1小时。每个待测血清均作二个重复试验。之后，于各孔内加入100μl猪肾细胞PK-15[购自于食品工业发展研究所(FIRDI)，寄存编号为BCRC 60057](以含5％胎牛血清的DMEM调成2 x 10⁵细胞/ml)，并将培养盘置于37℃、5％ CO₂恒温箱中反应历时3天。之后，以倒立显微镜来作观察。能够抑制融合样细胞病变(CPE)出现的最高血清稀释倍数，即为该血清的中和抗体效价。

除了猪肾细胞PK-15以外，本试验也可使用兔肾细胞RK-13来进行。

I、PAR-PR双价疫苗对小鼠的效力试验：

PAR-PR双价疫苗对抗多杀巴斯德氏菌的保护效力试验：

对小鼠(BALB/c)皮下注射以0.2ml上面所制备的含油质佐剂的PAR-PR双价疫苗，进行两次免疫且当中间隔20天，并于第2次免疫后20天进行攻击试验。免疫组于两次免疫后分别被腹腔注射以2 x 10⁶或2 x 10⁷CFU/0.2ml的多杀巴斯德氏菌PMD-48活菌液，而对照组则分别被腹腔注射以2 x 10²、2 x 10²与2 x 10⁴CFU/ml的多杀巴斯德氏菌PMD-48活菌液。在攻菌后连续观察14天，并记录小鼠的死亡时间，最后再以Behrens-Karber方程式来计算LD₅₀，并换算成免疫组的防御指数。

PAR-PR双价疫苗对抗PR的保护效力试验：

对小鼠(BALB/c)皮下注射以0.2ml上面所制备的含油质佐剂的PAR-PR双价疫苗，进行两次免疫且当中间隔20天，并于第2次免疫后20天进行攻击试验。免疫组与对照组都腹腔注射以10倍LD₅₀PR病毒(TNL株)。在攻菌后连续观察14天，并记录小鼠的死亡时间。

J、PAR-PR双价疫苗对兔子的免疫效力试验：

选取平均体重二公斤的纽西兰兔(New Zeal and rabbit)共5只，3只以含有油剂的双价疫苗来作免疫，而剩余的2只不做任何处理以作为对照组。以肌肉注射来施行免疫两次而当中次间隔10天，注射部位为左后大腿肌肉，免疫剂量为2ml。兔子于免疫前以及两次免疫后的第10天分别予以采血，以检测兔血清对于PMT及PR的中和抗体效价。

上述6只已接受双价疫苗免疫的兔子以及2只对照组兔子接着在两次免疫后第17天以100倍LD₅₀PR病毒(TNL株)来进行攻击试验，接种部位为右后大腿肌肉。攻击后连续观察10天，并记录临床症状以及死亡时间。整个实验期间米任食饲养。10天后仍存活者予以安乐死，全部实验兔子皆进行组织病理学检查。

K、PAR-PR双价疫苗的田间试验：

PAR-PR双价疫苗对怀孕母猪的免疫效力试验：

于一个无发生PAR临床病例的一贯养猪场(位于花莲县)进行PAR-PR双价疫苗田间试验。

自猪场选取怀孕约85天母猪共40头，分成4组，第1组免疫2ml含有铝胶佐剂双价疫苗，第2组免疫4ml含有铝胶佐剂双价疫苗，第3组免疫2ml含有油质佐剂双价疫苗，第4组免疫4ml含有油质佐剂双价疫苗，四组皆以肌肉注射方式进行一次免疫，并于免疫后3周采血以检测PMT及PR的中和抗体效价。

结果：

PAR-PR双价疫苗对抗多杀巴斯德氏菌的保护效用试验：

小鼠经皮下注射本实施例所制备的PAR-PR双价疫苗来作两次免疫后14天，以7 x 10⁷、7 x 10⁶与7 x 10⁵CFU/0.5ml的多杀巴斯德氏菌活菌液来作攻击试验，而对照组则是使用1.44 x 10⁵、1.44 x 10⁴与1.44 x 10³CFU/0.5ml的多杀巴斯德氏菌活菌液。结果对照组小鼠的LD₅₀为2.1 x 10³CFU。至于免疫组的LD₅₀为3.2 x 10⁶CFU。因此，依据免疫组与对照组的LD₅₀结果，免疫组的防御指数为1524[防御指数＝(3.2 x 10⁶CFU/2.1 x 10³CFU)]。表13显示依据本发明的PAR-PR双价疫苗对于小鼠的抗多杀巴斯德氏菌效力。

表13.PAR-PR双价疫苗对于小鼠的多杀巴斯德氏菌效力试验结果

^*以Behrens-Karber方程式来计算对照组的LD₅₀。

PAR-PR双价疫苗对抗假性狂犬病毒的保护效用试验：

小鼠经皮下注射本实施例所制备的PAR-PR双价疫苗来作两次免疫，免疫后第14天，以5 x 10⁵、5 x 10⁴与5 x 10³TCID₅₀/0.5ml的假性狂犬病病毒TNL株病毒液来作攻击试验，而对照组则是使用1 x 10⁴、1 x 10³与1 x 10²TCID₅₀/0.5ml的假性狂犬病病毒TNL株病毒液。结果对照组小鼠的LD₅₀为429TCID₅₀。至于免疫组的LD₅₀为>5 x 10⁵TCID₅₀。因此，依据免疫组与对照组的LD₅₀结果，免疫组的防御指数为大于1166[防御指数＝(>5 x 10⁵TCID₅₀/429 TCID₅₀)]。表14显示依据本发明的PAR-PR双价疫苗对于小鼠的抗假性狂犬病病毒效力。

表14.PAR-PR双价疫苗对于小鼠的假性狂犬病病毒效力试验结果

^*以Behrens-Karber方程式来计算对照组的LD₅₀。

PAR-PR双价疫苗对于兔子的免疫效用：

对照组的兔子于攻击前的PMT中和抗体效价平均值为32倍，而PR中和抗体呈阴性反应(<2倍)。以含油质佐剂的双价疫苗予以免疫的兔子在免疫前的PMT中和抗体效价平均值为86倍，而PR中和抗体为5.33倍；而经两次免疫后，PMT中和抗体效价的平均升高为130.67倍，而PR中和抗体为74.6倍(图21和22)。

经两次免疫的兔子连同对照组以100倍LD₅₀PR病毒(TNL株)进行攻击，结果以含油质佐剂的双价疫苗予以免疫的兔子于攻击后第8天有1只死亡，而对照组的2只兔子在攻击后第4天皆出现剧痒症状并死亡(表15)。

表15.PAR-PR双价疫苗对于兔子的PR保护效用试验结果

死亡的兔子在组织病变中可见剧痒部位的大腿肌肉出血、气管粘膜层出血、肺泡腔内充满粉红均质的水肿液，其中以含铝胶佐剂的双价疫苗予以免疫并在攻击后第5天死亡的兔子其肝脏呈多发局部性坏死灶。

PAR-PR双价疫苗对怀孕母猪的免疫效力：

将含铝胶佐剂与油质佐剂的双价疫苗分成2ml及4ml两种剂量且以肌肉注射来免疫怀孕母猪，并于免疫后3周采血以检测PMT及PR中和抗体效价。在含铝胶佐剂的双价疫苗方面，以2ml剂量予以免疫的母猪所测得的PMT中和抗体效价平均为88.4倍，而PR中和抗体效价平均为90.4倍；以4ml剂量予以免疫的母猪所测得的PMT中和抗体平均效价为75.2倍，而PR中和抗体平均效价为99.2倍。在含油质佐剂的双价疫苗方面，以2ml剂量予以免疫的母猪所测得的PMT中和抗体平均效价为88.8倍，而PR中和抗体平均效价为92.8倍；以4ml剂量予以免疫的母猪所测得的PMT中和抗体平均效价为101.2倍，而PR中和抗体平均效价为110.5倍(图23和24)。

在本实施例中所使用的PAR疫苗组份与PR疫苗组份，以小鼠来分别进行安全性与免疫效力试验，结果证实这两个疫苗组份皆具有良好的保护效力。将两种疫苗组份以铝佐剂胶或油质佐剂混合成PAR-PR双价疫苗再进一步检测其对小鼠的免疫效用，结果证实PAR-PR双价疫苗对PR病毒的攻击也可产生良好保护性。

进一步在分析不同佐剂对抗体扬升的比较上，兔子经含油质佐剂的双价疫苗予以免疫时所测得的抗PMT和PR中和抗体效价平均值则分别为130.67倍和74.6倍。

此外，在猪场的田间试验中，怀孕母猪经以含铝胶佐剂或油质佐剂的双价疫苗免疫后，所产生的PAR与PR抗体效价均可扬升至64倍以上(图23与24)，这显示双价疫苗能使母猪产生良好免疫保护的中和抗体效价，且由经免疫的母猪所分娩的新生仔猪也能通过移行抗体而避免PAR与PR的早期感染。

于本说明书中被引述的所有文献资料与专利案以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时，本案的详细说明(包含界定在内)将占上风。

虽然本发明已参考上述特定的实施方案被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神的下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书中所示者的限制。

序列表

<110>简茂盛

<120>猪进行性萎缩性鼻炎的预防、治疗与检测

<130>PE-27009-CM

<160>13

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>4380

<212>DNA

<213>多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)

<220>

<221>CDS

<222>(219)..(4076)

<400>1

<210>2

<211>1285

<212>PRT

<213>多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)

<400>2

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成前向引物

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成前向引物

<400>4

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成前向引物

<400>5

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成前向引物

<400>6

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成前向引物

<400>7

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成反向引物

<400>8

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成反向引物

<400>9

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成反向引物

<400>10

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成反向引物

<400>11

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多杀性巴氏杆菌毒素编码基因的合成反向引物

<400>12

<210>13

<211>10

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的随机引物

<400>13

Claims (7)

1.一种制备针对进行性萎缩性鼻炎(progressiveatrophic rhinitis，PAR)的动物用疫苗组合物的方法，其包含：

(a)将一(i)编码具有对应于多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)蛋白质的2-486氨基酸残基的氨基酸序列的多肽的核酸序列，(ii)编码具有对应于PMT蛋白质的486-986氨基酸残基的氨基酸序列的多肽的核酸序列，或(iii)编码具有对应于PMT蛋白质的986-1281氨基酸残基的氨基酸序列的多肽的核酸序列分别克隆入大肠杆菌表达载体pET32b或pET32a中；

(b)将所得到的重组表达载体转化至大肠杆菌中大量表达；

(c)将这些分别具有对应于多杀性巴氏杆菌毒素蛋白质的2-486氨基酸残基、486-986氨基酸残基或986-1281氨基酸残基的氨基酸序列的重组多肽从大肠杆菌培养物分离、纯化出来；以及

(d)将这些所制得的重组多肽单独或二种以上混合于选自于下列一组的疫苗载剂中而得到疫苗组合物，所述的组是：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝胶、油质佐剂(W/O/W型)、油包水型(W/O)乳剂、水包油型(O/W)乳剂、刀豆素A、β-葡聚醣、以及它们的组合。

2.如权利要求1的制备动物用疫苗组合物的方法，其特征在于：步骤(d)是将两种所制得的重组多肽混合于疫苗载剂中。

3.如权利要求1的制备动物用疫苗组合物的方法，其特征在于：步骤(d)是将三种所制得的重组多肽混合于疫苗载剂中。

4.如权利要求1的制备动物用疫苗组合物的方法，其特征在于：该疫苗组合物可供用于防治猪的进行性萎缩性鼻炎。

5.一种制备能防治至少PAR的动物用多价疫苗组合物的方法，其特征在于：将如权利要求1的制备动物用疫苗组合物的方法制得的一或多种重组多肽与至少一种和动物疾病有关联的病原性抗原混合于选自于下列一组的疫苗载剂中而得到疫苗组合物，所述的组是：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝胶、油质佐剂(W/O/W型)、油包水型(W/O)乳剂、水包油型(O/W)乳剂、刀豆素A、β-葡聚醣、以及它们的组合。

6.如权利要求5的制备动物用多价疫苗组合物的方法，其特征在于：所述和动物疾病有关联的病原性抗原为去活化的A与D型多杀性巴氏杆菌。

7.如权利要求5的制备动物用多价疫苗组合物的方法，其特征在于：所述和动物疾病有关联的病原性抗原为gE-删除的去活化假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)。

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