CN102167735A - 日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，包括日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增、日本血吸虫SjTollip重组质粒的构建和鉴定、重组蛋白的诱导表达和纯化等步骤。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。经过日本血吸虫SjTolliP重组蛋白的免疫保护性实验的验证，本发明的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白能诱导产生较强的免疫保护力，是潜在的疫苗候选靶标，可以作为日本血吸虫病防治疫苗的目的抗原。

Description

日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及分子和细胞生物学研究领域，具体涉及日本血吸虫SjTollip的重组抗原蛋白及其制备方法。此外，本发明还涉及该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白作为日本血吸虫病防治疫苗的应用。

背景技术

血吸虫病是由于人或哺乳动物感染了血吸虫所引起的一种人畜共患寄生虫病。血吸虫病历史悠久，分布广泛，在世界范围内其患病人数仅次于疟疾，是第二大热带寄生虫病。据1998年WHO血吸虫病专家咨询报告，估计全世界有76个国家和地区流行血吸虫病，被感染的人口达2亿，受威胁人群5-6亿，其中有症状的约1.2亿人，重症和伤残2000万人，每年死亡2万人，严重影响着人类的健康和社会经济的发展。我国曾经是日本血吸虫病流行最严重的国家之一，历时2100多年。通过半个世纪的努力，我国血吸虫病防治工作取得了巨大成就。然而近年来，在我国血吸虫病的流行区，疫情有所回升，并正逐步向城市蔓延，血吸虫病防治工作面临严峻形势。血吸虫病的严重疫情引起了党和国家领导的高度重视，国家卫生部已将其与艾滋病、乙型肝炎、肺结核共同列为我国须重点防治的4个重大传染病。

感染人体的血吸虫共有19种，主要的病原为曼氏血吸虫(Schistosoma.mansoni)、日本血吸虫(S.japonicum)、埃及血吸虫(S.haematobium)、间插血吸虫(S.intercalatum)和湄公血吸虫(S.mekongi)等。血吸虫生活史比较复杂，包括在哺乳动物终宿主体内的有性世代和在中间宿主螺体内的无性世代的世代交替，其生活史分虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫和成虫6个阶段。

血吸虫病被世界卫生组织列为再现传染病，是一种极易再感染、并卷土重来的寄生虫病。在我国和亚洲，日本血吸虫是引起严重血吸虫疾病的主要病原。由于日本血吸虫动物宿主多、成虫寿命长、感染后的伴随免疫和治愈后的免疫力差、中间宿主钉螺不易控制等原因，分布于亚洲的日本血吸虫感染引起的病情最重，防治难度最大。

目前血吸虫病主要的防治策略是化疗，同时研制血吸虫疫苗以及研究血吸虫转录组、蛋白质组及基因组也将为防治血吸虫病提供新的策略与途径。

化疗是控制血吸虫病患病率的重要措施之一，但连续群体化疗在血吸虫未消灭地区只能暂时降低发病，而不能阻断传播。虽然，高效低毒的吡喹酮使血吸虫病化疗有了突破性进展，但是长期反复使用同一化学药物，有可能导致产生抗药性。此外，吡喹酮是一个对血吸虫成虫有效而对童虫无效的治疗药物，虽可降低人群的感染率，但不能防止重复感染。我国在七十年代末和八十年代初发现青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯具有抗血吸虫的作用，该类药物对各个虫期的血吸虫均有一定效果，特别是对血吸虫童虫有很强的杀灭作用，已于二十世纪末被发展成为预防血吸虫病的药物。蒿甲醚和青蒿琥酯的问世为血吸虫病的早期治疗提供了条件，但杀成虫的效果不佳。因此，WHO/TDR于2002年提出要发展一个既具有杀灭成虫又有杀童虫效果的治疗血吸虫病(抗血吸虫成虫)的新药。目前，虽然国内外已有部分实验室开始进行此项研究，但多种原因制约了新药的研制，至今尚无理想的二线侯选药物的报道。因此，专家认为抗日本血吸虫病新药的研究需要技术创新，发掘新的药物靶点将有助于新药的开发。

由于血吸虫病在全世界范围内的严重危害，血吸虫基因组研究受到世界卫生组织(WHO)的特别关注，并已建立了血吸虫基因组网络。血吸虫基因组大小为270MB，其中60％为高度和中度重复序列，而30％为单拷贝序列，含8对染色体，预测含有15,000-20,000个表达基因。

在日本血吸虫转录组研究方面，2003年10月，巴西和中国两国学者分别同时在《Nature genetics》杂志上发表了重大研究进展，发布了大量数据信息和分析结果；在蛋白质组研究方面，由中国国家人类基因组南方研究中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所以及上海第二医科大学等有关科研人员组成的研究小组，主要针对日本血吸虫不同发育阶段包括雌虫、雄虫和虫卵进行大规模基因片段检测并作全面分析和验证。基于此工作，于2004年底，中国研究小组完成了日本血吸虫比较转录组和蛋白质组的相关分析，这项研究是揭开血吸虫分子之谜的有效手段；在基因组研究方面，以国家人类基因组南方研究中心为主的研究小组采用了全基因组随机测序(whole genome shotgun sequencing，WGS)方法结合大片段克隆(BAC，Fosmid)末端测序方法的综合战略，得到至少6倍基因组大小的日本血吸虫序列信息，预计近期将释放完整的日本血吸虫基因组数据。

目前，控制血吸虫病仍以灭螺和吡喹酮化疗为主，但由于钉螺难以彻底消除，目前还没有针对血吸虫成虫的特效药，防治效果并不理想，且仍然存在治愈患者发生血吸虫再感染等众多问题。因此，研制安全有效的疫苗是长期综合防治日本血吸虫病的重要措施之一。自上世纪20年代初期，国际上就开始了血吸虫疫苗的研究和探索。最近，WHO/TDR对最有希望的血吸虫疫苗候选分子进行独立检测，结果表明保护力均不到40％，只有部分保护力的疫苗在疫区使用可能最终导致疫苗无效，因此如何提高候选抗原分子的保护力水平仍是一个值得重视的问题。

血吸虫生活史包括有性世代和无性世代，必须通过这两个世代的交替才能够繁衍。因此，血吸虫成虫不能在终宿主体内繁殖。尾蚴侵入宿主皮肤到童虫发育为成熟成虫的体内移行阶段是药物治愈血吸虫病的最佳阶段，也是疫苗产生免疫应答诱导免疫保护力的重要目标。血吸虫虫卵形成的虫卵肉芽肿对宿主造成损害最大，虫卵既是主要致病因子也是血吸虫病传播的源头，因此具有抗生殖作用的抗血吸虫病疫苗也是研究的热点之一。减虫率是衡量抗血吸虫病疫苗的“金标准”，如果抗血吸虫病疫苗在动物方面能够产生50％～70％的免疫力，那么动物疫苗就能够给人类血吸虫疫苗的研制提供一个范例。

现有的抗血吸虫病疫苗主要包括以下几类：天然制备疫苗、基因工程(重组)疫苗、核酸疫苗和多价疫苗。

天然制备疫苗是以化学致弱或体外培养等技术处理后的血吸虫虫体/体细胞直接作为免疫原。曾庆仁、王敏等利用体外培养的虫体细胞作为疫苗直接免疫小鼠，获得较高的减虫率和减卵率。但天然制备疫苗也存在虫体来源有限，疫苗的保存，虫体直接作为免疫原可能造成的病理损害以及其安全性控制困难等诸多问题，这些都限制了其进一步的研究及应用。

基因工程疫苗是根据重组DNA技术，在体外进行基因剪接将重组DNA转化/转染到新的细菌或细胞中复制、转录、翻译而得到的。基因工程疫苗克服了天然制备疫苗的不足，具有较高的科研开发价值。很多研究采用重组抗原进行动物实验并获得了一定的保护性效果，取得了较大的研究进展。如已在进行抗曼氏血吸虫II期临床实验的曼氏血吸虫28KDa GST抗原就是基因工程产物，是列入世界卫生组织公布的血吸虫疫苗主要候选抗原之一。

核酸疫苗是一种新型疫苗，属于亚单位疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗。核酸疫苗是由编码引起保护性免疫应答抗原的基因片段与质粒载体重组构建而成，直接注入体内刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。核酸疫苗与重组蛋白疫苗相比有许多突出的优点：能够诱导更有效的免疫应答、制备简单、稳定性好、使用安全等。但目前核酸疫苗仍存在许多问题，一项亟待解决的问题就是如何选择理想的载体。

血吸虫作为多细胞生物，其生活史复杂且抗原表位众多，单价疫苗诱导产生的免疫保护力不足以抵抗血吸虫攻击感染。因此，考虑采用多价疫苗免疫可能提高免疫保护力，取得良好效果。用vRsi23+VRSj28联合的多价DNA疫苗通过肌内注射免疫牛，可获得38％减虫率和48％减卵率；而用VRSj62+VRsj28+VRSj23+VRSjl4-3-3四价联合的DNA疫苗通过肌内注射免疫小鼠，可诱导获得40％减虫率。但并非所有多价疫苗的免疫保护力都高于单价疫苗。目前已发展了联合核酸疫苗和重组蛋白疫苗(DNA-primer/protein-boost)的联合免疫方法，先以DNA疫苗诱导，再通过蛋白免疫强化的方法已成功地应用于曼氏血吸虫免疫接种，但其在日本血吸虫免疫应答及免疫保护方面的作用尚待研究。

Toll样受体(TLRs)是一类跨膜蛋白，广泛分布于各种免疫效应细胞上，如巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、γ&T细胞、TH1和TH2细胞、小肠上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等。Toll样受体由胞外富含亮氨酸的重复序列(LRR)、跨膜区和胞内负责信号传导的Toll/IL-1R同源结构域(TIR)三部分组成。胞外富含亮氨酸的重复序列在微生物的特异性识别方面有重要作用，LRR的差异是不同家族成员识别不同病原体的分子基础。

固有免疫是多细胞生物抵抗病原微生物的第一道快而有效的防线，同时还参与激活获得性免疫反应，在生物体的免疫应答中起着重要作用。Toll样受体是固有免疫系统的重要组成部分。TLRs在微生物感染和炎症后活化，在配体作用下，相应TLRs发生同源或异源二聚化，将刺激信号向细胞内传递，依次激活MyD88、IRAK、TRAF6、MAPK等，最终引起NF-κB的激活，导致一系列相关基因的活化表达，引起炎症因子大量释放。经由TLRs的刺激对于传染微生物的早期识别和消灭是十分重要的。然而，固有免疫过度且长期的活化对宿主是有害的，甚至是致命的。因此，刺激信号必须严格控制以确保其幅度和持续时间为合适的有益的反应。

Toll反应蛋白(Tollip)能与TLR2、TLR4及IRAK结合，Tollip结合IRAK后抑制IRAK磷酸化进而抑制IRAK的激酶活性使其下游的信号传导中断，即Tollip过表达抑制NF-κB活化，是TLRs信号通路中负性调节因子之一，能够抑制过度和长时间的免疫反应。

日本血吸虫肉芽肿的形成对宿主造成严重损害，原因之一是沉积在组织中的虫卵成熟后，不断通过卵壳上的微孔释放出虫卵抗原，引起终宿主长期且过度的免疫反应，造成严重的不良后果。而Tollip正是过度免疫反应的负性调节因子之一，由此推测Tollip可能能够减轻宿主过度免疫反应，提高宿主的免疫水平，对宿主有一定的免疫保护力并对日本血吸虫有一定的杀伤作用。

本发明通过PCR扩增出日本血吸虫SjTollip全基因，并在大肠杆菌中重组表达此基因，得到重组蛋白，经免疫保护性实验确认所得重组蛋白能诱导产生较强的免疫保护力，是潜在的疫苗候选靶标，从而完成了本发明。

在本发明之前，还没有出现涉及本发明日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其作为日本血吸虫疫苗的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之二是提供一对用于日本血吸虫SjTollip基因PCR扩增的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之三是提供该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。

本发明首先通过生物信息学技术和分子生物学技术分析并获得了日本血吸虫SjTollip的编码基因序列(如SEQ ID NO.1所示序列(Genbank AY814053))。然后，通过对日本血吸虫SjTollip基因进行PCR扩增，纯化扩增产物，将所得产物与质粒载体pET 28-a(+)构建成测序用重组pET 28-a(+)-SjTollip，通过转化筛选，抽提重组质粒，并进行测序鉴定；随后将纯化了的质粒pET 28-a(+)-SjTollip与质粒pET 28-a(+)通过酶切、回收及连接，构建成SjTollip基因原核表达的重组质粒pET 28-a(+)-SjTollip；转化此重组质粒至感受态细胞，培养，并抽提，所得重组质粒经PCR、测序及酶切鉴定确认后，转化至宿主细胞大肠肝菌中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，破碎所得菌体；由于构建的重组蛋白含6个His，可选用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白，最终得到纯化的重组蛋白SjTollip，完成了SjTollip基因的体外克隆表达及纯化。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一个方面是提供一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。

本发明第二个方面是提供了一对用于日本血吸虫SjTollip基因PCR扩增的特异性引物，其序列为：

上游：5’-CGC ATGAACCTTTACTGCATA-3’(如SEQ ID NO：3所示)或其互补链；

下游：5’-CCG

TCAAGTTTCCGATGCCAT-3’(如SEQ ID NO：4所示)或其互补链。

本发明第三个方面提供了一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增(用PCR技术从含有目的基因的pBlue script质粒获得日本血吸虫SjTollip的DNA片段)；

2)日本血吸虫SjTollip重组质粒的构建和鉴定：用pET 28-a(+)载体构建日本血吸虫SjTollip重组表达质粒pET 28-a(+)-SjTollip；

3)将pET 28-a(+)-SjTollip重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白SjTollip；

4)螯和的Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白SjTollip。

步骤1)日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增，具体为：

以含有日本血吸虫SjTollip基因序列的cDNA克隆为模板，SEQ ID NO.3(CGCGGATCCATGAACCTTTACTGCATA)为5’引物，SEQ  ID  NO.4(CCGCTCGAGTCAAGTTTCCGATGCCAT)为3’引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)回收纯化。所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，72℃延伸10min，30个循环；最后保存于4℃。

步骤2)构建可在宿主细胞中表达SjTollip编码基因的重组质粒pET 28-a(+)-SjTolliP，具体为：

将纯化的SjTolliP基因PCR产物片段和质粒载体pET 28-a(+)分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切，用QIAquick PCR Purification Kit回收纯化。根据纯化后的目的基因片段和载体酶切片段的浓度进行连接，构建成SjTolliP编码基因原核表达的重组质粒pET28-a(+)-SjTolliP。将此质粒通过CaCl₂法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，用Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定及酶切鉴定。

步骤3)重组质粒pET 28-a(+)-SjTolliP在大肠肝菌(宿主细胞)中的表达，具体为：

通过钙转化将上述抽提所得pET 28-a(+)-SjTolliP重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上。随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养。SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。

步骤4)纯化SjTolliP重组蛋白：

取表达重组蛋白SjTolliP量较高的冻存菌种于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体。在上述菌体中加入缓冲液超声裂解细菌，离心后保留上清夜与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果。根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，离心后用Ni-NTA亲和层析树脂进行纯化。SDS-PAGE检验纯化结果。

本发明第四个方面提供了一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。本发明将纯化的蛋白对雌性C57BL/6小鼠分三次进行免疫，然后再用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染，待感染后35天解剖小鼠，对其体内的成充数和虫卵数进行计数，比较免疫组和对照组之间两者的数值，计算减虫率和减卵率。经过上述日本血吸虫SjTolliP重组蛋白的免疫保护性实验的验证，本发明的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白能诱导产生较强的免疫保护力，是潜在的疫苗候选靶标，可以作为日本血吸虫病防治疫苗的目的抗原。

附图说明

图1是实施例1中日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增结果示意图。图1中，M：DNA分子量标准；1：SjTollip。

图2是实施例3中pET-28a/SjTollip重组质粒及其PCR鉴定结果示意图。图2中，M：DNA分子量标准；1：SjTollip；2：pET-28a/SjTollip。

图3是实施例4中重组质粒重组日本血吸虫Tollip蛋白(SjTollip)的SDS-PAGE分析结果示意图。图3中，M：蛋白分子量标准；1：未诱导对照；2：诱导后4h(1mM/L IPTG)；3：菌体裂解后上清；4：菌体裂解后沉淀；5：蛋白纯化后。

图4是实施例5中rSjTollip/pET28a重组蛋白纯化结果的SDS-PAGE电泳分析结果示意图。图4中，M：蛋白分子量标准；1：上样前；2：穿出；3-9：洗脱收集液。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

主要试剂：

主要仪器设备：

PCR仪	德国Biometra
		蛋白电泳仪(PAC300)	美国Bio-RAD

台式高速冷冻离心机	德国eppendorf
		高速冷冻离心机(CR22F)	日本日立
Milli-Q纯水系统	美国Millipore
		超声波细胞破碎机	宁波新芝
AKTA explore 100蛋白层析系统	GE Health

试验材料：

含日本血吸虫SjTollip基因(1056bp)序列的cDNA克隆(该克隆为中国人类基因组南方研究中心提供，按本领域常规方法克隆)、宿主菌株大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、质粒pET 28-a(+)，均由中国人类基因组南方研究中心和中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供。

实施例1日本血吸虫SjTollip基因的克隆

设计引物，扩增SjTollip的序列：

(1)根据SjTollip基因(Genbank AY814053)的序列(如SEQ ID NO.1所示序列)，利用DNA Star中的Primer Select程序设计一对特异性引物，如下：

SjTollip PF：CGC ATGAACCTTTACTGCATA(如SEQ ID NO.3所示)；

PR：CCG

TCAAGTTTCCGATGCCAT(如SEQ ID NO.4所示)；

双下划线分别是上游引物的Bam HI酶切位点和下游引物的Xho I酶切位点，单下划线表示的是上下游引物的保护性碱基。特异性引物由上海英骏生物技术工程有限公司合成。

(2)SjTollip基因的PCR扩增

反应体系：

反应条件：

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶(Gold view)电泳，观察结果，见图1。如图1所示，M：DNA分子量标准1：SjTollip；PCR扩增片段大小与SjTollip 537bp相符，表明成功从质粒中扩增出SjTollip基因。

(3)PCR产物的纯化回收(QIAGEN公司的快速胶纯化试剂盒)

1)用干净、锋利的刀片从核酸胶上将DNA目的片段切割下来；

2)将切割下来的胶加入已称重EP管中，再将两者称重，两次重量相减得凝胶净重，按照每100mg(约100ul)凝胶加入300ul Buffer QG；

3)放置EP管于55℃水浴中10min，为加速凝胶溶解，每2～3min将EP管取出上下颠倒混匀；

4)溶胶结束后，观察EP管内液体颜色是否和原来Buffer QG颜色基本一致；

5)将试剂盒中的quick spin column放入2ml收集管中；

6)将溶胶后的液体加入quick spin column中，12000rpm，离心1min，弃废液；

7)洗柱：加750ul Buffer PE于quick spin column中，静置3min，13000rpm，离心1min；

8)弃废液，13000rpm，空离2min，以除去残留的乙醇；

9)将quick column放入1.5ml EP管中；

10)加30ul elution buffer于quick spin column膜中央，静置3min，13000rpm，离心1min，收集离心后样品，保存于-20℃。

实施例2日本血吸虫SjTollip基因原核表达的重组质粒pET 28-a(+)-SjTolliP的构建

(1)PCR产物双酶切及回收

双酶切回收的SjTollip目的基因片段，37℃水浴过夜。

反应体系如下：

酶切后产物进行1％琼脂糖凝胶(Gold view)电泳，确认目的条带后切割回收目的片段，回收方式同实施例1中(3)，回收产物保存于-20℃。

(2)pET-28a空载体的制备

pET-28a空载体的抽提(采用V-gene公司的Rapid Plasmid DNADaily Mini-prep Kit)：

1)取-80℃保存的含pET-28a空载质粒的E.coli DH5α菌液划板(50ug/ml的Kan)，37℃倒置培养过夜；

2)次日，挑取平板上的单个菌落于3ml的LB培养基(含50μg/ml的卡那霉素(Kan))中，37℃振荡培养至OD值为0.6；

3)12000rpm，离心1min，弃上清；

4)向沉淀中加入250ul Buffer S1(已加入RNase A)，并用枪头悬浮细胞沉淀；

5)加入250ul Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合4～6次，直至形成透亮的溶液(此步骤不宜超过5min，以避免质粒受到破坏)；

6)加入350ul Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6～8次，12000rpm，离心10min；

7)将上步骤中的上清小心转移到置于2ml离心管中的DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃废液；

8)将制备管放回离心管，加500ul Buffer W1，12000rpm离心1min，弃废液；

9)将制备管放回离心管，加700ul Buffer W2，12000rpm离心1min，弃废液；同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤1次，弃废液；

10)将制备管置回离心管，12000rpm，离心1min；

11)将制备管放入新的1.5ml EP管中，在DNA制备管膜正中央加入30ul Eluent buffer，室温静置5min，12000rpm，离心1min；收集离心后样品，保存于-20℃。

(3)pET-28a空质粒的双酶切

双酶切pET-28a空质粒，反应条件37℃水浴过夜

反应体系如下：

酶切产物进行1％琼脂糖凝胶(Gold view)电泳，确认目的条带后切割回收目的片段纯化，回收方式同实施例1中(3)，样品保存于-20℃。

(4)重组质粒的构建

按照8∶1(摩尔比)的比例将回收后的外源基因片段与表达载体片段进行连接，连接体系如下：

连接体系于22℃水浴中连接30min，构建Tollip/pET28a重组质粒。

实施例3日本血吸虫SjTollip表达载体的鉴定

(1)重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞

将实施例2连接好的重组质粒加入E.coli DH5α感受态细胞中，用枪头轻轻混匀；冰浴30min后42℃热激30s；再冰浴3～5min；在超净工作台中向体系中加入800μl SOC培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；取出培养体系，3000rpm离心3min，弃去部分上清，留约100μl；将剩余菌液重悬后全部涂板(含50μg/ml Kan)，37℃温箱倒置培养过夜后抽提重组质粒。通过PCR扩增抽提的重组质粒，观察是否出现目的大小的基因条带，结果如图2所示，经过PCR鉴定显示在对应的分子量大小处出现目的条带，表明质粒重组成功。

(2)重组质粒的测序鉴定：

测序引物为T7引物和T7终止引物，由上海Sangon公司测定重组质粒pET28-a(+)-SjTolliP中的SjTolliP基因的全长序列。

测序鉴定结果表明，与预计结果一致。

实施例4日本血吸虫SjTolliP的重组表达质粒在大肠杆菌中的表达

(1)取1ul测序正确的pET 28-a(+)-SjTolliP重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化方法同实施例3。

(2)次日，从平板上随机挑取1个阳性克隆接种于5ml的LB培养基(含50μg/ml Kan)中，于37℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀0.6。

(3)取出1ml菌液作为菌种，再取出2ml菌液加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导，剩余的2ml菌液不加IPTG作为对照。37℃，200rpm，继续振荡培养4h。

(4)取对照及诱导4h的菌液各1ml放于EP管中，4℃，12000rpm离心2min。

(5)向离心后沉淀中加入100μl的BugBuster蛋白抽提剂(Novagen)，充分悬浮沉淀后，置于摇床上，室温振荡1h，使菌体裂解充分。

(6)菌体裂解液于4℃，12000rpm离心1min，将离心后上清保存于一干净的EP管中。沉淀用100ul PBS重悬，取5μl裂解后上清和PBS重悬后沉淀各加入2×SDS-PAGE上样凝胶缓冲液5μl，混匀后于100℃煮沸10min变性，SDS-PAGE电泳(分离胶5％，浓缩胶12％)至溴酚兰迁移至分离胶底部。

考马斯亮蓝染色，观察表达产物条带，分析重组蛋白的表达及溶解情况。

安装好玻璃板后，制备SDS-PAGE凝胶，配方如下：

制胶时先在小烧杯中加入前4种试剂，并充分混匀，再加入10％APS及TEMED，混匀后迅速加入两块玻璃板之间空隙，体积至梳子梳齿下端1厘米处为宜，以保证浓缩胶所需空间。加入适量无水乙醇封闭压平分离胶，待分离胶完全凝固后，将分离胶上覆盖的无水乙醇倾倒出并吸干。安装上面配方配制浓缩胶，最后加10％APS及TEMED，混匀后迅速加在分离胶上面。灌完后立即将梳子轻轻垂直插入浓缩胶上方，置室温直至浓缩胶完全凝固。电泳槽内加满电泳缓冲液，根据样品浓度用微量加样器向每孔内加入适量样品，120V恒压电泳，观察溴酚兰指示剂的位置，当蓝色溢出玻璃板下边缘时停止电泳。

如图3所示，结果显示，在两种宿主细胞中进行的诱导表达，于分子量约为24kDa处，诱导后的菌体均较诱导前的菌体呈现出明显表达条带，此处即为SjTolliP基因产物与6个组氨酸标签的重组体，大小与预期结果相符。根据此结果筛选表达量较高的克隆，8％甘油管冻存于-80℃冰箱中。

实施例5重组蛋白SjTolliP的纯化

(1)不可溶重组蛋白的纯化

1)将已确定可诱导表达的含重组质粒的E.coli BL21(DE3)菌种接种到5ml LB培养基中(含50ug/ml Kan)，37℃，200rpm培养过夜。

2)次日，将培养过夜的菌液转接到500ml的LB(含50μg/ml Kan)培养基中，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀0.6。

3)从培养的菌液中取1ml作为菌种，另取1ml作为对照。向剩余菌液中加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm，继续诱导培养4h。

4)诱导后的菌液12000rpm，4℃，离心30min，弃上清，向菌体沉淀中按比例加入适量的BugBuster蛋白抽提剂(每克菌体加入5ml BugBuster，使用前按照1KU/ml的比例向BugBuster中加入核酸酶)，将菌体与BugBuster充分悬浮后转移到15ml离心管中，摇床上室温振荡1h。再4℃，12000rpm离心20min，弃尽上清。

5)将5ml Lysis Buffer A(pH＝8.0)加入裂解后沉淀中混匀，室温振荡1h，使不可溶重组蛋白充分溶解于8M尿素中。然后12000rpm，4℃，离心30min，上清用0.22um滤膜过滤备用。

6)取1ml Ni-NTA装柱，待填料完全沉降后，用5ml PBS冲洗填料三次以除去残留的乙醇。再用5ml的Lysis Buffer A(pH未调)洗涤填料一次，最后加入5ml Lysis Buffer A(pH＝8.0)调节填料pH。

7)将0.22um滤膜过滤过的上清加入到已处理好柱子中，用微量移液器将上清和填料混匀，并一起转移到15ml的离心管，室温振荡结合1h。

8)将结合好的混合物重新装柱，待Ni-NTA填料充分沉降后，打开柱子下面的黄色塞子，收集流出液。

9)各用5ml Lysis Buffer B(pH＝6.3)、Lysis Buffer C(pH＝5.9)和Lysis Buffer D(pH＝4.5)先后冲洗亲和层析柱，每次加1m，待将要流尽时再加下1ml，洗脱液分别收集于标注好EP管中。

10)SDS-PAGE电泳检测不同pH下的洗脱样品，确定最适洗脱pH。结果如图4所示，诱导4h后和未诱导相比，在24kDa附近处有一明显蛋白条带，且上清中无此条带，重组蛋白以包涵体形式在沉淀中表达。以包涵体形式表达的重组蛋白rSjTollip用8M尿素溶解后，利用蛋白中组氨酸标签与Ni-NTA填料的亲和力进行纯化，再用不同pH的洗脱液洗脱结合蛋白。结果表明显示洗脱液pH为4.5时，洗脱得到纯度较高的目的蛋白。

(2)纯化后蛋白浓度测定

使用Bradford蛋白定量试剂盒测定纯化的蛋白浓度，具体操作步骤如下：

1)考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和颠倒混匀，预热分光光度计；

2)将0、5、10、15、20、25、30μl牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1mg/ml)分别加入到试管中，加入PBS补足到75μl；

3)将15μl的待测样品加入到2ml EP管中，并用PBS补足到75μl；

4)向EP管中加入1.425ml考马斯亮蓝染液，混匀后静置10min；

5)用分光光度计测定各样品595nm时的吸光值，并记录读数；以不含BSA样品的吸光值作为空白对照。

6)根据测定BSA数据绘制标准曲线并计算样品蛋白浓度。如果所得到的蛋白浓度超出标准曲线范围，增加或减少样品量后重新测定。

实施例6重组日本血吸虫Tollip蛋白(SjTollip)的免疫保护性实验

(1)分组及免疫方案

将雌性6-8周龄C57BL/6小鼠25只，分成A、B、C 3组，A、B组各10只，C组5只：A组为重组蛋白免疫组，接种rSjTollip和弗氏佐剂；B组和C组为对照组，分别接种弗氏佐剂和PBS，各组于0、2、4周在小鼠背部皮下3点免疫。

具体方案如下：

A.免疫组(10只)：

第一次(0d)：重组蛋白(25μg in 50μl PBS)+50μl弗氏完全佐剂

第二次(14d)：重组蛋白(25μg in 50μl PBS)+50μl弗氏不完全佐剂

第三次(28d)：重组蛋白(25μg in 50μl PBS)+50μl PBS

B.佐剂对照组(10只)

第一次(0d)：50μl PBS+50μl弗氏完全佐剂

第二次(14d)：50μl PBS+50μl弗氏不完全佐剂

第三次(28d)：50μl PBS+50μl PBS

C.PBS对照组(5只)

第一次(0d)：100μl PBS

第二次(14d)：100μl PBS

第三次(28d)：100μl PBS

(2)尾蚴攻击感染

时间：第三次免疫后一周

感染方法：经小鼠皮肤感染尾蚴，40头尾蚴/只

(3)成虫、虫卵计数

尾蚴感染后42天后剖杀小鼠。

1)成虫计数：采用灌注法，将小鼠门静脉挑断，从胸主动脉处用20ml注射器灌注冰冷的生理盐水(添加肝素钠)，收集冲出及肠系膜处的成虫并计数。

2)粪便虫卵计数：攻击感染后分别收集第40～42天、第43～45天粪便，记录粪便重量。用0.9％生理盐水浸泡，4℃过夜，用玻璃棒捣碎成泥状后，过160目和300目尼龙筛，将富集到300目尼龙筛中的虫卵3000rpm离心15min，去上清，再用生理盐水定容到10ml，取100μl在显微镜下计数。重复3次，计算每克粪便虫卵数。每次取样时上下颠倒混匀样品，取中间部分液体计数。

3)肝脏虫卵计数：肝脏拍照称重，剪碎后加5％KOH(或NaOH)定容到10ml，37℃振荡消化6h。消化结束后加少量福尔马林，固定虫卵形态。记录最终体积，取100μl稀释到1ml，取100μl显微镜下进行虫卵计数，重复3次。每次计数时上下颠倒混匀，取中间部分的液体计数。

4)计算公式：

减虫率(％)＝[1-(免疫组平均每鼠检获成虫数/佐剂组平均每鼠检获成虫数)]X100％；

肝脏减卵率(％)＝[1-(免疫组平均每克肝脏虫卵数/佐剂组平均每克肝脏虫卵数)]×100％；

粪便减卵率(％)＝[1-(免疫组平均每克粪便虫卵数/佐剂组平均每克粪便虫卵数)]×100％。

实验结果见表1和表2(表1是rSjTollip的免疫保护性实验-减虫率。表2是rSjTollip的免疫保护性实验-粪便EPG及粪便减卵率)，日本血吸虫的减虫率直接体现了日本血吸虫疫苗的保护性效果。粪便虫卵与血吸虫病的传播密切相关，因此粪便减卵率具有流行病学上的意义。

rSjTollip对于C57小鼠诱导产生了较强的免疫保护作用，尤其是粪便减卵率大幅度降低，可有效抑制日本血吸虫的传播。实验结果表明用rSjTollip免疫小鼠可诱导产生58.05％的减虫率，感染后40d～42d粪便减卵率为59.84％，43d～45d粪便减卵率为78.68％，说明其能够诱导产生较强的免疫保护力，推测rSjTollip对于日本血吸虫雌虫的生殖功能有较大影响，是具有重要价值的抗血吸虫候选疫苗。

表1rSjTollip的免疫保护性实验-减虫率

Worm reduction in mice immunized with rSjTollip

表2rSjTollip的免疫保护性实验-粪便EPG及粪便减卵率

Reduction of fecal eggs per gram in mice immunized with rSjTollip

序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120>日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其制备方法和用途

<130>CPC-NP-11-15181

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1756

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ttgacttatt agacttatca aaccctgacg ctaaaccttc aaattcttcg aacaatatag     60

ttcagaagcc tactcatgtt actgaaaatg gcctaaaata caatcatgat agcaatctta    120

cgcattcggt gtcacctcct aaagaacaac tattattaca gttagatgtt actcaagctc    180

gtcttgttag gaattatggt ttcctcccta tgaaccttta ctgcataatt cgcattggag    240

atgccagatt cgaaactcag acttcatcaa gatctggtaa acatcccatc tggaatgaaa    300

cttttcgatg ttggctccat gatggtgttg acaaattatc attagaaata gtttcggaaa    360

atatattttc gtcttcacaa gtcgctcatg ctgtaatagc ttttccacga tcgttatatg    420

atggtatcgc tttaaatcag tggtttgagc ttagtggaca acaaggagaa aacttagaag    480

gttcaattaa tctgattttc caatgtcgaa aagtaccagt aaatctccca cttctccaat    540

cgactccact atactgtcaa ccaagattgg gtgtagttgg tgatatgcaa gttttaccta    600

aaccgatatc tactgaagaa gttcagtcaa tacatgaaat cttcccatct gtcgaagagg    660

atacaattcg atcactttta gcaacacatc atggaaatcg tgaaattgta atcagcgaat    720

tacttctatg gcatcggaaa cttgaaatag tatgttcaga ctgtgatgta tttaaatcat    780

tttcaaataa tgttattttt ctgttcattt gttattggaa cgatttttct tctgaacaac    840

gttttccgct cacagcacta acgtgttatt accctgtttt acttcaacct cctttatcaa    900

actttttaac aaaaataaaa cagcgttatg atcatttcta cactgatttt atctaattca    960

attatcagtt attatttgtt tgttttcaca cagttacagt atatgtgcat tctgtgcgta    1020

tcttcatcct tctttcctaa tacctaatta ttaagatcat ctcaatgaaa cgacactgta    1080

gttataatgt ttatcacgta tgtatatttt attttgttgt ccatgttgtt cttattttcc    1140

attttttcta ccaatttatt ttcacctcta agcatatcct atttttgtgc tacatcagtt    1200

tgttatatag ccaaaacttt agtgaattca atgatagtgt ctatctcttt acaactgtca    1260

ctactgtcgt tgtaactgtc actcttttgt cttctacaaa taatgattgt gtagtttata    1320

tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatttc gaatcatcaa    1380

cctatggatt gaaactaact tctctaacta ccgtttcatt tacttaccaa atatagattt    1440

ttgtatactc tgctttaagt aacattgttt gtgtacgaac aattgtctta aatatactag    1500

attgaataag gttagtaact tcaaacccat tgatcgaaaa tgaatacttt ttcaaatact    1560

tggacactac tctccattta tgtatagtag gcttatggaa ttgctagtca tgtccccact    1620

ttgtatcctg cctagagcct ttaggctcca cggtaaatgc ttaaccctct gtccattgaa    1680

cctatatcca gtgattgaca actcacagta tatttctcag tcttgtccct gccattggtg    1740

agtaccgatc acctat                                                    1756

<210>2

<211>248

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

MNLYCIIRIG DARFETQTSS RSGKHPIWNE TFRCWLHDGV DKLSLEIVSE NIFSSSQVAH     60

AVIAFPRSLY DGIALNQWFE LSGQQGENLE GSINLIFQCR KVPVNLPLLQ STPLYCQPRL    120

GVVGDMQVLP KPISTEEVQS IHEIFPSVEE DTIRSLLATH HGNREIVISE LLLWHRKLEI    180

VCSDCDVFKS FSNNVIFLFI CYWNDFSSEQ RFPLTALTCY YPVLLQPPLS NFLTKIKQRY    240

DHFYTDFI                                                             248

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

cgcggatcca tgaaccttta ctgcata    27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ccgctcgagt caagtttccg atgccat    27

Claims (9)

1.一种日本血吸虫SJTollip重组抗原蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。

2.一对用于日本血吸虫SjTollip基因PCR扩增的特异性引物，其特征在于，其序列为：

上游：5’-CGC

ATGAACCTTTACTGCATA-3’(如SEQ ID NO：3所示)或其互补链；

下游：5’-CCG

TCAAGTTTCCGATGCCAT-3’(如SEQ ID NO：4所示)或其互补链。

3.一种如权利要求1所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增；

2)日本血吸虫SjTollip重组质粒的构建和鉴定；

3)将该重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白；

4)螯和的Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白。

4.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：设计SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，以含日本血吸虫SjTollip基因序列的cDNA克隆为模板进行PCR扩增；所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化。

5.如权利要求4所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，72℃延伸10min，30个循环；最后保存于4℃。

6.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将步骤1)所得的PCR产物片段与质粒载体pET-28a(+)分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切，并回收纯化；根据纯化后的目的基因片段和载体酶切片段的浓度进行连接，构建成SjTolliP编码基因原核表达的重组质粒pET 28-a(+)-SjTolliP；将此重组质粒通过CaCl₂法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定及酶切鉴定。

7.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：通过钙转化将步骤2)测序鉴定无误的pET 28-a(+)-SjTolliP重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养；SDS-PAGE电泳鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。

8.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：取表达重组蛋白SjTolliP量较高的冻存菌种于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入缓冲液超声裂解细菌，离心后保留上清夜与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果；根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，离心后用Ni-NTA亲和层析树脂进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。

9.一种如权利要求1所述的重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。

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