CN102399757A - 免疫原性组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明有关免疫原性组合物及其用途。特别是，本发明揭示制备经纯化的EV71病毒抗原的方法，亦揭示相关的免疫原性组合物及免疫方法。

Description

免疫原性组合物及其用途

技术领域

本发明是关于制备经纯化EV71病毒抗原的方法。本发明亦相关于利用本发明的经纯化EV71病毒以制备免疫原性组合物及其免疫方法。

背景技术

病毒感染引起各种病症。举例而言，肠病毒71(Enterovirus71/EV-71)为引起手足口病(hand，foot and mouth disease)的主要病原体之一，且与严重神经疾病相关。由于对宿主的EV71感染反应的分子机制了解极少，所以尚无对抗EV71感染的有效抗病毒制剂。故仍有需要发展有效对抗EV71感染的疫苗。

发明内容

本发明系关于对抗EV71感染的免疫原性组合物(例如疫苗)及相关方法。

因此，本发明一方面的特征在于一种制备经纯化EV71病毒抗原的方法，该EV71病毒抗原可用以制备对抗EV71感染的免疫原性组合物(例如疫苗)。该方法包括在培养基中培养产生EV71病毒的细胞、自细胞或培养基中纯化EV71病毒(全粒子或次粒子)，及使经纯化的EV71病毒失活以获得经纯化的EV71病毒抗原。培养基优选为无血清培养基。纯化步骤可通过液相层析纯化、蔗糖梯度超速离心纯化或两者来进行。失活步骤可如下进行：在含有甲醛的溶液中在20-45℃下培养EV71病毒2至20天，例如在20-40℃下培养2至10天，或在约37℃下培养2至5天。培养步骤可在旋转培养瓶或微载体生物反应器中进行。在一实施例中，该方法进一步包括测定经纯化的EV71病毒抗原量的步骤。此测定步骤可通过定量ELISA来进行。在以上方法中，EV71病毒抗原可为经分离的EV71病毒全粒子、经分离的EV71病毒次粒子，或经分离的EV71病毒蛋白。此等抗原可用于免疫原性组合物中。因此，在另一方面，本发明的特征为一种含有经纯化的EV71病毒抗原的免疫原性组合物。

经分离的病毒粒子、蛋白质、多肽或肽是指实质上不含天然结合分子的病毒粒子、蛋白质、多肽或肽，亦即以干重计为至少75％(亦即包括75％至100％在内的任何数值)纯度。纯度可通过任何适当标准方法(例如通过管柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析)量测。经分离的肽、多肽或蛋白质可纯化自天然来源、通过重组DNA技术或化学方法产生。术语「蛋白质」与「多肽」可互换使用以描述任何氨基酸链，而不论长度或转译后修饰(例如糖基化或磷酸化)如何。因此，术语「本发明的多肽」包括：本发明的全长、天然产生的蛋白质；对应于本发明的全长天然产生的蛋白质的重组或合成产生的多肽；或天然产生的蛋白质的特定域或部分。该术语亦包涵具有附加的氨基端甲硫胺酸(适用于在原核细胞中表现)的成熟多肽。肽是指足够短而能由氨基酸组成成分人工制备的链。一般而言，肽为50个氨基酸残基长或更短(例如50、40、30、20、15、10或5个残基长)。病毒全粒子或完整病毒粒子是指由核酸(其基因组)经蛋白质保护壳(亦即衣壳)包围组成的病毒粒子(virion)。次粒子系指含有衣壳，但含有不完整基因组或不含核酸的粒子。例如参看Kinpe DM.及Howley PM.(2001)Fundamental Virology，第4版，第18章。

EV71病毒蛋白的实例包括第一EV 71病毒多肽，其包括EV71VP1蛋白的片段或肽，该EV71 VP1蛋白具有选自下列组成的群的序列或由该序列组成：SEQ ID NO：5-7、11-14、16、20-24、39-41及44-46(列于下文)；及第二EV71病毒多肽，其包括EV71VP2或VP 3蛋白的片段或肽。免疫原性组合物可进一步包括医药学上可接受的佐剂，诸如磷酸铝。该第一或第二EV71病毒多肽为至少15个氨基酸残基长。该第二EV71病毒多肽可包括选自由以下组成的群的序列或由该序列组成：SEQ ID NO：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及43(列于下文)。

上述抗原或组合物可用于诱发对肠病毒感染的免疫反应。因此，可投予有效量的抗原或组合物至有需要的个体。「个体」是指人类及非人类动物。非人类动物的实例包括所有脊椎动物，例如哺乳类动物，诸如非人类的灵长类动物(尤其为较高等的灵长类动物)、犬、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、猫，及非哺乳动物，诸如鸟类。在一较佳实施例中，个体为人类，尤其为幼儿。在另一实施例中，个体为实验动物或适用作疾病模型的动物。

本发明的一个或多个实施将于附图及下文的说明中详述。本发明的其它特征、目标及优势可由说明书、附图及权利要求书而显而易见。

附图说明

图1为展示在旋转培养瓶中产生EV71-E59病毒原液的图。

图2为展示在1.4L生物反应器中产生EV71-E59病毒原液的图。

图3为展示在5.0L生物反应器中产生EV71-E59病毒原液的图。

图4A-4C为展示通过液相层析对EV71-E59病毒原液进行纯化的图及相片。

图5为一组展示通过连续蔗糖梯度超速离心对EV71-E59病毒原液进行纯化的图及相片。

图6为一组展示EV71-E59病毒粒子的特征的相片。

图7为展示EV71-E59病毒的失活动力学的图。

图8为展示通过TEM检测EV71-E59病毒粒子的相片。

具体实施方式

本发明，至少部分，是基于EV71抗原可引发免疫反应的意外发现及相关方法。EV71为小核醣核酸病毒科(familyPicornaviridae)肠病毒属(genus Enterovirus)的不具外套的RNA病毒。此科的特征包括这些病毒不具外套、具二十面对称性、直径30±5nm、含有单分子正义ss RNA(7.5-8.5kb)，且其在细胞质中复制。病毒衣壳为对称的二十面体(T＝1)且由60个相同单元构成，各单元由以下四种结构蛋白组成：VP1、VP2、VP3及VP4。EV71病毒在1969年于美国首次分离。已测定EV71原型病毒株BrCr的完整核苷酸序列。

如本文所述，本发明的特征在于一种制备经纯化的EV71病毒抗原的方法。该方法包括培养产生EV71病毒的宿主细胞。可使用各种培养方法。实例包括基于旋转培养瓶、微载体-生物反应器、旋转器及细胞于微载体珠粒间转移(Beads-to-Beadstransfer)的方法。

可使用各种细胞作为产生上述EV71抗原的宿主。在一实例中，使用Vero细胞。Vero细胞为人类疫苗制备的官方认可细胞株且已用来制备人类小儿麻痹疫苗(polio)及狂犬病疫苗。因为Vero细胞具固着依赖性，所以可使用微载体技术来建立用于疫苗制备的大规模细胞培养方法。为此，可使用微载体技术及无血清培养来克服使用高血清蛋白质含量进行培养的缺点，包括复杂的下游纯化过程及普里昂蛋白(prion)污染之风险。在一较佳实施例中，VP-SFM培养基(GIBCO)为较佳。亦可使用其它培养基，诸如Plus Vero(CESCO)、Excell(SAFC)及HyQ(HYCLONE)。

为产生病毒抗原，一般可以10^-2至10^-6(例如约10^-5)的MOI感染宿主细胞。对于收集，可使用批次、半批次或灌注技术。为纯化病毒抗原，可使用液相层析(LC)或蔗糖梯度超速离心纯化。可在25℃至37℃下使用例如4000∶1 37％福尔马林(formalin)进行病毒失活。为评估由此获得的抗原及含有该抗原的疫苗的效能，可使用VP2抗原中的交叉中和抗原决定基(例如SEQ IDNO：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35及38之一)作为疫苗效能测试的生物标记。

本发明的特征在于一种对抗病毒感染及/或其它相关病症(包括手足口病，及相关神经疾病)的免疫原性组合物，诸如疫苗。如上所述，该免疫原性组合物含有抗原，例如EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或多肽。

「抗原」是指含有一个或多个将刺激宿主的免疫系统产生体液反应和/或细胞抗原特异性反应的抗原决定基的粒子或分子。术语「抗原」可与「免疫原」互换使用。_{由于与适当细胞进行接触，因 此抗原诱导敏感状态或免疫反应且在活体内或活体外以可呈现方式与致敏个体的抗体或免疫细胞反应。}抗原可被生物体中的抗体特异性识别及结合。与主要组织相容性复合体(MH C)结合的抗原亦可被T淋巴细胞(T-细胞)表面上的受体识别及结合，导致T-细胞活化。如本文中所用，术语「抗原决定基」是指抗原上由特定抗体分子或T-细胞受体所结合的位点。在本文中，该术语可与「抗原决定簇」或「抗原决定簇位点」互换使用。

术语「免疫反应」或「免疫原性反应」是指个体中免疫系统响应于抗原的任何反应。脊椎动物免疫反应的实例包括(但不限于)抗体产生、诱导细胞介导的免疫性及补体活化。对相同抗原后续刺激的免疫反应(亦称为二次免疫反应)快于初次免疫所产生之反应。术语「免疫原性」系指在宿主动物中针对抗原产生免疫反应的能力。此免疫反应形成疫苗引发的针对特定感染生物体的保护性免疫力的基础。

「抗体」是指具有特定氨基酸序列且仅结合于一种抗原或密切相关的一组抗原的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的至少一个免疫活性部分。抗体实例包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括Fab及F(ab)′2片段，其可通过用诸如胃蛋白酶的酶处理抗体来产生。抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。「单克隆抗体」是指仅含有一个抗原结合位点且能够与特定抗原决定基发生免疫反应的一群抗体分子。「多克隆抗体」是指含有一个以上抗原结合位点且能够与多肽上一个以上抗原决定基发生免疫反应的一群抗体分子。

抗原优选可自宿主细胞或其培养基表达及分离。其一致性及纯度可经由此项技术中已知之方法(例如利用抗体的免疫印迹或质谱分析)确定。由此制备的抗原可用以制备免疫原性组合物(例如疫苗)以便在易染病毒的个体(例如人类个体)体内产生针对EV71病毒的抗体及免疫反应。例如可用下文所述的方式或通过此项技术中已知的任何其它等效方法制备这样的组合物。

此抗原可与医药学上可接受的载体(诸如磷酸盐缓冲盐水、碳酸氢盐溶液)或佐剂混合以制备医药组合物。载体在其与组合物的活性成分兼容且较佳能够稳定活性成分且对待治疗的个体无害的意义上须“可接受”。基于投药模式及途径及标准医药实施来选择载体。适合的医药载体及稀释剂、以及供其使用的医药必需品描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences中。在一实例中，将抗原与佐剂混合以形成适用于免疫调节的组合物。此组合物可制备成可注射剂、液体溶液或乳液。参看美国专利4,601,903；4,599,231；4,599,230；及4,596,792。

「佐剂」是指添加至免疫原性组合物(诸如疫苗)中的物质，其尽管本身不具有任何特定抗原作用，但可刺激免疫系统且增强对免疫原性组合物的免疫反应。佐剂实例包括(但不限于)矾沈淀物(alum-precipitate)、弗氏完全佐剂(Freund′s completeadjuVant)、弗氏不完全佐剂(Freund′s incomplete adjuvant)、单磷酰基-脂质A/海藻糖二霉菌酸酯佐剂(monophosphoryl-lipidA/trehalose dicorynomycolate adjuvant)、含有短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)及tRNA的油包水乳液，及通过模拟特定组的进化保守分子完成增强免疫反应任务的其它物质，该进化保守分子包括脂质体、脂多醣(LPS)、抗原之分子笼(molecular cage)、细菌细胞壁的组分，及胞饮核酸，诸如双链RNA、单链DNA及含非甲基化CpG二核苷酸的DNA。其它实例包括霍乱毒素(cholera toxin)、大肠杆菌(E.coli)热不稳定性肠毒素、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)、免疫刺激序列寡脱氧核苷酸及氢氧化铝。组合物亦可包括有助于活体内传递的聚合物。参看Au dran等人，Vaccine 21：1250-5，2003；及Denis-Mize等人，Cell Immunol.，225：12-20，2003。或者，本文所述的抗原可在无任何佐剂的情况下用于疫苗中。

有效量的上述组合物可非经肠投予，例如皮下注射或肌肉内注射。或者，可能需要包括栓剂及经口调配物的其它投药模式。对于栓剂，黏合剂及载体可包括例如聚伸烷二醇或三酸甘油酯。经口调配物可包括常用赋形剂，诸如医药级糖精、纤维素、碳酸镁及其类似物。这些组合物采用溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或散剂的形式。「有效量」意味研究者、兽医、医生或其它临床医师所寻求的在个体组织系统中或在个体体内引发生物或医学反应的组合物的量。

疫苗可经与剂量调配物兼容的方式，及在治疗上具有有效性、保护性及免疫原性的量投予。所投予的量视所治疗的个体而定，包括，例如，个体免疫系统合成抗体及必要时产生细胞介导的免疫反应的能力。需要投予的活性成分的确切量视从业者判断而定。然而，适合剂量范围可由熟习此项技术者容易地决定且可为约数微克的本发明多肽。初次投药及追加剂量的适合方案亦可变化，但可依次包括初次投药及后续投药。疫苗剂量亦可视投药途径而定且根据宿主体型而变。

易受病毒感染影响的个体(尤其为幼儿)可通过此项技术中已知之方法鉴别且投予本发明的组合物。组合物剂量视例如特定抗原、是否共投予佐剂及所共投予佐剂的类型、投药模式及频率而定，如可由熟习此项技术者决定。如可由熟习此项技术者决定，必要时重复投药。举例而言，致敏剂量之后可接着三次的追加剂量，时间间隔为每周一次。可在首次免疫后4至8周提供追加注射(booster shot)，且第二次追加可在8至12周给予相同调配物。可自个体取血清或T-细胞用于测试由组合物引发的对抗病毒的免疫反应。此项技术中熟知检定对抗蛋白质或感染的抗体或细胞毒性T细胞的方法。需要时可提供额外追加。通过改变多肽/蛋白质的量、组合物的剂量及投药频率，免疫方案可经最佳化以便引发最大免疫反应。在大规模投药之前，需要进行功效测试。在功效测试中，可经由口服或非经肠途径投予非人类个体(例如小鼠、大鼠、兔、马、猪、牛或猴)本发明的组合物。在初次投药后或在视需要追加投药后，可用病毒对测试个体与对照个体(接受模拟投药)进行攻毒以测试组合物的功效。

本发明的特征亦在于选择性结合于具有一种上述序列的肽的经分离的抗体。特征亦在于产生抗体的方法，该方法通过用在动物体内引发免疫反应的上述免疫原性组合物免疫动物以产生抗体；及自动物分离抗体或产生该抗体的细胞来达成。

以下特定实例应视为仅用于说明，而非以任何方式限制本揭示案的其余部分。在未进一步详述下，相信熟习此项技术者可基于本文中的描述最大程度地利用本发明。本文中引用的所有公开案均以全文引用的方式并入本文中。此外，下文提出的任何机制均不以任何方式限制所主张的本发明的范围。

材料及方法

1.细胞、培养基及病毒

Vero细胞(绿猴肾细胞)自美国菌种保存中心(American TypeCulture Collection，ATCC)获得。Vero细胞以VP-SFM培养基(GIBCO)培养于组织培养瓶(T-flask)中每周继代两次。EV71病毒株EV71-E59自台湾台北之疾病控制中心(Center of DiseaseControl，Taipei，Taiwan)获得。在感染后第3天(第3 DPI)，自受感染Vero细胞的培养基收集EV71-E59病毒原液(EV71-E59viral stock)。病毒原液储存于-80℃下。

2.在旋转培养瓶中产生EV71-E59病毒原液

于旋转培养瓶中培养，使Vero细胞在含200mL VP-SFM培养基(37℃下，在滚筒架(roller rack)中以0.33rpm的速率搅拌)的850cm²旋转培养瓶(CORNING)中继代。旋转培养瓶培养的接种细胞密度为约1.5-2×10⁷个细胞，且在培养6天后细胞密度达到1.5-2×10⁸个细胞。在100％培养基置换之后，EV71-E59病毒以10^-5的MOI感染Vero细胞。在此研究中，测试两百或四百毫升工作体积的培养基。在第5 DPI自培养基收集EV71-E59病毒原液。

3.在生物反应器中产生EV71-E59病毒原液

根据Wu等人，2004 Vaccine 22(29-30)：3858-64中所述的微载体细胞培养方法进行EV71-E59病毒制备。

在微载体培养方法中使用BIOFLO 310生物反应器(NBS，US)。在60rpm速率下在pH 7下搅拌生物反应器培养物(1.4L及5L工作体积)，且通过气体混合装置将溶解氧(DO)含量控制在50％。首先自上述旋转培养瓶收集生物反应器中所用的Vero细胞。遵照制造商的说明书制备Cytodex 1微载体(GE)。在设立各实验前先将Cytodex 1微载体浸于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中三小时以上且高压灭菌处理15分钟。以VP-SFM培养基洗涤经高压灭菌处理的微载体两次。生物反应器培养物中的接种细胞密度约为2×10⁵个细胞/毫升。在第3天，70％培养基经新鲜培养基置换，且在第6天，细胞密度达到2-2.5×10⁶个细胞/毫升。在置换70％培养基之后，用EV71-E59病毒以10^-5的MOI感染Vero细胞。在一实例中，在第6 DPI自微载体培养基收集EV71-E59病毒。在另一实例中，使用半批次培养法藉由在第6、第8、第10及第12 DPI每两天置换70％培养基来收集病毒。在又一实例中，使用灌注培养法通过在第6至第13 DPI每天置换50-70％培养基来收集病毒。

4.通过液相层析纯化EV71-E59病毒原液

以上述方式收集EV71-E59病毒原液后，通过0.65μm过滤器(SARTORS)移除Vero细胞碎片，且使用100K TFF卡匣(PALL)浓缩及透滤病毒原液。将浓缩病毒原液装载至Sepharose FastFlow 6凝胶管柱以便使用FPLC系统、AKTA pilot(GEHEALTHCARE)进行液相层析。Sephacryl S-500凝胶管柱亦用于进行纯化方法。对此法所得分离液区段以MAB979抗体(MILLIPORE)进行SDS-PAGE及Western印迹分析(Westernanalyses)来检测EV71病毒。使用100K TFF卡匣(PALL)浓缩经纯化的EV71-E59病毒原液且再悬浮于PBS中。使用BCA蛋白质检定组(PIERCE)测定再悬浮病毒原液的总蛋白质浓度。

5.通过连续蔗糖梯度超速离心来纯化EV71-E59病毒原液以上述方式收集EV71-E59病毒原液后，通过0.65μm过滤器(SARTORS)移除Vero细胞碎片，且使用100K TFF卡匣(PALL)浓缩EV71-E59病毒原液。将浓缩的病毒原液装载至10-50％连续蔗糖梯度以便在32,000RPM下超速离心3小时。对这些所得分离液区段使用MAB979抗体(MILLIPORE)进行SDS-PAGE及Western印迹分析(Western analyses)以检测经纯化的EV71病毒。使用Amicon 100K管(MILLIPORE)通过在3,000×g下离心来透滤经纯化的EV71-E59病毒原液。将浓缩原液再悬浮于PBS中。使用BCA蛋白质检定组(PIERCE)测定再悬浮病毒原液的总蛋白质浓度。

6.测定病毒效价

据组织培养物感染剂量的50％细胞感染力价(TCID₅₀)测定病毒效价。将连续稀释的病毒样品(10^-1至10^-8)添加至已长满Vero细胞的96孔盘中，且各稀释度以10重复试验之。在37℃下培育96孔盘六天，且通过计数受感染Vero细胞的细胞病变效应来获得TCID₅₀值。使用Reed-Muench法计算TCID₅₀值。

7.制备失活EV71-E59病毒及动物免疫

将EV71-E59病毒原液与37％甲醛溶液(MERCK)以4000∶1比率的体积比混合，且在37℃下培育3天以使EV71-E59病毒失活。在免疫之前，使失活病毒原液在室温下以磷酸铝吸附3小时。以0.2mL经磷酸铝吸附的失活EV71-E59病毒原液以肌肉内注射法(i.m)免疫一组6只雌性BALB/c小鼠(18-25g，出生6-8周)，且将相同剂量于首次免疫后两周再对小鼠进行强化免疫。另免疫两只纽西兰白兔(New Zealand whiter abbit)，且在2至3周后用0.5mL经磷酸铝吸附的失活EV71-E59病毒原液进行肌肉内注射强化免疫。同样地，一恒河猴亦以肌肉免疫，且在1个月后用0.5mL经磷酸铝吸附的失活EV71-E59病毒原液进行肌肉内注射强化免疫。在强化免疫一周之后对免疫的动物进行采血，且收集血清以便分析病毒中和能力。

8.通过穿透式电子显微镜(TEM)检测EV71-E59病毒粒子将失活的EV71-E59病毒原液滴于涂布福尔瓦膜(formvar)且经碳蒸(carbon-vaporized)的200网目铜网上。在室温下将样品(20μL)滴在铜网上保持15分钟，且接着以一片滤纸移除过量样品。以ddH₂O洗涤一次后，以2％钨磷酸溶液对铜网进行染色2分钟且随后以一片滤纸移除溶液。染色的铜网经干燥3天以上。在Hitachi H-7650电子显微镜下观察铜网。

9.抗EV71-E59血清的中和试验

在56℃下使自免疫小鼠收集的血清失活30分钟。将各血清样品添加至微管中且使用新鲜VP-SFM培养基以两倍连续稀释度稀释。将400μL体积含200T CID₅₀EV71-E59病毒的悬浮液添加至含有400μL连续稀释血清的各管中。在4℃下培育18-24小时后，将100μL连续稀释样品添加至含Vero细胞的96孔盘中。在37℃下培育96孔盘中的培养物七天，且通过计数受感染Vero细胞的细胞病变效应来获得TCID₅₀值。使用Reed-Muench法获得50％中和抑制剂量(ID₅₀)，其为使病毒效价减小50％的血清稀释度的几何倒数。

10.合成肽的设计及合成

EV 71病毒株TW/2086/98VP1、VP2及VP3衣壳蛋白的重叠合成肽在科罗耐国际科技公司(Kelowna International ScientificInc.，台北县，台湾)合成，包括涵盖VP1衣壳蛋白的完整序列的一组57种重叠合成肽、涵盖VP2衣壳蛋白之完整序列的一组49种重叠合成肽，及涵盖VP3衣壳蛋白之完整序列的一组47种重叠合成肽。各肽含有15个氨基酸残基，其中10个残基与相邻肽重叠。

11.通过ELISA检测抗体

通过酶联免疫吸附法(ELISA)测量抗体对各合成肽的亲和力。在4℃下以50μL在涂布缓冲液(0.1M NaHCO₃，pH＝9.5)中稀释至10μg/mL的个别合成肽或经纯化的病毒涂布96孔盘(COSTAR)的各孔过夜。以0.5微克/孔失活EV71-E59病毒原液用作阳性对照组。各合成肽或纯化病毒有二重复孔。以1×PBST(含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤一次后，以200μL阻断缓冲液(5％脱脂奶的PB S溶液)阻断各孔且在室温下培育2小时。将以1∶200稀释于1％BSA/PBS中的一抗添加至各孔(每孔100μL)中且培育2小时。在移除一抗溶液之后，以1×PBST洗涤各孔六次。向经洗涤的各孔中添加100μL以1∶5000稀释于1％BSA/PBS中的辣根过氧化酶(HorseradishPeroxidase)标记的二抗，且培育2小时。在移除二抗溶液之后，以1×PBST洗涤各孔六次。通过添加TMB底物溶液(KPL)使反应显色且在室温下培育15分钟。通过添加H₂SO₄(1N)来停止反应且通过ELISA读取器在450nm下量测吸光度。

12.序列比对及结构同源性预测

所有相关EV71病毒株均自NCBI PubMed网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)搜寻。使用称为ClustalW2的计算机软件(www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)对EV71VP2蛋白的基因组序列进行比对。

结果

1.在旋转培养瓶中产生EV71-E59病毒原液

Vero细胞在37℃下于含200mL VP-SFM培养基的850cm²旋转培养瓶中培养。当细胞密度达到1.5-2×10⁸个细胞时，置换培养基且用EV71-E59病毒以10^-5的MOI感染Vero细胞。如图1中所示，病毒效价在第3DPI达到2-4.5×10⁶T CID₅₀/mL且病毒效价维持稳定产量。当使用200mL或400mL培养基时，EV71-E59病毒的生成动力学为类似。

2.在生物反应器中产生EV71-E59病毒原液

使用VP-SFM培养基中的微载体细胞培养来产生EV71-E59病毒原液。在37℃下，在批次、半批次或灌注生物反应器中，使Vero细胞于载体浓度为5g/L的Cytodex微载体上生长。当细胞密度达到2-2.5×10⁶个细胞/毫升时，用新鲜VP-SFM培养基置换70％培养基，且在生物反应器中在32℃下用EV71-E59病毒以10^-5的MOI感染Vero细胞。发现在1.4L批次生物反应器培养物中最大病毒效价为在第6 DPI达到2.7×10⁵ TCID₅₀/mL。病毒效价在1.4L半批次生物反应器培养物中在第6至第12 DPI在0.8至7×10⁶ TCID₅₀/mL的范围内。病毒效价在1.4L灌注生物反应器培养物中在第6至第12DPI在0.5至2×10⁶ TCID₅₀/mL的范围内(图2)。在5L批次生物反应器培养物中最大病毒效价为在第6DPI达到1×10⁶ TCID₅₀/mL。病毒效价在5L半批次生物反应器培养物中在第6至第12 DPI在0.7至13×10⁶ TCID₅₀/mL的范围内。病毒效价在5L灌注生物反应器培养物中在第7至第13DPI在1至2×10⁷ TCID₅₀/mL的范围内(图3)。与批次培养法相比，半批次及灌注培养法可将收集产率提高3-5倍。

3.通过液相层析纯化EV71-E59病毒原液

将浓缩的EV71-E59病毒原液(20mL)装载至Sepharose FastFlow 6凝胶管柱或Sephacryl S-500，且进行液相层析。基于Western印迹分析，EV71-E59病毒主要收集于分离液区段3及4中(图4A及4B)。或者，将浓缩的病毒原液(20mL)装载至Sephacryl S-500凝胶管柱。EV71-E59病毒的主要分离液区段见于分离液区段7及8中(图4C)。浓缩汇集的分离液区段。透滤经纯化的病毒原液且以PBS再悬浮。

4.通过连续蔗糖梯度超速离心来纯化EV71-E59病毒原液将浓缩的EV71-E59病毒原液装载至10-50％连续蔗糖梯度以便在32,000RPM下超速离心3小时。当自培养基分离EV71-E59病毒时，通过Western印迹分析检测到两种EV71-E59病毒粒子(图5)。在具有25至28％蔗糖的分离液区段中检测到EV71-E59次粒子，而在具有35至38％蔗糖的分离液区段中检测到EV71-E59全粒子。EV71-E59全粒子比EV71-E59次粒子更具感染性。分别透滤此两种EV71-E59病毒粒子且以PBS再悬浮。

5.EV71病毒粒子的特征

通过组合纯化与液相层析及蔗糖梯度超速离心来获得超纯EV71-E59病毒原液。将样品装载于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上且用考马斯蓝(Coomassie Blue)染色。EV71-E59次粒子与全粒子显示不同蛋白质图谱(图6)。EV71-E59病毒抗原的预测分子量及观测分子量列于表1A-1C中。

表1A.完全切割的病毒抗原

表1B.不完全切割的病毒多肽

表1C.由甲醛交联的病毒抗原

如图6中所示，EV71-E59次粒子具有较多抗原，主要包括VP0(VP 2+VP4)、VP1及VP3。EV71-E59全粒子具有基本病毒组成：VP1、VP2、VP3及VP4。

6.制备失活的EV71-E59病毒原液

将EV71-E59病毒原液(1×10⁷PFU/mL)与37％甲醛溶液以4000∶1的体积比混合，且在37℃、25℃或4℃下培育以使病毒失活。在37℃下，EV71-E59病毒在24小时内失活，而EV71-E59病毒在25℃下失活需要3天(图7)。若使病毒在4℃下失活，则EV71-E59病毒效价在3天内仍较高。发现升高温度显着提高失活速率。在37℃下，EV71-E59病毒效价耗时2.16天降至10^-12PFU/mL(表2)。

表2.EV71-E59病毒的失活时间

为确保疫苗接种的安全性，在37℃下进行EV71-E59病毒的失活维持5-6天。

7.通过TEM检测EV71-E59病毒粒子

以2％钨磷酸溶液染色失活的EV71-E59原液且在穿透式电子显微镜下观测。发现EV71-E59病毒在失活后仍保持为完整病毒粒子。EV71-E59病毒粒子的尺寸在直径30±5n m的范围内(图8)。次粒子与全粒子样品均经检测具有完整病毒粒子。

8.失活的EV71-E59病毒的免疫原性研究

为进一步测定EV71-E59病毒的免疫原性，以甲醛溶液处理来自液相层析及来自连续蔗糖梯度超速离心的经纯化的病毒原液以使病毒失活。按照两周免疫时程，以吸附于磷酸铝上的失活的EV71-E59病毒免疫小鼠、兔及猴。在小鼠模型中，结果显示自液相层析或自连续蔗糖梯度超速离心制备的失活的EV71-E59病毒均引发中和抗体并具显着效价(表3)。

表3.小鼠模型中失活的EV71-E59病毒的免疫原性。

使用相同免疫时程时，EV71-E59全粒子引发高于次粒子的中和抗体效价。在兔及猴模型中，从已用液相层析纯化的病毒原液制备的失活的EV71-E59病毒亦诱导较高中和效价(表4及表5)。

表4.兔模型中失活的EV71-E59病毒的免疫原性。

表5.猴模型中失活的EV71-E59病毒的免疫原性。

使用这些抗血清进行交叉中和检定，且结果展示这些抗血清亦能对抗EV71病毒的C5及B5亚基因型(subgenotype)(表6)。

表6.不同血清对抗EV71病毒的遗传组(genogroup)C5及B5的中和抗体效价。

表6

明显地，化学失活的EV71-E59病毒亦诱导出对抗其它EV71病毒株的中和抗体(表6)。

9.使用对抗EV71疫苗候选物产生的抗血清来鉴别EV71的线性免疫显性抗原决定基(linear immunodominant epitope)

使用总共153种重叠合成肽来筛选对抗血清具有高亲和力的肽。在这些肽中，57种涵盖VP1蛋白(VP1-1至VP1-57)；49种涵盖VP2蛋白(VP2-1至VP 2-49)；且47种涵盖VP3蛋白(VP3-1至VP3-47)。

在一实验中，以在磷酸铝中调配的EV71疫苗候选病毒原液免疫六只小鼠及三只兔。在两个剂量后，收集小鼠抗血清且汇集在一起。小鼠抗血清对于VP1-42及VP1-43肽显示高OD值。在高OD值下小鼠抗血清未检测到VP2及VP3肽。兔抗血清对于VP1-01、VP2-27、VP2-28及VP2-29肽显示高OD值。在高OD值下兔抗血清未检测到VP3肽。对抗血清具有高亲和力的肽列于表7中。

表7.对抗血清具有高亲和力的合成肽的氨基酸序列

10.不同亚基因型中EV71VP2抗原决定基序列的比对将EV71VP1序列与亚基因型树比对。为了解来自不同亚基因型(基于VP1)的VP2抗原决定基序列，选择及比对十种EV71病毒株的VP2氨基酸序列(131-155)。VP2抗原决定基序列比对显示此序列在EV71病毒株中高度保守(表8)。

表8.来自不同亚基因型的VP2氨基酸(131-155)序列的比对

*SEQ ID NO：4为基于SEQ ID NO：1-3预测的序列，其两个变异残基为D及H。

对上述VP1-43肽序列进行位点突变分析。更特定言之，其残基(除A224外)各自用丙氨酸残基置换以产生14种突变型肽。这些突变体的序列列于下文，其中丙氨酸残基加下底线。接着进行ELISA检定以检验此14种突变型肽结合于E1(特异性结合于VP1-43的小鼠抗EV71抗体)的能力。发现215赖氨酸、217谷氨酸、218赖氨酸，及219天冬氨酸为EV71 VP1抗原性的必需氨基酸。

类似地，对上述VP2-28肽序列进行位点突变分析。基于VP2-28肽序列产生一组14种突变型肽，其中各氨基酸残基(除136A外)用丙氨酸残基置换。这些突变体的序列列于下文，其中丙氨酸加下底线。进行ELISA以检验突变体结合于MAB979(特异性结合于VP2-28肽的单克隆抗体)的能力。发现142谷氨酸、145组氨酸、148酪氨酸及149赖氨酸为必需的。

AGEHKQEKDLEYGAC，SEQ ID NO：11

FAEHKQEKDLEYGAC，SEQ ID NO：12

FGAHKQEKDLEYGAC，SEQ ID NO：13

FGEAKQEKDLEYGAC，SEQ ID NO：14

FGEHAQEKDLEYGAC，SEQ ID NO：15

FGEHKAEKDLEYGAC，SEQ ID NO：16

FGEHKQAKDLEYGAC，SEQ ID NO：17

FGEHKQEADLEYGAC，SEQ ID NO：18

FGEHKQEKALEYGAC，SEQ ID NO：19

FGEHKQEKDAEYGAC，SEQ ID NO：20

FGEHKQEKDLAYGAC，SEQ ID NO：21

FGEHKQEKDLEAGAC，SEQ ID NO：22

FGEHKQEKDLEYAAC，SEQ ID NO：23

FGEHKQEKDLEYGAA，SEQ ID NO：24

AAGTGTEDSHPPYKQ，SEQ ID NO：25

AGATGTEDSHPPYKQ，SEQ ID NO：26

AGGAGTEDSHPPYKQ，SEQ ID NO：27

AGGTATEDSHPPYKQ，SEQ ID NO：28

AGGTGAEDSHPPYKQ，SEQ ID NO：29

AGGTGTADSHPPYKQ，SEQ ID NO：30

AGGTGTEASHPPYKQ，SEQ ID NO：31

AGGTGTEDAHPPYKQ，SEQ ID NO：32

AGGTGTEDSAPPYKQ，SEQ ID NO：33

AGGTGTEDSHAPYKQ，SEQ ID NO：34

AGGTGTEDSHPAYKQ，SEQ ID NO：35

AGGTGTEDSHPPAKQ，SEQ ID NO：36

AGGTGTEDSHPPYAQ，SEQ ID NO：37

AGGTGTEDSHPPYKA，SEQ ID NO：38

在另一实验中，以0.5mL磷酸铝吸附的失活的EV71-E59病毒原液肌肉内免疫10只雄性及10只雌性(SD)IGS品系大鼠(分别为第1组及第2组)且在3周后进行强化免疫。结果总括于下表9中。如表中所示，该免疫诱发具有高中和效价的抗血清。

表9.大鼠模型中失活EV71-E59病毒之免疫原性。

通过酶联免疫吸附法(ELISA)以相同方式测量抗血清对各上述合成肽的亲和力。发现VP1-25、VP1-42、VP1-49、VP1-50、VP2-20及VP3-22经检测具有高OD值，显示抗血清以高亲和力结合于这些肽。下表10中列出这些肽的序列。

表10.对抗血清具有高亲和力的合成肽的氨基酸序列

进行序列比对以检验来自不同亚基因型的VP1-25氨基酸序列。结果展示于下表11中。发现这些肽具有高度共同序列：RKVELFTDMRFDAEF(SEQ ID NO：44)。

表11.来自不同亚基因型的P1-25氨基酸序列的比对

对来自不同亚基因型的VP1-49及VP1-50氨基酸序列进行类似比对分析。结果展示于下表12中。

表12.来自不同亚基因型的VP1-49或50氨基酸序列的比对

鉴别出两个共同序列：SKSKYPLVVRIYMRM(SEQ IDNO：45)及SKSEYSLVIRIYMRM(SEQ ID NO：46)

其它实施例

本说明书中揭示的所有特征均可以任何组合形式组合。本说明书中揭示的各特征可经具有相同、等效或类似目的的替代性特征替换。因此，除非另外明确规定，否则所揭示的各特征仅为通用系列的等效或类似特征的实例。

已描述本发明的许多实施例。然而，应了解在不脱离本发明的精神及范畴的情况下可进行各种修改。因此，其它实施例在以下权利要求书的范畴内。

Claims (20)

1.一种产生经纯化的EV71病毒抗原的方法，其包含

在培养基中培养产生EV71病毒的细胞，

自该细胞或该培养基纯化EV71病毒，及

使该经纯化的EV71病毒失活以获得该经纯化的EV71病毒抗原。

2.如权利要求1所述的方法，其中该培养基为无血清培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其中该纯化步骤通过液相层析纯化、蔗糖梯度超速离心纯化或两者之组合来进行。

4.如权利要求1所述的方法，其中该失活步骤通过在含有甲醛的溶液中在20-45℃下培育该EV71病毒2至20天来进行。

5.如权利要求4所述的方法，其中该失活步骤通过在该含有甲醛的溶液中在20-40℃下培育该EV71病毒2至10天来进行。

6.如权利要求5所述的方法，其中该失活步骤通过在该含有甲醛的溶液中在约37℃下培育该EV71病毒2至5天来进行。

7.如权利要求1所述的方法，其中该培养步骤是在旋转培养瓶或微载体生物反应器中进行。

8.如权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包含测定该经纯化的EV71病毒抗原的量的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其中该测定该经纯化的EV71病毒抗原的量的步骤是通过定量ELISA进行。

10.如权利要求1所述的方法，其中该EV71病毒抗原为EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或EV71病毒蛋白。

11.一种免疫原性组合物，其包含经纯化的EV71病毒抗原，其中该EV71病毒抗原为

经分离的EV71病毒全粒子、

经分离的EV71病毒次粒子、

经分离的第一EV71病毒多肽，其包括EV71 VP1蛋白的片段，该EV71 VP1蛋白包含选自由SEQ ID NO：5-7、11-14、16、20-24、39-41及44-46组成的群的序列；及

经分离的第二EV71病毒多肽，其包括EV71 VP2或VP3蛋白的片段。

12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含医药学上可接受的佐剂。

13.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中该佐剂含有磷酸铝。

14.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中该第一EV71病毒多肽或该第二EV71病毒多肽为至少15个氨基酸残基长。

15.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中该第二EV71病毒多肽包含选自由SEQ ID NO：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及43组成的群的序列。

16.如权利要求15所述的免疫原性组合物，其中该第二EV71病毒多肽由选自由以下组成的群的序列组成：SEQ ID NO：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及43。

17.如权利要求15所述的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含医药学上可接受的佐剂。

18.如权利要求15所述的免疫原性组合物，其中该佐剂含有磷酸铝。

19.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中该第一EV71病毒多肽由选自由以下组成的群的序列组成：SEQ ID NO：5-7、11-14、16、20-24、39-41及44-46。

20.一种诱导对肠病毒感染之免疫反应的方法，其包含投予有需要的个体有效量的如权利要求11的免疫原性组合物。

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