CN103301462B

CN103301462B - 治疗病毒疾病的成分和方法

Info

Publication number: CN103301462B
Application number: CN201310077649.9A
Authority: CN
Inventors: 艾德铭; 任培君
Original assignee: HAINAN HONZ PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Guangdong Kangda Pharmaceutical Co.,Ltd.; HAINAN HONZ PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-03-11
Also published as: US20150045318A1; JP6116596B2; EP2875829A1; US9872875B2; JP2015510870A; CN103301462A; EP2875829A4; SG11201405559TA; KR20150005526A; IN2014DN08266A; MY169687A; WO2013131496A1

Abstract

本发明涉及治疗病毒疾病的成分和方法。首次揭示了一种P2X受体拮抗剂的新用途，用于制备一种治疗病毒感染疾病的组合物。所述的P2X受体拮抗剂通过抑制病毒发挥预防或治疗手足口病的作用。

Description

治疗病毒疾病的成分和方法

技术领域

本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及治疗病毒疾病的成分和方法。

背景技术

手足口病是西太平洋地区常见的一种病毒性感染疾病，是引起中国和亚洲地区儿童疾病及死亡的一大原因。2011年，西太平洋地区有两百万儿童患手足口病(中国大于一百六十万，日本大于三十四万，越南大于十一万)。在过去二十年中，温带气候国家每两至三年就有一次发生于夏季和初秋的疫情爆发(Solomon，Lewthwaite et al.2010)。而中国大陆地区自2008年后，每年春夏季都有爆发。

手足口病主要感染五岁以下儿童，主要症状包括口腔溃疡，手足和口部疱疹，及口部疼痛灼烧(疱疹性咽峡炎)。大多数病例只有轻度症状并有自限性。然而，依然有大量病例(2010年中国两万七千多例，约1.6%)显示出严重神经系统症状，例如无菌性脑膜炎，脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹及中枢神经系统紊乱以及神经源性肺水肿及心脏功能失常(Huang，Liu et al.1999;Yang，Wang et al.2009;Weng，Chen et al.2010;Rhoades，Tabor-Godwin et al.2011)。2010年和2011年在中国各有905和506例死亡病例。

手足口病由非脊髓灰质炎肠道病毒引起，在2008年安徽省爆发的手足口病疫情中，主要致病病毒为EV71和CVA16(Yan，Gao et al.;Zhang，Wang et al.2010;Zhu，Zhu et al.2010)，其中绝大部分重症和死亡病例均由EV71感染引起。在中国EV71C4亚型是主要流行株，而在亚洲其他地区有EV71C1，C2，C4及B3，B4亚型的流行(Yang，Ren et al.2009)。

手足口病人与人间传播由直接接触感染者口鼻分泌物，疱液和粪便引起(Solomon，Lewthwaite et al.2010)。感染者在发病后一周的传染性最强，但症状好转后仍有持续感染性(Han，Ma et al.2010)。很多感染者(包括多数成年感染者)并无症状，出现口腔疱疹的儿童通过临床和后续病毒学诊断较易诊断。

目前尚无手足口病疫苗及药物。卫生，支持治疗，缓解疼痛，漱口水和静脉注射免疫球蛋白是治疗病患和阻止传播的唯一方法(中国卫生部2010)。虽有疫苗在研发中，但是保护效率仍然未知，且大规模实施接种仍需较长时日。

因此，本领域需要大力研究能够防治手足口病的药物，特别是研究抑制EV71和CVA16病毒感染的药物以从源头上进行防治。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗病毒疾病的成分和方法。

在本发明的第一方面，提供一种P2X受体拮抗剂的用途，用于制备抑制正义单链RNA病毒微小核糖核酸病毒的组合物。

在一个优选例中，所述的P2X受体拮抗剂用于制备预防、缓解或治疗手足口病的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：全身给药或肠胃外给药；较佳地，所述的组合物用于口服、静脉注射、肌肉注射或吸入给药。

在本发明的另一方面，提供一种抑制正义单链RNA病毒微小核糖核酸病毒的方法，包括：给予需要抑制病毒的对象有效量的P2X受体拮抗剂。

在一个优选例中，所述的对象是病毒感染的哺乳动物，包括肠道病毒71型或柯萨奇病毒感染的人，猴子或鼠等，更佳地是手足口病患者。

在另一优选例中，所述的P2X受体拮抗剂选自下组：PPADS，iso-PPADS，PPNDS，Suramin，NF023，TNP-ATP，NF279，NF157，Evans Blue，和/或它们的类似物或衍生物，和/或它们的药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述的病毒是肠道病毒。

在另一优选例中，所述的病毒是肠道病毒A（enterovirus A）。

在另一优选例中，所述的病毒是人肠道病毒71型和柯萨奇病毒。

更佳地，所述的病毒是人肠道病毒71型，C4亚型和柯萨奇病毒A16亚型。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、不同E02浓度下用EV71临床分离株感染RD细胞，MOI为0.1。培养46小时后提取培养上清中的病毒RNA，定量RT-PCR测定EV71相对病毒量。表中2、3、4列数字代表3次重复试验的结果，右图是三次结果的平均值。

图2、在不同E02浓度下用10倍梯度稀释的EV71感染RD细胞，培养3-4天后光学显微镜下观察CPE(细胞病变现象)，并用结晶紫染色，计算半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)。

图3、在不同E02浓度下用EV71感染12孔板中培养的RD细胞，培养5～7天后染色计算空斑形成单位(PFU)。

图4、在不同E02浓度下用10倍梯度稀释的EV71M.A.V.感染RD细胞，培养3至4天后光学显微镜下观察CPE，并用结晶紫染色，计算半数组织培养感染剂量 (TCID₅₀)。

图5、在不同E02浓度下用EV71M.A.V.感染12孔板中培养的RD细胞，培养5～7天后染色，计算空斑形成单位(PFU)。

图6、在不同E02浓度下用10倍梯度稀释的柯萨奇病毒A16感染RD细胞，培养2天后光学显微镜下观察CPE，并用结晶紫染色，计算半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)。

图7、用EV71临床分离株感染三日龄新生ICR小鼠，感染后5天采血分离血清；提取血清中病毒RNA，一步法实时定量RT-PCR检测病毒载量。

图8、CVA16在ICR新生小鼠各器官或组织中的分布。其中，1号和2号表示从分别的2只小鼠获取的血液样品。

图9、用CVA16病毒感染三日龄新生ICR小鼠，感染后6天取组织，采血分离血清，提取组织和血清RNA，测定CVA16病毒RNA，计算病毒载量。

图10、用Celltiter Glo reagent测定不同浓度E02对于RD细胞的细胞毒性。

图11、三日龄ICR小鼠分别腹腔注射50微升剂量为50mg/kg，20mg/kg的E02或者50微升DMEM培养基，连续4天，每日注射，观察毒性的结果。

图12、E02加入时间测试，测试在感染前(B，C)、感染中(D，E)、感染后(F)分别加入E02，E02抑制EV71感染的有效性。

图13、在不同PPADS浓度下用EV71临床分离株感染RD细胞，测定PPADS对EV71复制的抑制作用。

图14、通过RT-PCR方法，测定六种P2X亚型在RD细胞中的mRNA表达情况。

图15、E02抑制EV71分离株SH-TS和SH-RS在RD细胞中复制。

图16、E02降低RD细胞中EV71分离株SH-TS，SH-RS的PFU。

图17、E02抑制EV71分离株SEP-4在Vero细胞中复制。

图18、E02抑制EV71在恒河猴体内的复制。

图19、E02抑制EV71引起的恒河猴体温的升高。

图20、P2X受体拮抗剂抑制RD细胞中EV71复制。

图21、其它一些拮抗剂和激动剂对于EV71的作用。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种P2X受体拮抗剂的新用途，用于制备一种病毒的组合物。所述的P2X受体拮抗剂通过抑制病毒发挥预防或治疗手足口病的作用。

P2X受体拮抗剂及其用途

P2X是一类ATP门控离子通道蛋白家族，表达于细胞膜，一般为同源或异源三聚体，由一个胞外区、两个跨膜区和两个胞内区组成。P2X家族包括七个亚型。经胞外ATP触发，P2X离子通道打开，引发钙离子内流，胞内钙离子聚集，通过MAPK，PKC和钙调蛋白激发系列下游信号转导(Erb，Liao et al.2006)。

本发明人深入研究后发现，一些P2X受体拮抗剂对于抑制病毒是有用的，所述的病毒是正义单链RNA病毒微小核糖核酸病毒科的病毒，包括口蹄疫病毒属（Aphthovirus），禽肝炎病毒属（Avihepatovirus），心病毒属（Cardiovirus），泰勒病毒属（Theilovirus），肠病毒属（Enterovirus），马鼻病毒属（Erbovirus），肝病毒属（Hepatovirus），嵴病毒属（Kobuvirus），Parechovirus等；更佳地，所述的病毒是肠道病毒属，包括肠道病毒A-H类，鼻病毒A-C（Rhinovirus A-C）；更佳地，所述的病毒是肠道病毒A类(Enterovirus A)，包括狒狒肠道病毒（Baboon enterovirus），人柯萨奇病毒A2-8，A10，A12，A14，A16型，人肠道病毒71，76，89，90-92型等；更佳地，包括肠道病毒71型(EV71)(包括A，B和C亚型)，柯萨奇病毒(包括A和B类，优选包括A16亚型；CVA16)。

公知地，肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16亚型感染是手足口病的主要病因。中国卫生部公布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》及多项已发表的研究都指出，EV71和CVA16是主要病原。因此，P2X受体拮抗剂可以用于防治手足口病。

作为本发明的一种选择方式，所述的P2X受体是P2X1-7亚型受体。

作为本发明的另一优选方式，所述的P2X受体拮抗剂选自：PPADS，Iso-PPADS，PPNDS，Suramin，NF023(Suramin衍生物)，TNP-ATP，NF279，NF157，Evans Blue。

作为本发明的更优选方式，所述的P2X受体拮抗剂可以是：Suramin，PPADS，iso-PPADS，PPNDS，NF023，NF279，TNP-ATP，NF157，Evans Blue。

本发明还包括上述所列举的各种化合物的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物、前体、衍生物或类似物，只要所述的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物、衍生物或类似物也具有抑制病毒(如肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16亚型)的功能。

所述的“异构体”包括：构象异构体，光学异构体(如对映异构体和非对映异构体)，几何异构体(如顺反异构体)。

所述的“衍生物或类似物”是指具有上述所列举的P2X受体拮抗剂类似的结构式，特别是具有相同的母核结构的，但一些化合物基团被相近的基团所取代的化合物，该化合物仍然保留有抑制病毒(如肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16亚型)的功能。例如，H被C1-C4烷基取代；C1烷基被C2烷基取代；卤素基团(包括F、Cl、Br、I)之间发生取代；OH、OCH₃、OCH₂CH₃、OCH₂CH₃之间发生取代等。

所述的“药学上可接受的盐”是指上述化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖酸、安息香酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、草酸、丁二酸、酒石酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，铵盐或水溶性的胺盐(如N-甲基葡糖胺盐)、低级的烷醇铵盐以及其它药学上可接受的胺盐(比如甲胺盐、乙胺盐、丙胺盐、二甲基胺盐、三甲基胺盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、叔丁基胺盐、乙二胺盐、羟乙胺盐、二羟乙胺盐、三羟乙胺盐，以及分别由吗啉、哌嗪、赖氨酸形成的胺盐)，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成本发明前面所列举的P2X受体拮抗剂化合物，或P2X受体拮抗剂化合物所组成的盐或溶液。化合物的前体包括但不局限于所述化合物的羧酸酯、碳酸酯、磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、砜酯、亚砜酯、氨基化合物、氨基甲酸盐、偶氮化合物、磷酰胺、葡萄糖苷、醚、乙缩醛等形式。

筛药方法

本发明人的研究发现一类P2X受体拮抗剂能抑制病毒的复制，该抑制作用可能是通过靶向P2X受体发挥的。

在得知了P2X受体拮抗剂通过选择性地结合于P2X受体，发挥抑制病毒的作用后，可以基于该特征来筛选结合于P2X受体的物质。之后，可从所述的物质中找到对于抑制病毒真正有用的药物。

因此，本发明提供筛选防治手足口病的潜在药物的方法，所述方法包括：(1)提供一包含(如表达)P2X受体的体系；(2)将候选物质给予步骤(1)的体系，观察候选物质与P2X受体的结合情况；若候选物质能够与P2X受体结合，则该候选物质是防治手足口病的潜在药物。所述的包含(如表达)P2X受体的体系例如可以是细胞体系，所述的细胞可以是内源性表达P2X受体的细胞；或可以是重组表达P2X受体的细胞。所述的包含P2X受体的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。检测一个化合物是否与受体或受体的部分亚基结合是本领域已知的技术。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到P2X受体与候选物质结合情况的差异，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的包含P2X受体的体系。

所述的候选物质可以包括(但不限于)：小分子化合物，多肽，配体。较佳地，所述的候选物质是小分子化合物。例如，所述的候选物质可以是各种P2X受体拮抗剂。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制病毒真正有用的物质。

另一方面，本发明还包括采用所述筛选方法获得的抑制病毒的物质。

组合物

本发明的化合物可以制备药物组合物，药用载体可以是固体或液体，固体制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂，固体载体可以是一种或多种物质，它们可以作为稀释剂、矫味剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料。在散剂中，载体是微细分的固体，本发明的化合物与微细分的活性组份存在于混合物中。在片剂中，此化合物与所需的粘合载体以适当比例混合，并压制成所需的形状和大小。适宜的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点腊和可可脂等。同样，扁囊剂或锭剂、片剂、散剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可以是适合于口服给药的固体剂型。

溶液形式的制剂包括溶液、悬浮剂和乳剂，例如水或含水丙二醇溶液。对于非肠道注射液体制剂，可以在含水聚乙二醇溶液中制备。适于口服的含水溶液可以通过将活性组份溶解于水中，并按照需要加入适宜的着色剂、矫味剂、乳化剂和增稠剂制备。

所述的组合物可用于全身给药、局部给药或肠胃外给药等。

适于口服的含水混悬剂可以通过将微细分的活性组份分散于含水粘性物质中制备，如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠及其他熟知的混悬剂。

在治疗用途中，用于本发明的化合物以起始剂量每天0.01mg至200mg/kg体重，更佳地0.25mg至100mg/kg体重，更佳地0.5mg至50mg/kg体重。但是，这些剂量可以根据患者的需要、被治疗病症的严重性以及使用的化合物而变化，一般来说，开始以小于该化合物最佳剂量的较小剂量治疗，此后，小量增加此剂量达到最佳效果，方便起见，如果需要可将总日剂量再细分为一天内分次给药。

本发明的药物组合物还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

试剂盒

本发明所述的P2X受体拮抗剂或含有P2X受体拮抗剂的组合物，可以被置于试剂盒中，以便于出售或使用。

所述的P2X受体拮抗剂或含有P2X受体拮抗剂的组合物可以被制成单元剂型的形式，置于试剂盒中。“单元剂型”是指为了服用方便，将本发明的P2X受体拮抗剂或含有P2X受体拮抗剂的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。当制备成单元剂型时，可每天服用所述单元剂型的组合物1-3剂。

所述的试剂盒中还包括：将P2X受体拮抗剂给予需要抑制病毒的对象(如患有病毒疾病的患者，或含有病毒的场所)的给药说明书，以知道人们正确地用药。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。

I.实验材料

1、细胞系

横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)购自ATCC，编号VR-805。细胞培养基为在含有10%(v/v)FBS的DMEM，加入1%(w/v)氨苄青霉素/链霉素溶液。

2、病毒株

EV71临床分离株：EV71FY573，由2008年中国安徽省手足口病例样本中分离得到，基因型为EV71C4，Genbank登录号HM_064456。由中国科学院上海生命科学研究院提供。

EV71临床分离株SH-TS和SH-RS，由中国科学院上海生命科学研究院提供，基因型为C4。

EV71临床分离株SEP-4，由柬埔寨巴斯德研究所(Institut Pasteur of Cambodia)从柬埔寨临床手足口病样本分离所得并提供，基因型为C4。

EV71-FY23株：由中国医学科学院医学生物学研究所病毒免疫室提供，批号：20121001,Genebank登录号EU812515.1。

EV71M.A.V.：EV71小鼠适应株，将EV71FY573在新生小鼠内反复传代获得。

CVA16：柯萨奇病毒A16亚型，shzh05-1(GenBank#EU262658)。

3、化合物

E02购自Sigma-Aldrich，以Suramin Sodium给药。

猴子实验所用suramin由Bayer公司提供，以Suramin自由酸给药。

iso-PPADS(0683-10mg)，NF279(1199-10mg)，PPNDS(1309)购自Tocris。

除非另外说明，其他化合物均购自Sigma-Aldrich和Tocis。

4、RT-PCR引物及探针(5’～3’)：

EV71引物，正向：CCCTGAATGCGGCTAATC(SEQ ID NO:1)；

EV71引物，反向：ATTGTCACCATAAGCAGCCA(SEQ ID NO:2)；

EV71探针：FAM(6-羧基荧光素)-AACCGACTACTTTGGGTGTCC GTGTTTC(SEQ ID NO:3)-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；

GAPDH正向引物：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO:4)；

GAPDH反向引物：GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO:5)；

P2X1-164F：CCTCTTCGAGTATGACACC(SEQ ID NO:6)；

P2X1-164R：CAGAGACACTGCTGATGAG(SEQ ID NO:7)；

P2X2-202F：CTGGACATGCTGGGAAACG(SEQ ID NO:8)；

P2X2-202R：TGCCCTTGGAGAAGTGGAAT(SEQ ID NO:9)；

P2X3-153F：GGCTCGACAGCGTTTCT(SEQ ID NO:10)；

P2X3-153R：TGCCAGCATTCCCGTAT(SEQ ID NO:11)；

P2X4-201F：TGGGATGTGGCGGATTAT(SEQ ID NO:12)；

P2X4-201R：TACGCACCTGCCTGTTGAGA(SEQ ID NO:13)；

P2X5-220F：TCTTTGCCTGGTGCCCGTTG(SEQ ID NO:14)；

P2X5-220R：ATCACGGAGCCCAGTCGGAAG(SEQ ID NO:15)；

P2X6-205F：GGAGGACAAAGTATGAGGAGG(SEQ ID NO:16)；

P2X6-205R：GAATGGGTTGGCAAGTGG(SEQ ID NO:17)；

P2X7-175F：CGTGGAGAAGTGAAGAAG(SEQ ID NO:18)；

P2X7-175R：TCGGTCAGAGGAACAGAGC(SEQ ID NO:19)。

5、试剂及试剂盒

DMEM：Invitrogen cat#11965118；

FBS：Invitrogen cat#10099141；

TRYPSIN0.25%EDTA：Invitrogen cat#525200072；

病毒RNA提取试剂盒：QIAamp Viral RNA Mini Kit，QIAGEN cat#52906；

细胞总RNA提取试剂盒：RNeasy Mini Kit(250)，QIAGEN cat#74106；

组织保存液：RNAstore样本保存液，天根生化科技(北京)有限公司，DP408-02；

组织RNA提取试剂盒：RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，DP43；

Taqman real time RT-PCR reagent：ABIOne-Step RT-PCR，ABI cat#4309169；

SYBR real time RT-PCR reagent：QIAGEN QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit(200)，Cat#204243；

一步法RT-PCR试剂：QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(100)；Cat#201212；

DNA电泳琼脂糖：Biowest Argarose，Cat#BW-R0100；

DNA marker；DL2,000DNA Marker，Cat#D501；

Crystal violet：Santa Cruz cat#sc-207460；

Seaplaque Agarose：lonza/amaxa450101；

CellTiter Glo：Promega G7572；

PENICILLIN STREPTOMYCIN：Invitrogen Cat#15140122

6、缩写及简称

CPE：cytopathic effect，细胞病变作用；

CT：cycle threshold，循环阈值；

EC50：50%effective concentration，半数有效剂量；

EV71：Enterovirus71，肠道病毒71型；

Evans Blue：6,6-[(3,3‘-Dimethyl[1,1‘-biphenyl]-4,4‘-diyl)bis(azo)bis[4-amino-5-hydroxy-1,3-naphthalenedisulphonic acid]tetrasodium salt；

HFMD：Hand Foot and Mouth Disease，手足口病；

iso-PPADS：pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2’，5’-disulphonic acid；

M.A.V.：Mouse Adapted Virus，小鼠适应病毒；

MAPK：Mitogen-activated protein kinases，促分裂素原活化蛋白激酶；

MOI：Multiplicity of infection，感染复数；

NF023：8,8‘-[carbonylbis(imino-3,1-phenylenecarbonylimino)]bis-1,3,5-naphthalene-trisulphonic acid，hexasodium salt；

NF157：8,8‘-[Carbonylbis[imino-3,1-phenylenecarbonylimino(4-fluoro-3,1-phenylene)carbonylimino]]；

NF279：8,8‘-(carbonylbis(imino-4，1-phenylenecarbonylimino-4,1-phenylenecarbonylimino))bis(1,3,5-naphthalenetrisul fonic acid)

PFU：plaque forming unit

PKC：Protease kinase C，蛋白激酶C；

PPADS：pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2’，4’-disulphonic acid；哆磷酸盐-6–苯偶氮-2’，4’-二磺酸；

PPNDS:Pyridoxal-5′-phosphate-6-(2′-naphthylazo-6′-nitro-4′,8′-disulfonate)tetrasodium salt，哆-5’-磷酸-6-(2’-naphthylazo-6’-硝基-4’，8’-磺酸钠)四钠盐；

RD cell：Rhabdomyosarcoma cell，横纹肌肉瘤细胞；

T.O.A.：Time of Addition assay，加入时间实验；

TCID₅₀：50%Tissue Culture Infective dose，半数组织培养感染剂量

TNP-ATP：trinitrophenol-ATP，苦味酸-ATP；

UTP：uridine triphosphate，尿苷三磷酸；

7、化合物结构式及CAS号

化合物结构式 CAS注册号或化学式

II.实施例

EV71和CVA16是导致手足口病的主要病原，本发明人在以下实施例中测定了E02(Suramin Sodium)或其类似物抑制EV71和CVA16体外感染及体内感染的能力。

实施例1、E02抑制病毒EV71临床分离株（EV71FY573）感染RD细胞(体外试验)

1、E02能够抑制EV71在RD细胞中的复制

在不同E02浓度下用EV71临床分离株（EV71 FY 573）感染RD细胞，MOI(multiplicity of infection感染复数)为0.1。培养46小时后提取培养上清中的病毒RNA，定量RT-PCR测定EV71相对病毒量。详细步骤如下：

①细胞接种：感染前24小时，接种RD细胞于96孔细胞培养板，每孔5×10⁴个细胞；

②感染：

a.药物预孵育病毒：用DMEM稀释病毒储存液至5×10⁴TCID₅₀/ml，每孔100微升分装至96孔板，并加入11微升相应浓度溶解于DMEM的E02或者DMEM培养基，37℃孵育1小时；

b.药物预孵育细胞：弃去96孔板中的细胞培养液，每孔加入100微升DMEM，再加入11微升相应浓度的E02溶液或者DMEM培养基，37℃孵育1小时；

c.孵育1小时后，弃去细胞培养板中的药物，将111微升药物预孵育的病毒转移至细胞培养板，37℃孵育1小时；

d.孵育后，弃去上清，50微升DMEM洗细胞两次，每孔加入180微升含2%FBS的DMEM培养基，20微升相应浓度的E02DMEM溶液或者DMEM培养基，将细胞培养板置于37℃，5%(v/v)二氧化碳的培养箱培养；

③病毒收获和RNA提取：被感染的细胞培养46小时后，转移140微升上清至96孔深孔板，用病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit，cat#52906)提取病毒RNA，按照试剂盒标准操作程序进行；

④病毒载量测定：用ABI Taqman一步法RT-PCR试剂盒(ABIOne-Step RT-PCR，cat#4309169)在ABI7900HT384孔板PCR系统检测EV715’UTR基因。反应体系和PCR程序见表1和表2。EV715’UTR定量RT-PCR热循环程序(Taqman)；

⑤将PCR的CT值用PCR标准曲线转化为病毒载量(标准曲线由已知滴度的病毒十倍梯度稀释，抽提RNA，RT-PCR测定CT值得到)。

表1、EV715’UTR实时定量RT-PCR反应体系(Taqman)

表2、EV715’UTR定量RT-PCR热循环程序(Taqman)

结果显示，E02能够抑制EV71在RD细胞中的复制，EC50(50%有效浓度)为6.93微摩，3.44微摩可降低EV71复制10倍；5.19微摩降低EV71复制100倍；6.45微摩降低1000倍；7.63微摩降低10000倍，详见图1。

2、E02显著降低RD细胞中EV71TCID₅₀

在不同E02浓度下用10倍梯度稀释的EV71（临床分离株EV71 FY 573）感染RD细胞，培养3-4天后光学显微镜下观察CPE(细胞病变现象)，并用结晶紫染色，计算半数组织培养感染剂量。详细步骤如下：

②感染：

a.药物预孵育病毒：用DMEM培养基10倍梯度稀释病毒储存液，每孔100微升分装至96孔板，并加入11微升相应浓度溶解于DMEM的E02，37℃孵育1小时；

b.药物预孵育细胞：弃去96孔板中的细胞培养液，每孔加入100微升DMEM，再加入11微升相应浓度的E02溶液，37℃孵育1小时；

d.孵育后，弃去病毒药物混合液，50微升DMEM洗细胞两次，每孔加入180微升含2%FBS的DMEM培养基，20微升相应浓度的E02DMEM溶液，将细胞培养板置于37℃，5%二氧化碳的培养箱培养；

③培养3至4天后，光学显微镜下观察CPE，并用结晶紫染色，用Reed-Muench算法计算半数组织培养感染剂量TCID₅₀；

结果显示，E02能够抑制RD细胞中EV71病毒感染导致的CPE，E02降低RD细胞中EV71 TCID₅₀的半数有效剂量为4.7微摩，见图2。因此，E02显著降低RD细胞中EV71 TCID₅₀。

3、E02降低RD细胞中EV71空斑形成单位

在不同E02浓度下用EV71（临床分离株EV71 FY 573）感染12孔板中培养的RD细胞，培养5～7天后染色计算空斑形成单位。详细步骤如下：

①细胞接种：感染前24小时，接种RD细胞于12孔板，每孔2×10⁵个细胞；

②感染细胞：

a.药物预孵育病毒：用DMEM培养基10倍梯度稀释病毒储存液至50000PFU/ml，5000PFU/ml和500PFU/ml，每孔500微升分装至12孔板，并加入56微升相应浓度溶解于DMEM的E02，37℃孵育1小时；

b.药物预孵育细胞：弃去12孔板中的细胞培养液，每孔加入500微升DMEM，再加入56微升相应浓度的E02溶液，37℃孵育1小时；

c.孵育1小时后，弃去细胞培养板中的药物，将556微升药物预孵育的病毒转移至细胞培养板，37℃孵育1小时；

d.孵育后，弃去病毒药物混合液，300微升DMEM洗细胞两次，每孔加入150微升相应浓度的E02DMEM溶液，再加入1350微升预热熔解(冷却至37～40℃)的含有1%低熔点琼脂糖seaplaque，2%FBS的DMEM培养基。将细胞培养板置于37℃，5%二氧化碳的培养箱培养；

③培养5-7天后，移去凝胶，用结晶紫染色，PBS冲洗一次，计空斑数并计算空斑形成单位。

结果显示，E02能够抑制EV71在RD细胞中形成的空斑数量。E02降低RD细胞中EV71PFU的半数有效剂量为2.6微摩，见图3。因此，E02可以降低RD细胞中EV71空斑形成单位。

综上，通过实时定量RT-PCR，TCID₅₀和PFU三种测试方法，结果均表明E02能够抑制EV71临床分离株感染RD细胞：抑制EV71在RD细胞中复制的EC50为6.93微摩；降低RD细胞中TCID₅₀的EC50为4.7微摩；降低PFU的EC50为2.6微摩。

实施例2、E02抑制肠道病毒EV71鼠适应株感染RD细胞(体外试验)

1、E02降低RD细胞中EV71M.A.V.TCID₅₀

在不同E02浓度下用10倍梯度稀释的EV71M.A.V.感染RD细胞，培养3至4天后光学显微镜下观察CPE，并用结晶紫染色，计算半数组织培养感染剂量。具体步骤同实施例1中相应的TCID₅₀测试步骤。

结果显示，E02降低RD细胞中EV71M.A.V.TCID₅₀的半数有效剂量为8.07微摩，见图4。因此，E02降低RD细胞中EV71M.A.V.TCID₅₀。

2、E02降低RD细胞中EV71M.A.V.PFU

在不同E02浓度下用EV71M.A.V.感染12孔板中培养的RD细胞，培养5～7天后染色，计算空斑形成单位。详细步骤同实施例1中相应的PFU测试方法。

E02降低RD细胞中EV71M.A.V.PFU的半数有效剂量为2.0微摩，见图5。因此，E02降低RD细胞中EV71M.A.V.PFU。

综上，TCID50和PFU测试表明，E02能够抑制小鼠适应EV71病毒株感染RD细胞，EC50分别为8.07微摩和2.0微摩。

实施例3、E02抑制柯萨奇病毒A16(CVA16)感染RD细胞(体外试验)

在不同E02浓度下用10倍梯度稀释的柯萨奇病毒A16感染RD细胞，培养2天后光学显微镜下观察CPE，并用结晶紫染色，计算半数组织培养感染剂量。具体步骤同实施例1中TCID₅₀测试方法。

结果显示，25微摩E02使RD细胞中CVA16滴度由的1×10⁹TCID₅₀/ml降至1×10⁴TCID₅₀/ml，见图6。因此，E02降低RD细胞中CVA16TCID₅₀.

以上实施例1-3的测定结果表明，E02能够在体外抑制EV71和CVA16感染RD细胞。E02抑制EV71临床分离株的EC50小于6.93微摩，10微摩E02能够完全抑制E02临床株和鼠适应株感染RD细胞，并使CVA16在RD细胞中的TCID₅₀降低。

实施例4、E02抑制肠道病毒EV71感染ICR新生小鼠

用EV71临床分离株（EV71 FY 573）感染三日龄新生ICR小鼠，测试小鼠体内E02抑制EV71的能力。实验小鼠分为三组：药物组、感染组、安慰组。小鼠二日龄时，药物组腹腔注射50微升50mg/kg剂量E02，感染组和安慰组腹腔注射50微升DMEM培养基；三日龄时药物组腹腔注射50mg/kg剂量E02和5×10⁷TCID₅₀剂量的EV71临床分离株病毒混合物(50微升)，感染组注射5×10⁷TCID₅₀病毒(25微升)和25微升DMEM混合物，安慰组腹腔注射50微升DMEM培养基。

感染后5天采血分离血清。提取血清中病毒RNA(病毒RNA提取试剂盒，QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit，cat#52906)；用一步法实时定量RT-PCR试剂盒(QIAGEN QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit)在ABI7900HT384孔板PCR系统检测EV715’UTR基因及GAPDH基因拷贝，反应体系和PCR程序见表3和表4。

表3、EV715’UTR和GAPDH基因实时定量RT-PCR反应体系(SYBR)

表4、EV715’UTR和GAPDH基因实时定量RT-PCR热循环程序(SYBR)

计算EV71和GAPDH RNA载量比值，感染组平均值为15.0，药物组平均值为1.8，见图7。结果表明，E02降低小鼠血清中EV71病毒量，50mg/kg的E02能够降低感染EV71的ICR新生小鼠血清中的病毒量。

实施例5、E02抑制柯萨奇病毒A16感染ICR新生小鼠

1、CVA16在小鼠体内的组织分布

注射5×10⁶TCID₅₀CVA16病毒(50微升)感染三日龄ICR新生小鼠两只，感染后5天采集血清及组织(脑，骨髓，心脏，小肠，肾，肝脏，肺，肌肉，脾，胸腺)。提取血清中病毒RNA(病毒RNA提取试剂盒，QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit，cat#52906)。组织置于RNAstore样本保存液(天根，DP408-02)保存在-80℃冰箱，用组织RNA提取试剂盒(RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒)提取组织总RNA。用一步法实时定量RT-PCR试剂盒(QIAGEN QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit)在ABI7900HT384孔板PCR系统检测CVA16病毒基因组及GAPDH基因拷贝，引物同EV715’UTR引物，反应体系和PCR程序见表3和表4。各组织及血清中相对病毒量见图8。可见，CVA16病毒主要检出于脑，脊髓，肌肉和血清中。

2、E02抑制CVA16感染新生ICR小鼠

用CVA16病毒感染三日龄新生ICR小鼠，测试小鼠体内E02抑制EV71的能力。实验小鼠分为三组：药物组，感染组和安慰组。小鼠二日龄时，药物组腹腔注射50微升50mg/kg剂量E02，感染组和安慰组腹腔注射50微升DMEM培养基；三日龄时药物组腹腔注射50mg/kg剂量E02和1×10⁴TCID₅₀剂量的CVA16病毒(50微升)，感染组注射1×10⁴TCID₅₀剂量的CVA16病毒(25微升)和25微升DMEM混合物，安慰组腹腔注射50微升DMEM培养基。感染后6天取组织，采血分离血清，提取组织和血清RNA，测定CVA16病毒RNA，处理步骤同前述“1”。

结果见图9。结果显示，50mg/kg E02使ICR新生小鼠的脑，骨髓，肌肉和血清中的CVA16病毒RNA均有显著下降。

综上实施例4-5，新生ICR小鼠中的测试表明，50mg/kg E02可在体内抑制肠道病毒EV71和柯萨奇病毒A16。

实施例6、E02安全性、耐受性及毒性测试

1、E02无体外细胞毒性

用Celltitr Glo reagent测定不同浓度E02对于RD细胞的细胞毒性，如下：

(1)细胞接种：测试前24小时，每孔5×10⁴个细胞接种RD细胞于96孔细胞培养板；

(2)E02培养细胞：弃去细胞培养板内的培养基，加入180微升含2%FBS的DMEM培养基，再加入20微升相应浓度的E02 DMEM溶液，置37℃，5%CO₂培养箱培养；

(3)培养46小时后，用PROMEGA Celltitr Glo reagent测定细胞ATP水平，按照试剂说明书测定。

测定结果显示：1×10^-6至1×10⁴微摩的E02对RD细胞均无细胞毒性，见图10。

2、E02对ICR新生小鼠无毒性

三日龄ICR小鼠分别腹腔注射50微升剂量为50mg/kg，20mg/kg的E02或者50微升DMEM培养基，连续4天，每日注射，观察未见毒性，见图11。

实施例7、E02抑制肠道病毒EV71临床分离株SH-TS和SH-RS感染RD细胞

1、E02抑制EV71SH-TS和SH-RS在RD细胞中复制

在不同E02浓度下用EV71SH-TS或SH-RS毒株感染RD细胞，MOI0.1。培养46小时后提取培养上清中的病毒RNA，定量RT-PCR测定EV71相对病毒量。定量RT-PCR具体步骤参见实施例1。

结果显示，E02能够抑制EV71临床分离株SH-TS和SH-RS在RD细胞中的复制，对于SH-TS，7.14微摩可使EV71复制降低10倍，25.35微摩可使EV71复制降低100倍；对于SH-RS，4.41微摩可使EV71复制降低10倍；16.29微摩可使EV71复制降低1000倍，如图15。

因此，E02抑制EV71SH-TS和SH-RS在RD细胞中复制。

2、E02抑制EV71SH-TS和SH-RS感染RD细胞(空斑形成单位，PFU)

在不同E02浓度下用EV71SH-TS或者SH-RS毒株感染12孔板中培养的RD细胞，培养5～7天后染色计算空斑形成单位。详细步骤同实施例1中“3、E02降低RD细胞中EV71空斑形成单位”。

结果，E02降低RD细胞中EV71SH-TS PFU的半数有效剂量为2.24微摩，对于SH-RS为3.47微摩，如图16。

病毒复制和PFU测试表明E02能够抑制EV71临床分离株SH-TS和SH-RS感染RD细胞。

实施例8、E02抑制肠道病毒EV71柬埔寨分离株SEP-4感染Vero细胞

在不同E02浓度下用EV71SEP-4病毒株(由Institut Pasteur of Cambodia提供，Cambodia毒株)感染Vero细胞，MOI0.1。培养46小时后提取培养上清中的病毒RNA，定量RT-PCR测定EV71相对病毒量。具体步骤参见实施例1。

结果显示，E02能够抑制EV71SEP-4株在Vero细胞中的复制，5.89微摩E02可使EV71复制降低10倍，15.49微摩使EV71复制降低100倍，如图17。

实施例9、E02抑制肠道病毒EV71在恒河猴体内的复制

将已检测EV71抗体阴性的10只成年恒河猴随机分为2组(恒河猴(Macaca)，来源：中国医学科学院医学生物学研究所，实验动物使用许可证号：SYXK(滇)2010-0009，发证单位：云南省科学技术厅)，即：5只对照组(年龄约4岁，体重约5.3kg，注射生理盐水)，5只给药组(年龄约4.6岁，体重约5.44kg，注射50mg/kg suramin)。采用静脉多次注射suramin(50mg/kg)，并于首次注射suramin的1天后感染4.5lgCCID₅₀EV71FY-23病毒(EV71-FY23株(由中国医学科学院医学生物学研究所病毒免疫室提供)，批号：20121001，含量：7.5lgCCID50/ml，保存条件：-80℃)，逐日检测病毒在感染成年恒河猴(>3岁)体内的病毒载量，观察感染动物的临床症状、体温，从而分析该药对EV71感染的治疗预防作用。具体的实验操作流程如下：

1)感染前一天：采集本底全血及血清，测量体温，观察动物的外观体征、行为活动、精神状态、给药局部是否异常等。并按剂量静脉给药(50mg/kg suramin或生理盐水)。

2)感染当天(0天)：测量体温，观察动物的外观体征、行为活动、精神状态、给药局部是否异常等。并按4.5lgCCID50EV71FY-23进行静脉攻毒。

3)感染期间(1-14天)：每日测量体温，观察动物的外观体征、行为活动、精神状态、给药局部是否异常等，检测病毒载量。并于感染后1、3、5天，按剂量静脉给药(50mg/kg suramin或生理盐水)。

4)感染后期(21和28天)测量体温，观察动物的外观体征、行为活动、精神状态、给药局部是否异常等，检测病毒载量。

血液病毒载量检测

提取全血RNA：取0.2ml，加入0.8mlTRNzol-A⁺，充分混匀后在室温放置10min；加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15sec，室温放置5min，于12500rpm，4℃离心20min，取水相0.4ml于另一新管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置30分钟；12500rpm，4℃离心20min，弃上清，加入1ml75%乙醇洗涤沉淀，12500rpm，4℃离心30min.弃上清，室温放置30min，干燥RNA，加入20μl RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。检测病毒载量，测定方法如下：

1)标准品稀释：标准品提取（按TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA extraction Kit Ver.3.0说明操作），取10μl提取好的标准品，10倍系列稀释为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、 10⁰

2)引物序列（Taqman探针法）：

上游引物（10μM）：5’-agcccaaaagaacttcacta-3’；

下游引物（10μM）：5’-atccagtcgatggctgctca-3’；

探针5-FAM-agtgatatcctgcagacgggcaccatcc-TAMRA-3。

3)配制RT-PCR反应液（反应液配制在冰上进行）：

2x One Step RT-PCR BufferⅢ：10μl

TaKaRa Ex TaqTM HS（5U/μl）：0.4μl

PrimescriptTM RT Enzyme MixⅡ：0.4μl

上游引物（10μM）：0.4μl

下游引物（10μM）：0.4μl

探针：0.8μl

ROX Reference Dye Ⅱ：0.4μl

Total RNA：2μl

RNase Free dH₂O：5.2μl

总量：20μl

4)进行Real Time One Step RT–PCR反应。

1、病毒载量检测

10只实验动物经4.5lgCCID₅₀的EV71 FY23株攻击后，对照组动物在攻毒后第6和7天出现一过性的病毒载量升高(达1-1.5×10³拷贝/ml)，在第8天后开始下降，在攻毒后第9天出现一过性的病毒载量升高(达5.25×10²拷贝/ml)，第10天开始下降。给药组动物分别在攻毒后第4天、第7天和第13天出现了病毒载量的小幅升高(平均1.5×10¹拷贝/ml)，病毒载量明显低于对照组，如图18。

2、体温检测

对照组动物体温在感染后1天就出现一定的上升，并随之(约于感染后3天)降低至正常范围内；给药组动物体温基本均在正常范围内，如图19。

结论：在本实验条件下，静脉途径感染4.5lgCCID₅₀EV71病毒后，对照组成年恒河猴体内病毒载量在特定时间内出现一定的升高，并且体温也出现小幅上升。与之相比，在该特定时间内给药组成年恒河猴出现病毒载量的小幅升高，病毒载量明显低于对照组，体温检测未出现显著变化。

实施例10、E02作用靶点鉴定

1、E02抑制EV71进入细胞

用MOI10的EV71临床分离株EV71FY573感染96孔板中的RD细胞，在感染前，感染中和感染后三个阶段分别加入32微摩E02(溶解于DMEM)或者DMEM培养基，测定EV71复制，确定E02抑制EV71感染的作用阶段。详细步骤如下：

(1)细胞接种：感染前24小时，接种RD细胞于96孔细胞培养板，每孔5×10⁴个细胞；

(2)药物预孵育细胞：弃去96孔板中的细胞培养液，每孔加入100微升DMEM，再加入11微升320微摩E02溶液(药物处理细胞组)或者11微升DMEM培养基(细胞未经药物处理组)，37℃孵育1小时；

(3)药物预孵育病毒：用DMEM稀释病毒储存液至5×10⁶TCID₅₀/ml，每孔100微升分装至96孔板，并加入11微升320微摩E02溶液(B，C组)或者11微升DMEM培养基(A，F组)，37℃孵育1小时；

(4)感染：药物孵育细胞和病毒1小时后，弃去细胞培养板中的药物，将111微升药物(B，C组)或DMEM(A，F组)预孵育的病毒转移至细胞培养板，D,E组移入100微升病毒溶液后补加11微升320微摩E02，37℃孵育1小时；

(5)病毒感染细胞1小时后，弃去细胞培养板中病毒药物混合液，50微升DMEM洗细胞两次，每孔加入180微升含2%FBS的DMEM培养基，20微升320微摩E02溶液(B，E，F组)或20微升DMEM培养基(A，C，D组)，将细胞培养板置于37℃，5%二氧化碳的培养箱培养。

(6)病毒收获和RNA提取：被感染的细胞培养18小时后，转移140微升上清至96孔深孔板，用病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit，cat#52906)提取病毒RNA，按照试剂盒标准操作程序进行。

(7)病毒载量测定：用ABI Taqman一步法RT-PCR试剂盒(ABIOne-Step RT-PCR，Cat#4309169)在ABI7900HT384孔板PCR系统检测EV715’UTR基因。反应体系和PCR程序见表1和表2。

(8)用PCR标准曲线将PCR的CT值转化为病毒载量(标准曲线由已知滴度的病毒梯度稀释，抽提RNA，RT-PCR测定CT值得到)。

高MOI病毒感染细胞，可使大部分细胞同步感染，18小时的培养时间保证病毒只有一次扩增，该感染条件可测试药物抑制病毒作用发生在病毒生活周期的哪个阶段(Bonavia，Franti et al.2011;Daelemans，Pauwels et al.2011)。如图12，E02加入时间测试的结果表明在感染前(B，C)和感染中(D，E)加入E02均可抑制EV71感染，而感染后加入E02(F)，不能抑制EV71感染。若感染过程中已加入药物，则感染后是否再加入药物(D与E)对病毒复制并无显著影响。该结果显示，E02通过抑制EV71病毒进入细胞而抑制EV71病毒感染。

2、P2X受体拮抗剂能够抑制EV71感染

E02是感知受体P2X的拮抗剂，能够抑制P2X1，2，3和5亚型(Khakh，Burnstock et al.2001;Burnstock2004;Coddou，Yan et al.2011)受体，即是P2X1，2，3和5亚型受体的拮抗剂。P2X是一类ATP门控离子通道蛋白家族，表达于细胞膜，一般为同源或异源三聚体，由一个胞外区、两个跨膜区和两个胞内区组成。P2X家族包括七个亚型。经胞外ATP触发，P2X离子通道打开，引发钙离子内流，胞内钙离子聚集，通过MAPK，PKC和钙调蛋白激发系列下游信号转导(Erb，Liao et al.2006)。P2X受体在高等动物组织中广泛分布(Valera，Hussy et al.1994)，表达于CNS各部分，在神经元突触触发，感知信号(如疼痛，味觉，听觉等)传入，平滑肌收缩，心血管系统血压控制和炎症反应中都发挥作用(Surprenant and North2009)。

EV71感染中枢神经系统会导致急性弛缓性麻痹，急性传播性脊髓炎和急性横贯性脊髓炎，还可引起无菌性脑膜炎和脑炎，肠病毒感染还可能引起潜在行为和记忆障碍(Yang，Wang et al.2009;Rhoades，Tabor-Godwin et al.2011)。EV71主要通过诱发病毒感染患者CNS炎症，而导致神经紊乱。EV71感染可在大脑皮层，脑干和脊髓各个层次引起炎症。EV71感染病人常死于肺水肿或者出血，有研究表明EV71肺水肿是神经性的(Solomon，Lewthwaite et al.2010)。在死于肺部综合征的EV71感染病人中，只有脊髓和大脑检测到炎症，而在肺部和心脏检测不到病毒颗粒和炎症。(Weng，Chen et al.2010)。联系EV71感染引发的疾病的特点，以及P2X的分布和生理作用，本发明人认为P2X在EV71病理中发挥重要作用。

因此，本实施例中，本发明人用化学探针(已知的P2X抑制剂或激活剂)来确定P2X受体在EV71感染中的作用。

1、PPADS抑制EV71感染RD细胞

PPADS是E02的类似物(Khakh，Burnstock et al.2001;Burnstock2004;Coddou，Yan et al.2011)，对P2X各亚型的抑制作用与E02一致。在不同PPADS浓度下用EV71临床分离株FY573感染RD细胞，测定PPADS对EV71复制的抑制作用。详细过程同实施例1中“1”。并测定各浓度PPADS对RD细胞的细胞毒性，详细步骤同实施例6中“1”。

结果见图13，64微摩以下浓度PPADS对RD细胞无细胞毒性，抑制EV71复制的EC50为18.9微摩。

2、P2X受体在RD细胞中的表达

提取RD细胞中总RNA，一步法RT-PCR扩增P2X各亚型mRNA，凝胶电泳鉴定PCR产物长度。具体步骤如下：

①.细胞总RNA提取：取2×10⁶个RD细胞，用QIAGEN RNeasy试剂盒提取总RNA，实验按照试剂盒说明书进行，产物溶于50微升无核酸酶水；

②.PCR：一步法RT-PCR扩增各P2X亚型和GAPDH mRNA，反应体系和循环程序如表5和表6。

③.电泳：2%凝胶电泳检测PCR产物大小。

表5、P2X mRNA RT-PCR反应体系

表6、P2X mRNA RT-PCR热循环程序

电泳结果显示，除P2X7外，其它六种P2X亚型在RD细胞中均有表达，结果见图14。

3、P2X受体拮抗剂抑制EV71感染RD细胞

测定0.1，1，10和100微摩各P2X受体拮抗剂及激动剂对EV71复制的抑制作用，具体步骤参考实施例1中“1”，但感染后细胞需孵育3～4天，光学显微镜观察并用结晶紫染色，确定有无CPE(细胞病变现象)。并测定各浓度化合物对RD细胞的细胞毒性，在不同浓度化合物中培养RD细胞后3～4天，光学显微镜观察并用结晶紫染色，观察细胞层有无破坏。能保护细胞免于感染，无CPE且不破坏健康细胞层的化合物，能够抑制RD细胞中EV71的复制。

结果见表7及图20，除E02，PPADS外，P2X受体拮抗剂iso-PPADS，NF023，NF279，NF157，TNP-ATP，PPNDS，Evans Blue也能够抑制EV71复制。

表7、P2X受体拮抗剂抑制RD细胞中EV71复制

对比这些化合物对P2X和EV71感染的抑制作用，如表8，表明P2X受体在EV71感染RD细胞中发挥重要作用。

表8、P2X受体与EV71复制

注：激动剂：-：无活性，+：激活浓度>10μM，++：激活浓度1～10μM，+++：激活浓度<1μM；

拮抗剂：-：无活性，+：拮抗浓度>300nM，++：拮抗浓度＝10～300nM，+++：拮抗浓度<10nM。

其它一些拮抗剂和激动剂对于EV71的作用如表9和图21。

表9、其它一些拮抗剂和激动剂对于EV71的作用

表中，“空白”表示无报道数据，“NO”表示没有。

对于Antagonists：√√√激活浓度<10nM；√√激活浓度10nM-300nM，√激活浓度>300nM，无活性。

对于Agonists：√√√激活浓度<1μM，√√激活浓度1-10μM，√激活浓度>10μM。

因此，P2X1～6亚型在RD细胞中均有mRNA表达，且多个P2X受体拮抗剂可抑制EV71感染RD细胞复制，结合P2X信号转导和P2X异常与疾病的关系，提示P2X在EV71感染中发挥重要作用，且P2X与EV71的作用与EV71感染引起的手足口病的病理有密切关系。

综上实施例，可以得出如下结论：

(1)P2X受体拮抗剂化合物E02能够抑制EV71病毒感染RD细胞；

(2)化合物E02能够降低柯萨奇病毒A16感染RD细胞的感染力；

(3)化合物E02能够在ICR新生小鼠体内，降低血清中EV71病毒量；

(4)化合物E02能够在ICR新生小鼠体内，降低脑，骨髓，肌肉和血清中CVA16病毒量；

(5)E02抑制EV71在恒河猴体内的复制以及抑制EV71引起的恒河猴体温的升高。

(6)RD细胞中可检测到P2X受体1～6六种亚型的mRNA；

(7)多个P2X受体拮抗剂能够抑制EV71感染RD细胞。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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中国卫生部(2010)手足口病诊疗指南(2010年版)。

Claims

1.一种P2X受体拮抗剂的用途，用于制备抑制正义单链RNA病毒微小核糖核酸病毒的组合物；

所述的P2X受体拮抗剂选自下组：PPADS，iso-PPADS，PPNDS，Suramin，NF023，TNP-ATP，NF279，NF157，Evans Blue和/或它们的药学上可接受的盐；

所述的正义单链RNA病毒微小核糖核酸病毒是肠道病毒。

2.一种P2X受体拮抗剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗手足口病的组合物；所述的P2X受体拮抗剂选自下组：PPADS，iso-PPADS，PPNDS，Suramin，NF023，TNP-ATP，NF279，NF157，Evans Blue，和/或它们的药学上可接受的盐。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于：全身给药或肠胃外给药。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于口服、静脉注射、肌肉注射或吸入给药。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肠道病毒是导致手足口病的肠道病毒。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肠道病毒是肠道病毒A。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肠道病毒是人肠道病毒71型和柯萨奇病毒。