CN110064044B - 一种肠道病毒71型的抑制剂及应用 - Google Patents
一种肠道病毒71型的抑制剂及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体公开了一种肠道病毒71型的抑制剂及应用,所述的抑制剂为多肽P2,P2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示;本发明还公开了多肽P2的改造体,所述的改造体为3A‑TAT‑EP、3A‑EP‑DRI或3A‑EP‑PEG4‑PA,3A‑TAT‑EP的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示、3A‑EP‑DRI的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示、3A‑EP‑PEG4‑PA的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。P2系列多肽有高效的抗病毒活性。这将为人类肠道病毒71型的防控提供了一种新的策略,同时也为加快抗人肠道病毒71型的多肽小分子药物的研发提供了新的理论依据。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种肠道病毒71型的抑制剂及应用。
背景技术
人肠道病毒71型(EV71)是引发手足口病的主要病原体之一,EV71感染能够导致严重的神经系统并发症如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹和神经源性肺水肿等,具有较高的病死率和致残率。目前针对EV71的药物还处于实验研究阶段,这些药物一般是一或多个多肽或小分子化合物。该类多肽或化合物可以干扰或阻断EV71进入宿主细胞的某一步骤,例如膜融合步骤。或者抑制逆EV71的复制酶,蛋白酶,膜定位酶,从而达到抗EV71的效果。本发明涉及的高分子及其衍生物能够抑制病毒逃逸天然免疫的能力,是一种新兴的EV71治疗药物,其针对新的靶点,对抗耐药等具有重要意义。
RNA干扰是一种抗病毒免疫机制。在RNA干扰抗病毒过程中,病毒RNA复制产生的双链RNA被宿主Dicer蛋白识别并切割成小干扰RNA。这些病毒衍生的小干扰RNA被转移并组装成RNA诱导沉默复合体,介导同源病毒RNA的降解,从而达到抗病毒的目的。EV71的非结构蛋白3A能够与病毒双链RNA结合来阻止Dicer对其剪切,抑制病毒来源小干扰RNA的产生,从而达到逃逸RNA干扰抗病毒免疫的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种肠道病毒71型的抑制剂,所述的抑制剂为多肽P2、3A-TAT-EP、3A-EP-DRI或3A-EP-PEG4-PA,所述的P2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示、3A-TAT-EP的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示、3A-EP-DRI的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示、3A-EP-PEG4-PA的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
本发明的另一个目的在于提供了一种肠道病毒71型的抑制剂的应用。
为了达到上述目的,本发明采取以下技术措施:
本发明的发明思路如下:
EV71 3A蛋白含有86个氨基酸残基。3A具有二聚化的能力,其二聚化对3A正确行使功能起到关键作用。申请人依据3A二聚化结构域两个螺旋结构组成和序列特点,设计了一段EP多肽序列(SEQ ID NO.1所示),该序列可以与EV71非结构蛋白3A结合,干扰3A蛋白二聚体的形成过程,从而抑制病毒的复制及感染。
根据上述思路,申请人为了能让该抑制剂能穿透细胞膜进入到细胞从而起到抑制病毒的作用,申请人以EP多肽为核心序列,设计了多肽P2(SEQ ID NO.2所示),其能够与α1竞争性相互作用,从而阻止3A二聚化,起到抑制3A抗天然免疫能力的作用,最终达到抗病毒的目的。
申请人还在P2的基础上,对其结构进行改造,构建了一系列的改造体,经试验证实,经改造后的P2,实验证实,提高了抑制病毒的能力,对人肠道病毒的防控和治疗方面具有重大的意义。
所述的改造体为:3A-TAT-EP、3A-EP-DRI和3A-EP-PEG4-PA;所述的3A-TAT-EP的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示、3A-EP-DRI的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示、3A-EP-PEG4-PA的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示,其中3A-EP-PEG4-PA中不添加穿膜序列,在C端对多肽进行了棕榈酸化的修饰,并用PEG4分子作为连接子进行链接,棕榈酸化可使不含有穿膜肽的多肽具有穿过细胞膜的活性;。
一种肠道病毒71型的抑制剂的应用,包括利用本发明提供的P2以及P2改造体制备成肠道病毒71型的抑制剂,或是利用本发明提供的P2以及P2改造体与其他有效成分一起,制备成肠道病毒71型的抑制剂,或是利用本发明提供的P2以及P2改造体制备治疗或预防肠道病毒71型病毒感染的药物。
本发明的保护内容还包括,依据P2多肽,对其替换不同的穿膜序列、或进行多肽修饰、或进行非天然氨基酸的设计和改造后具有抑制EV71的活性的抑制剂。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
P2系列多肽有高效的抗病毒活性。这将为人类肠道病毒71型的防控提供了一种新的策略,同时也为加快抗人肠道病毒71型的多肽小分子药物的研发提供了新的理论依据。并且P2系列多肽清晰的抗病毒机制,可以保证其应用的安全性和优化途径的明确性,便于以后的进一步开发。
附图说明
图1为通过荧光标记检测多肽P2能够穿过细胞膜进入胞浆的示意图。
图2为通过CCK-8测定多肽P2的细胞毒性示意图;
结果表明在多肽P2浓度≤100μM的时候对细胞没有毒性。
图3为P2在RD细胞中的药效示意图。
图4为多肽P2在多种细胞中均对病毒有抑制作用的示意图。
图5为对多肽P2进行改造后的多肽的抗病毒效果示意图。
图6为多肽3A-EP-DRI和3A-TAT-EP的抗病毒效果示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案,如未特别说明,均为本领域的常规技术;所述试剂或材料,如未特别说明,菌来源于商业渠道。
本发明通过下述实施例进一步阐明,但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。在不偏离本发明的精神和范围的前提下,本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变,这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
本发明涉及到的多肽如下:
实施例1:
多肽P2穿膜效率检测(Makram Essafi,Alice D.Baudot,Xavier Mouska,Jill-Patrice Cassuto,Michel Ticchioni and Marcel Deckert.Virus and dsRNA-triggeredtranscriptional re sponses reveal key components of honey bee antiviraldefense.Sci Rep[J],7:6448,2017)
1.材料:
MEM培养基(thermo),血清(gibco)购自英潍捷基公司,免疫荧光平皿(NEST)购自启动子公司,PBS,DAPI,多聚甲醛购自迪跃创新公司。
多肽P2由南京金斯瑞公司合成,其序列为SEQ ID NO.2所示。
2.实验过程
实验分为两组,为了避免加入EV71病毒对多肽进入细胞产生的影响,一组实验加入EV71病毒后加多肽P2,另一组不加病毒只加多肽,且每组做好阴性对照。
免疫荧光步骤如下:
(1)在免疫荧光专用皿中铺1ml RD细胞,待其长到30%融合度时收样。
(2)吸出培养基,用1ml 0.01mol/L,pH7.4的PBS洗去残余培养基,洗三次,每次5min。
(3)配制4%多聚甲醛溶液,将4g多聚甲醛溶解于100mlPBS。将配好的4%多聚甲醛加1ml到每个皿中,反应5min,目的是将细胞固定。
(4)吸出4%多聚甲醛,再加入1ml 0.01mol/L,pH7.4的PBS洗去残余的多聚甲醛,洗三次,每次5min。
(5)将1mg/ml的DAPI溶液用PBS稀释到100ng/ml,加入皿中,反应15min。
(6)吸出反应液,再次加入1ml 0.01mol/L,pH7.4的PBS洗去残余反应液,洗三次,每次5min。
(7)将平皿放置于荧光显微镜下观察。
如图1,在未加病毒及加病毒的细胞中,均能观察到多肽入胞,证明多肽P2有很好的穿膜能力。
实施例2:
多肽P2的细胞毒性测定(JieliangChen12WenZhang12JunyuLin1FanWang12MinWu2CuncunChen13YeZheng2XiuhuaPeng2JianhuaLi1ZhenghongYuan123.An efficientantivir al strategy for targeting hepatitis B virus genome usingtranscription activator-like effe ctor nucleases.Mol Ther[J],22:303-311,2014)
1.实验材料
cck-8试剂(MCE)购自启动子公司。
2.实验过程
多肽P2在抗病毒的过程中不但要能抑制病毒,还要保证对细胞没有毒性。因此通过细胞毒性测试来检测这一指标,以未做任何处理的细胞为对照组。
步骤如下:
(1)用RD细胞铺96孔细胞板,每孔100μl。
(2)待其长到70%-80%融合度时将含有10%血清的MEM培养基换成含2%血清的MEM培养基,加入一定浓度梯度的多肽P2,使得孔中最终的P2浓度分别为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM。
(3)加入多肽24h后收样,每孔中加入10μl活细胞检测剂cck-8,混匀。
(4)37度放置4h。
(5)用酶标仪检测OD450的吸光度值。
结果如图2所示,以未处理细胞的活细胞量为100%,加入100μM多肽后活细胞量与对照组(未处理细胞)基本一致,证明多肽P2在100μM以内对细胞都没有毒性。
实施例3:
多肽抗病毒效率的测定(Aure′lie Ducroux1,2,Shirine Benhenda1,2¤,LiseRivie`re1,2,O.John Semmes3,Monsef Benkirane4,Christine Neuveut1,2.The Tudordomai n protein Spindlin1 is involved in intrinsic antiviral defense againstincoming hepatitis B Virus and herpes simplex virus type 1.PLoS Pathog[J],10:e1004343,2014)
1.材料
Total RNA提取试剂盒(Omega)、24孔板、100mm皿、50ml注射器购自迪跃创新公司,0.22μm的滤膜(millipore)购自飞羿公司,One step q-pcr试剂盒(takara)购自友名公司,提取RNA及qRT-PCR过程中使用的水为DEPC水,整个实验在RNase Free环境中进行。
2.病毒的扩增:
(1)用RD细胞铺5个100mm皿;
(2)待其长到70%-80%融合度时,将含有10%血清的MEM培养基换成含2%血清的MEM培养基,加入1μl 10^7PFU/ml的EV71病毒;
(3)2天后,观察细胞是否发生CPE现象,当现象明显时收样;
(4)将100mm皿中的上清吸出到15ml离心管中,500g,5min离心;
(5)再取上清于新的15ml离心管中,并用50ml注射器和0.22μm的滤膜过滤除菌;
(6)取100μl病毒提取RNA与之前提取的已知滴度的病毒RNA进行one step qRT-PCR,测病毒滴度。
3.多肽P2抗病毒效率的测定:
(1)用RD细胞铺24孔板。
(2)待其长到70%-80%融合度时,将含有10%血清的MEM培养基换成含2%血清的MEM培养基(每孔2%血清的MEM培养基的加入量是0.5ml),每孔加入5μl 10^6PFU/mL EV71病毒。
(3)1h后,分别加入终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、50μM的多肽P2。
(4)病毒感染24h后收样,用total RNA提取试剂盒提取RNA。
(5)弃去上清,向孔中加入350μl TRK裂解液,放到摇床上5min。
(6)再向孔中加入350μl 70%乙醇(DEPC),放到摇床上5min。
(7)取出孔中溶液转移至RNA提取柱子中,12000g离心1min。
(8)将回收管中的溶液重新上一次柱子,12000g离心1min。
(9)加入RNA washing bμffer1,12000g离心30s。
(10)加入RNA washing bμffer2,12000g离心1min。
(11)重复步骤(10)。
(12)空离柱子12000g,2min,以完全去除残余RNA wasing buffer。
(13)加50μl DEPC水,12000g离心2min。
(14)取2μl RNA样品,用one step qRT-PCR试剂盒进行荧光定量实验。
以添加了R8穿膜肽(序列为:RRRRRRRR)的RD细胞,作为阴性对照。
结果如图3所示,以只加EV71病毒的病毒RNA的量为100%,加入多肽P2后,病毒量随着多肽浓度的增大而降低,在多肽浓度为50μM时,病毒量降到4%,证明多肽P2有很好的抗病毒效果,用qRT-PCR的方法检测病毒滴度,测得P2的IC50值是6.372μM;结合图2,多肽P2在100μM内都没有细胞毒性,证明多肽在用药安全的前提下起到了很好的抗病毒效果。
实施例4:
多肽P2在多种细胞中抗病毒效率的测定:
1.材料
HEK293T,Vero,Huh7.5细胞
2.多肽P2在多种细胞中抗病毒效率的测定
(1)用293T细胞、vero细胞和huh7.5细胞铺24孔板。
(2)待其长到70%-80%融合度时,将含有10%血清的MEM培养基换成含2%血清的MEM培养基(每孔2%血清的MEM培养基的加入量是0.5ml),每孔加入5μl 10^6PFU/ml EV71病毒。
(3)1h后,分别在不同细胞中加入终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、50μM的多肽P2。
(4)病毒感染24h后收样用total RNA提取试剂盒提取RNA。
(5)弃去上清,向孔中加入350μl TRK裂解液,放到摇床上5min。
(6)再向孔中加入350μl 70%乙醇(DEPC),放到摇床上5min。
(7)取出孔中溶液转移至RNA提取柱子中,12000g离心1min。
(8)将回收管中的溶液重新上一次柱子,12000g离心1min。
(9)加入RNA washing bμffer1,12000g离心30s。
(10)加入RNA washing bμffer2,12000g离心1min。
(11)重复步骤(10)。
(12)空离柱子12000g,2min,以完全去除残余RNA wasing buffer。
(13)加50μl DEPC水,12000g离心2min。
(14)取2μl RNA样品,用one step qRT-PCR试剂盒进行荧光定量实验。
在图4中可以看到如论是在RD细胞,293T细胞,vero细胞还是huh7.5细胞中,多肽P2都可以起到明显的抗病毒效果。
293T细胞、vero细胞、hμh7.5细胞测得的IC50值分别是9.677μM,1.958μM,1.842μM。
实施例5:
多肽P2的改造体多肽对抗病毒效果的影响(Laura M.Brutscher1,2,3,KatieF.Daughenbaugh1,3&Michelle L.Flenniken 1,2,3.Cell-penetrating TAT-FOXO3fusion proteins induce apoptotic cell death in leukemic cells.Mol Cancer Ther[J],10:37-46,2011)
1.材料
多肽3A-TAT-EP(SEQ ID NO.3所示)、3A-EP-DRI(SEQ ID NO.4所示)和3A-EP-PEG4-PA(SEQ ID NO.5所示)。所述序列均为商业合成。
2.多肽P2的改造体对抗病毒效果的影响
(1)用293T细胞铺24孔板。
(2)待其长到70%-80%融合度时,将含有10%血清的MEM培养基换成含2%血清的MEM培养基(每孔2%血清的MEM培养基的加入量是0.5ml),每孔加入5μl 10^6PFU/ml EV71病毒。
(3)1h后,分别加入终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的多肽P2、3A-TAT-EP、3A-EP-DRI和3A-EP-PEG4-PA。
(4)病毒感染24h后收样用total RNA提取试剂盒提取RNA。
(5)弃去上清,向孔中加入350μl TRK裂解液,放到摇床上5min。
(6)再向孔中加入350μl 70%乙醇(DEPC),放到摇床上5min。
(7)取出孔中溶液转移至RNA提取柱子中,12000g离心1min。
(8)将回收管中的溶液重新上一次柱子,12000g离心1min。
(9)加入RNA washing bμffer1,12000g离心30s。
(10)加入RNA washing bμffer2,12000g离心1min。
(11)重复步骤(10)。
(12)空离柱子12000g,2min,以完全去除残余RNA wasing buffer。
(13)加50μl DEPC水,12000g离心2min。
(14)取2μl RNA样品,用one step qRT-PCR试剂盒进行荧光定量实验。
3.CCK8法检测3A-TAT-EP与3A-EP-DRI在RD细胞中的病毒抑制活性(Lu Han1,2,*,Kang Li1,*,Chaozhi Jin3,*,JianWang3,*,Qingjun Li1,Qiling Zhang1,Qiyue Cheng1,JingYang1,Xiaochen Bo1&ShengqiWang1.Human enterovirus 71protein interactio nnetwork prompts antiviral drug repositioning.Sci Rep[J],7:43143,2017)
(1)首先将生长状态良好的RD细胞铺96孔板,每孔1×104个,37摄氏度、5%CO2条件下培养24h。
(2)使用含2%FBS的MEM 2倍比梯度稀释多肽药物(3A-TAT-EP和3A-EP-DR I),稀释浓度为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.313μM,每孔100μl,加入一个新的96孔板中,每个浓度设置3个复孔。
(3)将稀释好的病毒加入上述孔中,每孔100μL,设置无药物无病毒孔和无药物加病毒孔(MEM)作为对照,病毒终浓度为0.1MOI。
(4)将混合物转入已铺细胞的96孔板中,37摄氏度、5%CO2条件下培养24h后,利用CCK8试剂盒测定多肽对病毒的抑制活性。
(5)计算不同浓度多肽对病毒感染的抑制率,计算公式为:多肽抑制率=(药物孔-病毒孔)×100%(无药物孔-病毒孔)。
结果如图5所示,对多肽P2改造后的多肽3A-TAT-EP(SEQ ID NO.3所示)、3A-EP-DRI(SEQ ID NO.4所示)和3A-EP-PEG4-PA(SEQ ID NO.5所示),也都可以作为EV71抑制剂的作用,且能起到提高病毒抑制的效果。qRT-PCR测得3A-EP-PEG4-PA的IC50为3.25μM。
在图6中,通过CCK8法测定多肽的病毒抑制活性表明,3A-TAT-EP的IC50为4.36μM,而3A-EP-DRI的IC50为3.56μM。
序列表
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
复旦大学
<120> 一种肠道病毒71型的抑制剂及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Glu Val Arg Gln Tyr Cys Arg Glu Gln Gly Trp Ile Ile Pro
1 5 10 15
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Glu Val Arg Gln Tyr Cys Arg
1 5 10 15
Asp Gln
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Gly Glu Glu
1 5 10 15
Val Arg Gln Tyr Cys Arg Glu Gln Gly Trp Ile Ile Pro
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Pro Ile Ile Trp Gly Gln Glu Arg Cys Tyr Gln Arg Val Glu Glu Pro
1 5 10 15
Pro Arg Arg Arg Gly Arg Lys Lys Arg Gly Tyr
20 25
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Glu Val Arg Gln Tyr Cys Arg Glu Gln Gly Trp Ile Ile Pro
1 5 10 15
Claims (4)
1.一种肠道病毒71型的抑制剂,所述的抑制剂为多肽P2,所述的P2的氨基酸序列为SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述抑制剂制备的改造体,所述的改造体为3A-TAT-EP、3A-EP-DRI或3A-EP-PEG4-PA, 所述的3A-TAT-EP的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示、3A-EP-DRI的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示、3A-EP-PEG4-PA的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
3.权利要求1所述的抑制剂或权利要求2所述的改造体在制备肠道病毒71型抑制剂中的应用。
4.权利要求1所述的抑制剂或权利要求2所述的改造体在制备治疗或预防肠道病毒71型病毒感染的药物中的应用。
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