CN105394045B - 一种肠道病毒的小分子化合物抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肠道病毒的小分子化合物抑制剂及其应用，具体地，本发明提供了伊曲康唑、伊曲康唑类似物或其药学上可接受的盐在制备试剂中的用途，用于抑制肠道病毒的生长或繁殖；和/或抑制肠道病毒RNA的合成。本发明还提供了包含伊曲康唑、伊曲康唑类似物的肠道病毒的抑制剂及药物组合物，以及体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道病毒的方法。实验结果表明，伊曲康唑及其类似物对多种肠道病毒均有良好的抑制作用。

Description

一种肠道病毒的小分子化合物抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种肠道病毒的小分子化合物抑制剂及其应用。

背景技术

肠道病毒，颗粒小，呈20面体，直径24～30nm，不含类脂体﹐核心有单链核糖核酸，耐乙醚和其它脂溶剂，耐酸，对各种抗生素﹑抗病毒药﹑去污剂有抵抗作用。多数病毒在细胞培养中产生细胞病变。属于小RNA病毒科，为裸露病毒，不同肠道病毒可引起相同的症状，同一种病毒可引起不同临床表现。肠道病毒多见隐性感染，可引起轻微上感、腹部不适和腹泻等症状。偶尔侵犯中枢神经系统，引起弛缓型麻痹。

肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(CVA16)是引起亚太地区婴幼儿手足口病的主要病原体。从2008年1月到2013年12月间，仅中国大陆地区就有九百多万的儿童被确诊为手足口病，并有2700多的死亡病例。手足口病的常见症状包括发热，局部出疹等，但也有些病人会发展成中枢神经系统(CNS)疾病，如无菌性脑膜炎，致死性脑炎。EV71是引起重症手足口病的主要病原体(Huang et al.,1999；Komatsu et al.,1999；McMinn et al.,2001)。手足口病目前仍然是非常严峻的公共卫生问题，但迄今为止尚无有效的预防措施及治疗方法，因此寻找抗病毒药物迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠道病毒的小分子化合物抑制剂及其应用。

本发明的第一方面，提供了伊曲康唑、和/或伊曲康唑类似物或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于

(i)抑制RNA的合成；和/或

(ii)抑制病毒的生长或繁殖；和/或

(iii)抑制病毒的3A蛋白的活性。

在另一优选例中，所述RNA选自：病毒RNA、原核细胞RNA和真核细胞RNA。

在另一优选例中，所述病毒为RNA病毒，优选地，所述RNA病毒为肠道病毒。

在另一优选例中，所述药物还用于治疗或预防肠道病毒感染引起的疾病。

在另一优选例中，所述肠道病毒感染引起的疾病包括但不限于由肠道病毒感染引起的：手足口病、无菌性脑膜炎、脑膜炎、脊髓灰质炎、急性呼吸道疾病、急性心肌炎、新生儿多器官衰竭和急性弛缓性麻痹。

在另一优选例中，所述伊曲康唑类似物选自下组：泊沙康唑、美国专利申请公开号US4267179A中描述的伊曲康唑类似物。

在另一优选例中，所述伊曲康唑的结构如式I所示，

在另一优选例中，所述泊沙康唑的结构如式II所示，

在另一优选例中，所述肠道病毒包括：人肠道病毒A、人肠道病毒B、人肠道病毒C、和/或人肠道病毒D。

在另一优选例中，所述新型肠道病毒包括：人肠道病毒EV71型、CVA16型、CVB3型、PV1型或EV68型。

在另一优选例中，所述药物包括口服制剂。

本发明的第二方面，提供了一种肠道病毒的抑制剂，所述抑制剂通过抑制肠道病毒的RNA合成和/或通过抑制病毒3A蛋白的活性来抑制所述肠道病毒的生长或繁殖；优选地，所述抑制剂选自下组中的一种或多种：

(1)伊曲康唑；和/或

(2)伊曲康唑类似物。

本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第二方面所述的抑制剂或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：口服制剂。

本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道病毒的方法，包括步骤：在需要处理的场所施用本发明第二方面所述的抑制剂或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述方法中，所述伊曲康唑或伊曲康唑类似物的施用浓度为≥1μM，优选地，≥10μM；可以为5μM，10μM，15μM，20μM，50μM。

本发明的第五方面，提供了一种复合物，所述复合物如式III所示

A-B III

其中，A为伊曲康唑或其类似物；B为肠道病毒的3A蛋白。

本发明的第六方面，提供了一种筛选药物的方法，所述方法包括：将待筛选药物与肠道病毒或者肠道病毒的3A蛋白接触，并检测是否形成本发明第五方面所述的所述的复合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.伊曲康唑和泊沙康唑抑制EV71的感染。图1A显示了RD细胞中加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，加入病毒或培养基培养96h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测伊曲康唑对EV71的抑制效果及对细胞的作用。结果使用Graphpad Prism5进行处理。图1B显示了用感染复数(Multiple of infections,MOI)为0.1的EV71感染RD细胞，并且加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，培养42h后收集上清液，用空斑形成实验测定病毒滴度。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。图1C显示了RD细胞中加入3倍倍比稀释的泊沙康唑，加入病毒或培养基培养96h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测泊沙康唑对EV71的抑制效果及对细胞的作用。结果使用Graphpad Prism5进行处理。图1D显示了氟康唑对EV71病毒的抑制活性。图1E显示了伏立康唑对EV71病毒的抑制活性。

图2.伊曲康唑的抗病毒谱研究。图2A显示了分别用EV71SH036株(MOI＝0.1)，CVA16(MOI＝0.01)，CVB3(MOI＝0.001)，PV1(MOI＝0.01),EV68(MOI＝0.1)感染RD细胞，并加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，分别在感染48、42、24、42、48h后收集上清液，测定病毒的滴度。图2B显示了用GraphpadPrism处理数据，计算得出伊曲康唑抑制病毒的EC₅₀。

图3.伊曲康唑抑制病毒的机制研究。图3A显示了不同时点加药实验。MOI为5的EV71在4℃感染Vero细胞1h，用预冷的培养基洗三遍，然后在相应的时间点加入5μM的伊曲康唑，20h后收集上清液测病毒滴度。对照组是在感染0、10、16h时加入0.25％DMSO。图3B显示了瞬时复制子实验。1μg含萤火虫荧光素酶报告基因(F-Luc)的复制子转染BHK-21细胞，转染后的细胞接种到12孔板中,分别加入5μM的伊曲康唑，0.25％DMSO(对照)，并在1h、16h收集裂解液进行检测。加药组与对照组的荧光酶活性通过two-way ANOVA进行比较(***p<0.001)。

图4.伊曲康唑通过抑制病毒3A蛋白的合成来发挥抗病毒活性。图4A显示了伊曲康唑耐药株的筛选方案。图4B显示了3株耐药株的耐药性比较。图4C显示了3株耐药株抑制倍数与野生型比较。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现了伊曲康唑及其类似物对肠道病毒的抑制活性，实验结果表明，伊曲康唑及其类似物对多种肠道病毒均有良好的抑制作用。在此基础上完成了本发明。

肠道病毒

肠道病毒(enterovirus)在分类上属于小核糖核酸(RNA)病毒科(picomaviridae)，人肠道病毒至少由100个血清型组成，其代表性的种类包括(但并不限于)：

人肠道病毒A，包括21种血清型：柯萨奇病毒coxsackievirus A2(CV-A2),CV-A3,CV-A4,CV-A5,CV-A6,CV-A7,CV-A8,CV-A10,CV-A12,CV-A14,CV-A16,肠道病毒enterovirusA71(EV-A71),EV-A76,EV-A89,EV-A90,EV-A91,EV-A92,EV-A114,EV-A119,EV-A120,EV-A121；

人肠道病毒B，包括59种血清型:coxsackievirus B1(CV-B1),CV-B2,CV-B3,CV-B4,CV-B5(incl.swine vesicular disease virus[SVDV]),CV-B6,CV-A9,埃可病毒echovirus1(E-1),E-2,E-3,E-4,E-5,E-6,E-7,E-9(包括CV-A23),E-11,E-12,E-13,E-14,E-15,E-16,E-17,E-18,E-19,E-20,E-21,E-24,E-25,E-26,E-27,E-29,E-30,E-31,E-32,E-33,enterovirus B69(EV-B69),EV-B73,EV-B74,EV-B75,EV-B77,EV-B78,EV-B79,EV-B80,EV-B81,EV-B82,EV-B83,EV-B84,EV-B85,EV-B86,EV-B87,EV-B88,EV-B93,EV-B97,EV-B98,EV-B100,EV-B101,EV-B106,EV-B107,EV-B111；

人肠道病毒C，包括23种血清型：人脊髓灰质炎病毒poliovirus(PV)1,PV-2,PV-3,coxsackievirus A1(CV-A1),CV-A11,CV-A13,CV-A17,CV-A19,CV-A20,CV-A21,CV-A22,CV-A24,EV-C95,EV-C96,EV-C99,EV-C102,EV-C104,EV-C105,EV-C109,EV-C113,EV-C116,EV-C117and EV-C118；

人肠道病毒D，包括4种血清型：EV-D68,EV-D70,EV-D94,EV-D111。

肠道病毒感染的临床表现多样，除无症状感染外，还有广泛的急性疾病，包括急性呼吸道疾病、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎、急性心肌炎、手足口病、新生儿多器官衰竭和急性弛缓性麻痹，甚至死亡。

3A蛋白

3A蛋白含有80多个氨基酸残基，它是肠道病毒中比较保守的一个疏水膜结合蛋白，由其前体蛋白3AB经蛋白酶切割产生，在病毒感染过程中抑制宿主细胞蛋白的分泌和从内质网至高尔基体的顺序转运。3A蛋白N-端为一个富含脯氨酸的结构域，可能参与蛋白—蛋白的相互作用，是抑制从内质网至高尔基体顺序转运所必需的功能域。另外，3A前体蛋白3AB是一个多功能蛋白，它能与3CD和3D结合，并刺激3CD剪切成3C和3D；帮助3CD形成RNA复制复合体；与RNA以非序列特异性方式结合。

在本发明的一个优选地实施方式中，3A蛋白的氨基酸序列如下：

>EV71G082

GPPKFRPIRISLEEKPAPDAISDLLASVDSEEVRQYCRDQGWIIPETPTNVERHLNRAVLVMQSIATVVAVVSLVYVIYKLFAGFQ(SEQ ID NO.:1)

伊曲康唑及其类似物

伊曲康唑(Itraconazole)是一种口服的三唑类广谱抗真菌剂，能够抑制曲霉菌和白色念珠菌(Haria et al.,1996；Potter,2005)，也能有效治疗儿童的霉菌感染(Gupta etal.,1998；Gupta et al.,1999)。

在美国专利美国专利申请公开文本(公开号US4267179A)中，记载了一系列的伊曲康唑的类似物。

现有报道认为，伊曲康唑与14-α去甲基化酶相互作用来发挥抗真菌活性，该酶是将羊毛甾醇转化为麦角甾醇所必需的一种细胞色素P-450酶。由于麦角固醇是真菌细胞膜的重要成分，抑制其合成会导致细胞渗透性增加进而造成细胞内容物的泄漏。伊曲康唑也可抑制内源呼吸，与膜磷脂相互作用，抑制酵母向菌丝形式转化，抑制嘌呤的摄取，并影响甘油三酯和/或磷脂的生物合成。

活性成分

如本文所用，术语“伊曲康唑及其类似物”包括伊曲康唑及其类似物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

药物组合物和施用方法

由于本发明人发现本发明所涉及的化合物“伊曲康唑及其类似物”具有优异的抗肠道病毒的作用，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由肠道病毒感染所导致的疾病。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明人通过对FDA批准的化合物库进行高通量筛选鉴定出一种EV71的抑制剂—伊曲康唑。对伊曲康唑类似物泊沙康唑(Posaconazole)进行体外测试发现泊沙康唑也能有效抑制EV71感染。本发明人同时对同属于三唑类抗真菌药物的氟康唑(Fluconazole)，伏立康唑(Voriconazole)进行体外测试，发现氟康唑和伏立康唑并没有抑制EV71的活性。

伊曲康唑对其他种的肠道病毒，包括柯萨奇病毒A16(CVA16)，柯萨奇病毒B3(CVB3)，I型脊髓灰质炎病毒(PV1)和肠道病毒68型(EV68)也具有抑制效果，证明了其广谱抗肠道病毒效果。机制研究发现它通过抑制病毒RNA的合成而发挥抗病毒活性。

本发明所涉及的化合物的结构式，1为伊曲康唑，2为泊沙康唑，3为氟康唑，4为伏立康唑。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示了伊曲康唑及其类似物的抗肠道病毒的作用；

(2)首次揭示了伊曲康唑及其类似物能够作用于病毒RNA合成阶段；

(3)首次揭示了伊曲康唑及其类似物能够作用于肠道病毒的3A蛋白。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和方法

细胞、病毒和化合物

RD(人横纹肌瘤)细胞(购自美国菌种保藏中心，ATCC)，Vero(非洲绿猴肾)细胞(购自ATCC)和BHK-21(幼仓鼠肾)细胞(购自ATCC)在含有1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin,P/S)和10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基中，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。EV71FY573株(GenBank登录号HM064456)用于高通量药物的筛选，EV71G082株用于病毒空斑减少实验以及不同时点加药实验。EV71病毒株SH12-036(GenBank登录号KC570452，可以购自中国科学院上海巴斯德研究所)，CVA16SHZH05-1株(GenBank登录号EU262658)，柯萨奇病毒B3(CVB3，Nancy株，ATCC VR-30)以及I型脊髓灰质炎病毒(PV1，Sabin株)用于该化合物抗病毒谱的研究。上述病毒毒株可以购自美国菌种保藏中心。从MicroSource Discovery Systems Inc(Gaylordsville，美国)购买了美国药物库(1040个化合物)和国际药物库(240个化合物)。化合物伊曲康唑购自Sigma-Aldrich，并溶解于DMSO中进行抗病毒实验。

高通量筛选药物库

向96孔白板(Corning Costar)的每孔中加入50μl含有10000个RD细胞的DMEM，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h后，每孔分别加入5μl终浓度为10μM的被测化合物(化合物中的DMSO终浓度为0.25％)，对照组中加入5μl0.25％的DMSO。然后加入45μl含50PFU的病毒稀释液，每孔的终体积为100μl，培养96小时后，取出，于室温下平衡30分钟。而后每孔加入50μl CellTiter-Glo(Promega)试剂，在室温下放置10到30分钟，使用Veritas MicroplateLuminometer(Turner BioSystem)酶标仪进行检测。抑制率大于30％的化合物将进行第二轮的验证实验。

化合物的验证实验

从Sigma-Aldrich购得伊曲康唑，溶于DMSO中，终浓度为10mM。为了验证化合物抑制EV71诱导的CPE的活性，本发明人进行了剂量依赖实验，方法类似于以上所述的高通量筛选药物库实验。为了测定化合物对细胞的作用，本发明人进行了细胞毒性实验，实验方法与剂量依赖实验相同，但是不再加入病毒液，取而代之的是含2％FBS和1％P/S的DMEM。

病毒效价的测定

测EV71的效价，向12孔板(Corning Costar)的每孔中加入1ml含3×10⁵个RD细胞的DMEM，培养24h。病毒进行10倍倍比稀释，即将25μl病毒液与225μl的含2％FBS和1％P/S的DMEM混匀。吸出12孔板中的培养基，每孔加入200μl病毒液。放置在37℃，5％CO₂的培养箱中感染1h，每隔15分钟轻轻摇动。然后吸出病毒液，加入1ml含0.8％甲基纤维素(AquacideⅡ，Calbiochem)和2％FBS的DMEM，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养6天，置于3.7％的福尔马林中固定1h后，用1％的结晶紫染色。对于其它病毒，CVB3培养1天，PV1培养2天，CVA16培养3天后再固定染色。

EV68的滴度是通过半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)测定的。向96孔透明板每孔中加入20000个RD细胞，培养24小时后加入100μl10倍倍比稀释的病毒(从10^-1到10^-8)，每个稀释度的病毒加入到10个孔中。感染1小时后，吸出病毒，加入含2％FBS的DMEM。在37℃，5％CO₂的培养箱中培养7天后置于3.7％的福尔马林中固定1h后，用1％的结晶紫染色。用Reed-Muench方法(Reed and Muench，1938)测病毒滴度并表示为TCID₅₀/ml。

病毒效价减少实验

在12孔板中接种RD细胞，3×10⁵个/孔，37℃培养过夜，24小时后加入MOI＝0.1的EV71病毒液和3倍倍比稀释的伊曲康唑，在37℃培养42h后，收集上清液，放到-80℃冰箱中冻存，然后测定病毒滴度。对于CVA16和PV1，用MOI＝0.01的病毒感染42h后收上清液，对于CVB3，用更低的MOI＝0.001的病毒感染24h后收上清液。而对于EV68，用MOI＝0.1的病毒感染48h后收培养液，然后测TCID₅₀。

不同时点加药实验

为了研究化合物伊曲康唑抗病毒的作用机制，本发明人进行了不同时点加药实验。在12孔板中接种Vero细胞，3×10⁵个/孔，37℃培养24h后，用MOI为5的EV71在4℃感染1h。用预冷的培养基洗两遍后，每孔加入1ml培养基放到培养箱中(所有操作均在冰上进行)，并分别在0，2,4,6，8,10,12,16h时加入5μM的伊曲康唑，感染20h后收上清液，放到-80℃冰箱中冻存，测定病毒滴度。

瞬时复制子实验

构建含萤火虫荧光素酶报告(F-Luc)基因的EV71复制子，该复制子用萤火虫荧光素酶基因替换了EV71感染性cDNA克隆中的结构基因，并在F-Luc报告基因的下游加入了2A蛋白的识别序列“AITTL”用于自我裂解，用NotⅠ酶切割复制子的质粒DNA进行线性化，并且用MEGAscript T7转录试剂盒进行体外转录。复制子RNA(1μg)电转入8×10⁶个BHK-21细胞中(25μF，850V，电击三次，每次间隔3秒)。转染后的细胞用15ml含10％FBS的DMEM悬浮，并接种到12孔板中，1ml/孔，实验组加入5μM的伊曲康唑，对照组加入0.25％的DMSO，检测转染1h和16h时的荧光素酶活性。收集裂解产物时，在4℃，700g条件下离心5分钟，吸出培养基并加入PBS清洗，相同条件离心5分钟后加入250μl的裂解液(Promega)，用封口膜把板子封存放到-80℃。待所有的样品收齐后，取20μl裂解液加到96孔白板中，用Veritas MicroplateLuminometer(Turner BioSystems)检测荧光信号。

数据分析

根据原始数据计算信背比(S/B)，信噪比(S/N)，Z因子以及待测化合物对病毒的抑制率。计算公式如下：S/B＝μ_c/μ_v，μ_c表示细胞对照组信号的平均值，μ_v表示病毒对照组信号的平均值，S/N＝(μ_c-μ_v)/(σ_c-σ_v),σ_c表示细胞对照组信号的标准差，σ_v表示病毒对照组信号的标准差，Z＝1-((3σ_c+3σ_v)/|μ_c-μ_v|),Z因子在0.5与1之间表示实验方法能够有效的区分对照组之间的差异(Zhang et al.,1999)。化合物的抗病毒活性CPE抑制率＝(μ_cpd-μ_v)/(μ_c-μ_v)×100％，μ_cpd表示待测化合物的平均信号强度，化合物对细胞的作用细胞存活率＝μ_cpd/μ_c×100％。半数最大效应浓度(EC₅₀)是指能引起50％最大效应的浓度。半数细胞毒性浓度(CC₅₀)是指引起50％细胞毒性反应的药物浓度，在此实验中表示为实验组比对照组荧光强度降低50％。EC₅₀和CC₅₀是用Prism软件计算的，每个化合物的选择性指数(SI)＝CC₅₀/EC₅₀。

本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1 伊曲康唑及其类似物的抗EV71病毒活性

本实施例中验证了伊曲康唑及其类似物的抗EV71病毒活性以及他们的细胞毒性，图1显示了伊曲康唑和泊沙康唑抑制EV71的感染。

图1A显示了RD细胞中加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，加入病毒或培养基培养96h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测伊曲康唑对EV71的抑制效果及对细胞的作用。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果表明，伊曲康唑浓度在1μM以下时，抗病毒活性不明显，在3μM以上时，具有显著的抑制EV71病毒的活性。

图1B显示了用感染复数(Multiple of infections,MOI)为0.1的EV71感染RD细胞，并且加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，培养42h后收集上清液，用空斑形成实验测定病毒滴度。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。实验结果表明伊曲康唑可以在不引起细胞毒性的浓度下抑制EV71引起的细胞病变效应。

图1C显示了RD细胞中加入3倍倍比稀释的泊沙康唑，加入病毒或培养基培养96h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测泊沙康唑对EV71的抑制效果及对细胞的作用。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果表明，泊沙康唑浓度在1μM以下时，抗病毒活性不明显，在2μM以上时，具有显著的抑制EV71病毒的活性。

图1D和图1E分别显示了氟康唑和伏立康唑对EV71病毒的抑制活性。从图中可以看出，氟康唑和伏立康唑对EV71无抑制作用。

伊曲康唑能够有效抑制EV71对细胞的感染且在最高测试浓度下不显示细胞毒性，其EC₅₀为1.15μM。氟康唑和伏立康唑对EV71无抑制作用，而泊沙康唑有一定的抑制作用，其EC₅₀为1.24μM。这三个化合物在所测试的最高浓度下均不显示细胞毒性。

实施例2 伊曲康唑对其它肠道病毒的抑制效果

图2A显示了分别用EV71SH036株(MOI＝0.1)，CVA16(MOI＝0.01)，CVB3(MOI＝0.001)，PV1(MOI＝0.01),EV68(MOI＝0.1)感染RD细胞，并加入3倍倍比稀释的伊曲康唑，分别在感染48、42、24、42、48h后收集上清液，测定病毒的滴度。实验结果表明，伊曲康唑对各实验病毒株均表现出了良好的抑制活性，其中，伊曲康唑在25μM的浓度下对PV1、CVB3、EV71SH036病毒株的抑制程度要显著优于对CVA16病毒株的抑制效果，但是CVA16的EC₅₀值最低，表明它对伊曲康唑最敏感。

图2B显示了用Graphpad Prism处理数据，计算得出伊曲康唑抑制病毒的EC₅₀。

上述实验结果表明，伊曲康唑除了能抑制EV71的感染外，对其它种的肠道病毒也表现出了抑制活性，尤其是对脊髓灰质炎病毒(PV1)有明显的抑制效果。

表1 伊曲康唑对不同种类的肠道病毒的抑制活性

从表1中可以看出，伊曲康唑对不同种类的肠道病毒有明显的抑制活性。

此外，如图2A所示，虽然对CVA16的EC₅₀最低，但是在最高浓度25μM时，伊曲康唑对它的抑制程度较低。

实施例3 伊曲康唑通过抑制病毒RNA的合成来发挥抗病毒活性

本发明人对伊曲康唑的抑制病毒活性的机制进行了研究，实验结果如图3所示。

图3A不同时点加药实验。MOI为5的EV71在4℃感染Vero细胞1h，用预冷的培养基洗三遍，然后在相应的时间点加入5μM的伊曲康唑，20h后收集上清液测病毒滴度。对照组是在感染0、10、16h时加入0.25％DMSO。结合病毒感染周期，实验结果证明伊曲康唑抑制了RNA的合成。

图3B瞬时复制子实验。1μg含萤火虫荧光素酶报告基因(F-Luc)的复制子转染BHK-21细胞，转染后的细胞接种到12孔板中，分别加入5μM的伊曲康唑，0.25％DMSO(对照)，并在1h、16h收集裂解液进行检测。加药组与对照组的荧光酶活性通过two-way ANOVA进行比较(***p<0.001)。转染后1h代表了病毒蛋白翻译阶段，16h代表病毒RNA合成阶段，实验结果表明1h的荧光素酶活性各组之间没有区别，但是在转染后16h，伊曲康唑处理组显著抑制了荧光素酶活性，证明伊曲康唑抑制了RNA的合成。

实施例4 伊曲康唑通过抑制病毒3A蛋白的合成来发挥抗病毒活性

本发明中在Vero细胞上在逐步提高伊曲康唑浓度下传16代获得了EV71耐药株，全基因组测序发现耐药株的突变位于3A蛋白(G5213U，3A Val51Leu和U5286C，3A Val75Ala)，提示3A蛋白和/或其前体蛋白3AB是伊曲康唑的作用靶点。

图4A伊曲康唑耐药株的筛选方案。耐药株是通过在EV71病毒盲传过程中逐步增加药物浓度来筛选获得的。病毒分别在终浓度为0.3，0.6，1.2，2.4，4.8，9.6，19.2和25μM的伊曲康唑中传2代，总共16代。盲传采用在传代培养过程中每天观察细胞病变情况的方式，决定病毒培养的最佳时间。同时以野生型病毒在不加伊曲康唑的培养基中平行传代作为对照。平行筛选了3株耐药株。

图4B3株耐药株的耐药性比较。用感染复数(MOI)为0.1的3株耐药株(筛选系1、2、3)与平行传代的野生型病毒感染Vero细胞，一组加入25μM的伊曲康唑，另一组加入DMSO作为对照，感染42小时后收取上清，用空斑试验测病毒滴度。

图4C3株耐药株抑制倍数与野生型比较。抑制倍数等于各组病毒用DMSO处理的病毒滴度除以25μM伊曲康唑处理的病毒滴度。与野生型比抑制倍数比值等于野生型抑制倍数除以各筛选系的抑制倍数。从图4C中可以看出，与野生型相比，3A蛋白突变的突变株其耐药性提高了10倍以上，说明伊曲康唑或其类似物的作用靶点为病毒的3A蛋白，3A蛋白突变以后导致耐药性显著增强。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (9)

1.伊曲康唑、和/或伊曲康唑类似物或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的用途，其特征在于，所述试剂或药物用于

(i)抑制肠道病毒的RNA的合成；和/或

(ii)抑制肠道病毒的生长或繁殖；和/或

(iii)抑制肠道病毒的3A蛋白的活性；

所述伊曲康唑类似物为泊沙康唑。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述药物还用于治疗或预防肠道病毒感染引起的疾病。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述肠道病毒感染引起的疾病选自下组：由肠道病毒感染引起的：手足口病、脑膜炎、脊髓灰质炎、急性呼吸道疾病、急性心肌炎、新生儿多器官衰竭和急性弛缓性麻痹。

4.如权利要求3所述的用途，其中，所述脑膜炎是无菌性脑膜炎。

5.如权利要求2所述的用途，其中，所述肠道病毒包括：人肠道病毒A、人肠道病毒B、人肠道病毒C、和/或人肠道病毒D。

6.如权利要求1所述的用途，其中，所述肠道病毒选自下组：肠道病毒A的EV71 SH036、柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒B3、或I型脊髓灰质炎病毒和肠道病毒68型。

7.一种体外非治疗性地抑制肠道病毒生长或者杀灭肠道病毒的方法，其特征在于，包括步骤：在需要处理的场所施用一抑制剂或其药学上可接受的盐,

其中，所述抑制剂选自下组中的一种或多种：

(1)伊曲康唑；和/或

(2)泊沙康唑。

8.一种复合物，其特征在于，所述复合物如式III所示

A-B III

其中，A为伊曲康唑或其类似物；B为肠道病毒的3A蛋白；其中所述伊曲康唑类似物为泊沙康唑。

9.一种筛选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：将待筛选药物与肠道病毒或者肠道病毒的3A蛋白接触，并检测是否形成权利要求8所述的复合物。

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