CN110693888B - 头孢拉定作为牛肠道病毒抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本公开属于牛肠道病毒防治技术领域，具体涉及头孢拉定作为牛肠道病毒抑制剂的应用。牛肠道病毒对会造成牛的胃肠道疾病及呼吸道症状，对养殖业具有严重的危害，并且目前对于牛肠道病毒的研究较少，尚未公开有效的防治药物。本公开提供了头孢拉定在抑制和杀灭牛肠道病毒中的应用。经研究表明，头孢拉定在体外实验MDBK细胞模型上能抑制和杀灭牛肠道病毒，能够有效地抑制牛肠道病毒的入侵和复制，且细胞毒性小，可作为一类新的抗牛肠道病毒的药物，为牛肠道病毒的防控和药物研发奠定了基础，也为开发高效特异的抗牛肠道病毒的药物奠定实验基础并提供新视野。

Description

头孢拉定作为牛肠道病毒抑制剂的应用

技术领域

本公开属于牛肠道病毒防治技术领域，具体涉及头孢拉定作为牛肠道病毒抑制剂的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)与猴肠道病毒、猪肠道病毒、人柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道致细胞病变弧儿病毒等属于小RNA病毒科、肠道病毒属成员，病毒粒子大小25～30nm，为球形、无囊膜的单股正链RNA病毒。根据病毒的最新分类，牛肠道病毒归属于肠道病毒属的E种(A群牛肠道病毒)或F种(B群牛肠道病毒)肠道病毒。该病毒于1959年被Moll和Davis首次报道后，现已在全世界主要养牛国家和地区普遍发现与流行，在我国多个地区的牛场已有发现，可以导致牛发生多种综合征，其主要通过粪口途径传播，传染源主要为病牛和无症状的病毒携带者，感染牛肠道病毒的牛表现为轻度下痢和轻微呼吸道症状，食欲下降，严重者甚至便血，产奶量大幅下降，给养牛业造成了严重的经济损失。目前我国对牛肠道疾病的防治还很薄弱，研发能抑制和杀灭牛肠道病毒的药物对我国奶牛养殖业具有重大意义。

发明内容

针对上述研究背景，本公开针对牛肠道病毒防治药物展开研究，并提供了头孢拉定(CAS：38821-53-3)对牛肠道病毒的抑制作用。经本公开研究表明，头孢拉定在安全剂量范围内对牛肠道病毒具有抑制作用，并且与药物浓度呈现剂量依赖关系。机制研究表明，头孢拉定对牛肠道病毒具有直接杀灭作用，还能够降低牛肠道病毒对正常细胞的吸附作用，阻断牛肠道病毒的复制。

基于上述研究结果，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供头孢拉定作为牛肠道病毒抑制剂的应用。

本公开第二方面，提供一种牛肠道病毒活性抑制剂，所述抑制剂当中包含头孢拉定。

优选的，所述牛肠道病毒活性抑制剂为牛肠道病毒活性抑制模型工具药物。

优选的，所述牛肠道病毒活性抑制剂为牛肠道病毒抑制剂药物。

本公开通过细胞实验证实头孢拉定对于牛肠道病毒具有良好的抑制活性。基于该研究结果，本领域技术人员可以容易的联想到将头孢拉定用于牛肠道病毒抑制药物的开发和应用。

本公开第三方面，提供头孢拉定在制备用于预防和/或治疗与牛肠道病毒相关的疾病或病症的药物中的应用。

本公开第四方面，提供用于治疗与牛肠道病毒相关的疾病的药物组合物或药物制剂，其包含头孢拉定。

优选的，头孢拉定作为活性成分占该组合物或药物制剂总重量的1-99％。

发明人通过实验发现头孢拉定具有优越的牛肠道病毒抑制活性，本公开提供的化合物也许将成为治疗与牛肠道病毒相关的疾病的强效的化学实体。可用于制备牛肠道病毒抑制剂、牛肠道病毒抑制剂的实验模型工具药或制备用于预防和/或治疗相关疾病的药物。

在本公开的一些实施方式中，本公开的药物组合物含有治疗有效量的头孢拉定，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

这些药物组合物通常安全、无毒且为生物学上所需要的，因此，本公开中所述药学上可接受的载体或赋形剂是无毒且安全的，而且其与头孢拉定的组合也是无毒且安全的。本公开所述的药学上可接受的载体和赋形剂通常为本领域人员所熟知的，或者可由本领域技术人员根据实际情况能够确定的。

本公开的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括牛或其他大型牲畜，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径，最优选为口服。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

本公开涉及到的化合物头孢拉定是广谱、高效、低毒抗生素，对革兰氏阳性及阴性菌均有杀菌作用，临床主要用于呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织等的感染。对于本发明涉及的化合物在抑制和杀灭牛肠道病毒中的应用，是首次公开，与已知的临床用药用途不同

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1显示为头孢拉定抗牛肠道病毒损伤细胞的作用。

其中：A.正常的细胞B.病毒对照组C.感染细胞药物试验组

图2显示为头孢拉定对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)

图3显示为头孢拉定对牛肠道病毒的半数有效浓度(EC₅₀)

图4显示为头孢拉定不同时间点给药对牛肠道病毒抑制的效果图

图5显示为头孢拉定对牛肠道病毒直接杀伤作用效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，近几年牛肠道病毒在国内逐渐流行，对我国养殖业的危害日益加重。目前对于牛肠道病毒的研究还较为空白，缺乏有效的治疗药物。本公开通过研究，提供了头孢拉定作为牛肠道病毒抑制剂的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 BEV的分离鉴定

将新鲜的牛粪便用PBS稀释，反复冻融3次，5 000r/min离心5min，取上清液加入青霉素(200IU/mL)、链霉素(100μg/mL)，取200μL上清液，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取BEV病毒基因组RNA,反转录为cDNA,用BEV特异性引物进行PCR扩增,将PCR鉴定为阳性的粪便上清液用0.22um的滤膜过滤除菌，取1ml接种MDBK单层细胞，37℃吸附1h，弃去，加入含有2％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，每12h观察细胞病变情况，连续观察4d。将出现病变(CPE)的细胞反复冻融3次，收集细胞病毒液，同时鉴定获得的细胞病毒夜是否是BEV单一感染，若不是单一病毒感染，使用噬斑纯化的方法获得BEV单一感染的细胞病毒液。

经BEV结构蛋白VP1和VP3系统进化树分析鉴定，该分离株属于BEV-A族基因1型。

实施例2病毒TCID₅₀的测定

将MDBK细胞消化后以每孔3×10⁵个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将牛肠道病毒连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10^-1-10^-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO₂的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID₅₀。

表1 TCID₅₀ of BEV

结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数,并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算牛肠道病毒的TCID₅₀值：

LgTCID₅₀＝L-D(S-0.5)(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)

LgTCID₅₀＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(3.25-0.5)＝-3.75

TCID₅₀＝10^-3.75/0.1mL

即将该病毒稀释10^3.75接种100μL可使50％的细胞发生病变。

实施例3头孢拉定对MDBK细胞的毒性实验：

MDBK细胞是牛肠道病毒的易感细胞。因此，首先检测头孢拉定对MDBK细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：

(1)在96孔板内接种100μL细胞(MDBK 3×10⁴个/孔)。

(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的2％FBS DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL 2％FBS DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。

(3)在37℃，5％CO₂条件下培养48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定490nm处的OD值。

(4)37℃，5％CO₂条件下继续培养4h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。

(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算头孢拉定的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)值。其结果如图2所示。

结果：头孢拉定出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定头孢拉定半数中毒浓度为大于100μM。

实施例4头孢拉定对牛肠道病毒的抑制实验：

(1)在96孔板的每个孔中接种3×10⁴个MDBK细胞，37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养；

(2)弃去培养基，每孔加入100μL 100TCID₅₀的牛肠道病毒稀释液(用2％FBS DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，按照50μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO₂培养箱中培养；

(3)48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。

(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值一病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值一病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC₅₀)值。其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC₅₀/EC₅₀，计算相应的治疗指数TI值。

结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对牛肠道病毒的有效抑制率。从结果可以看出，头孢拉定在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛肠道病毒的半数有效浓度(EC₅₀)为50μM。头孢拉定对牛肠道病毒的治疗指数大于2。

实施例5作用机制的初步研究

通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了牛肠道病毒的MDBK细胞中，进而初步判断头孢拉定的作用时期。具体实验步骤如下：

(1)在96孔板的每个孔中接种3×10⁴个MDBK细胞，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。

(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μL的待测药物，记为-2h。

(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的牛肠道病毒稀释液加到第2～11列的每孔中，每孔加样体积为50μL。同时在第3列的三个复孔中加入50μL相应待测物，此刻记为0h。

(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间。以第11列的MDBK细胞作为病毒对照组。

(6)培养48h后，进行OD值测定。分析数据，得出结论，其结果如图4所示。

结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，头孢拉定在病毒感染细胞0h、2h时加药，对病毒有明显的抑制作用，说明头孢拉定可能主要作用于牛肠道病毒生活周期的早期阶段。

实施例6化合物不同时间加入对牛肠道病毒复制的影响

本实施例将筛选出的效果较好毒性较低的头孢拉定进行了进一步的作用机制研究。分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。

(1)药物对病毒的直接杀伤作用

将等量的100TCID₅₀病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO₂培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC₅₀。

结果：头孢拉定与牛肠道病毒预先作用的给药方式下，各浓度的试验加药组细胞病变较病毒对照组轻微，细胞的变圆、脱落、空泡化等病理现象有所减轻，通过分析软件，头孢拉定对牛肠道病毒的作用效果如图5所示。从图中可以看出，在这种作用式下，头孢拉定对牛肠道病毒表现出一定的抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。表明头孢拉定对牛肠道病毒具有一定的直接灭活的作用。

(2)药物对牛肠道病毒吸附的阻断作用

按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的100TCID₅₀病毒液置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。

结果：CPE观察结果显示，药物预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度有明显的变化。细胞活力检测结果显示，此种药物对牛肠道病毒的有效抑制率在60％以上，表明头孢拉定能阻止牛肠道病毒对细胞的吸附作用。

(3)药物对牛肠道病毒复制的阻断作用

按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100TCID₅₀病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。

结果：CPE观察结果显示，病毒预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。检测结果显示，头孢拉定对牛肠道病毒的有效抑制率低于20％，表明头孢拉定不能阻断在细胞中的复制作用。

本公开应用实施例以牛肾细胞(MDBK)为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现头孢拉定的新型抗病毒作用，对牛肠道病毒有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (3)

1.头孢拉定在制备牛肠道病毒抑制剂的应用。

2.如权利要求1所述头孢拉定在制备牛肠道病毒抑制剂的应用，其特征在于，头孢拉定作为活性成分占牛肠道病毒抑制剂总重量的1-99%；

所述抑制剂可对哺乳动物临床使用，所述哺乳动物为牛，通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道的途径给药。

3.如权利要求2所述头孢拉定在制备牛肠道病毒抑制剂的应用，其特征在于，通过口服的途径给药。

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