CN113304158B - 磺胺甲氧吡嗪在制备预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及磺胺甲氧吡嗪在制备预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的应用。牛副流感病毒3型是引发养殖场牛呼吸道综合征的重要病原体，传播途径包括呼吸道及生殖器官传播可能引发严重肺炎甚至不孕。本发明研究结果提供了磺胺甲氧吡嗪在开发预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的应用，经验证，在正常细胞的安全剂量范围内，磺胺甲氧吡嗪显示出对牛副流感病毒3型的抑制作用，阻断病毒对正常细胞的吸附作用，有望应用于兽药或饲料添加剂的开发。

Description

磺胺甲氧吡嗪在制备预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的 应用

技术领域

本发明属于兽用药物技术领域，具体涉及磺胺甲氧吡嗪在制备预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的应用、包含磺胺甲氧吡嗪的药物组合物、牛呼吸道综合征治疗药物、治疗方法及牛的饲料添加剂。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)属于副黏病毒科、呼吸道病毒属的成员，是牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)最重要病原，临床上以发热、咳嗽、气喘、食欲减退、眼睛鼻部分泌物增多，少数伴有腹泻为特征，最终表现为肺炎，严重的能够引起流产。目前，BPIV3的感染已呈世界性分布，给世界养牛业造成严重的经济损失。

BPIV3是引起犊牛和成年牛上呼吸道感染的重要病原体之一，BPIV3同属的成员还包括人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,HPIV3)和仙台病毒(Sendaivirus,SeV)。在自然条件下，本病仅感染牛，多见于舍饲的肥育牛，病牛及带毒牛是主要的传染源，易感牛群因与排毒的牛接触，通过空气-飞沫经呼吸道而感染，也可以发生子宫内感染。研究人员曾从公牛精液和母牛生殖道中发现病毒，并可能导致不育。此外，也有研究者从奶牛临床乳房炎中分离到了BPIV3。本病常见于晚秋和冬季，感染BPIV3的牛只常因呼吸道上皮受损，而造成呼吸道黏膜的防御能力下降，引起免疫抑制，因此，BPIV3的患病牛经常容易继发感染严重的细菌性或支原体性疾病，从而引起严重的肺炎，使死亡率大大增加。

磺胺甲氧吡嗪(Sulfamethoxydiazine)，又名长效磺胺，属于合成抗微生物药\磺胺类，用于膀胱炎喉炎、支气管炎、扁桃体炎、鼻炎、耳炎、蜂窝组织炎、疮疖等。从1935年Domagk氏发现百浪多息、对于感染溶血性键球菌的小白鼠有很强的治疗作用以后，引起各国科学家的重视，继而大量合成了磺胺、磺胺噻唑、磺胺嘧啶等，为细菌感染疾病的治疗开辟了新的一页，在临床工作中起了很大的作用。后来由于抗菌素的出现，磺胺类药物虽有所逊色，但磺胺类药物具有疗效确实、应用方便、价格低廉、毒性校小、过敏反应较少等优点，因此目前仍是一种向疾病作斗争的有力武器。尤其是近年来合成了抗菌谱广、抗菌力强、吸收良好、排泄较慢、作用时间持久、毒性甚低、临床应用价值更大的长效磺胺。国内外临床应用证明，长效磺胺可用于多种感染症的治疗和预防。对大叶性肺炎、急性肾盂肾炎、急性膀胱炎、脑膜炎，其疗效甚佳。对乳腺炎、扁桃腺炎、中耳炎、骨髓炎、丹毒、脓肿、疖、痈以及手术后镇防感染等均有良效。由于在血中有效浓度持久，故适用于顶防风湿热、细菌性痢疾及链球菌感染。

发明内容

基于上述研究背景，本发明目的在于提供能够抑制BPIV3的活性成分，经验证，本发明发现，磺胺甲氧吡嗪在正常细胞的安全剂量下，可以有效抑制牛副流感病毒3型的感染，对BPIV3的半数有效浓度(EC50)为9.7μM，对BPIV3的治疗指数大于10，是一种开发前景非常理想的活性成分。

因此，基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明首先提供磺胺甲氧吡嗪在制备预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的应用。

本领域公知，磺胺甲氧吡嗪属于磺胺类药物，通过抑制细菌蛋白质合成实现抑制细菌的作用。细菌和病毒虽然都能够引发呼吸道症状，但是两种病原体的结构差异较大，引发呼吸道症状的机制也差异明显。然而，本发明研究结果则证实了磺胺甲氧吡嗪能够抑制牛副流感病毒3型感染。在进一步的机制研究中，本发明证实了所述磺胺甲氧吡嗪虽然不能直接灭活病毒，但是可以减少病毒对正常机体细胞的粘附作用，减少病毒在正常细胞表面的停留，从而降低感染机会。

基于上述研究结果，本领域技术人员不难联想到将其应用于牛副流感病毒产品的开发，所述产品包括药物或饲料添加剂的形式。在针对相关产品进行开发的技术方案中，所述磺胺甲氧吡嗪还可能包括药学上可接受的其他形式或药物组合物的形式。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明首次发现化合物磺胺甲氧吡嗪能够有效预防BPIV3的增殖，且对正常细胞的毒性相对较小，经实验证明，磺胺甲氧吡嗪对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)大于100μM，而对BPIV3病毒的半数有效浓度(EC50)为9.7μM；磺胺甲氧吡嗪对BPIV3的治疗指数大于10，表明其具有开发成抗BPIV3药物的前景，为磺胺甲氧吡嗪开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗BPIV3药物奠定实验基础并提供新的视野。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明磺胺甲氧吡嗪预防BPIV3损伤细胞的作用图；

其中：其中图1A为病毒对照组；图1B为MDBK正常细胞组；图1C为感染细胞药物试验组(使用10μM磺胺甲氧吡嗪)；

图2为实施例2中磺胺甲氧吡嗪对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图；

图3为实施例3中磺胺甲氧吡嗪对BPIV3的半数有效浓度(EC50)图；

图4为实施例4中磺胺甲氧吡嗪不同时间点给药对BPIV3抑制的效果图；

图5为实施例5中磺胺甲氧吡嗪对BPIV3复制的阻断作用效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，牛副流感病毒3型(BPIV3)是牛呼吸道综合征的重要病原，除引发牛的肺炎外，还可能引发子宫感染、乳房炎等，是牛养殖业的重要威胁。本发明研究验证了磺胺甲氧吡嗪能够有效抑制BPIV3对正常牛机体细胞的感染作用，有望应用于防治牛副流感病毒药物的制备。

本发明第一方面，提供磺胺甲氧吡嗪在制备预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的应用。

上述方案中所述磺胺甲氧吡嗪，其结构如下式所示：

应当理解的是，本发明中所述磺胺甲氧吡嗪还包括其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物、互变异构体、内消旋体、外消旋体、立体异构体、代谢产物或前药；除此之外，本发明所述磺胺甲氧吡嗪还包括磺胺甲氧吡嗪的修饰物或晶型结构；如改善溶解性所进行的基团修饰，或为了改善透膜性能与穿膜活性成分偶联后的修饰物；所述晶型结构包括磺胺甲氧吡嗪的晶型化合物以及包含磺胺甲氧吡嗪的共晶结构。

优选的，所述预防和/或治疗牛副流感病毒产品包括但不限于兽药、饲料添加剂或饲料。

优选的，所述牛副流感病毒优选为牛副流感病毒3型。

本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中，磺胺甲氧吡嗪作为活性成分。

优选的，所述药物组合物中，还包括其他活性成分，所述其它活性成分为但不限于抗病毒成分、抗炎成分或免疫激活成分中一种或几种的组合。

优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的辅料。

本发明第三方面，提供一种牛呼吸道综合征治疗药物，所述药物中包括磺胺甲氧吡嗪和/或第二方面所述药物组合物。

优选的，所述磺胺甲氧吡嗪和/或第二方面所述药物组合物应当是治疗有效剂量的，所述“治疗有效剂量”包括预防疾病、治疗及缓解疾病的应答剂量，上述剂量可由本领域技术人员通过常规手段进行确定。

上述技术方案中，所述牛呼吸道综合征治疗药物剂型为本领域兽药常见剂型，包括液体制剂、气体制剂、固体制剂或半固体制剂；所述液体制剂包括注射剂、溶液剂、浇淋剂、喷滴剂或酊剂等；所述固体制剂包括散剂、粉剂、预混剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂等；所述半固体制剂包括软膏剂、浸膏剂、糊剂等。

本发明第四方面，提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂中包括磺胺甲氧吡嗪和/或第二方面所述药物组合物。

优选的，所述饲料添加剂应用于畜禽养殖过程中饲料的添加，从而实现对牛副流感病毒感染的预防和治疗；所述饲料添加剂优选为固体制剂或液体制剂，所述固体制剂可能通过拌料等方式进行添加，所述液体制剂可通过拌水方式进行添加。

本发明第五方面，提供一种通过抑制牛副流感肝病毒3型来预防/治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用磺胺甲氧吡嗪和/或第二方面所述药物组合物。

本发明第六方面，提供一种牛副流感病毒综合征的治疗方法，所述治疗方法包括向治疗需要的个体施用磺胺甲氧吡嗪和/或第二方面所述药物组合物。

上述第五及第六方面所述技术方案中，所述“有需要的个体”应当理解为畜禽中的哺乳动物，优选的方案中，为有治疗需求的牛。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1病毒TCID₅₀的测定

将MDBK细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔1×10⁵个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将BPIV3连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10^-1～10^-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO₂的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID₅₀。

表1 TCID₅₀ of BPIV3

注：TCID₅₀，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。

结果：在显微镜下的形态学观察发现36h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数,并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算BPIV3的TCID₅₀值：

LgTCID₅₀＝L-D(S-0.5)

(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)

LgTCID₅₀＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(5.75-0.5)＝-3.75

TCID₅₀＝10^-6.25/0.1mL

即将该病毒稀释10^6.25接种100μL可使50％的细胞发生病变。

实施例2磺胺甲氧吡嗪对MDBK细胞的毒性实验

MDBK细胞是BPIV3的易感细胞。因此，首先检测磺胺甲氧吡嗪对MDBK细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：

(1)在96孔板内接种100μL细胞(MDBK 1×10⁴个/孔)。

(2)培养至MDBK单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的2％FBS DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL 2％FBS DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。

(3)在37℃，5％CO₂条件下培养48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。

(4)37℃，5％CO₂条件下继续培养2h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。

(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算磺胺甲氧吡嗪的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)值。其结果如图2所示。

结果：磺胺甲氧吡嗪出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定磺胺甲氧吡嗪半数中毒浓度大于100μM。

实施例3磺胺甲氧吡嗪对BPIV3的抑制实验

(1)在96孔板的每个孔中接种1×10⁴个MDBK细胞，37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养；

(2)弃去培养基，每孔加入100μL 2％DMEM，按照50μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO₂培养箱中培养；药物孵育2h后，每孔加入100μL 1000TCID₅₀的BPIV3稀释液。

(3)48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。

(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC₅₀)值。其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC₅₀/EC₅₀，计算相应的治疗指数TI值。

结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对BPIV3的有效抑制率。从结果可以看出，磺胺甲氧吡嗪在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对BPIV3的半数有效浓度(EC₅₀)为9.7μM。磺胺甲氧吡嗪对BPIV3的治疗指数大于10。

实施例4作用机制的初步研究

通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了BPIV3的MDBK细胞中，进而初步判断磺胺甲氧吡嗪的作用时期，具体实验步骤如下：

(1)在96孔板的每个孔中接种1×10⁴个MDBK细胞，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。

(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μL的待测药物，记为-2h。

(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的BPIV3稀释液加到第2～11列的每孔中，每孔加样体积为50μL。同时在第3列的三个复孔中加入50μL相应待测物，此刻记为0h。

(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间，以第11列的MDBK细胞作为病毒对照组。

(6)培养48h后，进行OD值测定。分析数据，得出结论，其结果如图4所示。

结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，磺胺甲氧吡嗪在病毒感染细胞-2h时加药，对病毒均有明显的抑制作用。

实施例5不同时间加入化合物对BPIV3复制的影响

将磺胺甲氧吡嗪分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。

(1)药物对病毒的直接杀伤作用

将等量的1000TCID₅₀病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO₂培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本实施例同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC₅₀。

结果：磺胺甲氧吡嗪与BPIV3预先作用的给药方式下，可以看出，磺胺甲氧吡嗪对BPIV3没有直接灭活的作用。

(2)药物对BPIV3吸附的阻断作用

按每孔1×10⁴个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的1000TCID₅₀病毒液置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。本实施例同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。

结果：通过分析软件，磺胺甲氧吡嗪对BPIV3的作用效果如图5所示，结果显示，在安全浓度范围内，9.7μM及以上浓度对BPIV3的有效抑制率能达到70％，表明磺胺甲氧吡嗪能阻止BPIV3对细胞的吸附作用。

(3)药物对BPIV3复制的阻断作用

按每孔1×10⁴个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的1000TCID₅₀病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本实施例同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。

结果：通过数据分析发现磺胺甲氧吡嗪不能阻断BPIV3的复制。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.磺胺甲氧吡嗪在制备预防和/或治疗牛副流感病毒产品中的应用；

所述预防和/或治疗牛副流感病毒产品可以为兽药、饲料添加剂或饲料中的一种；

或，所述牛副流感病毒为牛副流感病毒3型。

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