CN112641789A - 一种化合物在治疗和预防新型冠状病毒和流感病毒药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化合物在抗病毒药物方面的应用，具体涉及牛黄罗定在治疗和预防新型冠状病毒或流感病毒药物方面的应用。所述药物为预防和治疗由病毒引起肺部疾病的药物。所述病毒包括流感病毒、冠状病毒等RNA病毒。本发明拓展了牛磺罗定的功效范围，证实在细胞水平上能够显著抑制流感病毒和SARS‑CoV‑2的复制，提示牛磺罗定对流感病毒和SARS‑CoV‑2具有非常积极的抑制作用，为制备预防和治疗由流感病毒和新型冠状病毒引起肺部感染药物提供了研究基础和开辟了新方向。并通过体外实验证实牛磺罗定对肺脏具有显著的保护作用，能延长流感病毒对小鼠的生存时间，可用于流感病毒引起的肺部疾病的预防和治疗。

Description

一种化合物在治疗和预防新型冠状病毒和流感病毒药物方面 的应用

技术领域

本发明涉及化合物药物用途技术领域，尤其涉及一种化合物在治疗和预防新型冠状病毒和流感病毒药物方面的应用。

背景技术

冠状病毒(Coronaviruses)是自然界中广泛存在的一大类病毒。在生物学分类中，冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，其直径在80～120nm，核酸为非节段单链(+)RNA，长27-31kb。冠状病毒是RNA病毒中具有最长的RNA核酸链，含有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化“帽子”，3’端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似，也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础。

冠状病毒可通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏、接触传染，并通过空气飞沫传播，以此感染脊椎动物和人类并引起呼吸系统感染和急性胃肠炎等多种疾病，如人、鼠、马、猪、猫、犬、禽类等。

流感病毒(Influenza viruses)是引起急性呼吸道传染病，从而导致流行性感冒的主要病毒。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种RNA病毒,主要包括A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒。A型流感病毒具有较高的变异性，传播性和致病性最强，极易造成季节性流行病。人类感染流感病毒后会引起重症肺炎，急性呼吸窘迫综合征，败血症伴发休克等，死亡率非常高，对社会公共卫生安全构成了巨大的威胁。目前常用于抗流感病毒的药物主要包括烷胺类药物和神经氨酸酶抑制剂药物。但是，烷胺类药物仅对A型流感病毒有效，并且发现流感病毒会通过基因变异或药物反应等方式，快速地产生对此类抗病毒药物的抗药性。神经氨酸酶抑制剂药物能通过阻止子代病毒释放，从而抑制病毒的复制。然而此类药物的副作用一直是临床应用中的难题，包括出现幻觉，行为异常，听觉和视觉障碍。因此寻找针对流感病毒的多种亚型，开发一类具有普遍适用性的药物具有重要的意义。

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，该病毒具有潜伏时间长、传染性强、复制率高以及难以防控等特点。人类感染新型冠状病毒后，其临床表现为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍，严重影响了国民经济和人类的健康。目前并没有治疗SARS-CoV-2的有效药物，只能够在对症治疗的基础上积极防治并发症的发生。因此开发可预防或者治疗新型冠状病毒的有效药物已刻不容缓，该类药物的研发也引起了世界各国广大研究者的注意。

牛磺罗定(英文名为Taurolidine,化学名为4,4'-亚甲双[四氢-2H-1,2,4-噻二嗪]1,1,1',1'-四氧化物，分子式为C₇H₁₆N₄O₄S₂)是氨基酸牛磺酸的衍生物，具有抗内毒素，抗细菌和抗粘附的特性。在细菌方面，牛磺罗定可与细胞壁、内毒素和外毒素发生化学反应，抑制微生物粘附，起到抗细菌的作用。此外，在抗肿瘤方面，牛磺罗定可通过诱导细胞凋亡、自噬和坏死病来诱导肿瘤细胞的细胞毒性。这些过程涉及的程度可能随肿瘤细胞的类型而变化。直到2020年7月，对牛磺罗定研究报道的国外文献检索约有260余篇，多数研究集中在牛磺罗定对肿瘤相关信号通路作用方面的探索，而在抗病毒活性方面的应用未见有研究报道。

由于目前对牛磺罗定的治病研究集中于抗肿瘤和除菌方面，限制了牛磺罗定的功效范围。本发明开发了牛磺罗定的一种新的治疗药物用途，即牛磺罗定在抗病毒药物中的应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种化合物在制备抗病毒药物方面的应用，其中，所述化合物为牛磺罗定或者牛磺罗定的衍生物或以牛磺罗定分子结构为前提的化合物。

所述以牛磺罗定分子结构为前提的化合物为对于牛磺罗定分子的两个硫氧基团进行简单的替换或对其增减基团-NH-和-CH₂-带来的结构的改变所形成的类似化合物。

所述药物为预防和治疗由病毒引起肺部疾病的药物。

或者，所述药物为抑制病毒在细胞或体内中复制或繁殖的制剂。

所述病毒为RNA病毒，包括流感病毒、冠状病毒、肝炎病毒。

具体地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

本发明的目的之二是提供一种预防或治疗抗SARS-CoV-2的药物组合物，包含牛磺罗定或者其衍生物，或以牛磺罗定分子结构为前提的化合物。

上述的药物组合物，加入药学上可接受的载体化合物、盐溶或水溶化合物，采用现有技术制备成为注射剂、喷剂、气雾剂或冲洗剂。

所述载体化合物包括稀释剂、吸收剂、湿润剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂中的一种或多种。

所述载体化合物为PVP-KF-17，作为增溶剂与稳定剂。

具体地，上述剂型配方可为：每100ml溶液中含牛磺罗定2g，PVP-KF-17 5g；制备过程为：室温下先将PVP-KF-17溶于水，全溶后，在45℃～50℃的温度中，加入牛磺罗定，搅拌至全溶后，加适量4％氢氧化钠溶液调PH，再加入活性炭适量，保温30分钟，趁热过滤。滤液再经0.25mm滤膜过滤，灌瓶、压盖既得。

此外，牛磺罗定还可与抗生素(万古霉素除外)联合共用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明使用MDCK、Vero-E6、F81细胞作为牛磺罗定对抗病毒作用的细胞模型，通过将病毒接种于细胞，根据细胞病变状态收获病毒液，并测定牛磺罗定对病毒的抑制效果。本发明拓展了牛磺罗定的功效范围，证实在细胞水平上能够显著抑制流感病毒和SARS-CoV-2的复制，提示牛磺罗定对流感病毒和SARS-CoV-2等RNA病毒具有非常积极的抑制作用，为制备预防和治疗由流感病毒和新型冠状病毒引起肺部感染药物提供了研究基础和开辟了新方向。同时，选取两株DNA病毒为代表毒株，以无囊膜的细小病毒和有囊膜的伪狂犬病毒为例，证实在细胞水平上，牛磺罗定不能够抑制犬细小病毒和伪狂犬病毒的复制，提示牛磺罗定对该类DNA病毒无抑制作用。此外，本发明还通过体外实验证实牛磺罗定对肺脏具有显著的保护作用，能延长流感病毒对小鼠的生存时间，可用于流感病毒引起的肺部疾病的预防和治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的牛磺罗定对MDCK、Vero-E6、F81细胞的敏感性的检测结果图；

图2为本发明实施例2提供的牛磺罗定抑制流感病毒感染力的检测结果图；

图3为本发明实施例3提供的牛磺罗定抑制伪狂犬病毒感染力的检测结果图；

图4为本发明实施例4提供的牛磺罗定抑制犬细小病毒感染力的检测结果图；

图5为本发明实施例5提供的牛磺罗定对流感病毒模型鼠体重的影响图；

图6为本发明实施例5提供的牛磺罗定对流感病毒模型鼠生存率的影响图；

图7为本发明实施例6提供的牛磺罗定对流感病毒在小鼠体内致病作用的影响图；

图8为本发明实施例6提供的牛磺罗定抑制SARS-CoV-2感染力的检测结果图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细介绍。本发明采用的BALB-C小鼠、MDCK、Vero-E6、F81和牛磺罗定均为市售产品，其中牛磺罗定由长春迈灵生物工程有限公司提供，MDCK、Vero-E6、F81、流感病毒、狂犬病毒、犬细小病毒来源于军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，SARS-CoV-2病毒来源于北京分离株，保存于军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所。

实施例1牛磺罗定对细胞安全性的影响

MDCK、Vero-E6、F81细胞分别于液氮中储存，取出并将其复苏，连续传三代，待细胞长势良好后用于实验研究。将MDCK、Vero-E6、F81细胞分别接种与96孔板，每孔细胞为量1×10⁵，于37℃，5％CO₂恒温细胞孵育箱中培养过夜。待细胞密度在60-70％时加入含不同浓度的牛磺罗定(起始浓度4mg/ml，以10倍梯度将待测药物进行倍比稀释，共10个浓度)的2％FBS DMEM维持液100μL/孔，每个浓度测4个复孔。另设立空白细胞对照和PBS对照，进行4个重复，继续培养，每天显微镜下观察细胞状态。加药第2天，加入10μL MTT溶液(5mg/ml)，37℃、5％CO₂条件孵育1小时，测定OD₅₇₀值。利用Graphpad Prism5.0软件对数据进行分析，并计算药物对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。

检测结果见附图1，可以发现牛磺罗定对MDCK细胞(图1A)的IC₅₀值为22.88μM，Vero-E6细胞(图1B)的IC₅₀值为20.38μM，F81细胞(图1C)的IC₅₀值为36.74μM。

实施例2牛磺罗定抑制流感病毒感染力的检测结果

MDCK细胞于液氮中储存，取出并将其复苏，连续传三代，待细胞长势良好后用于实验研究。将保存的H3N2流感病毒株放置于冰上缓慢融化，接种于单层MDCK细胞(不超过24小时)，继续培养至72-96小时，根据细胞病变状态收获病毒液。并测定其含量，以TCID₅₀/100μl为计算单位。

药物与H3N2亚型流感病毒混合后接入细胞。将长势良好的MDCK细胞以胰酶消化后计算细胞含量，接种与96孔板，每孔细胞为量1×10⁵。在接种12小时内且细胞处于单层状态时进行药物作用的研究。接种病毒含量为100TCID₅₀的H3N2亚型流感病毒与牛磺罗定(14μM)混合后，室温作用10分钟后接种于铺好的96孔板中。另设立空白细胞对照和病毒对照进行3个重复。将接种后的细胞板放置于37℃，5％的CO₂培养箱中继续培养72小时后观察细胞病变，计算细胞增殖率。

计算公式为：

细胞的相对增殖率＝OD实验组/OD对照组×100％

观察结果见附图2。可以发现，含量为14μM牛磺罗定在细胞水平上对流感病毒具有显著的抑制作用。检测结果表明化合物牛磺罗定能够明显抑制流感引起的细胞病变，该结果提示牛磺罗定能够抑制流感病毒的感染。

实施例3牛磺罗定抑制伪狂犬病毒感染力的检测结果

病毒：伪狂犬病毒为具有囊膜的DNA病毒，病毒粒子直径150nm-180nm。

MDCK细胞于液氮中储存，取出并将其复苏，连续传三代，待细胞长势良好后用于实验研究。将保存具有囊膜的病毒伪狂犬株放置于冰上缓慢融化，接种于单层MDCK细胞(不超过24小时)，继续培养至72-96小时，根据细胞病变状态收获病毒液。并测定其含量，以TCID₅₀/100μl为计算单位。

药物与伪狂犬病毒混合后接入细胞。将长势良好的MDCK细胞以胰酶消化后计算细胞含量，接种与96孔板，每孔细胞为量1×10⁵。在接种12小时内且细胞处于单层状态时进行药物作用的研究。接种病毒含量为100TCID₅₀的伪狂犬病毒分别与15μM牛磺罗定、30μM牛磺罗定混合后，室温作用10分钟后接种于铺好的96孔板中。另设立空白细胞对照和病毒对照，进行3个重复。将接种后的细胞板放置于37℃，5％的CO₂培养箱中继续培养72小时后观察细胞病变，计算细胞增殖率。

计算公式为：

细胞的相对增殖率＝OD实验组/OD对照组×100％

观察结果见附图3。可以发现，含量为15μM和30μM牛磺罗定在细胞水平上对伪狂犬病毒无抑制作用。检测结果表明含量为15μM和30μM牛磺罗定化合物不能抑制伪狂犬病毒引起的细胞病变，该结果提示牛磺罗定不能抑制伪狂犬病毒的感染。

实施例4牛磺罗定抑制犬细小病毒感染力的检测结果

病毒：细小病毒为无囊膜的DNA病毒，病毒粒子直径18-26nm。

F81细胞于液氮中储存，取出并将其复苏，连续传三代，待细胞长势良好后用于实验研究。将保存犬细小病毒株放置于冰上缓慢融化，接种于单层F81细胞(不超过24小时)，继续培养至72-96小时，根据细胞病变状态收获病毒液。并测定其含量，以TCID₅₀/100μl为计算单位。

药物与犬细小病毒混合后接入细胞。将长势良好的F81细胞以胰酶消化后计算细胞含量，接种与96孔板，每孔细胞为量1×10⁵。在接种12小时内且细胞处于单层状态时进行药物作用的研究。接种病毒含量为100TCID₅₀的犬细小病毒分别与15μM牛磺罗定、30μM牛磺罗定混合后，室温作用10分钟后接种于铺好的96孔板中。另设立空白细胞对照和病毒对照，进行3个重复。将接种后的细胞板放置于37℃，5％的CO₂培养箱中继续培养72小时后观察细胞病变，计算细胞增殖率。

计算公式为：

细胞的相对增殖率＝OD实验组/OD对照组×100％

观察结果见附图4。可以发现，含量为15μM和30μM牛磺罗定在细胞水平上对犬细小病毒无抑制作用。检测结果表明含量为15μM和30μM牛磺罗定化合物不能抑制犬细小病毒引起的细胞病变，该结果提示牛磺罗定不能抑制犬细小病毒的感染。

实施例5牛磺罗定对流感病毒感染鼠体重和生存率影响

将BALB-C小鼠分为空白对照组、病毒对照组、雾化处理组和肌肉注射组，每组7只小鼠。将流感病毒接种于病毒对照组、雾化处理组和肌肉注射组小鼠，并采取不同方式每天分别持续给予雾化处理组和肌肉注射组小鼠牛黄罗定药物处理。每天对各个组别小鼠体重进行检测，并观察小鼠生存状态。

用上述方法，观察结果见附图5和图6。与空白对照组相比，流感病毒接种的小鼠体重明显下降(附图5)。尽管药物处理并不能挽救小鼠的体重，但是可以延长小鼠的生存时间，其中肌肉注射组>雾化处理组(附图6)。检测结果表明化合物牛黄罗定能延长流感病毒对小鼠的生存时间，可用于流感病毒的预防和治疗。

实施例6牛磺罗定对流感病毒在小鼠体内致病性的影响

实验方法与实施例5相似，将流感病毒接种于病毒对照组、雾化处理组和肌肉注射组小鼠，并采取不同方式每天分别持续给予雾化处理组和肌肉注射组小鼠药物处理。并分别在接毒后第三天和第五天取小鼠肺组织，观察牛磺罗定对流感病毒引起的小鼠肺指数的影响。

计算公式为：肺指数＝(小鼠肺组织的重量÷小鼠体重)×100％

用上述方法，观察结果见附图7。与病毒对照相比，牛磺罗定处理后(雾化处理组和肌肉注射组)对小鼠肺脏具有显著的保护作用。

实施例5牛磺罗定抑制SARS-CoV-2感染力的滴定检测结果

Vero-E6细胞于液氮中储存，取出并将其复苏，连续传三代，待细胞长势良好后用于实验研究。将保存的SARS-CoV-2液放置于冰上缓慢融化，接种于单层Vero-E6细胞(不超过24小时)，继续培养至72-96小时，根据细胞病变状态收获SARS-CoV-2液。并测定其含量，以TCID₅₀/100μl为计算单位。

药物与SARS-CoV-2混合后接入细胞。将长势良好的Vero-E6细胞以胰酶消化后计算细胞含量，接种与96孔板，每孔细胞为量1×10⁵。在接种12小时内且细胞处于单层状态时进行药物作用的研究。接种病毒含量为100TCID₅₀的SARS-CoV-2病毒与牛磺罗定混合后，室温作用10分钟后接种于铺好的96孔板中，药物剂量依次为5，15，25，50μl/mL。另设立空白细胞对照和牛磺罗定细胞毒性对照，进行3个重复。将接种后的细胞板放置于37℃，5％的CO₂培养箱中继续培养72小时后观察细胞病变。并计算药物对流感病毒的半数最大有效浓度(EC₅₀)。

计算公式为：

感染率＝(药物处理组OD-病毒对照组OD)÷(细胞对照组OD-病毒对照组OD)×100％

观察结果见附图8。可以发现，牛磺罗定在细胞水平上对SARS-CoV-2具有显著的抑制作用。检测结果表明化合物牛磺罗定能够明显抑制SARS-CoV-2引起的细胞病变，可用于SARS-CoV-2的预防和治疗药物的研发。

综合以上结果，表明牛磺罗定能显著抑制流感病毒和新型冠状病毒，并且牛磺罗定还能延长流感病毒小鼠的生存时间以及改善流感病毒对小鼠肺部的致病作用。但是，分别以剂量为15μM和30μM的牛磺罗定并不能够抑制犬细小病毒和伪狂犬病毒的复制。

这些结果提示，牛磺罗定对伪狂犬病毒和犬细小病毒或该类DNA病毒无抑制作用。然而，牛磺罗定对流感病毒和新型冠状病毒等RNA病毒具有非常有效的抑制作用，可用于该类病毒的预防和相关治疗药物的研发。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种化合物在制备抗病毒药物方面的应用，其特征在于，所述化合物为牛磺罗定或者牛磺罗定的衍生物或以牛磺罗定分子结构为前提的化合物，所述病毒为RNA病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述以牛磺罗定分子结构为前提的化合物为对于牛磺罗定分子的两个硫氧基团进行简单的替换或对其增减基团-NH-和-CH₂-带来的结构的改变所形成的类似化合物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为预防或治疗由病毒引起肺部疾病的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制病毒在细胞中或体内复制或繁殖的制剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为流感病毒或冠状病毒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

7.预防或治疗抗SARS-CoV-2的药物组合物，其特征在于，包含牛磺罗定或者其衍生物，或以牛磺罗定分子结构为前提的化合物。

8.根据权利要求7所述的预防或治疗抗SARS-CoV-2的药物组合物，其特征在于，加入药学上可接受的载体化合物、盐溶或水溶化合物，制备成为注射剂、喷剂、气雾剂或冲洗剂。

9.根据权利要求8所述的预防或治疗抗SARS-CoV-2的药物组合物，其特征在于，所述载体化合物包括稀释剂、吸收剂、湿润剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的预防或治疗抗SARS-CoV-2的药物组合物，其特征在于，所述载体化合物为PVP-KF-17，作为增溶剂与稳定剂。

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