CN110585206A - 依米丁在制备抗肠道病毒药物中的应用 - Google Patents

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吴叔文
唐崎
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Abstract

本发明公开了依米丁在制备抗肠道病毒药物中的应用。属于医药领域。为了克服现有防控肠道病毒手段存在的缺陷与不足，本发明提供依米丁在制备预防和/或治疗肠道病毒感染的药物中的新用途，实验结果表明依米丁在纳摩尔水平能有效阻断Vero或RD细胞被EV‑A71、CV‑A16、CV‑B1、EV‑D68和Echov‑6病毒感染；小鼠实验进一步表明，通过口服给药，依米丁对EV‑A71感染引起的死亡具有100%保护作用。因此，依米丁具有毒性小、作用强、安全有效等优点，为由肠道病毒引起的疾病的预防和治疗开辟了新的途径，具有重要的社会价值、经济价值。

Description

依米丁在制备抗肠道病毒药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及依米丁(emetine)在制备抗肠道病毒药物中的应用。
背景技术
肠道病毒(Enteroviruses,EVs)是一类侵入肠细胞并在其中繁殖的病原体，其可诱导人肠上皮细胞产生多种炎症。肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属,包括脊髓灰质炎病毒﹑柯萨奇病毒(CVA、CVB)和在人类肠道致细胞病变的孤儿病毒(ECHO病毒)、新型肠道病毒。1970年国际病毒命名委员会将这些病毒归属于微小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。在上述已命名的3种肠道病毒的67个型别以后发现的肠道病毒﹐都按肠道病毒序数编号命名﹐即68﹑69﹑70﹑71﹑72型肠道病毒等。多数病毒在细胞培养中产生细胞病变。
肠道病毒通常寄生于肠道﹐仅于少数情况下﹐进入血流或神经组织。正常的病毒携带者不多见﹐隐性感染甚为普遍﹐人受染后出现临床症状的也是少数。肠道病毒感染临床表现复杂多变，病情轻重差别甚大。同型病毒可引起不同的临床症候群，而不同型的病毒又可引起相似的临床表现。
(一)呼吸道感染埃可病毒及柯萨奇病毒的很多型均可引起，以上呼吸道感染为常见，也可引起婴儿肺炎等下呼吸道感染。肠道病毒68型可引起小儿毛细支气管炎和肺炎。
(二)疱疹性咽峡炎主要由柯萨奇A群及B群病毒引起，埃可病毒引起较少。本病遍及世界各地，呈散发或流行，但以夏秋季多见。传染性很强。潜伏期平均4天左右，表现为发热、咽痛、咽部充血、咽部有散在灰白色丘疱疹，直径1～2mm，四周有红晕，疱疹破溃后形成黄色溃疡，多见于扁桃体、软腭和悬雍垂。一般4～6日后自愈。
(三)出疹性疾病又称流行性皮疹病(epidemic ixanthemata)，柯萨奇病毒及埃可病毒均可引起。多见于婴儿及儿童，成人较少见。潜伏期3～6天。出疹前多有上呼吸道症状如发热、咽痛等。皮疹于发热或热退时出现，呈多形性，有斑丘疹、斑疹、猩红热样皮疹、风疹样皮疹、疱疹及荨麻疹样等。不同形态的皮疹可同时存在或分批出现。可伴有全身或颈部及枕后淋巴结肿大。
(四)手足口病主要由柯萨奇病毒A5、9、10、16型引起，尤以A16多见。多发生于5岁以下小儿，传染性强，可暴发流行或散发。初起低热、厌食、口痛等。口腔粘膜出现小疱疹，后破溃形成溃疡。多分布于后舌、颊及硬腭，亦可见于齿龈、扁桃体及咽部。多同时在手足皮肤出现斑丘疹，偶见于躯干、大腿及臀部。斑丘疹很快转为小疱疹，较水痘皮疹为小，2～3日内吸收，不留痂。预后良好，但可复发。有时可伴发无菌性脑膜炎、心肌炎等。
(五)脑膜炎、脑炎及瘫痪性疾病柯萨奇病毒A群、B群和埃可病毒的许多型以及肠道病毒71型均可引起此类疾病。
肠道病毒疫苗接种是当前人类预防肠道疾病发生和流行的首选措施。2015年EV-A71减毒疫苗在我国首先上市。但由于肠道病毒的血清型和种类很多，且RNA病毒变异迅速，疫苗的保护率并不高，而且该疫苗只对EV-A71 C4等肠道病毒血清型有预防作用，因此该疫苗并未在全球范围内广泛使用。而抗肠道病毒药物发展缓慢，临床上还没有一个真正的有效药物用于手足口病的治疗肠道病毒药物。目前治疗手足口病的方法主要是采用对症治疗和针对一些并发症的综合治疗，并不针对EV-A71等病原体病因本身。这类治疗手段由于缺乏病因针对性，存在使病情复发甚至恶化，导致更严重并发症的可能性。由于缺乏有效治疗手足口病药物，尤其是EV-A71抗病毒药物的缺乏，使得筛选、设计和合成一系列新型高效的EV-A71抑制剂具有很大的应用前景，但同时也具有一定的挑战性。
依米丁(emetine)又名吐根碱，作为一种抗原虫药物在临床长期使用，具有安全性、低耐药性和经济性。
迄今为止，尚未见依米丁在预防和/或治疗肠道病毒感染中的应用的相关性报道。
发明内容
为了克服现有防控肠道病毒手段存在的缺陷与不足，本发明的首要目的是提供依米丁在制备预防和/或治疗肠道病毒感染的药物中的新用途。该化合物对细胞的毒性小，在肠道病毒感染的预防和治疗方面有一定的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供依米丁在制备抗肠道病毒药物中的应用，依米丁的化合物结构如式I所示：
第二方面，提供依米丁在制备预防和/或治疗肠道病毒感染引起的手足口疾病或疱疹性咽颊炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明涉及的依米丁(emetine)，是临床已经在用的小分子化合物，其安全性和药代动力学特性已经在人或动物中得到了评估，因此它潜在的抗肠道病毒作用可以在临床中直接检测，避免了新药审批时间过长的弊端。申请人研究发现依米丁可以有效抑制肠道病毒的感染和复制，实验结果表明依米丁在纳摩尔水平能有效阻断Vero或RD细胞被EV-A71、CV-A16、CV-B1、EV-D68和Echov-6病毒感染；小鼠实验进一步表明，通过口服给药，依米丁对EV-A71感染引起的死亡具有100％保护作用。因此，依米丁具有毒性小、作用强、安全有效等优点，为由肠道病毒引起的疾病的预防和治疗开辟了新的途径，具有重要的社会价值、经济价值。
具体实施方式
通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：依米丁体外生物活性测试
(1)依米丁细胞毒性测定:
CCK-8试剂中含有WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)是一种类似于MTT的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan，生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
实验时，将RD细胞以每孔2×104的密度传至96孔板中，在37℃培养24小时后，吸走培养基，将含有多种浓度梯度化合物的细胞培养基加到每个孔(DMSO,0.98μM,1.95μM,3.91μM,7.81μM,15.63μM,31.25μM,62.5μM,125μM,250μM,500μM)；24小时后，每孔加入10μl的CCK-8试剂，细胞板在37℃的CO2孵化器中培养4h，酶标仪测定450nm波长下的OD值。细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100，其中：A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度，A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度，A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。化合物的半数抑制浓度(CC50)作为该化合物细胞毒性的指标。
表1本发明目标化合物和对照化合物RD细胞毒性
化合物 CC<sub>50</sub>(M)
emetine 10
enviroxime >10
(2)依米丁(emetine)抗肠道病毒活性实验：
通过RD细胞感染后上清病毒产量的减少来评估化合物的抗病毒活性。按照1MOI感染复数感染RD细胞，37℃吸附1小时，吸出病毒，加入含有不同稀释梯度的药物，在37℃、5％CO2条件下培养36小时后，取细胞培养液提取上清病毒的总RNA，经逆转录后对其进行qPCR定量，其相对Ct值反映了RV感染后细胞培养上清中病毒的相对数量，可以反映药物对病毒感染和复制的影响。EC50是指特定药物有效抑制细胞培养上清中病毒产生量至对照孔的50％所需的浓度。
表2本发明目标化合物和对照化合物抗肠道病毒各毒株活性(EC50μM)
化合物 EV-A71 EV-D68 Echov-6 CV-A16 CV-B1
emetime 0.0489 0.0187 0.04504 0.0832 0.0505
enviroxime 0.2039 0.0498 0.3093 0.1449 0.1029
实施例2：依米丁体内生物活性测试
实验分为空白对照组、病毒对照组和emetine处理实验组和enviroxime处理组。将EV-A71 GZ-CII按照1.2x108PFU的致死剂量腹腔注射感染小鼠。攻毒6小时前，emetine按照0.05mg/kg/d和0.20mg/kg/d剂量口服给药，enviroxime按照0.20mg/kg/d剂量口服给药,小鼠每天给药2次，连续给药4天。每天监测小鼠体重变化、发病及死亡情况，持续观察14天。实验结果表明：对照组的小鼠全部死亡,emetine 0.05mg/kg/d和0.20mg/kg/d口服给药，小鼠的存活率分别为30％和100％。而对照化合物enviroxime按照0.20mg/kg/d剂量口服给药小鼠存活率仅为20％。
表3 Emetine在小鼠体内抗EV71病毒活性
组别 小鼠成活率
1.空白组 100％
2.病毒对照组 0％
3.emetine 0.05mg/kg/d 30％
4.emetine 0.2mg/kg/d 100％
5.enviroxime 0.2mg/kg/d 20％
结果表明：化合物依米丁(emetine)具有很好的抗肠道病毒活性，具有非常广谱的抗肠道病毒活性和非常高的选择性。这类化合物在肠道病毒致手足口等疾病的预防和治疗方面有很强的应用前景。

Claims (2)

1.依米丁在制备抗肠道病毒药物中的应用，依米丁的结构如式I所示：
2.依米丁在制备预防和/或治疗肠道病毒感染引起的手足口疾病或疱疹性咽颊炎药物中的应用。
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