TW201722414A - Ev71感染的組合治療 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於治療EV71感染的組合，該組合包含兩種或更多種在各自之非有效量的化合物並提供對抗EV71複製之不可預期的協同活性，其中該化合物係選自於由金諾芬（auranofin）、哇巴因（ouabain）、依米丁（emetine）、氯硝柳胺（niclosamide）及S-(+)-氟西汀（S-(+)-fluoxetine）所組成之群組。

Description

EV71感染的組合治療
本發明係關於EV71感染的組合療法。
腸病毒71型（EV71）已引起幾次大爆發。EV71通常感染幼兒並引發手足口病。EV71還有引起嚴重神經疾病的可能性。到目前為止，還沒有已知能有效治療EV71感染的抗病毒劑。
EV71最早是在1969年在美國加州被分離出（Wang, J.R.等人，1998 - 2000年台灣手足口病爆發的腸病毒71型之主要基因型變化（Wang, J.R. et al., Change of Major Genotype of Enterovirus 71 in Outbreaks of Hand-Foot-and-Mouth Disease in Taiwan between 1998 and 2000. Journal of Clinical Microbiology 40, 10-15, 2002）。EV71已經成為亞太地區各地的重要臨床問題（(McMinn et al., Phylogenetic Analysis of Enterovirus 71 Strains Isolated during Linked Epidemics in Malaysia, Singapore, and Western Australia. Journal of Virology 75, 7732-7738, 2001）。EV71通常感染年齡3歲以下的幼兒。EV71可能引起皮疹、嚴重的神經疾病和手足口病（HFMD）（Repass et al., Hand, foot, and mouth disease: identifying and managing an acute viral syndrome. Cleveland Clinic journal of medicine 81, 537-543, 2014）。在台灣，自從1998年以來已經報導了許多具有致死病例的大爆發。因此，開發用於預防的疫苗和用於治療的有效藥物是重要的。
各種EV71候選疫苗正在進行動物模型研究，包括活性減毒疫苗、重組VP1疫苗、合成肽疫苗及類病毒微粒疫苗（Kung et al., Update on the development of enterovirus 71 vaccines. Expert Opinion on Biological Therapy 14, 1455-1464, 2014）。最近，EV71疫苗的第三期臨床試驗已在中國完成，台灣和新加坡也分別完成兩個第一期臨床試驗。這些EV71疫苗都是分別使用分離的C4基因型病毒作為疫苗株的不活化全病毒明礬佐劑疫苗（inactivated whole-virus alum-adjuvant caccines）（Liang and Wang, EV71 vaccine, an invaluable gift for children. Clin Trans Immunol 3, e28, 2014）。這些EV71疫苗在EV71相關HFMD上的保護功效超過90％，而且在其它EV71相關疾病上的保護功效超過80％。
因此，需要開發用於EV17感染的新療法。
在本發明中意外地發現，五種在各自的非有效量之藥物的組合在對抗EV71的複製上提供強的協同作用，特別是在各種易受EV71感染的細胞中顯現具有普遍的抗EV71作用。吾人相信，對雞尾酒療法之重新推論不僅可以提供有效的抗EV71配方，而且還可以是治療各種病毒感染的強大工具。
因此，在一方面，本發明提供一種用於治療EV71感染的組合，該組合包含兩種或更多種在各自之非有效量的化合物並提供對抗EV71複製的協同活性，其中該化合物係選自於由金諾芬（auranofin）、哇巴因（ouabain）、依米丁（emetine）、氯硝柳胺（niclosamide）及S-(+)-氟西汀（S-(+)-fluoxetine）所組成之群組。
另一方面，本發明係關於一種用於治療EV71感染的方法，包含對需要該治療的個體投予治療有效量的本發明之組合。
再另一方面，本發明係關於一種用於治療手足口病（HFMD）的方法，包含對需要該治療的個體投予治療有效量的本發明之組合。
又另一方面，本發明係關於一種用於治療EV71感染的醫藥組合物，包含治療有效量的本發明之組合。
又再另一方面，本發明係關於一種用於治療手足口病（HFMD）的醫藥組合物，包含治療有效量的本發明之組合。
通過參照以下描述、附圖及申請專利範圍，本文揭示的本發明之具體實施例的這些和其他目的，以及優點和特徵將變得更加顯而易見。此外，應當理解的是，本文描述的各種具體實施例之特徵不是相互排斥的，而且可以以各種組合和排列存在。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語皆具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識之人士一般理解的相同的含義。
在下表1中提供本文使用的縮寫之列表。 表1 縮寫列表
到目前為止，研究經常選擇單一病毒蛋白作為藥物標靶，其包括結構和非結構蛋白。雖然有許多化合物已經顯示可抑制EV71複製，但該些化合物中沒有一種已經通過人類臨床試驗驗證。因為EV71 RNA基因組是由其不具校對活性的RNA依賴性RNA聚合酶合成的，所以在複製期間新合成的病毒基因組中經常產生突變。因此，在抗病毒治療期間經常可以選擇呈現抗病毒抗性表型的EV71變體。因此，需要修改對抗EV71的具體抗病毒策略的發展方向。本發明嘗試提供通過多重部分抑制的協同作用來開發抗EV71之雞尾酒療法的替代方法。
本發明提供一種用於治療EV71感染的組合，該組合包含兩種或更多種在各自之非有效量的化合物並提供對抗EV71複製之不可預期的協同活性，其中該化合物係選自於由金諾芬、哇巴因、依米丁、氯硝柳胺、及S-(+)-氟西汀所組成之群組。
在本發明的一個具體實施例中，提供對抗EV71複製的協同活性的組合的一些實例包括： 氯硝柳胺和依米丁； 氯硝柳胺和金諾芬； 氯硝柳胺和哇巴因； 氯硝柳胺和S-(+)-氟西汀； 依米丁和哇巴因； 依米丁和金諾芬； 依米丁和S-(+)-氟西汀； 哇巴因和金諾芬； 哇巴因和S-(+)-氟西汀；以及 金諾芬和S-(+)-氟西汀。
此外，本發明提供一種用於治療EV71感染的方法或醫藥組合物。
本發明還提供一種用於治療手足口病（HFMD）的方法或醫藥組合物。
本文中使用的「治療有效量」乙詞是指用以提供所需治療效果或誘導特定類型的反應的每種化合物的足夠量。所需的治療有效量因個體而異，取決於個體的疾病狀態、身體狀況、年齡、性別、種類及體重等。然而，所屬技術領域中具有通常知識者可以僅使用例行實驗來決定適當的有效量。
本文中使用的「每天的非有效量」乙詞是指對人類個體來說每天無法對平均體重60 kg的人類個體提供所需治療效果或誘導特定類型的反應的化合物量或劑量。在一個具體實施例中，每種化合物的非有效量低於人類個體每天的治療有效量。
在本發明的一個實例中，氯硝柳胺用於人類個體的非有效量低於2 mg/天。
在本發明的一個實例中，哇巴因用於人類個體的非有效量為低於0.3 mg/天。
在本發明的一個實例中，金諾芬用於人類個體的非有效量為低於6 mg/天。
在本發明的一個實例中，依米丁用於人類個體的非有效量為低於60 mg/天。
在本發明的一個實例中，S-(+)-氟西汀用於人類個體的非有效量為低於20 mg/天。
本發明的醫藥組合物可以藉由傳統習知的方法使用一種或更多種醫藥上可接受的載體製造。本文中使用的「醫藥上可接受的載體」乙詞包括任何標準的醫藥載體。本發明的醫藥組合物可以被組構成任何形式，其適用於所選的給藥模式。例如，適用於口服給藥的組合包括固體形式及液體形式，固體形式例如丸劑、膠囊、顆粒、片劑、及粉末，液體形式例如溶液、糖漿、酏劑、及懸浮液。對於局部施用有用的形式包括乳膏、軟膏、凝膠、懸浮液、滴劑、乳劑、皮膚貼劑。
除了標準載體之外，本發明的口服醫藥組合物可以被補充一種或更多種通常用於口服製劑的賦形劑，例如界面活性劑、吸入劑、增溶劑、穩定劑、乳化劑、增稠劑、著色劑、甜味劑、調味劑、及防腐劑。這些賦形劑是所屬技術領域中具有通常知識者熟知的。
實施例
材料和方法
抗體 - 使用的抗體包括兔抗VP1（GTX70007，1：2000，GeneTex）、小鼠抗波形蛋白（sc-6260，1：1000，Santa Cruz）。
藥物 - 使用的化學藥物是金諾芬（Cat.＃A6733，Sigma）、依米丁（Cat.＃E2375，Sigma）、氯硝柳胺（Cat.＃N3510，Sigma）、哇巴因（Cat.＃O3125，Sigma）、S-(+)-氟西汀（Cat.＃F1553，Sigma）。
細胞株、病毒及病毒感染 -在5％ CO2和37 ℃下在含有10％胎牛血清（Invitrogen，USA）的Dulbecco改良Eagle培養基（Sigma，USA）中生長RD（人類橫紋肌肉瘤，ATCC® CCL-136TM）細胞。EV71菌株4643/TW/1998（GeneBank登錄號JN544418.1）是由台灣國立楊明大學的黃麗華博士提供。將病毒加到在含有2％ FBS的DMEM中培養的RD細胞中。藉由細胞病理學分析法滴定新產生的病毒。對於病毒感染，將細胞以80％的滿度接種在6孔盤中並使其生長整夜。在以感染多樣性（MOI）5的病毒激發之前，用無血清培養基替換舊培養基。吸附病毒1小時之後，在含有10％ FBS的DMEM中培養感染的細胞。
實時逆轉錄聚合酶鏈反應 - 使用具有Fast SYBR® Green Master Mix（Applied Biosystems，USA）和ReverAid First Strand cDNA合成套組（Thermo Scientific，USA）的StepOnePlusTM 實時PCR系統（applied Biosystems，USA）進行實時逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。按照製造商的說明書進行RT分析。EV71特異性正向引子（5’-TGTAGATCAGGCCGATGAGTCA-3’）和反向引子（5’-CATGTCCACATTAGAGCGTCCTAT-3’）標記保留的5’-UTR區域。我們將管家基因GAPDH用於內部對照。在由5μL的2X Fast SYBR® Green Master Mix、0.2 μL的10 μM/μL之每種寡核苷酸引子、及4.6 μL從樣品萃取的2.5 ng/μL RNA組成的10 μL體積中進行qPCR試驗。選擇具有解離曲線和快速模式的ΔCt比較法作為StepOnePlusTM 實時PCR系統用於標靶片段擴增的RUN設置。熱循環條件之規定如下：AmpliTaq® Fast DNA聚合酶在95 ℃下初始活化10分鐘；兩個步驟40個循環，以95 ℃進行15秒及以60 ℃進行60秒。在擴增循環結束時，藉由以0.5 ℃/s逐漸升高溫度至95 ℃來獲得解離溫度分析。
西方墨點法 – 用電泳分離從RD細胞萃取的蛋白質。將蛋白質電泳印跡到硝酸纖維素膜上，並與指定的抗體一起培育。用LAS-4000（FUJIFLIM）顯現免疫反應帶。
實例 1 市售藥物的選擇
選擇包括氯硝柳胺、依米丁、哇巴因、金諾芬、及S -(+)-氟西汀的五種市售藥物用於進一步特徵化其藥理學性質。為了檢查這五種市售化合物在EV71拮抗作用中的劑量反應，檢查這些試劑在不同濃度下如何影響EV71的複製。
當以5μM的濃度添加這五種化合物中的每一種（除了氟西汀之外）時，基於VP1表現的EV71複製效率大大受損（圖1）。雖然氟西汀的差異可能意味著生物檢定之間的不同，但我們的數據大大驗證了Kung的方法在挑選抗EV71化學物質的有效性。同時，這些數據總體上也強烈表示我們當前的檢定具有測試化合物及其組合對EV71複製的抑制作用的能力。對於氯硝柳胺和金諾芬，由於VP1表現分別只有未處理感染細胞的0.2和0.05（圖1），當各以5 μM施用時觀察到明顯抑制EV71，。當它們的量降到0.5 μM時，抗EV71作用相應減弱，且VP1表現回到0.9〜0.6。更重要的是，當使用0.005 μM時，在VP1表現為0.9下未觀察到可測得的抑制。因此，氯硝柳胺和金諾芬在5 μM具有強的抗EV71，但在0.05 μM下具有最小的作用，顯示在EV71抑制中的適當劑量-反應關係。同時，依米丁和哇巴對VP1表現具有較強的作用。當個別使用0.5-5 μM的依米丁或0.05-5 μM的哇巴因時，觀察到強烈阻斷EV71表現。為了看到VP1表現恢復，依米丁和哇巴因需要分別降至0.05和0.005 μM（圖1）。相對地，當僅使用氟西汀時，在所有的測試濃度都記錄了0.9-1.0的VP1表現情況下，沒有明顯的效果。
實例 2 對 EV71 複製的協同抑制作用的測試
為了測試以上五種化合物是否可能對EV71複製具有協同抑制作用，使用含有所有在其非抑制量之成分的組合，並且逐漸增加其量直到看到明顯的作用。
組合中包括0.05 μM的氯硝柳胺、依米丁、金諾芬及氟西汀以及5 nM的哇巴因。有趣的是，我們發現，即使是在它們各自的非抑制劑量，這五種化合物仍具有強的EV71複製抑制作用。在這種條件下，只有30％的EV71 RNA（圖2）和8％的VP1蛋白表現（圖3）。總之，這些數據表示這五種化合物之間的協同作用導致意外高的EV71複製抑制作用。由於這些成分在五化合物列表中的協同作用是可能的藥動力學機制，所以進行綜合分析來檢查每種成分可以如何與列表中的另一種成分相互作用。進行了所有的二元組合在其抗EV71作用上的徹底檢視。雖然大多數的組合確實將VP1表現降低80至90％，但有一些組合產生VP1表現為0.4-0.6的輕度抑制。更重要的是，VP1表現為1.0時，氯硝柳胺（N）-哇巴因（O）和哇巴因（O）-氟西汀（F）的組合對EV71複製幾乎沒有影響（圖3）。總之，這些數據表示列表中的每種成分在抗EV71功效上確實彼此具有特定的交互作用。例如，雖然缺乏與氯硝柳胺或氟西汀的協同作用，但哇巴因與金諾芬具有中度作用而且與依米丁具有強的相互作用。此外，這些特定的交互作用表示組合的效力可以通過特定地包含化合物來調整。
實例 3 依據本發明的所有三元和四元組合的測試
為了找到最佳組合，進行所有三元和四元組合的完全測試。
雖然大多數的三元組合可以將VP1表現降低至少70〜80％，但有兩種配方僅顯示中度降低（圖6）。氯硝柳胺（N）-哇巴因（O）-氟西汀（F）組合的結果特別有趣。由於N-O和O-F的組合沒有協同作用（圖5），我們預期N-O-F組合的作用必定來自N-F協同作用。事實上，N-O-F和N-F組合具有相似的抗EV71活性（圖3和圖4）。最後，我們研究了四元組合如何在EV71複製中影響VP1表現。如預期地，所有的四元組合皆顯示強的抗EV71作用，且N-E-A-F和N-E-O-A表現出與原始的五化合物配方相似的效力（圖5）。有趣的是，所有的成分都參與最大協同作用的構成；換句話說，當目標是最強效力時，所有的成分中沒有一個可以被省略。具體而言，雖然在此EV71複製試驗中，在正確劑量範圍的氟西汀具有很小的作用，但在此試驗中仍不能忽略氟西汀與其它化合物的特定協同作用。
實例 4 依據本發明的組合中使用的每種化合物之非抑制量的測試
由於所有化合物都以其非抑制量進行測試，因此這些分析中使用的這些化合物是相對量較低的，各自之範圍為5-50 nM。儘管它們的量少，仍進行了測試來檢查這些化合物是否可以被進一步減少，以了解組合的濃度可以被最佳化的可能性。
為了測試N-E-O-A或N-E-A-F組合中任何成分的稀釋是否可能引起抗EV71效力的損害。
當組合僅減少一種化合物時，這些新方案中沒有一個引起明顯的抗EV71功效變化（圖6至圖9）。這些結果表示這些方案可以藉由降低成分濃度來進一步最佳化。例如，在N-E-O-A方案中，哇巴因可被降到低至0.6 nM，並且總體抑制作用沒有任何變化（圖7）。同樣地，使用低至6 nM的氟西汀並未改變原始N-E-A-F方案的抗EV71效力（圖9）。尚進行了測試以了解是否可同時減少所有的成分而不會降低抗EV71作用，但其中一種成分可以一次性地進一步減少而用於兩種四元組合。發現同時減少所有的成分會嚴重降低它們的抗EV71功效（圖10）；當使用1：4的稀釋方案時，沒有觀察到抑制作用。因此，這些數據表示通過降低成分濃度的最佳化可能是高度複雜的過程，也許是來自這些成分之間的複雜相互作用。
雖然本說明書包含許多的具體細節，但這些具體細節不應被解讀為對本發明或要求保護的範圍的限制，而是應被解讀為對本發明的特定具體實施例特定的特徵之描述。在本說明書中在各具體實施例的內文中描述的某些特徵也可以在單個具體實施例中組合實施。相反地，在單個具體實施例的內文中描述的各種特徵也可以在多個具體實施例中個別地或以任何適合的適當子組合實施。此外，雖然特徵可以在上面被描述為以某些組合起作用，甚至是最初如此要求保護，但在一些情況下可自所要求保護的組合中去除一個或更多個特徵，而且所要求保護的組合可以針對子組合或子組合的變化。
無
當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明的前述發明內容以及以下實施方式。在圖式中：
圖1提供依據本發明的組合在不同濃度下的抗EV71作用之測定結果，其中RD細胞在指定化合物於5、0.5或0.05 μM之情況下以5的感染多樣性（MOI）感染EV71；使用第四種濃度0.005 μM於哇巴因；凝膠軌跡下面的數字表示在西方墨點法分析下VP1與波形蛋白訊號之間的比率；依據未處理的EV71感染細胞將這些比率標準化。
圖2提供在有或沒有五化合物處理的細胞中EV71 RNA的定量分析結果；其中RD細胞在有或沒有5化合物的組合之下被以5的感染多樣性（MOI）感染EV71。培養4小時後，分離細胞RNA。設計正向和反向引子來擴增EV71的5’ –UTR，內部對照為GAPDH。應用實時逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）來檢測EV71 RNA的表現。藉由ΔCt法量測EV71 RNA的相對量。使用0.05 μM之氯硝柳胺、依米丁、金諾芬及S -(+)-氟西汀；使用5 nM之哇巴因。
圖3提供依據本發明，存在各種二元組合之情況下使用VP1抗體對感染EV71的RD細胞進行西方墨點法分析；其中RD細胞在含有五種化合物中的兩種化合物的組合存在下感染EV71；而且印跡底部的數字表示未處理之對照組的相對VP1表現。使用0.05 μM之氯硝柳胺、依米丁、金諾芬及S -(+)-氟西汀；使用5 nM之哇巴因。
圖4提供依據本發明，存在各種三元組合之情況下來自感染EV71的RD細胞的蛋白質之抗VP1西方墨點法分析。RD細胞在含有五種化合物中的三種化合物的組合存在下感染EV71。印跡底部的數字表示未處理之對照組的相對VP1表現。使用0.05 μM之氯硝柳胺、依米丁、金諾芬及S -(+)-氟西汀；使用5 nM之哇巴因。
圖5提供依據本發明，存在四元組合之情況下下來自感染EV71的RD細胞的蛋白質之抗VP1西方墨點法分析。RD細胞在含有五種化合物中的四種化合物的組合存在下感染EV71。印跡底部的數字表示未處理的對照組之相對VP1表現。使用0.05 μM的氯硝柳胺、依米丁、金諾芬及S -(+)-氟西汀；使用5 nM的哇巴。
圖6提供在藉由連續稀釋氯硝柳胺或依米丁所製成的指定N-E-O-A組合存在下來自感染EV71的RD細胞的蛋白質之抗VP1西方墨點法分析。印跡底部的數字指明相對於未處理的對照組的VP1表現。使用0.05 μM和5 nM的金諾芬和哇巴因。分數是化學藥物的稀釋比。對於氯硝柳胺和依米丁，1/2、1/4及1/8分別表示25、12.5及6.25 nM的濃度。
圖7提供在藉由連續稀釋哇巴因或金諾芬所製成的指定N-E-O-A組合存在下來自感染EV71的RD細胞的蛋白質之抗VP1西方墨點法分析。印跡底部的數字指明相對於未處理的對照組的VP1表現。氯硝柳胺和依米丁的濃度是0.05 μM。對於哇巴因，1/2、1/4及1/8分別是2.5、1.25及0.6 nM。對於金諾芬，相同的分數組分別表示25、12.5及6.25 nM。
圖8提供藉由連續稀釋氯硝柳胺或依米丁所製成的指定N-E-A-F組合存在下來自感染EV71的RD細胞的蛋白質之抗VP1西方墨點法分析。印跡底部的數字指明相對於未處理的對照組的VP1表現。金諾芬和氟西汀的濃度是0.05 μM。對於氯硝柳胺和依米丁，1/2、1/4及1/8分別指25、12.5及6.25 nM。
圖9提供在藉由連續稀釋金諾芬或氟西汀所製成的指定N-E-A-F組合存在下來自感染EV71的RD細胞的蛋白質之抗VP1西方墨點法分析。印跡底部的數字指明相對於未處理的對照組的VP1表現。氯硝柳胺和依米丁的濃度是0.05 μM。對於金諾芬和氟西汀，1/2、1/4及1/8分別表示25、12.5及6.25 nM。
圖10顯示在連續稀釋的N-E-A-O或N-E-A-F組合存在下來自感染EV71的RD細胞的蛋白質之抗VP1西方墨點法分析。印跡底部的數字指明相對於未處理的對照組的VP1表現。對於1：1的條件，N、E、A及F的濃度是0.05 μM，O的濃度是5 nM。N：氯硝柳胺；E：依米丁；A：金諾芬；O：哇巴因；F：氟西汀。
無

Claims (19)

  1. 一種用於治療EV71感染的組合，該組合包含兩種或更多種在各自之非有效量的化合物並提供對抗EV71複製之不可預期的協同活性，其中該化合物係選自於由金諾芬（auranofin）、哇巴因（ouabain）、依米丁（emetine）、氯硝柳胺（niclosamide）及S-(+)-氟西汀（S-(+)-fluoxetine ）所組成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含氯硝柳胺及依米丁。
  3. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含氯硝柳胺及金諾芬。
  4. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含氯硝柳胺及哇巴因。
  5. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含氯硝柳胺及S-(+)-氟西汀。
  6. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含依米丁及哇巴因。
  7. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含依米丁及金諾芬。
  8. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含依米丁及S-(+)-氟西汀。
  9. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含哇巴因及金諾芬。
  10. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含哇巴因及S-(+)-氟西汀。
  11. 如申請專利範圍第1項之組合，該組合包含金諾芬及S-(+)-氟西汀。
  12. 如申請專利範圍第1項之組合，其中每種化合物的非有效量為低於人類個體的治療有效量的量。
  13. 如申請專利範圍第1項之組合，其中氯硝柳胺用於人類個體的非有效量為低於2 mg/天。
  14. 如申請專利範圍第1項之組合，其中哇巴因用於人類個體的非有效量為低於0.3 mg/天。
  15. 如申請專利範圍第1項之組合，其中金諾芬用於人類個體的非有效量為低於6 mg/天。
  16. 如申請專利範圍第1項之組合，其中依米丁用於人類個體的非有效量為低於60 mg/天。
  17. 如申請專利範圍第1項之組合，其中S-(+)-氟西汀用於人類個體的非有效量為低於20 mg/天。
  18. 一種用於治療EV71感染的醫藥組合物，包含治療有效量的如申請專利範圍第1至11項中任一項之組合。
  19. 一種用於治療手足口病（HFMD）的醫藥組合物，包含治療有效量的如申請專利範圍第1至11項中任一項之組合。
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