CN101869574B - 哇巴因在增强非小细胞肺癌细胞敏感性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及钠钾ATP酶抑制剂哇巴因在逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。具体是哇巴因可作为治疗非小细胞肺癌的增敏剂，与TRAIL联合使用用于非小细胞肺癌的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及钠钾ATP酶抑制剂哇巴因在逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病。江苏省近几年开展了以恶性肿瘤为主的全人口死因回顾性调查，结果显示男女性第1位死因均为恶性肿瘤，其死亡率占全部死因的27.41％。资料显示，2003年江苏省城市地区位于恶性肿瘤死亡前4位的分别是肺癌、胃癌、肝癌、食管癌；而农村地区为肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明显高于农村。尤其是通过分析1973至2004年几种主要恶性肿瘤的死亡情况发现，肺癌死亡率大幅上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5.65倍。由此可见，肺癌已经成为我省恶性肿瘤数一数二的“杀手”，严重威胁着我省人民的生存健康。
为什么在短短的几十年间，肺癌的发病率及死亡率有如此迅猛的发展趋势？1：大样品调查研究表明肺癌的主要危险因素为吸烟和大气污染，而近年来吸烟人数有增加的趋势，汽车尾气和工业废气的大量排放，又加重了大气环境污染的程度。因此，随着我省经济的发展，城市化、工业化进程的加快，空气污染将会越来越严重，这将不可避免地导致肺癌死亡率进一步增加。2：肺癌在早期时往往没有明显的症状，当有症状被诊断出来时，常常已经是局部晚期或晚期无法手术切除的情形。一般而言，新诊断的肺癌仅约不到20％的病人属于早期可以有机会接受手术切除的病患。而另外80％的晚期肺癌病人则失去了外科手术根治的最佳时机。3：到目前为止，对肺癌的治疗，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治疗干预手段。
临床上，肺癌通常分为小细胞与非小细胞肺癌两种类型，总的肺癌病例中，非小细胞肺癌(包括肺鳞癌，肺腺癌)约占80％。因此针对非小细胞肺癌的治疗研究是攻克肺癌的一项极其重要的课题，引起了全世界医学界的广泛关注。
如上所述，虽然手术治疗是治疗非小细胞肺癌的重要手段，但对绝大部分晚期肺癌病人来说手术治疗并不能有效解决肿瘤转移的问题。因此对于这些晚期或已经有远端转移的肺癌病人，全身性的化学治疗是非小细胞肺癌多学科综合治疗的主要策略之一。尤其是化疗与手术、放射等疗法综合运用能明显防止癌肿转移、复发，提高长期生存率。现在，非小细胞肺癌化疗已经初步形成共识，通常采用顺铂加泰索帝、紫杉醇、健择、诺维本等中的一种。根据患者的具体情况，选择不同的组合，可以达到提高疗效，降低毒性反应的目的，特别是出现了一些极具前景的新型靶向药物，其作用机制与传统化疗药物不同。传统化疗药物属于细胞毒性药物，是通过毒性杀死肿瘤细胞，但同时不可避免会伤害正常细胞。而靶向药物进入肿瘤细胞后，可以通过特异性作用于肿瘤生长的细胞信号途径，抑制肿瘤细胞的增殖、浸润、转移，不良反应轻，患者可以很好耐受。
在这些靶向药物中，TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)越来越受到人们的关注。TRAIL是由Wiley于1995年检索EST时首次发现并克隆的，是一种II型糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族，与相应受体结合后，可以快速诱导细胞发生凋亡。但与其它凋亡诱导分子显著不同的是，TRAIL主要杀伤转化细胞和肿瘤细胞，而正常细胞可以逃逸它的杀伤作用。体内研究表明，TRAIL可以明显抑制肿瘤生长，甚至彻底清除肿瘤。TRAIL的这种肿瘤细胞选择性杀伤作用使该蛋白在抗肿瘤方面具有很强的开发价值与潜力。但是值得注意的是，并非所有的肿瘤细胞对TRAIL都具有很强的敏感性。体外研究表明，有些肿瘤细胞株对TRAIL诱导凋亡作用具有很强的耐受性。这可能与肿瘤细胞表面缺乏TRAIL受体(DR4，DR5)，或分布有假受体(DcR1，DcR2)，或过度表达一些抗凋亡蛋白如bcl-2，FLIIP，survivin有关。因此TRAIL的抗肿瘤作用因不同的肿瘤类型而异。
研究表明，非小细胞肺癌细胞，如A549对TRAIL有明显的耐受性，但具体的机理目前并不清楚。为了充分发挥TRAIL对肿瘤细胞的选择杀伤作用，有必要寻找新的策略以逆转非小细胞肺癌细胞株对TRAIL的敏感性，从而达到运用TRAIL有效治疗非小细胞肺癌的目的。而作为一个理想干预手段必须具备以下特点：1：显著性增强TRAIL对非小细胞肺癌细胞的细胞凋亡诱导作用；2：对非小细胞肺癌细胞具有高度的选择性；即不会对正常细胞及机体产生较强的非特异性的毒副作用。事实上，虽然有些化疗药物能明显逆转非小细胞肺癌细胞株A549对TRAIL的敏感性，但这些化疗药物本身对肿瘤细胞的选择性不够强，因此常常以造成对正常组织与细胞的损伤为代价。
钠钾ATP酶是分布于真核生物细胞膜重要的离子转运泵，通过消耗ATP能量将钠离子与钾离子逆浓度梯度进行跨膜转运，从而维持细胞膜内外稳定的钠钾离子浓度梯度、细胞膜静息电位与细胞渗透压平衡。在兴奋性细胞如神经元细胞或心肌细胞中，钠钾ATP酶与动作电位产生、兴奋信号传递密切相关。在非兴奋性细胞如肾小管上皮细胞中，钠钾ATP酶是肾小管对水分、钠离子进行重吸收、营养物质摄取的关键蛋白，对维持机体电解质平衡、酸碱平衡、营养物质正常利用发挥至关重要的作用，鉴于此，机体平均1/3ATP能量用于维持该泵的正常运转。
从天然植物洋地黄中提取的强心苷成分是钠钾ATP酶抑制剂与细胞膜钠钾ATP酶α亚基有很强的亲合力，结合后通过构象改变抑制钠钾ATP酶对Na+，K+离子的转运能力，具有多种生物活性。自1785年W.Withering使用紫花洋地黄叶(Digitalis purpurea)治疗水肿以来，至今已经在夹竹桃科、玄参科、十字花科、卫矛科等10几个科的100多种植物中发现强心苷，常见的较重要的有洋地黄毒苷(Digitoxin)，异羟基洋地黄毒苷(Digoxin)，夹竹桃苷(Oleandrin)，乌本苷(ouabain)等。中药洋地黄类成分长期以来一直用于治疗充血性心力衰竭及节律性障碍等心脏疾病，但同时该类成分也具有明显的抗肿瘤效果。研究表明，强心苷如digoxin，oleandrin以及ouabain能诱导多种肿瘤细胞，如淋巴瘤细胞、前列腺癌细胞、神经胶质瘤细胞的凋亡或坏死，从而具有明显的抗肿瘤效果。
强心苷的这种抗肿瘤作用通常认为是由强心苷的细胞毒性引起的，因此人们对钠钾ATP酶物质是否能用于肿瘤治疗产生怀疑。但是越来越多的研究表明，强心苷，如哇巴因在非毒性剂量下也能显著性抑制肿瘤细胞的生长和转移。遵循这样的思路，我们在前期的工作中发现钠钾ATP酶抑制剂哇巴因能在非毒性剂量(20-150nM)下很显著性地增强非小细胞肺癌细胞对TRAIL的敏感性，从而逆转非小细胞肺癌细胞对TRAIL的耐受性。因此本研究发明钠钾ATP酶抑制剂在抗肿瘤药物制备中的新用途。
发明内容
本发明的目的是提供钠钾ATP酶抑制剂在抗肿瘤药物制备中的新用途，即作为抗肿瘤增敏剂，该增敏剂能能显著逆转非小细胞肺癌细胞对TRAIL耐受性。
本发明公开了哇巴因在增强非小细胞肺癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)敏感性中的应用。
基于上述应用，哇巴因可作为治疗非小细胞肺癌的增敏剂，与TRAIL联合使用用于非小细胞肺癌的治疗。
哇巴因也可以与TRAIL一起制成药物组合物，从而在制备治疗非小细胞肺癌的药物中应用。
上述所说的应用中，哇巴因的剂量为(20-150nM)。
本发明中经实验显示，哇巴因能显著性提高非小细胞肺癌细胞膜DR4与DR5mRNA的表达量，上调DR4与DR5可能是哇巴因增强TRAIL诱导的A549细胞凋亡的重要手段。在毒性实验中显示，在明显诱导A549细胞凋亡的情况下，TRAIL+哇巴因对正常细胞无明显的毒性。
通过细胞水平与裸鼠实验，表明TRAIL与哇巴因的药物组合能使非小细胞肺癌细胞凋亡率接近90％，体内抗肿瘤实验结果表明这两种药的组合使肺癌抑制率达到70％以上。因此哇巴因除了具有强心利尿的传统药理作用外，尚能作为效果很好的抗肿瘤增敏剂。
附图说明
图1：哇巴因增强非小细胞肺癌细胞A549对TRAIL的敏感性图2：哇巴因剂量依赖性地增强非小细胞肺癌细胞A549对TRAIL的敏感性图3：哇巴因联用TRAIL对非小细胞肺癌细胞A549核碎裂图4：哇巴因联用TRAIL对非小细胞肺癌细胞A549caspase3活性激活图5：哇巴因选择性增强非小细胞肺癌细胞对TRAIL的敏感性图6：哇巴因上调A549细胞表面死亡受体DR4与DR5mRNA表达水平图7：哇巴因上调A549细胞表面死亡受体DR4与DR5分布图8：哇巴因与TRAIL联用抑制裸鼠接种A549肿瘤生长曲线图9：哇巴因与TRAIL联合应用抑制裸鼠接种A549肿瘤生长图。
具体实施方式
实验材料哇巴因、DAPI、PI、DEPC、Trizol购自Sigma公司，A549非小细胞肺癌细胞株购自ATCC公司。DMEM细胞培养液、胰酶购自美国Hyclone公司。caspase3检测试剂盒购自Biovision公司。EGFP-Annexin V为南京大学医药生物技术国家重点实验室表达。流式细胞仪FACS Calibur(美国Becton Dickson公司)，DR4与DR5抗体购自美国Milipore公司，半干半湿法蛋白质转膜仪(美国Biorad公司)，DNA凝胶电泳仪(南京大学电子设备厂)。逆转录体系dNTP、oligo(dT)18、RNase inhibitor、逆转录酶、PCR试剂盒均购自Takara公司。琼脂糖凝胶、EB购自南京大治生物公司。LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。
实施例一Annexin V/PI流式细胞仪法检测TRAIL与哇巴因联用致A549细胞凋亡非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量6×104/孔接种于24孔细胞培养板中。待细胞贴壁生长完全后，加入药物分别为TRAIL10ng/ml，TRAIL 10ng/ml+哇巴因100nM，TRAIL 20ng/ml，TRAIL 20ng/ml+哇巴因100nM，TRAIL 50ng/ml，TRAIL 50ng/ml+哇巴因100nM，TRAIL 100ng/ml，TRAIL100ng/ml+哇巴因100nM，TRAIL 200ng/ml，TRAIL 200ng/ml+哇巴因100nM，TRAIL400ng/ml，TRAIL 400ng/ml+哇巴因100nM，每组3个孔(图1)，或分别为TRAIL100ng/ml+哇巴因10nM，哇巴因10nM，TRAIL 100ng/ml+哇巴因20nM，哇巴因20nM，TRAIL100ng/ml+哇巴因30nM，哇巴因30nM，TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，哇巴因50nM，TRAIL100ng/ml+哇巴因100nM，哇巴因100nM，每组3个孔(图2)。
细胞经药物处理12h后收集，用预冷PBS洗2遍，加入EGFP标记的Annexin V(2μL)，冰上孵育20min，迅速加入PI(1μg/mL)，于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，Annexin V(+)/PI(-)为早期凋亡细胞。
结果：采用Annexin V/PI双染法考察A549细胞对TRAIL的敏感性，发现只有在使用TRAIL达到400ng/ml时，才使得A549细胞有轻微的细胞凋亡发生，表明该细胞对TRAIL并不敏感(图1)。同样，哇巴因在使用浓度到100nM时，本身对肿瘤细胞具有轻微的细胞凋亡作用(图2)，但是两药的联用能极显著性地增强A549细胞对细胞凋亡的敏感性，从图1中可知，在哇巴因使用浓度为100nM时，TRAIL能剂量依赖性地增强A549细胞凋亡，在TRAIL使用浓度达到100ng/ml时，已经能使细胞凋亡达到75％以上，表明TRAIL与哇巴因组合是很有前景的药物组合。同样地，从图2中可知，当TRAIL使用浓度为100ng/ml时，哇巴因也能剂量性地增强A549细胞凋亡。
实施例二荧光显微镜法检测TRAIL与哇巴因联用致A549细胞核碎裂非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量1×105/孔接种于6孔细胞培养板中。培养板中预先放置灭菌过的盖玻片面，待细胞贴壁生长至60％时，加入药物处理，分别为对照组、TRAIL 100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，TRAIL 100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，每组重复3个孔(图3)。处理12h后，将载玻片取出，冷PBS洗涤2次，滴加DAPI(1μg/ml)数滴后于荧光显微镜上观察，拍片。
结果：DAPI是一种常见的细胞核染料，能掺入到核DNA中，在激发光作用下，呈现蓝色核，通过观察发现(图3)，单用哇巴因50nM与TRAIL100ng/ml时，细胞核相对完整，没有明显的细胞凋亡核碎裂，但是当TRAIL与哇巴因联用时，细胞核破碎明显，进一步表明哇巴因能增强A549细胞对TRAIL的敏感性。
实施例三TRAIL与哇巴因对caspase3水解酶活性的影响非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量6×104/孔接种于24孔细胞培养板中。加入药物处理，分别为对照组、TRAIL100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，TRAIL 100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，每组重复3个孔(图4)。处理12h后，将细胞用胰酶消化后，加入FITC标记的DEVD.fmk 1-2μl，于冰上孵育30min后，PBS洗2遍，流式细胞仪分析FITC荧光强度。
结果：当细胞处于凋亡状态时，会引起caspase3的激活，从而使细胞中诸多蛋白质发生非选择性切割，最终使细胞走向凋亡。采用流式细胞仪方法考察TRAIL与哇巴因对caspase3水解酶活性的影响，底物为FITC-DEVE.fmk。其基本原理在于当细胞内caspase3酶激活时，会切割FITC-DEVD.fmk，从而使细胞内荧光能在488nm激发光激发下被检测到(图4)。结果与免疫荧光相符，在单用TRAIL或哇巴因情况下，细胞内caspase3酶激活不明显，但是两药的联用，细胞内caspase3被激活。
实施例四毒性实验HEK293与A549细胞分别于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量5×103/孔接种于96孔细胞培养板中。加入药物TRAIL 100ng/ml+哇巴因100nM处理0，8，12，24，48h，每组重复3个孔(图5)，处理12h后，收集细胞，按实施例一检测A549与HEK293细胞凋亡。
结果：为考察TRAIL与哇巴因的联用增效作用是否对正常细胞具有毒性副作用。本研究比较TRAIL100ng/ml+哇巴因(100nM)在正常细胞株(HEK293)及肿瘤细胞株(A549)上的细胞毒性差异。结果见图5，在明显诱导A549细胞凋亡的情况下，TRAIL+哇巴因对正常细胞无明显的毒性，这些数据说明TRAIL+哇巴因对肿瘤具有明显的选择性，是具有开发前景的治疗方案。
实施例五哇巴因对A549细胞DR4与DR5mRNA与蛋白质表达的影响1、细胞mRNA的提取所有物品均提前用DEPC处理并灭菌。非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量1×105/孔接种于6孔细胞培养板中。铺细胞于6孔板，等细胞长到80％-90％后，加药(分别为哇巴因0，50，100，200nM)，处理12h后收集细胞，PBS洗涤一次。加入1mL TRIZOL，用枪吹打至细胞完全溶解，室温放置5min。加入200μL的氯仿，振荡15s后放置2-3min，2-8℃12000g离心15min。吸取上层，转移到干净eppendorf管中，加入500μL异丙醇，放置10min，2-8℃下12000g离心10min，可见RNA沉淀。弃上清，加入1mL75％乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，在空气中晾干RNA沉淀，加入30μL DEPC处理的DDW溶解。
2.、逆转录PCR采用20μL逆转录体系，将提取的模板RNA约1μg与5×buffer4μL，dNTP(10mM)2μL，oligo(dT)18(10μmol/L)1μL，RNase Inhibitor1μL，逆转录酶1μL混匀后30℃水浴10min，42℃水浴30min，98℃水浴10min。取等量的cDNA做模板做PCR扩增，采用20μL PCR反应体系：DDW15.2μL，10×Taq buffer2.5μL，dNTP2μL，Mg2+2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA模板1μL，Taq polymerase0.3μL。PCR条件：94℃热变性4min后；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s(循环数为20-45个)；最后72℃延伸7min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB显色。
3、流式细胞仪检测细胞膜DR4与DR5分布非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10％胎牛血清培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2的湿润无菌环境。细胞长至80％-90％融合时，用PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化。按细胞量1×105/孔接种于6孔细胞培养板中。收集药物处理后细胞，PBS洗涤2遍后，加入含2％BSA的PBS预包被30min后，洗涤，加入4μl DR4或DR5抗体，孵育1h后，洗涤，加入FITC标记二抗孵育1h，PBS洗涤2次后，加入1μg/ml PI后，流式细胞仪检测细胞FITC的荧光强度。
结果：TRAIL死亡受体是决定肿瘤细胞对TRAIL是否有敏感性的重要因素，本研究发现哇巴因能显著性提高A549细胞内DR4与DR5mRNA的表达量(图6)。对细胞膜DR4与DR5包被特异性抗体及FITC标记的二抗后，流式细胞仪技术分析细胞膜DR4与DR5的表达情况(图7)，结果显示哇巴因能显著性增加细胞膜表面DR4与DR5的分布。
实施例六哇巴因联用TRAIL用药的体内抗肿瘤作用取指数生长期的A549细胞，经胰酶消化后，用PBS洗2遍。将每只100μL107个A549细胞皮下注射到7周龄的裸鼠右侧背部皮下，一周后形成原位肿瘤，将小鼠分成4组，每组8只。然后开始治疗，分别用PBS、哇巴因2μg/只、TRAIL100μg/只、哇巴因/TRAIL联合治疗组进行裸鼠腹腔注射，每天注射一次，共治疗15次。从开始治疗后每三天测量肿瘤大小，并按下列公式计算肿瘤体积：0.5236×L1×(L2)2，其中L1为肿瘤长轴，L2为肿瘤短轴。开始治疗后第25天，处死小鼠，进行数据分析。结果：接种A549细胞于裸鼠形成人源肺癌实体瘤，由于正常情况下，A549低表达TRAIL受体DR4与DR5，对TRAIL诱导凋亡作用具有很强的抵抗性，所以单用TRAIL抗肿瘤效果并不显著。而通过TRAIL与哇巴因联合治疗异体接种A549负瘤裸鼠，显示出明显的治疗效果，肿瘤体积显著小于其他三组(图8，9)。
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1. 哇巴因与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL联用在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
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