JP2721817B2 - ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体 - Google Patents
ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、たとえば、人の抗原性疾患の予
防、治療、診断などの医学及び薬学分野や生化学的試
薬、生体高分子の精製試薬など薬理学分野、生化学分野
等の如き広い分野において有用な抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンの生産をヒト体外で工業的に行うことを可能と
するヒト／ヒト・ハイブリドーマの創製、その他各種の
融合細胞株の形成に利用できる融合パートナー（Fusion
partner）として有用な新規なヒトＢセル・リンパ芽球
細胞変異株に関する。 【０００２】本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リ
ンパ芽球細胞変異株を利用して創製される抗原特異的ヒ
ト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドーマ、
更には該ハイブリドーマが生産する抗原特異的ヒト免疫
グロブリンにも関する。 【０００３】更に詳しくは、本発明はヒトＢセル・リン
パ芽球細胞から導かれた変異株であつて、且つ下記
（ｉ）〜（ｖ） （ｉ） ６−チオグアニン耐性である、（ii） ウワバ
イン耐性である、（iii) ＨＡＴＯ含有培地で死滅す
る、（iv） 免疫グロブリンＩｇＧ及びＩｇＭを実質的
に生産しない、（ｖ） 基礎培地ＲＤＦ中にインシユリ
ン、トランスフエリン、セレニウム、エタノールアミ
ン、β−メルカプトエタノール及び血清アルブミンを含
む無血清培地において増殖可能である、 の形質（phenotype）特性を有することを特徴とするヒ
トＢセル・リンパ芽球細胞変異株に関する。 【０００４】本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リ
ンパ芽球細胞変異株を融合パートナーとするヒト／ヒト
・ハイブリドーマ、たとえば、ヒト胃癌患者のヒトリン
パ球細胞の如き悪性腫瘍患者のヒトリンパ球細胞と該融
合パートナーとのヒト／ヒト融合細胞株である抗原特異
的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドー
マ、更には、このようなヒト／ヒト・ハイブリドーマが
生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンにも関する。 【０００５】従来、ヒト／ヒト・ハイブリドーマの形成
に利用できるヒトリンパ系株化細胞についていくつか知
られている。そのような融合パートナーとして利用でき
るヒトリンパ系株化細胞の例としては、Immunology Tod
ay, vol. ４、No. ３、１９８３、７３頁のＴＡＢＬＥ
ＩＩに記載のＳＫＯ−００７（Ｉｇε，λ）、ＴＭ−
Ｈ２（Ｉｇλ，κ）、ＤＨＭＣ（Ｉｇγ，λ）、ＧＭ１
５００（Ｉｇγ２，κ）、ＫＲ−４（Ｉｇγ，κ）、Ｌ
ＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２（Ｉｇγ１，κ）、ＧＭ０４
６７.３（Ｉｇμ，λ）、Ｈ３５１.１（Ｉｇμ，κ）、
ＵＣ７２９−６（Ｉｇμ，κ）、ＧＭ４６７２（Ｉｇγ
２，κ）などを挙げることができる。しかしながら、こ
れら従来公知のヒトリンパ系株化細胞は、上記文献のＴ
ＡＢＬＥＩＩに記載され、上記にカツコで示したよう
に、程度の差こそあれ免疫グロブリンを実質的に生産す
る点で、その融合パートナーとしての利用に好ましい株
とは言い難く、その利用に制約をうける。その理由は、
これらの融合パートナーと例えば癌患者のヒトリンパ球
細胞とから導かれるヒト／ヒト・ハイブリドーマが生産
するヒト免疫グロブリンは、該融合パートナーが本来生
産する免疫グロブリンが、該癌患者のヒトリンパ球細胞
に由来する目的とする免疫グロブリンに混入したポリ・
クロナリテイ（polyclonality）形態で得られるため、
目的とする免疫グロブリンの単一性（mono-clonality）
が失われるからである。 【０００６】本発明者は、上述のような制約から解放さ
れた融合パートナーを創製すべく研究を行つてきた。 【０００７】その結果、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞か
ら導かれた変異株であつて、免疫グロブリンを実質的に
生産しない新しいヒトリンパ系株化細胞を創製すること
に成功した。 【０００８】本発明者は、それ自体公知のヒトＢセル・
リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２［微工研寄託受託拒否通知
書、通知番号：６０微寄文第１６２１号］から、薬剤耐
性化手法を利用した特定の変異株形成操作を経て、それ
自体増殖能を有するが免疫グロブリンを実質的に生産し
ない新規ヒトリンパ系株化細胞を創製し且つこの新規ヒ
トＢセル・リンパ芽球細胞変異株は、ヒト／ヒト・ハイ
ブリドーマの創製その他各種の融合細胞株の形成に利用
できる融合パートナーとして、前述の如き制約から解放
された単一性の高い免疫グロブリンの生産を可能とする
融合細胞株の形成に有用な新規ヒトＢセル・リンパ芽球
細胞変異株であることを発見した。 【０００９】更に、本発明者は、このヒトＢセル・リン
パ芽球細胞変異株を用いて、ヒト胃癌患者のヒトリンパ
球細胞と該ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株とのヒト
／ヒト融合細胞株である抗原特異的ヒト免疫グロブリン
生産性ヒト／ヒト・ハイブリドーマの創製に成功し、且
つ該抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産に成功した。 【００１０】従つて、本発明の目的は、医学、薬理学、
生化学分野等の広い分野において有用な新規ヒトＢセル
・リンパ芽球細胞変異株を提供するにある。 【００１１】本発明の他の目的は、上記新規ヒトＢセル
・リンパ芽球細胞変異株と悪性腫瘍患者のヒトリンパ球
細胞から導かれる抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性
ヒト／ヒト・ハイブリドーマ、更にはその生産する抗原
特異的ヒト免疫グロブリンを提供するにある。 【００１２】本発明によれば、ヒトＢセル・リンパ芽球
細胞から導かれた変異株であつて、且つ下記（ｉ）〜
（ｖ） （ｉ） ６−チオグアニン耐性である、（ii） ウワバ
イン耐性である、（iii) ＨＡＴＯ（ヒポキサンチン、
アメソプテリン、チミジン及びウワバイン）含有培地で
死滅する、（iv） 免疫グロブリンＩｇＧ及びＩｇＭを
実質的に生産しない、（ｖ） 基礎培地ＲＤＦ中にイン
シユリン、トランスフエリン、セレニウム、エタノール
アミン、β−メルカプトエタノール及び牛血清アルブミ
ンを含む無血清培地において増殖可能である、 の形質特性を有することを特徴とするヒトＢセル・リン
パ芽球細胞変異株が提供できる。 【００１３】本発明の新規Ｂセル・リンパ芽球細胞変異
株は、例えば、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞を無血清培
地で培養適応させ、適応した細胞群から実質的に免疫グ
ロブリン生産能を欠如する細胞をスクリーニングし、こ
のスクリーニングした細胞を６−チオグアニン含有無血
清培地で培養適応させ、斯くて形成された６−チオグア
ニン耐性細胞を突然変異剤で処理したのち、ウワバイン
含有無血清培地で培養適応させ、得られた耐性細胞を６
−チオグアニン及びウワバインの両者を含有する無血清
培地でクローン化することにより創製することができ
る。 【００１４】この際利用する無血清培地の例としては、
基礎培地ＲＤＦ（基礎培地ＲＰＭＩ１６４０：基礎培地
ＤＭＥ：基礎培地Ｆ１２＝２：１：１の混合基礎培地）
に、インシユリン、トランスフエリン、セレニウム、エ
タノールアミン、β−メルカプトエタノール及び牛血清
アルブミンの適量を配合した無血清培地を好ましく例示
することができる。他の無血清培地も利用でき、培養適
応させるヒトＢセル・リンパ芽球細胞及び基礎培地の種
類、上記他の配合成分の種類及びそれらの量などに応じ
て、実験的に適宜に選択、変更、決定して利用すること
ができる。又、利用する突然変異剤の例としては、ＭＮ
ＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン）、ＥＭＳ（メチルスルホン酸エチル）、ＡＡＢ
（４−アミノアゾベンゼン）、ＡＡＦ（２−アセチルア
ミノフルオレン）、ＡＦ−２（２−（２−フリル）−３
−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド）、ＢＰ
ox（ベンゾピレンオキシド）、ＢＺＤ（ベンチジン）、
ＤＡＢ（Ｎ,Ｎ′−ジメチルアミノアゾベンゼン）、Ｄ
ＡＮ（ジアミンアニソール）、ＤＢＡ（ジベンズアント
ラセン）、ＤＢＥ（ジブロモエタン）、ＤＢＰ（ジブロ
モクロロプロパン）、ＤＭＮ（ジメチルニトロサミ
ン）、ＥＮＮＧ（Ｎ−エチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン）、ＥＮＵ（エチルニトロソウレア）、
ＨＦＡ（Ｎ−ハイドロキシ−２−アセチル−アミノフル
オレン）、３ＭＣＡ（３−メチルコランスレン）、ＭＭ
Ｓ（メチルスルホン酸メチル）、２ＮＡ（２−ナフチル
アミン）、ＮＡＡＡＦ（Ｎ−アセトオキシアセチルアミ
ノフルオレン）、ＮＢＡ（Ｎ−ニトロソジブチルアミ
ン）、４ＮＱＯ（４−ニトロキノリン−１−オキシ
ド）、ＯＡＴ（ｏ−アミノアゾトルエン）、ＰＩ（プロ
ピレンイミン）、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）、ＴＤ
Ｓ（トルエンジアミノスルフエイト）、ＴＯＸ（トキサ
フエン）、ＶＣ（ビニルクロライド）などの公知変異剤
を例示することができる。 【００１５】培養適応は、例えば３７℃、５％ＣＯ2条
件下で行なうことができ、また、クローン化はそれ自体
公知の例えば限界希釈法を利用して行なうことができ
る。培養適応手段、スクリーニング手段、突然変異剤処
理手段などの各単位手段それ自体はよく知られており、
適宜に選択利用することができる。 【００１６】上記において利用するヒトＢセル・リンパ
芽球細胞の例としては、前述したそれ自体公知のヒトＢ
セル・リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２（微工研寄託受託拒否
通知書、通知番号：６０微寄文第１６２１号）のほか
に、例えば、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＩＭ−９（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ １５９）、ヒトＢセル・リンパ芽球細
胞ＮＣ−３７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１４）及びヒトＢ
セル・リンパ芽球細胞ＣＣＲＦ−ＳＢ（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ １２０）などの如き公知株化細胞を例示することが
できる。 【００１７】上述のようにして得ることのできる前記
（ｉ）〜（ｖ）の形質特性を有するヒトＢセル・リンパ
芽球細胞ＷＩ−Ｌ２から導かれた変異株の１つはＨＩＨ
／ＴＯ１株（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：６
０微寄文第１１９８号）と命名された。 【００１８】本発明によれば、上述のようにして得られ
るヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株を融合パートナー
として利用し、抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産を
ヒト体外で工業的に行うことを可能とするヒト／ヒト・
ハイブリドーマの創製を包含して、たとえば悪性腫瘍患
者のヒトリンパ球細胞と該変異株とのヒト／ヒト・ハイ
ブリドーマの創製、その他各種の融合細胞株を創製する
ことができる。 【００１９】以下、そのような融合細胞株創製の一態様
について述べる。例えば、ヒト胃癌患者のヒトＢセルを
用い、これを本発明のヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異
株と人間の体外で融合させ、たとえば胃癌、肺癌、悪性
黒色腫細胞などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒト・ハイブリドー
マを産生することができる。 【００２０】この融合細胞を産生する融合操作それ自体
はよく知られており、本発明で利用することができる。
例えば、溶媒中で融合促進剤の存在下に、ヒト胃癌患者
のヒトＢセルと本発明のヒトＢセル・リンパ芽球細胞変
異株とを接触させることにより行うことができる。この
ような融合方法の例としては、たとえば仙台ビールス
（ＨＶＪ）、ポリエチレエングリコールなどの如き融合
促進剤を用いる方法を例示できる。更に、高電圧で電気
的に融合する方法［例えば、U. Zimmerman et. al.,
“Electric Field-Mediated Cell Fusion”；The Journ
al of Biological Physics, １０，４３−５０，１９８
２。U. Zimmerman et. al., “Electric Field-Induced
Cell-to-Cell Fusion”；The Journal of Membrene Bi
ology, ６７，１６５−１８２，１９８２。U. Zimmerma
n，“Electric Field Mediated Fusion and Related El
ectrical Phenomena”；Biochimica et Biophysica Act
a ６９４，２２７−２７７，１９８２。等］を利用して
行なうこともできる。 【００２１】前者の態様に於ては、例えば、水性媒体
中、上記例示の如き融合促進剤の存在下、所望によりお
だやかな撹拌を加えて系を均一にし、前記ヒト胃癌患者
のヒトＢセルと本発明変異株から成る融合細胞が産生さ
れる時間、たとえば数分間のオーダーで両者を接触させ
ることにより、所望の融合細胞を産生することができ
る。利用する水性媒体の例としては、水、生理食塩水、
５％ジメチルスルホキシド水溶液、５％グリセロール水
溶液などを例示することができる。 【００２２】斯くて所望の融合細胞が産生された系を、
たとえば遠心分離して細胞群を採取し、再び適当な培地
たとえば１０％仔牛血清を含有させた。前記（ｖ）無血
清培地にＨＡＴＯを加えた培地に、採取した該細胞群を
分散させ、この分散液を例えばマイクロ・タイター・プ
レートの穴に、夫々、一定量づつ分取注入し、たとえば
５％ＣＯ2の存在下、３７℃で培養し、各穴中の培養液
を例えば３日毎に新しい培養液と取りかえ、たとえば２
週間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調
べ、コロニーの認められた試料の培養液を採取し、ヒト
免疫グロブリンの有無をたとえば125Ｉを用いたラジオ
・イムノ・アツセイや酵素抗体法により検出することに
より、所望のコロニーを選別することができる。 【００２３】このようにして選別されたヒト免疫グロブ
リンの生産の認められたコロニーを、新しい培養液に移
して培養し、融合細胞を増殖させることにより融合細胞
クローンを取得することができる。更に、必要に応じ
て、サブ・クローニングして、所望のヒト胃癌、肺癌、
悪性黒色腫などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免
疫グロブリン生産性クローンを得ることができる。 【００２４】上述の態様で、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セ
ルと本発明ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株から産生
された抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイ
ブリドーマＴＯＳ／Ｇ５株の細胞生化学的性質を以下に
示す。 【００２５】(１) ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）分
泌（生産）、(２) 倍加時間（ダブリング・タイム）
［於（ｖ）無血清培地］約４０時間、(３) ＤＮＡ含量
が正常ヒトリンパ球の２倍以上、(４) 上記（１）のＩ
ｇＭはヒト株化細胞ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（胃癌）に対して
結合性を示す、(５) ＨＡＴＯ含有培地（ヒポキサンチ
ン、アメソプテリン、チミジン及びウワバイン含有培
地）中で分裂増殖可能である。 【００２６】尚、相対ＤＮＡ含量（正常ヒトリンパ球の
ＤＮＡ含量に対する比率）は、ハイブリドーマをプロピ
ジウム・アイオダイドで染色したのち、フローサイトメ
ーター（flow cytometer）で分離分析する方法によつて
決定された。 【００２７】本発明によれば、上述のようにして産生す
ることのできるたとえばヒト胃癌患者のヒトＢセルと本
発明ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株から導かれた抗
原特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト融合細胞株を
利用して、抗原特異的ヒト免疫グロブリンを得ることが
できる。該抗原特異的ヒト免疫グロブリンは上記ヒト／
ヒト融合細胞株を培地に培養し、その培養物より抗原特
異的ヒト免疫グロブリンを採取することにより製造でき
る。 【００２８】例えば、上記ヒト／ヒト融合細胞株を適当
な培地たとえば前記（ｖ）の培地で培養し、培養液を採
取することによりヒト胃癌、肺癌、悪性黒色腫の如きガ
ン関連抗原に特異的に結合する免疫グロブリン含有物質
を得ることができる。精製はたとえば、硫安分画法、ア
フイニテイークロマトグラフイー、ゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフイー、電気泳動法などの如き生体液か
ら免疫グロブリンを採取、精製する際に利用できると同
様な精製手段を利用して行なうことができる。本発明に
よれば、前述した融合細胞クローン又はその培養液から
ガン関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン含
有物質又は該免疫グロブリンを取得するに際し、抗原性
組織（例えば癌組織）を一度、免疫物質生産能を欠如す
るか若しくは生産能の極めて弱い生体たとえばヌード・
マウス（nude mouse）などに植えつけ組織を維持した
後、その組織に対して或いは培養系にもどされた組織に
対して反応するヒト免疫グロブリン（抗体）を探し出
し、これを分離するのが有利である。 【００２９】上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に利
用できる培地の例としては、前記（ｖ）の無血清培地の
ほかに、例えば、基礎培地ＲＤＦに牛胎児血清、仔牛血
清、成牛血清、ヒト血清などの如き血清を含有させた培
地、基礎培地ＲＰＭＩ１６４０に上記の如き血清を含有
させた培地などを例示することができる。又、培養条件
としては、たとえば５％ＣＯ2の存在下で３７℃の条件
を例示できる。 【００３０】上述のようにして得ることのできる本発明
のガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリンの例として、
前述したヒト／ヒト・ハイブリドーマＴＯＳ／Ｇ５株の
生産する本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンを例示
できる。その特性を以下に示す。 【００３１】(イ) ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）で
あつて、(ロ) ヒト株化細胞ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（胃癌）
及びヒト株化細胞Ａ５４９（肺癌）に対して結合力を示
す、(ハ) Ｈ鎖（heary chain）及びＬ鎖（light chai
n）より成り、分子量が約１８万である。 【００３２】上記ヒト株化細胞ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（胃
癌）はＡＴＣＣ ＨＴＢ１０３として、又ヒト株化細胞
Ａ５４９（肺癌）はＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５としてＡＴ
ＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ン）から自由に入手できる。 【００３３】本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリン
は、たとえばヒト胃癌、肺癌、脳腫瘍、悪性黒色腫など
の如きヒト癌への作用抗体或いはそれ自体の作用でこれ
ら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、更
に、ヒト体外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補
体もしくはＴ−リンパ球（マクロフアージ）の助けをか
りて癌細胞の増殖抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせた
りすることができる。更にまた、ヒト体外で量産された
これら癌特異的抗体をキヤリアーとして利用して、例え
ば化学療法剤結合−ヒト・モノクロナル抗体、インター
フエロン結合−ヒト・モノクロナル抗体、高分子毒素結
合−ヒト・モノクロナル抗体、薬物入りリポゾーム結合
−ヒト・モノクロナル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制
や死滅のはたらきをさせたりするのに有用である。ま
た、本発明のヒト・モノクロナル抗体をキヤリアーとし
て利用し、これに放射線感受性物質を結合させて患者に
投与し、癌細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を
検知し放射線療法に利用することができる。このような
癌に対する利用に際しては、ヒト・モノクロナル抗体と
して完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法
で特異的抗原認識部位を含むより小さな分子に切断して
用いたり、或は、そのような小さな分子もしくは特異的
抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分と
結合させて、より有効性のある修飾ヒト・モノクロナル
抗体を化学的手法で創製して用いることもできる。 【００３４】以下、実施例により、本発明の数態様につ
いて更に詳しく説明する。 【００３５】 【実施例】実施例１ ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株。 【００３６】ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２
（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：６０微寄文第
１６２１号）を、基礎培地ＲＤＦ中にインシユリン、ト
ランスフエリン、セレニウム、エタノールアミン、β−
メルカプトエタノール及び牛血清アルブミンの適量を含
有する無血清培地で培養適応させる。該無血清培地を分
注した９６穴マイクロタイタープレートに１ cell／wel
lとなるように植えこみ、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で
限界希釈法によりクローニング操作を行なう。約１ケ月
経過後、増殖してきた５０穴より免疫グロブリンＩｇＧ
及びＩｇＭを実質的に培地中に生産していないクローン
を１つ選び出した。 【００３７】このクローンを、まず０.１μＭの６−チ
オグアニンを含む前記と同様な無血清培地中で培養適応
させる。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下で、継代培
養をくり返すごとに、６−チオグアニン濃度を０.２μ
Ｍ、０.５μＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭ、１０μＭ、
１５μＭ、２０μＭと段階的に上げて行ない、最終的に
２０μＭの６−チオグアニン含有無血清培地中で増殖可
能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法によるクロ
ーニング操作で選別する。 【００３８】この細胞を、１μｇ／ｍｌの突然変異剤Ｍ
ＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン）を含有する基礎培地ＲＤＦ中で、５％ＣＯ2、
３７℃の条件下で３時間培養した後、前記と同様な無血
清培地で洗浄し、洗浄した細胞を２０μＭの６−チオグ
アニン及びウワバインを含む前記と同様な無血清培地中
で培養適応させる。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下
で、継代培養をくり返すごとに、ウワバインの濃度を
０.１μＭ、０.２μＭ、０.５μＭ、１μＭ、５μＭと
段階的に上げて行ない、最終的に２０μＭの６−チオグ
アニン及び５μＭのウワバインを含む無血清培地中で増
殖可能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法による
クローニング操作で選別する。 【００３９】斬くて創製されたヒトＢセル・リンパ芽球
細胞変異株は前記（ｉ）〜（ｖ）の形質特性を示し、Ｈ
ＩＨ／ＴＯ１株と命名された。 【００４０】実施例２ 胃癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手し
た。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ、内部のリン
パ球を培地ＲＤＦ（ＲＰＭＩ１６４０：ＤＭＥ：Ｆ−１
２＝２：１：１）中に分散させ、続いて２重のガーゼを
用いて、濾過を行い、脂肪層を除いた後に、濾液中の細
胞（リンパ球＞８０％）を遠心法によつて集める。その
後、癌患者由来のリンパ球分画（ドナーＢセル）を２０
％牛胎児血清および、１０％ジメチルスルホオキサイド
（ＤＭＳＯ）を含むＲＤＦ培地中で凍結（−１３０℃）
し、細胞融合を行う日まで保存した。 【００４１】ドナーＢセルと免疫グロブリン生産能を実
質的に欠損している前記実施例１で得た親ヒトＢ−セル
（ＨＩＨ／ＴＯ１）のそれぞれを１×１０7および２×
１０7個混合し、３５％ポリエチレングリコール１５０
０の存在下に融合を完了させる。その後、１００×ｇ、
１０分間の遠心処理を行つてポリエチレングリコールを
除き、新たに、１０％牛胎児血清および、ヒポキサンチ
ン、アメソプテリン、チミジン、ウワバイン（ＨＡＴ
Ｏ）を含むＲＤＦ培地を加える。この細胞群を含む培養
液２００μｌ（この中には１×１０5個のセルを含む）
づつを９６個の穴をもつミクロプレートに分注し、約２
０日間、３７℃、５％ＣＯ2条件下のインキユベーター
で培養した。この間、ＨＡＴＯ及び１０％牛胎児血清を
含むＲＤＦ培地を３日に１度交換した。親Ｂ−セル（Ｈ
ＩＨ／ＴＯ１）はアメソプテリン存在下ではヒポキサン
チンホスホリボシールトランスフエラーゼを欠損してい
るため、生きることが出来ない。またドナーＢセルは、
ウワバインを含むＲＤＦ＋１０％牛胎児血清中では永続
的に増殖し生きのびることができない。よつてＨＡＴＯ
を含む培地で永続的に増殖した細胞はドナーＢセルと親
Ｂ−セル（ＨＩＨ／ＴＯ１）の融合した細胞である。３
週間培養の後、ミクロプレートの９６個の穴の中に７個
のハイブリドーマのサブクローンが見られた。このうち
の１個のハイブリドーマサブクローンは更にクローン化
されるために、集められ、新たに１０％牛胎児血清及
び、ＨＡＴＯを含むＲＤＦ培地を加え、懸濁させる。こ
の細胞群を含む培養液を９６個の穴をもつミクロプレー
トに各穴に３個の細胞が入るよう分注し、約１ケ月、３
７℃、５％ＣＯ2条件下のインキユベーターで培養し
た。この間、ＨＡＴＯ及び１０％牛胎児血清を含むＲＤ
Ｆ培地を６日に１度交換した。生じたサブクローンのう
ち最も増殖率のよいものを選び、ＴＯＳ／Ｇ５と命名し
た。これがハイブリドーマであることをさらに確認する
ために、細胞内ＤＮＡ含量を調べた。その方法を以下に
説明する。 【００４２】遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理に
より上清を除去する。７０％エタノール溶液で３０分以
上固定を行う。遠心処理により上清を除き、ＲＮＡ分解
酵素（ＲＮａｓｅ）溶液を加え、静かに振盪し、ＲＮＡ
を分解する。３７℃で３０分間反応させた後、再蒸留水
で２度洗浄する。プロピデイウムイオダイド（ＰＩ）を
加え、室温で２０分間、染色した後再蒸留水で２度洗浄
する。再蒸留水で希釈し、セルソーターを用いて分析し
た結果、ＴＯＳ／Ｇ５にはドナーＢセルの２倍以上のＤ
ＮＡ含量が認められた。以上の結果より、ＴＯＳ／Ｇ５
はハイブリドーマであることが確認された。 【００４３】このＴＯＳ／Ｇ５がヒト免疫グロブリン
（ＨｕＩｇ）を産出していることを酵素抗体法を用いて
確めた。以下、その方法を説明する。 【００４４】ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫
グロブリン抗体を滴下（５０μｌ）し、３７℃で１時間
プレートに吸着させる。０.３％のゼラチンを含む１０
ｍＭＰＢＳ（ゼラチン緩衝液）で３回洗浄した後、５％
牛血清アルブミン溶液を滴下（２００μｌ）し、３７℃
で１時間吸着させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未
吸着のものを除去する。次に検液（培養上清）を滴下
（５０μｌ）して、３７℃で１時間反応後、ゼラチン緩
衝液で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト
Ｉｇ抗体を滴下（５０μｌ）して、３７℃で３０分間反
応させ、培養上清中のヒトＩｇと結合させる（酵素抗体
法）。ゼラチン緩衝液で３回洗浄後、過酸化水素とｏ−
フエニレンジアミンを含む基質溶液を加え、暗室で１０
分間反応させる。５Ｎ Ｈ2ＳＯ4（５０μｌ）を加え反
応を止める。もしミクロプレート上にペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体が残つている場合、すなわちそ
れに結合されるヒトＩｇが残つている場合には４９０ｎ
ｍに吸収をもつ黄色の基質反応物が生産される。この量
を吸光度計を用いて測定し、ハイブリドーマ培養上清中
に含まれるヒトＩｇの量を知る。ハイブリドーマ培養上
清中にヒトＩｇが存在しない場合には、ペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体は洗浄の段階で洗い流され
る。 【００４５】以上の測定方法を用いた結果ＴＯＳ／Ｇ５
はヒトＩｇＭを生産していることがわかつた（ドナーＢ
−セルと同形質のＩｇ）。 【００４６】１ケ月後にＴＯＳ／Ｇ５を２４個の穴をも
つミクロプレート（２ｍｌ／穴）に植えかえた後さらに
１週間培養を続けた。その培養液の上清を採取し、種々
の株化細胞を標的細胞としてヒトハイブリドーマから生
産されるＩｇの特異性を調べた。その方法を以下に説明
する。 【００４７】ヒトの種々の株化培養細胞を、ＤＦ培地
（ＤＭＥ：Ｆ−１２＝１：１）に１０％牛胎児血清を加
えた培地で培養する。細胞の数が５×１０6〜１×１０7
になつた段階でトリプシンを用いて細胞をシヤーレの底
面から剥がし、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく
洗浄する。９６個の穴をもつミクロタイタープレートの
各穴に細胞を一定数（１０5／１００μｌ）ずつ分注
し、３７℃で１晩、プレートに吸着させる。次に３％グ
ルタルアルデヒド溶液を滴下（５０μｌ）し、３７℃で
２０分間、細胞の固定を行う。遠心法（２００ｇ、１０
分間）で細胞をおとし、ゼラチン緩衝液で３回洗浄した
後、１％牛血清アルブミン溶液を滴下（２００μｌ）
し、３７℃で１時間プレートに吸着させる。ゼラチン緩
衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する。その後、
検液（培養上清）を細胞の上に滴下（５０μｌ）し、３
７℃で１時間反応させ、ゼラチン緩衝液で３回洗浄す
る。続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇ抗体を滴下
（５０μｌ）し、３７℃で３０分間、反応させる。ゼラ
チン緩衝液で３回洗浄を行つた後、先述の酵素抗体法で
述べた方法によつて細胞に結合する培養液中のヒトＩｇ
の量を測定する。 【００４８】以上の方法によつてＴＯＳ／Ｇ５のＩｇＭ
の標的細胞特異性をそれぞれ調べた結果、ＴＯＳ／Ｇ５
の培養液中のＩｇＭは胃癌由来の株化細胞ＫＡＴＯ−Ｉ
ＩＩ及びＡＧＳに対して結合力を有しており、本発明者
の検討によれば胃癌以外の株化細胞であるＡ５４９（肺
癌）に対しても結合力を有する。 【００４９】すなわち、ドナーＢ−セルは体内に胃癌を
もつ患者から採取されたものであるので、細胞融合法に
よつて作り出された自己増殖性をもつハイブリドーマの
クローンからは、ドナーＢ−セルと同形質のかつ特定の
抗原結合部位をもつモノクロナール（単一）抗体を生産
していることを示している。 【００５０】約４週間後に、ハイブリドーマの培地から
ＨＡＴＯを除きＲＤＦを基礎培地とする前述（ｖ）の無
血清培地で培養、倍加時間４０時間で、ＴＯＳ／Ｇ５は
１×１０6個／ｍｌ細胞が倍地で生育する時約１μｇ／
ｍｌの量でヒトＩｇＭを生産し続けている。 【００５１】ハイブリドーマの多量培養液を７０％の硫
酸アンモニウムで沈殿させ、粗Ｉｇ分画を集めた。得ら
れた沈殿を生理食塩水に溶かし、ヤギ抗ヒトＩｇＭを結
合させたセフアロースを用いてアフイニテイクロマトグ
ラフイーの手法でＩｇＭを精製した。ＴＯＳ／Ｇ５の培
養液１ｌから精製したＩｇＭ１ｍｇが得られた。この精
製したＩｇＭ標品をＳＤＳ−電気泳動法で分析した結
果、ヒトＩｇと同形質の分子量１８０,０００のＩｇＭ
を生産していることが確かめられた。 【００５２】実施例３ 上記実施例２における胃癌患者とは別の胃癌患者から入
手したリンパ節を用いるほかは、実施例２と同様に行つ
て、実施例２と同様な抗原特異的ヒト免疫グロブリンを
生産する実施例２と同様なヒト／ヒト・ハイブリドーマ
ＴＯＳ／Ｈ８（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：
６１微寄文第８４４号）が得られた。
防、治療、診断などの医学及び薬学分野や生化学的試
薬、生体高分子の精製試薬など薬理学分野、生化学分野
等の如き広い分野において有用な抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンの生産をヒト体外で工業的に行うことを可能と
するヒト／ヒト・ハイブリドーマの創製、その他各種の
融合細胞株の形成に利用できる融合パートナー（Fusion
partner）として有用な新規なヒトＢセル・リンパ芽球
細胞変異株に関する。 【０００２】本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リ
ンパ芽球細胞変異株を利用して創製される抗原特異的ヒ
ト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドーマ、
更には該ハイブリドーマが生産する抗原特異的ヒト免疫
グロブリンにも関する。 【０００３】更に詳しくは、本発明はヒトＢセル・リン
パ芽球細胞から導かれた変異株であつて、且つ下記
（ｉ）〜（ｖ） （ｉ） ６−チオグアニン耐性である、（ii） ウワバ
イン耐性である、（iii) ＨＡＴＯ含有培地で死滅す
る、（iv） 免疫グロブリンＩｇＧ及びＩｇＭを実質的
に生産しない、（ｖ） 基礎培地ＲＤＦ中にインシユリ
ン、トランスフエリン、セレニウム、エタノールアミ
ン、β−メルカプトエタノール及び血清アルブミンを含
む無血清培地において増殖可能である、 の形質（phenotype）特性を有することを特徴とするヒ
トＢセル・リンパ芽球細胞変異株に関する。 【０００４】本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リ
ンパ芽球細胞変異株を融合パートナーとするヒト／ヒト
・ハイブリドーマ、たとえば、ヒト胃癌患者のヒトリン
パ球細胞の如き悪性腫瘍患者のヒトリンパ球細胞と該融
合パートナーとのヒト／ヒト融合細胞株である抗原特異
的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドー
マ、更には、このようなヒト／ヒト・ハイブリドーマが
生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンにも関する。 【０００５】従来、ヒト／ヒト・ハイブリドーマの形成
に利用できるヒトリンパ系株化細胞についていくつか知
られている。そのような融合パートナーとして利用でき
るヒトリンパ系株化細胞の例としては、Immunology Tod
ay, vol. ４、No. ３、１９８３、７３頁のＴＡＢＬＥ
ＩＩに記載のＳＫＯ−００７（Ｉｇε，λ）、ＴＭ−
Ｈ２（Ｉｇλ，κ）、ＤＨＭＣ（Ｉｇγ，λ）、ＧＭ１
５００（Ｉｇγ２，κ）、ＫＲ−４（Ｉｇγ，κ）、Ｌ
ＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２（Ｉｇγ１，κ）、ＧＭ０４
６７.３（Ｉｇμ，λ）、Ｈ３５１.１（Ｉｇμ，κ）、
ＵＣ７２９−６（Ｉｇμ，κ）、ＧＭ４６７２（Ｉｇγ
２，κ）などを挙げることができる。しかしながら、こ
れら従来公知のヒトリンパ系株化細胞は、上記文献のＴ
ＡＢＬＥＩＩに記載され、上記にカツコで示したよう
に、程度の差こそあれ免疫グロブリンを実質的に生産す
る点で、その融合パートナーとしての利用に好ましい株
とは言い難く、その利用に制約をうける。その理由は、
これらの融合パートナーと例えば癌患者のヒトリンパ球
細胞とから導かれるヒト／ヒト・ハイブリドーマが生産
するヒト免疫グロブリンは、該融合パートナーが本来生
産する免疫グロブリンが、該癌患者のヒトリンパ球細胞
に由来する目的とする免疫グロブリンに混入したポリ・
クロナリテイ（polyclonality）形態で得られるため、
目的とする免疫グロブリンの単一性（mono-clonality）
が失われるからである。 【０００６】本発明者は、上述のような制約から解放さ
れた融合パートナーを創製すべく研究を行つてきた。 【０００７】その結果、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞か
ら導かれた変異株であつて、免疫グロブリンを実質的に
生産しない新しいヒトリンパ系株化細胞を創製すること
に成功した。 【０００８】本発明者は、それ自体公知のヒトＢセル・
リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２［微工研寄託受託拒否通知
書、通知番号：６０微寄文第１６２１号］から、薬剤耐
性化手法を利用した特定の変異株形成操作を経て、それ
自体増殖能を有するが免疫グロブリンを実質的に生産し
ない新規ヒトリンパ系株化細胞を創製し且つこの新規ヒ
トＢセル・リンパ芽球細胞変異株は、ヒト／ヒト・ハイ
ブリドーマの創製その他各種の融合細胞株の形成に利用
できる融合パートナーとして、前述の如き制約から解放
された単一性の高い免疫グロブリンの生産を可能とする
融合細胞株の形成に有用な新規ヒトＢセル・リンパ芽球
細胞変異株であることを発見した。 【０００９】更に、本発明者は、このヒトＢセル・リン
パ芽球細胞変異株を用いて、ヒト胃癌患者のヒトリンパ
球細胞と該ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株とのヒト
／ヒト融合細胞株である抗原特異的ヒト免疫グロブリン
生産性ヒト／ヒト・ハイブリドーマの創製に成功し、且
つ該抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産に成功した。 【００１０】従つて、本発明の目的は、医学、薬理学、
生化学分野等の広い分野において有用な新規ヒトＢセル
・リンパ芽球細胞変異株を提供するにある。 【００１１】本発明の他の目的は、上記新規ヒトＢセル
・リンパ芽球細胞変異株と悪性腫瘍患者のヒトリンパ球
細胞から導かれる抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性
ヒト／ヒト・ハイブリドーマ、更にはその生産する抗原
特異的ヒト免疫グロブリンを提供するにある。 【００１２】本発明によれば、ヒトＢセル・リンパ芽球
細胞から導かれた変異株であつて、且つ下記（ｉ）〜
（ｖ） （ｉ） ６−チオグアニン耐性である、（ii） ウワバ
イン耐性である、（iii) ＨＡＴＯ（ヒポキサンチン、
アメソプテリン、チミジン及びウワバイン）含有培地で
死滅する、（iv） 免疫グロブリンＩｇＧ及びＩｇＭを
実質的に生産しない、（ｖ） 基礎培地ＲＤＦ中にイン
シユリン、トランスフエリン、セレニウム、エタノール
アミン、β−メルカプトエタノール及び牛血清アルブミ
ンを含む無血清培地において増殖可能である、 の形質特性を有することを特徴とするヒトＢセル・リン
パ芽球細胞変異株が提供できる。 【００１３】本発明の新規Ｂセル・リンパ芽球細胞変異
株は、例えば、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞を無血清培
地で培養適応させ、適応した細胞群から実質的に免疫グ
ロブリン生産能を欠如する細胞をスクリーニングし、こ
のスクリーニングした細胞を６−チオグアニン含有無血
清培地で培養適応させ、斯くて形成された６−チオグア
ニン耐性細胞を突然変異剤で処理したのち、ウワバイン
含有無血清培地で培養適応させ、得られた耐性細胞を６
−チオグアニン及びウワバインの両者を含有する無血清
培地でクローン化することにより創製することができ
る。 【００１４】この際利用する無血清培地の例としては、
基礎培地ＲＤＦ（基礎培地ＲＰＭＩ１６４０：基礎培地
ＤＭＥ：基礎培地Ｆ１２＝２：１：１の混合基礎培地）
に、インシユリン、トランスフエリン、セレニウム、エ
タノールアミン、β−メルカプトエタノール及び牛血清
アルブミンの適量を配合した無血清培地を好ましく例示
することができる。他の無血清培地も利用でき、培養適
応させるヒトＢセル・リンパ芽球細胞及び基礎培地の種
類、上記他の配合成分の種類及びそれらの量などに応じ
て、実験的に適宜に選択、変更、決定して利用すること
ができる。又、利用する突然変異剤の例としては、ＭＮ
ＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン）、ＥＭＳ（メチルスルホン酸エチル）、ＡＡＢ
（４−アミノアゾベンゼン）、ＡＡＦ（２−アセチルア
ミノフルオレン）、ＡＦ−２（２−（２−フリル）−３
−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド）、ＢＰ
ox（ベンゾピレンオキシド）、ＢＺＤ（ベンチジン）、
ＤＡＢ（Ｎ,Ｎ′−ジメチルアミノアゾベンゼン）、Ｄ
ＡＮ（ジアミンアニソール）、ＤＢＡ（ジベンズアント
ラセン）、ＤＢＥ（ジブロモエタン）、ＤＢＰ（ジブロ
モクロロプロパン）、ＤＭＮ（ジメチルニトロサミ
ン）、ＥＮＮＧ（Ｎ−エチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン）、ＥＮＵ（エチルニトロソウレア）、
ＨＦＡ（Ｎ−ハイドロキシ−２−アセチル−アミノフル
オレン）、３ＭＣＡ（３−メチルコランスレン）、ＭＭ
Ｓ（メチルスルホン酸メチル）、２ＮＡ（２−ナフチル
アミン）、ＮＡＡＡＦ（Ｎ−アセトオキシアセチルアミ
ノフルオレン）、ＮＢＡ（Ｎ−ニトロソジブチルアミ
ン）、４ＮＱＯ（４−ニトロキノリン−１−オキシ
ド）、ＯＡＴ（ｏ−アミノアゾトルエン）、ＰＩ（プロ
ピレンイミン）、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）、ＴＤ
Ｓ（トルエンジアミノスルフエイト）、ＴＯＸ（トキサ
フエン）、ＶＣ（ビニルクロライド）などの公知変異剤
を例示することができる。 【００１５】培養適応は、例えば３７℃、５％ＣＯ2条
件下で行なうことができ、また、クローン化はそれ自体
公知の例えば限界希釈法を利用して行なうことができ
る。培養適応手段、スクリーニング手段、突然変異剤処
理手段などの各単位手段それ自体はよく知られており、
適宜に選択利用することができる。 【００１６】上記において利用するヒトＢセル・リンパ
芽球細胞の例としては、前述したそれ自体公知のヒトＢ
セル・リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２（微工研寄託受託拒否
通知書、通知番号：６０微寄文第１６２１号）のほか
に、例えば、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＩＭ−９（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ １５９）、ヒトＢセル・リンパ芽球細
胞ＮＣ−３７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１４）及びヒトＢ
セル・リンパ芽球細胞ＣＣＲＦ−ＳＢ（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ １２０）などの如き公知株化細胞を例示することが
できる。 【００１７】上述のようにして得ることのできる前記
（ｉ）〜（ｖ）の形質特性を有するヒトＢセル・リンパ
芽球細胞ＷＩ−Ｌ２から導かれた変異株の１つはＨＩＨ
／ＴＯ１株（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：６
０微寄文第１１９８号）と命名された。 【００１８】本発明によれば、上述のようにして得られ
るヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株を融合パートナー
として利用し、抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産を
ヒト体外で工業的に行うことを可能とするヒト／ヒト・
ハイブリドーマの創製を包含して、たとえば悪性腫瘍患
者のヒトリンパ球細胞と該変異株とのヒト／ヒト・ハイ
ブリドーマの創製、その他各種の融合細胞株を創製する
ことができる。 【００１９】以下、そのような融合細胞株創製の一態様
について述べる。例えば、ヒト胃癌患者のヒトＢセルを
用い、これを本発明のヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異
株と人間の体外で融合させ、たとえば胃癌、肺癌、悪性
黒色腫細胞などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒト・ハイブリドー
マを産生することができる。 【００２０】この融合細胞を産生する融合操作それ自体
はよく知られており、本発明で利用することができる。
例えば、溶媒中で融合促進剤の存在下に、ヒト胃癌患者
のヒトＢセルと本発明のヒトＢセル・リンパ芽球細胞変
異株とを接触させることにより行うことができる。この
ような融合方法の例としては、たとえば仙台ビールス
（ＨＶＪ）、ポリエチレエングリコールなどの如き融合
促進剤を用いる方法を例示できる。更に、高電圧で電気
的に融合する方法［例えば、U. Zimmerman et. al.,
“Electric Field-Mediated Cell Fusion”；The Journ
al of Biological Physics, １０，４３−５０，１９８
２。U. Zimmerman et. al., “Electric Field-Induced
Cell-to-Cell Fusion”；The Journal of Membrene Bi
ology, ６７，１６５−１８２，１９８２。U. Zimmerma
n，“Electric Field Mediated Fusion and Related El
ectrical Phenomena”；Biochimica et Biophysica Act
a ６９４，２２７−２７７，１９８２。等］を利用して
行なうこともできる。 【００２１】前者の態様に於ては、例えば、水性媒体
中、上記例示の如き融合促進剤の存在下、所望によりお
だやかな撹拌を加えて系を均一にし、前記ヒト胃癌患者
のヒトＢセルと本発明変異株から成る融合細胞が産生さ
れる時間、たとえば数分間のオーダーで両者を接触させ
ることにより、所望の融合細胞を産生することができ
る。利用する水性媒体の例としては、水、生理食塩水、
５％ジメチルスルホキシド水溶液、５％グリセロール水
溶液などを例示することができる。 【００２２】斯くて所望の融合細胞が産生された系を、
たとえば遠心分離して細胞群を採取し、再び適当な培地
たとえば１０％仔牛血清を含有させた。前記（ｖ）無血
清培地にＨＡＴＯを加えた培地に、採取した該細胞群を
分散させ、この分散液を例えばマイクロ・タイター・プ
レートの穴に、夫々、一定量づつ分取注入し、たとえば
５％ＣＯ2の存在下、３７℃で培養し、各穴中の培養液
を例えば３日毎に新しい培養液と取りかえ、たとえば２
週間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調
べ、コロニーの認められた試料の培養液を採取し、ヒト
免疫グロブリンの有無をたとえば125Ｉを用いたラジオ
・イムノ・アツセイや酵素抗体法により検出することに
より、所望のコロニーを選別することができる。 【００２３】このようにして選別されたヒト免疫グロブ
リンの生産の認められたコロニーを、新しい培養液に移
して培養し、融合細胞を増殖させることにより融合細胞
クローンを取得することができる。更に、必要に応じ
て、サブ・クローニングして、所望のヒト胃癌、肺癌、
悪性黒色腫などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免
疫グロブリン生産性クローンを得ることができる。 【００２４】上述の態様で、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セ
ルと本発明ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株から産生
された抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイ
ブリドーマＴＯＳ／Ｇ５株の細胞生化学的性質を以下に
示す。 【００２５】(１) ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）分
泌（生産）、(２) 倍加時間（ダブリング・タイム）
［於（ｖ）無血清培地］約４０時間、(３) ＤＮＡ含量
が正常ヒトリンパ球の２倍以上、(４) 上記（１）のＩ
ｇＭはヒト株化細胞ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（胃癌）に対して
結合性を示す、(５) ＨＡＴＯ含有培地（ヒポキサンチ
ン、アメソプテリン、チミジン及びウワバイン含有培
地）中で分裂増殖可能である。 【００２６】尚、相対ＤＮＡ含量（正常ヒトリンパ球の
ＤＮＡ含量に対する比率）は、ハイブリドーマをプロピ
ジウム・アイオダイドで染色したのち、フローサイトメ
ーター（flow cytometer）で分離分析する方法によつて
決定された。 【００２７】本発明によれば、上述のようにして産生す
ることのできるたとえばヒト胃癌患者のヒトＢセルと本
発明ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株から導かれた抗
原特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト融合細胞株を
利用して、抗原特異的ヒト免疫グロブリンを得ることが
できる。該抗原特異的ヒト免疫グロブリンは上記ヒト／
ヒト融合細胞株を培地に培養し、その培養物より抗原特
異的ヒト免疫グロブリンを採取することにより製造でき
る。 【００２８】例えば、上記ヒト／ヒト融合細胞株を適当
な培地たとえば前記（ｖ）の培地で培養し、培養液を採
取することによりヒト胃癌、肺癌、悪性黒色腫の如きガ
ン関連抗原に特異的に結合する免疫グロブリン含有物質
を得ることができる。精製はたとえば、硫安分画法、ア
フイニテイークロマトグラフイー、ゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフイー、電気泳動法などの如き生体液か
ら免疫グロブリンを採取、精製する際に利用できると同
様な精製手段を利用して行なうことができる。本発明に
よれば、前述した融合細胞クローン又はその培養液から
ガン関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン含
有物質又は該免疫グロブリンを取得するに際し、抗原性
組織（例えば癌組織）を一度、免疫物質生産能を欠如す
るか若しくは生産能の極めて弱い生体たとえばヌード・
マウス（nude mouse）などに植えつけ組織を維持した
後、その組織に対して或いは培養系にもどされた組織に
対して反応するヒト免疫グロブリン（抗体）を探し出
し、これを分離するのが有利である。 【００２９】上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に利
用できる培地の例としては、前記（ｖ）の無血清培地の
ほかに、例えば、基礎培地ＲＤＦに牛胎児血清、仔牛血
清、成牛血清、ヒト血清などの如き血清を含有させた培
地、基礎培地ＲＰＭＩ１６４０に上記の如き血清を含有
させた培地などを例示することができる。又、培養条件
としては、たとえば５％ＣＯ2の存在下で３７℃の条件
を例示できる。 【００３０】上述のようにして得ることのできる本発明
のガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリンの例として、
前述したヒト／ヒト・ハイブリドーマＴＯＳ／Ｇ５株の
生産する本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンを例示
できる。その特性を以下に示す。 【００３１】(イ) ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）で
あつて、(ロ) ヒト株化細胞ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（胃癌）
及びヒト株化細胞Ａ５４９（肺癌）に対して結合力を示
す、(ハ) Ｈ鎖（heary chain）及びＬ鎖（light chai
n）より成り、分子量が約１８万である。 【００３２】上記ヒト株化細胞ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（胃
癌）はＡＴＣＣ ＨＴＢ１０３として、又ヒト株化細胞
Ａ５４９（肺癌）はＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５としてＡＴ
ＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ン）から自由に入手できる。 【００３３】本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリン
は、たとえばヒト胃癌、肺癌、脳腫瘍、悪性黒色腫など
の如きヒト癌への作用抗体或いはそれ自体の作用でこれ
ら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、更
に、ヒト体外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補
体もしくはＴ−リンパ球（マクロフアージ）の助けをか
りて癌細胞の増殖抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせた
りすることができる。更にまた、ヒト体外で量産された
これら癌特異的抗体をキヤリアーとして利用して、例え
ば化学療法剤結合−ヒト・モノクロナル抗体、インター
フエロン結合−ヒト・モノクロナル抗体、高分子毒素結
合−ヒト・モノクロナル抗体、薬物入りリポゾーム結合
−ヒト・モノクロナル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制
や死滅のはたらきをさせたりするのに有用である。ま
た、本発明のヒト・モノクロナル抗体をキヤリアーとし
て利用し、これに放射線感受性物質を結合させて患者に
投与し、癌細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を
検知し放射線療法に利用することができる。このような
癌に対する利用に際しては、ヒト・モノクロナル抗体と
して完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法
で特異的抗原認識部位を含むより小さな分子に切断して
用いたり、或は、そのような小さな分子もしくは特異的
抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分と
結合させて、より有効性のある修飾ヒト・モノクロナル
抗体を化学的手法で創製して用いることもできる。 【００３４】以下、実施例により、本発明の数態様につ
いて更に詳しく説明する。 【００３５】 【実施例】実施例１ ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株。 【００３６】ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２
（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：６０微寄文第
１６２１号）を、基礎培地ＲＤＦ中にインシユリン、ト
ランスフエリン、セレニウム、エタノールアミン、β−
メルカプトエタノール及び牛血清アルブミンの適量を含
有する無血清培地で培養適応させる。該無血清培地を分
注した９６穴マイクロタイタープレートに１ cell／wel
lとなるように植えこみ、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で
限界希釈法によりクローニング操作を行なう。約１ケ月
経過後、増殖してきた５０穴より免疫グロブリンＩｇＧ
及びＩｇＭを実質的に培地中に生産していないクローン
を１つ選び出した。 【００３７】このクローンを、まず０.１μＭの６−チ
オグアニンを含む前記と同様な無血清培地中で培養適応
させる。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下で、継代培
養をくり返すごとに、６−チオグアニン濃度を０.２μ
Ｍ、０.５μＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭ、１０μＭ、
１５μＭ、２０μＭと段階的に上げて行ない、最終的に
２０μＭの６−チオグアニン含有無血清培地中で増殖可
能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法によるクロ
ーニング操作で選別する。 【００３８】この細胞を、１μｇ／ｍｌの突然変異剤Ｍ
ＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン）を含有する基礎培地ＲＤＦ中で、５％ＣＯ2、
３７℃の条件下で３時間培養した後、前記と同様な無血
清培地で洗浄し、洗浄した細胞を２０μＭの６−チオグ
アニン及びウワバインを含む前記と同様な無血清培地中
で培養適応させる。培養は５％ＣＯ2、３７℃の条件下
で、継代培養をくり返すごとに、ウワバインの濃度を
０.１μＭ、０.２μＭ、０.５μＭ、１μＭ、５μＭと
段階的に上げて行ない、最終的に２０μＭの６−チオグ
アニン及び５μＭのウワバインを含む無血清培地中で増
殖可能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法による
クローニング操作で選別する。 【００３９】斬くて創製されたヒトＢセル・リンパ芽球
細胞変異株は前記（ｉ）〜（ｖ）の形質特性を示し、Ｈ
ＩＨ／ＴＯ１株と命名された。 【００４０】実施例２ 胃癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手し
た。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ、内部のリン
パ球を培地ＲＤＦ（ＲＰＭＩ１６４０：ＤＭＥ：Ｆ−１
２＝２：１：１）中に分散させ、続いて２重のガーゼを
用いて、濾過を行い、脂肪層を除いた後に、濾液中の細
胞（リンパ球＞８０％）を遠心法によつて集める。その
後、癌患者由来のリンパ球分画（ドナーＢセル）を２０
％牛胎児血清および、１０％ジメチルスルホオキサイド
（ＤＭＳＯ）を含むＲＤＦ培地中で凍結（−１３０℃）
し、細胞融合を行う日まで保存した。 【００４１】ドナーＢセルと免疫グロブリン生産能を実
質的に欠損している前記実施例１で得た親ヒトＢ−セル
（ＨＩＨ／ＴＯ１）のそれぞれを１×１０7および２×
１０7個混合し、３５％ポリエチレングリコール１５０
０の存在下に融合を完了させる。その後、１００×ｇ、
１０分間の遠心処理を行つてポリエチレングリコールを
除き、新たに、１０％牛胎児血清および、ヒポキサンチ
ン、アメソプテリン、チミジン、ウワバイン（ＨＡＴ
Ｏ）を含むＲＤＦ培地を加える。この細胞群を含む培養
液２００μｌ（この中には１×１０5個のセルを含む）
づつを９６個の穴をもつミクロプレートに分注し、約２
０日間、３７℃、５％ＣＯ2条件下のインキユベーター
で培養した。この間、ＨＡＴＯ及び１０％牛胎児血清を
含むＲＤＦ培地を３日に１度交換した。親Ｂ−セル（Ｈ
ＩＨ／ＴＯ１）はアメソプテリン存在下ではヒポキサン
チンホスホリボシールトランスフエラーゼを欠損してい
るため、生きることが出来ない。またドナーＢセルは、
ウワバインを含むＲＤＦ＋１０％牛胎児血清中では永続
的に増殖し生きのびることができない。よつてＨＡＴＯ
を含む培地で永続的に増殖した細胞はドナーＢセルと親
Ｂ−セル（ＨＩＨ／ＴＯ１）の融合した細胞である。３
週間培養の後、ミクロプレートの９６個の穴の中に７個
のハイブリドーマのサブクローンが見られた。このうち
の１個のハイブリドーマサブクローンは更にクローン化
されるために、集められ、新たに１０％牛胎児血清及
び、ＨＡＴＯを含むＲＤＦ培地を加え、懸濁させる。こ
の細胞群を含む培養液を９６個の穴をもつミクロプレー
トに各穴に３個の細胞が入るよう分注し、約１ケ月、３
７℃、５％ＣＯ2条件下のインキユベーターで培養し
た。この間、ＨＡＴＯ及び１０％牛胎児血清を含むＲＤ
Ｆ培地を６日に１度交換した。生じたサブクローンのう
ち最も増殖率のよいものを選び、ＴＯＳ／Ｇ５と命名し
た。これがハイブリドーマであることをさらに確認する
ために、細胞内ＤＮＡ含量を調べた。その方法を以下に
説明する。 【００４２】遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理に
より上清を除去する。７０％エタノール溶液で３０分以
上固定を行う。遠心処理により上清を除き、ＲＮＡ分解
酵素（ＲＮａｓｅ）溶液を加え、静かに振盪し、ＲＮＡ
を分解する。３７℃で３０分間反応させた後、再蒸留水
で２度洗浄する。プロピデイウムイオダイド（ＰＩ）を
加え、室温で２０分間、染色した後再蒸留水で２度洗浄
する。再蒸留水で希釈し、セルソーターを用いて分析し
た結果、ＴＯＳ／Ｇ５にはドナーＢセルの２倍以上のＤ
ＮＡ含量が認められた。以上の結果より、ＴＯＳ／Ｇ５
はハイブリドーマであることが確認された。 【００４３】このＴＯＳ／Ｇ５がヒト免疫グロブリン
（ＨｕＩｇ）を産出していることを酵素抗体法を用いて
確めた。以下、その方法を説明する。 【００４４】ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫
グロブリン抗体を滴下（５０μｌ）し、３７℃で１時間
プレートに吸着させる。０.３％のゼラチンを含む１０
ｍＭＰＢＳ（ゼラチン緩衝液）で３回洗浄した後、５％
牛血清アルブミン溶液を滴下（２００μｌ）し、３７℃
で１時間吸着させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未
吸着のものを除去する。次に検液（培養上清）を滴下
（５０μｌ）して、３７℃で１時間反応後、ゼラチン緩
衝液で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト
Ｉｇ抗体を滴下（５０μｌ）して、３７℃で３０分間反
応させ、培養上清中のヒトＩｇと結合させる（酵素抗体
法）。ゼラチン緩衝液で３回洗浄後、過酸化水素とｏ−
フエニレンジアミンを含む基質溶液を加え、暗室で１０
分間反応させる。５Ｎ Ｈ2ＳＯ4（５０μｌ）を加え反
応を止める。もしミクロプレート上にペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体が残つている場合、すなわちそ
れに結合されるヒトＩｇが残つている場合には４９０ｎ
ｍに吸収をもつ黄色の基質反応物が生産される。この量
を吸光度計を用いて測定し、ハイブリドーマ培養上清中
に含まれるヒトＩｇの量を知る。ハイブリドーマ培養上
清中にヒトＩｇが存在しない場合には、ペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体は洗浄の段階で洗い流され
る。 【００４５】以上の測定方法を用いた結果ＴＯＳ／Ｇ５
はヒトＩｇＭを生産していることがわかつた（ドナーＢ
−セルと同形質のＩｇ）。 【００４６】１ケ月後にＴＯＳ／Ｇ５を２４個の穴をも
つミクロプレート（２ｍｌ／穴）に植えかえた後さらに
１週間培養を続けた。その培養液の上清を採取し、種々
の株化細胞を標的細胞としてヒトハイブリドーマから生
産されるＩｇの特異性を調べた。その方法を以下に説明
する。 【００４７】ヒトの種々の株化培養細胞を、ＤＦ培地
（ＤＭＥ：Ｆ−１２＝１：１）に１０％牛胎児血清を加
えた培地で培養する。細胞の数が５×１０6〜１×１０7
になつた段階でトリプシンを用いて細胞をシヤーレの底
面から剥がし、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく
洗浄する。９６個の穴をもつミクロタイタープレートの
各穴に細胞を一定数（１０5／１００μｌ）ずつ分注
し、３７℃で１晩、プレートに吸着させる。次に３％グ
ルタルアルデヒド溶液を滴下（５０μｌ）し、３７℃で
２０分間、細胞の固定を行う。遠心法（２００ｇ、１０
分間）で細胞をおとし、ゼラチン緩衝液で３回洗浄した
後、１％牛血清アルブミン溶液を滴下（２００μｌ）
し、３７℃で１時間プレートに吸着させる。ゼラチン緩
衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する。その後、
検液（培養上清）を細胞の上に滴下（５０μｌ）し、３
７℃で１時間反応させ、ゼラチン緩衝液で３回洗浄す
る。続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇ抗体を滴下
（５０μｌ）し、３７℃で３０分間、反応させる。ゼラ
チン緩衝液で３回洗浄を行つた後、先述の酵素抗体法で
述べた方法によつて細胞に結合する培養液中のヒトＩｇ
の量を測定する。 【００４８】以上の方法によつてＴＯＳ／Ｇ５のＩｇＭ
の標的細胞特異性をそれぞれ調べた結果、ＴＯＳ／Ｇ５
の培養液中のＩｇＭは胃癌由来の株化細胞ＫＡＴＯ−Ｉ
ＩＩ及びＡＧＳに対して結合力を有しており、本発明者
の検討によれば胃癌以外の株化細胞であるＡ５４９（肺
癌）に対しても結合力を有する。 【００４９】すなわち、ドナーＢ−セルは体内に胃癌を
もつ患者から採取されたものであるので、細胞融合法に
よつて作り出された自己増殖性をもつハイブリドーマの
クローンからは、ドナーＢ−セルと同形質のかつ特定の
抗原結合部位をもつモノクロナール（単一）抗体を生産
していることを示している。 【００５０】約４週間後に、ハイブリドーマの培地から
ＨＡＴＯを除きＲＤＦを基礎培地とする前述（ｖ）の無
血清培地で培養、倍加時間４０時間で、ＴＯＳ／Ｇ５は
１×１０6個／ｍｌ細胞が倍地で生育する時約１μｇ／
ｍｌの量でヒトＩｇＭを生産し続けている。 【００５１】ハイブリドーマの多量培養液を７０％の硫
酸アンモニウムで沈殿させ、粗Ｉｇ分画を集めた。得ら
れた沈殿を生理食塩水に溶かし、ヤギ抗ヒトＩｇＭを結
合させたセフアロースを用いてアフイニテイクロマトグ
ラフイーの手法でＩｇＭを精製した。ＴＯＳ／Ｇ５の培
養液１ｌから精製したＩｇＭ１ｍｇが得られた。この精
製したＩｇＭ標品をＳＤＳ−電気泳動法で分析した結
果、ヒトＩｇと同形質の分子量１８０,０００のＩｇＭ
を生産していることが確かめられた。 【００５２】実施例３ 上記実施例２における胃癌患者とは別の胃癌患者から入
手したリンパ節を用いるほかは、実施例２と同様に行つ
て、実施例２と同様な抗原特異的ヒト免疫グロブリンを
生産する実施例２と同様なヒト／ヒト・ハイブリドーマ
ＴＯＳ／Ｈ８（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：
６１微寄文第８４４号）が得られた。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ０７Ｋ 16/42 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ
Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ａ
33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒトＢセル・リンパ芽球細胞から導かれた変異株で
あつて、且つ下記（ｉ）〜（ｖ） （ｉ） ６−チオグアニン耐性である、 （ｉｉ） ウワバイン耐性である、 （ｉｉｉ） ＨＡＴＯ含有培地で死滅する、 （ｉｖ） 免疫グロブリンＩｇＧ及びＩｇＭを実質的に
生産しない、 （ｖ） 基礎培地ＲＤＦ中にインシユリン、トランスフ
エリン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプ
トエタノール及び血清アルブミンを含む無血清培地にお
いて増殖可能である、の形質特性を有するヒトＢセル・
リンパ芽球細胞変異株ＨＩＨ／ＴＯ１と、ヒト胃癌患者
のヒトリンパ球細胞とのヒト／ヒト融合細胞株である抗
原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブ
リドーマＴＯＳ／Ｇ５またはＴＯＳ／Ｈ８。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7138943A JP2721817B2 (ja) | 1995-05-15 | 1995-05-15 | ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7138943A JP2721817B2 (ja) | 1995-05-15 | 1995-05-15 | ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60293595A Division JP2599123B2 (ja) | 1985-12-28 | 1985-12-28 | 新規なヒトｂセル・リンパ芽球細胞変異株 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9233272A Division JP2830976B2 (ja) | 1997-08-15 | 1997-08-15 | 癌関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0833481A JPH0833481A (ja) | 1996-02-06 |
| JP2721817B2 true JP2721817B2 (ja) | 1998-03-04 |
Family
ID=15233786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7138943A Expired - Fee Related JP2721817B2 (ja) | 1995-05-15 | 1995-05-15 | ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2721817B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101869574B (zh) * | 2010-07-24 | 2011-12-21 | 南京大学 | 哇巴因在增强非小细胞肺癌细胞敏感性中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60141285A (ja) * | 1983-12-29 | 1985-07-26 | Hironori Murakami | ヒトハイブリド−マ作成用親細胞株 |
| JPS60203186A (ja) * | 1984-03-28 | 1985-10-14 | Green Cross Corp:The | ヒト−ヒトハイブリド−マ |
-
1995
- 1995-05-15 JP JP7138943A patent/JP2721817B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．７９，（１９８２），Ｐ．６６５１−６６５５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0833481A (ja) | 1996-02-06 |
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