JP2599258B2 - ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫グロブリン生
産能を有するヒトＢ−セル免疫とグロブリン生産能を実
質的に欠損しているヒトＢ−セルとの新しいタイプのヒ
ト／ヒト融合細胞クローン、それらが生産した抗原特異
的ヒト免疫グロブリン、更には該ヒト免疫グロブリンの
製法に関する。

【０００２】更に詳しくは、本発明はヒト大腸癌患者の
ヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンと
のヒト／ヒト融合細胞株であつて抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマに関
する。本発明はまた、該ヒト／ヒト融合細胞株が生産し
た抗原特異的ヒト免疫グロブリンにも関する。

【０００３】更に、本発明は、該ヒト／ヒト融合細胞株
を培地に培養し、その培養物より抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンを採取することを特徴とする抗原特異的ヒト免
疫グロブリンの製法にも関する。

【０００４】該抗原特異的免疫グロブリンは、例えばヒ
ト結腸癌、肺癌、胃癌などの予防、治療、診断の如き医
学及び薬学分野、生化学的試薬、生体高分子の精製試薬
などの薬理学分野、さらには、癌抗原の精製などの生化
学的分野の研究等の広い分野において有用である。

【０００５】

【従来の技術】従来、癌その他の抗原によつて感作され
たマウスＢ−セルと骨髄性白血病(myeloma)マウスから
のマウスＢ−セルとの融合細胞をマウス体外で形成し、
上記抗原に対するマウス免疫グロブリン生産能を有し、
且つ自己増殖性を有するマウス／マウス融合細胞を形成
した報告は知られている[例えば、ケーラ・ジー、ミル
スタイン・シー、ネイチヤ“(Ｋoehler Ｇ．,Ｍilstein
Ｃ．,Ｎature),２５６,４９５(１９７５);デイポール
ド・イー・ジー,ロイド・ケー・オー,リー・エル・テイ
ー・シー,イケダ・エイチ,エツトゲン・エイチ・エフ,
オールド・エル・ジエイ,プロシーデイング オブ ナ
シヨナル アカデミイ オブ サイエンスオブ ザ ユ
ナイテツドステート オブ アメリカ(Ｄippold,Ｅ．
Ｇ．,Ｌloyd,Ｋ．Ｏ．,Ｌi,Ｌ．Ｔ．Ｃ．,Ｉkeda,Ｈ．,
Ｏettgen,Ｈ．Ｆ．＆ Ｏld,Ｌ．Ｊ．,Ｐorc．Ｎat．Ａ
cad．Ｓci．Ｕ．Ｓ．Ａ．),７７,６１１４(１９８０);
等]。又、抗原によつて感作されたヒトＢ−セルと骨髄
性白血病マウスからのマウスＢ−セルとの融合細胞を体
外で形成し、上記抗原に対するヒト免疫グロブリン生産
能を有し且つ自己増殖性を有するヒト／マウス融合細胞
を形成した報告も知られている[例えばシユローム・ジ
エイ,ワンダーリツヒ・デイー,アンド テラモト・ワイ
・エイ プロシーデイング オブ ナシヨナル アカデ
ミイ オブ サイエンス オブ ザ ユナイテツド ス
テート オブ アメリカ(Ｓchlom Ｊ．,Ｗunderrich
Ｐ．,and Ｔeramoto Ｙ．Ａ．,Ｐroc．Ｎat．Ａcad．
Ｓci．,Ｕ．Ｓ．Ａ．),７７(１１),６８４１(１９８
０)]。

【０００６】しかしながら、ヒト免疫グロブリン生産能
を有する融合細胞を取得しようという上記後者の試みに
おいては、経時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グ
ロブリン生産能が、経時的に喪失し、免疫グロブリン生
産能が極めて不安定である致命的な欠陥を有する。

【０００７】ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／
ヒト融合細胞を形成する試みとして、抗原としてハシカ
・ビールス又はハプテン(hapten)[２,４−ジニトロフエ
ニル]によつて感作されたヒトＢ−セルをドナーとして
使用し、これと骨髄性白血病患者からのヒト免疫グロブ
リン生産能を有するセルライン(ヒトＢ−セル,親株)と
の融合細胞をヒト体外で形成し、上記抗原に対するヒト
免疫グロブリン生産能を有し、且つ自己増殖性を有する
ヒト／ヒト融合細胞を形成した報告が知られている[例
えば、クロツチエ・シー・エム,ライネンバツハ・エイ,
ホール・ダブリユ,ステプレスキー・ゼツト,コプロウス
キー・エイチ,ネイチヤー(Ｃroce,Ｃ．Ｍ．,Ｌinnenbac
h,Ａ．,Ｈall,Ｗ．,Ｓteplowski,Ｚ ＆ Ｋoprowski,
Ｈ．,Ｎature,２８８,４８８(１９８０);オルソン・エ
ル,カプラン・エイチ・エス,プロシーデイング オブ
ナシヨナル アカデミイ オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテツド ステート オブ アメリカ(Ｏlsson,Ｌ
＆ Ｋaplan,Ｈ．Ｓ．,Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．
Ｕ．Ｓ．Ａ．),７(９),５４２９(１９８０);等]。

【０００８】しかしながら、上述の方法はマウス／マウ
スでは、マウスの免疫グロブリンを作製する方法であ
り、マウス／ヒトハイブリドーマでは、マウス由来の生
産物が細胞培養中に生成されることは避けられない。ヒ
ト染色体の欠失に伴うヒト免疫グロブリン生産の消失が
起こる場合もある。そこでヒト／ヒト融合細胞から採取
されるヒト型免疫グロブリンの生産が望まれる理由であ
る。しかしながら、上記のヒト／ヒトハイブリドーマか
ら生産されるヒト免疫グロブリンの報告は癌細胞に対す
る結合性についてはなんら実証例を提示していない。と
くに、結腸癌、胃癌、肺癌細胞への結合性についての記
載はない。

【０００９】本発明者の一人によつて、ヒト子宮癌患者
のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
とのヒト／ヒト融合細胞株であつて抗原特異的ヒト免疫
グロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマが
創製された(特開昭５９−１３７４９７号公報)。そし
て、子宮頚部偏平上皮癌細胞、該細胞由来の株化細胞Ｈ
ela及びＣaskiに対し、正常繊維芽細胞(ＷＩ−３８)に
対する結合力に比してより強い結合力を示したことが報
告された。しかしながら、ヒト肺癌、胃癌、結腸癌細胞
などへの結合性に関しては言及していない。

【００１０】更に、Ｃote et．al．,Ｐroc．Ｎat．Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ,Ｖal．８０,pp２０２６−２０３０
(１９８３)には、ヒト癌患者のヒトＢ−セルとヒトリン
パ芽球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株及び該株の生産
するヒト免疫グロブリンに関して報告されている。この
報告によれば、ヒトリンパ芽球細胞株としてＬＩＣＲ−
２もしくはＳＫＯ−００７を用い、ヒト乳癌患者、ヒト
肺癌患者及びヒト腎癌患者のヒトＢ−セルとのヒト／ヒ
ト融合細胞株の形成及び形成された融合細胞株の中には
ＩgＡを産生するものもあることが示されている。しか
しながら、この報告にはヒト大腸癌患者のヒトＢ−セル
とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／ヒト
融合細胞株は、全く示されていない。更に、癌細胞との
結合性について具体的に示された例では、ヒト結腸癌由
来の株化細胞ＳＷ−１０８３、−１１１６、−１２２
２、ＨＴ−２９に対しては結合性がない(nonreactive)
ことが示されている。

【００１１】更にまた、特開昭６１−４４９００号公報
には、膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原に対して特異
的に反応するモノクローナル抗体に関して記載され、そ
れを生産する融合細胞は、抗体産生細胞と骨髄細胞の融
合によつて得られるが、それらは同種動物由来のもので
あることが好ましいと記載している。しかしながら、こ
の提案において具体的に開示されているのはマウス／マ
ウス融合細胞株のみである。

【００１２】

【発明の開示】本発明者等は、ヒト／ヒトハイブリドー
マの創製研究を行ってきた。その結果、ヒト大腸癌患者
のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
とのヒト／ヒト融合細胞株であつて、抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマ
の創製に成功した。

【００１３】更に、本発明のヒト／ヒトハイブリドーマ
が生産する免疫グロブリンは大腸癌とくには結腸癌のみ
ならず、その発生の起源の異なる肺癌細胞に対しても結
合力を有し、たとえばヒト株化細胞Ａ５４９(肺癌)に対
して結合力を有することがわかつた。

【００１４】本発明の該ヒト／ヒトハイブリドーマは、
ヒト大腸癌患者のヒトＢ−セルの免疫学的形質を有し且
つそのような形質を安定に持続し得ること、及び該ヒト
／ヒトハイブリドーマは、ヒト免疫グロブリンＡ(Ｉg
Ａ)生産能を有し且つ生産されたこれら抗体はヒト肺癌
細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞に結合性を示す抗原特異的
モノクローナル抗体であることを発見し且つそのような
抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造に成功した。

【００１５】また更に、上記の新しいタイプのヒト／ヒ
トハイブリドーマは、ヒト大腸癌患者のヒトＢ−セルを
含有するヒト細胞群とヒトリンパ芽球細胞株のサブクロ
ーン[ヒトＢ−セル]を含有するヒト細胞群とを、人間体
外で融合してヒトＢ−セルとヒトＢ−セルとの融合細胞
を産生し、常法のＨＡＴ培地中で培養して融合細胞クロ
ーンを取得することにより産生できることを発見し且つ
そのような手法で上記ヒト／ヒトハイブリドーマ(たと
えば、ＣoＬＮＥ１０やＴＯＣo／Ａ１)を創製すること
に成功した。

【００１６】従つて、本発明の目的は、ヒト大腸癌患者
のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
[ヒトＢ−セル]とのヒト／ヒト融合細胞株であつて、抗
原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒト
ハイブリドーマを提供するにある。

【００１７】本発明の他の目的は、上記ヒト／ヒトハイ
ブリドーマを用いて、ヒト結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌
細胞などに結合性を示す癌関連抗原特異的ヒト免疫グロ
ブリン(モノクローナル抗体)を製造する方法及び該ヒト
免疫グロブリンを提供するにある。

【００１８】本発明の上記目的及び更に多くの目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるであろ
う。

【００１９】本発明のヒト／ヒトハイブリドーマは、ヒ
ト大腸癌患者のヒトＢ−セル、たとえば該患者の血中リ
ンパ節、脾臓、骨髄などから得ることのできるヒトＢ−
セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒトＢ−
セル]、たとえばＵＣ７２９−６株(ＡＴＣＣ ＣＲＬ８
０６１:微工研寄託拒否通知書通知番号、５７微寄文第
６６４号)やＨＩＨ／ＴＯ１株(微工研受託番号：ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１８８４)などとのヒト／ヒト融合細胞株で
あつて、ヒト結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞などに結
合性を示す抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能(モノ
クローナル抗体生産能)を有する。

【００２０】本発明者等の研究により、ヒト大腸癌患者
のヒトＢ−セルを用い、これを免疫グロブリン生産能を
実質的に欠損しているヒトリンパ芽球細胞株のサブクロ
ーン[ヒトＢ−セル]と人間の体外で融合させ、大腸癌、
胃癌、肺癌などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマ
が初めて産生された。

【００２１】この融合細胞を産生する融合操作それ自体
は、公知の如何なる方法で行ってもよい。例えば、融合
操作は液媒中で融合促進剤の存在下に、ヒト大腸癌患者
のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
[ヒトＢ−セル]とを接触させることにより行うことがで
きる。このような融合方法の例としては、仙台ビールス
(ＨＶＪ)、ポリエチレングリコールなどの融合促進剤を
用いる方法や高電圧で電気的に融合する方法などを例示
することができる。

【００２２】例えば、水性媒体中、上記例示の如き融合
促進剤の存在下、所望によりおだやかな撹拌を加えて系
を均一にし、次いで、前記ヒトＢ−セルの１個と前記サ
ブクローン(ヒトＢ−セル)の１個から成る融合細胞が産
生される時間、たとえば数分間のオーダーで静置するこ
とにより、所望の融合細胞が産生できる。液媒の例とし
ては、水、生理食塩水、５％ジメチルスルホキシド水溶
液、５％グリセロール水溶液などを例示することができ
る。

【００２３】所望の融合細胞が産生された系を、例え
ば、遠心分離して細胞群を採取し、再び適当な培地に、
たとえば１０％仔牛もしくは牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−
１６４０液体培地中にＨＡＴ試薬を加えた培地に、採取
した該細胞群を分散させ、この分散液を例えばマイクロ
・タイター・プレートの穴に、夫々、一定量づつ分取注
入し、例えば、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃で培養を行う
ことができる。上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に代えて、
ＲＰＭＩ−１６４０:ＤＭＥ:Ｆ−１２＝２:１:１の混合
培地(ＲＤＦ)を利用することもできる。各穴中の培養液
を例えば３日毎に新しい培養液と取りかえ、例えば２週
間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調
べ、コロニーの認められた試料の培養液を採取し、ヒト
免疫グロブリンの有無を例えば¹²⁵Ｉを用いたラジオ・
イムノ・アツセイや酵素抗体法により検出することがで
きる。

【００２４】このようにして、ヒト免疫グロブリンの生
産の認められたコロニーを、新しい培養液に移して培養
し、融合細胞を増殖させることにより融合細胞クローン
を取得することができる。更に、必要に応じてサブ・ク
ローニングして、所望のヒト大腸癌、胃癌、肺癌などの
癌関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン生産
性クローンを得ることができる。

【００２５】この態様の実施に際しては例えば下記文献
により公知の手法を利用することができる[グラツシイ
・エム・シー,ハンドレイ・エイチ・エイチ,ハギワラ・
エイチ,アンド ロイストン・アイ,プロシーデイング
オブ ナシヨナル アカデミイ オブ サイエンス オ
ブ ザ ユナイテツド ステート オブ アメリカ(Ｇl
assy,Ｍ．Ｃ．,Ｈandley,Ｈ．Ｈ．,Ｈagiwara,Ｈ．,and
Ｒoyston,Ｉ．,Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．Ｕ．Ｓ．
Ａ．),８０,６３２７,(１９８３)]。

【００２６】たとえば、上記文献に記載の手法を利用し
て健康なヒト脾臓からバイオプシー(Ｂiopsy)により、
リンパ芽球、骨髄性白血病患者のリンパ球などの如きリ
ンパ系細胞をとり、その中の免疫グロブリン生産能を実
質的に有しないＢセルリンパ球を選別分離し、たとえば
６−チオグアニン耐性でＨＡＴ培地中では死滅する感受
性を有するヒトＢ−セルを得ることができる。例えば後
記実施例で利用したヒトＢセルＵＣ７２９−６は上記リ
ンパ芽球を用いて６−チオグアニン含有培地で培養して
得ることができる。

【００２７】前述の手法により、ヒト結腸癌患者のヒト
Ｂ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン[ヒト
Ｂ−セル]ＵＣ７２９−６株(ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６
１)[微工研寄託受託拒否通知書通知番号:５７微寄文第
６６４号]から産生された抗原特異的免疫グロブリン生
産性ヒト／ヒトハイブリドーマ(Ｈuman Ｈybridoma)Ｃ
oＬＮＥ１０[微工研寄託受託拒否通知書通知番号:６１
微寄文第７９４号]及び上記ＵＣ７２９−６株の代り
に、ＨＩＨ／ＴＯ１株[微工研受託番号：ＦＥＲＭＢＰ
−１８８４]を融合パートナーとして得られた抗原特異
的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマＴＯ
Ｃo／Ａ１[微工研寄託拒否通知書通知番号:６１微寄文
第１０７５号]の細胞生化学的性質を以下に示す。

【００２８】ヒトヒトハイブリドーマＣoＬＮＥ１０及
びＴＯＣo／Ａ１ （１） ヒト免疫グロブリンＡ(ＩgＡ)分泌(生産)、
（２） 倍加時間(ダブリング・タイム)約２０時間、
（３） ＤＮＡ含量が正常ヒトリンパ球の約２倍、たと
えば１.５〜２.５倍、（４） 上記（１）のＩgＡはヒ
ト株化細胞ＣaＣo−２(結腸癌)及びヒト株化細胞Ａ５４
９(肺癌)に対して結合性を示す、（５） ＨＡＴ含有培
地(ヒポキサンチン、アメソプテリン、チミジン含有培
地)中で分裂増殖可能である。

【００２９】更に、上記（１）のＩgＡはヒト株化細胞
ＬoＶo(結腸癌由来の株化細胞;ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２
９)に対しても結合性を示す。

【００３０】なお、相対ＤＮＡ含量(正常ヒトリンパ球
のＤＮＡ含量に対する比率)は、ハイブリドーマをプロ
ピジユウム・アイオダイドで染色したのち、flow cyto
meterで分離分析する方法によつて決定された。

【００３１】本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリン
は、ヒト大腸癌患者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細
胞株のサブクローン[ヒトＢ−セル]とのヒト／ヒト融合
細胞株であつて抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を
有する細胞株を培地に培養し、その培養物より抗原特異
的ヒト免疫グロブリンを採取することにより製造でき
る。

【００３２】例えば前述のようにして産生できるヒト／
ヒトハイブリドーマを適当な培地、たとえば１０％仔牛
血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、培養液を採
取することによりヒト大腸癌、胃癌、肺癌などのガン関
連抗原に特異的に結合する免疫グロブリン含有物質を得
ることができる。上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養
に際して、無血清培地を用いることもでき、得られる免
疫グロブリンの精製が容易となるので有利である。この
ような無血清培地の例として、同一出願人の出願に係わ
る特願昭６０−１９２１４５号（特開昭６２−５１９８
３号公報）に提案された無血清培地を挙げることができ
る。更に、所望により精製して精製免疫グロブリンとす
ることもできる。精製はたとえば、硫安分画法、アフイ
ニテイークロマトグラフイー、ゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフイー、電気泳動法などの如き生体液から免
疫グロブリンを採取、精製する際に利用できると同様な
精製手段を適宜に利用することができる。

【００３３】本発明によれば、前述した融合細胞クロー
ンまたはその培養液からヒト大腸癌、胃癌、肺癌などの
ガン関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン含
有物質又は該免疫グロブリンを取得するに際し、抗原性
組織(例えば癌組織)を一度、免疫物質生産能を欠如する
かもしくは極めて弱い生体、例えばヌード・マウス(nud
e mouse)等に植えつけ組織を維持した後、その組織に
対して或いは培養系にもどされた組織に対して反応する
ヒト免疫グロブリン(抗体)を探し出し、これを分離する
のが有利である。

【００３４】上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に利
用できる培地の他の例としては、１０％ウシ胎児血清含
有ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｄulbeco培地及びＨＡＭ培
地の三者混合培地(混合比２:１:１)であるＲＤＦ培地、
及びトランスフエリン、インシユリン、亜セレン酸ナト
リウム、エタノールアミン並びにβ−メルプトエタノー
ル添加のＲＤＦ培地などを例示することができる。ま
た、培養条件としては、たとえば５％ＣＯ₂の存在下、
３７℃の条件を例示できる。

【００３５】上述のようにして得ることのできる本発明
のガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリンの例として、
前述したヒト／ヒトハイブリドーマＣoＬＮＥ１０或い
は前述したヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＣo／Ａ１を
用いて得られる本発明グロブリンを例示できる。その特
性を以下に示す。ヒト／ヒトハイブリドーマＣoＬＮＥ
１０或いはヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＣo／Ａ１が
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン: （イ） ヒト免疫グロブリンＡ(ＩgＡ)であつて、
（ロ） ヒト株化細胞ＣaＣo−２(結腸癌)及びヒト株化
細胞Ａ５４９(肺癌)に対して結合力を有する。更に、ヒ
ト株化細胞ＬoＶo(結腸癌)及びＫＡＴＯ−III(胃癌)な
どに対しても結合力を示す、（ハ） 分子量約６万のＨ
鎖(heavy chain)、分子量約２万のＬ鎖(light chain)
及び分子量約１.５万のＪ鎖(Ｊ chain)のサブユニツト
を含有する。

【００３６】上記ヒト株化細胞Ａ５４９(肺癌)は、ＡＴ
ＣＣＣＣＬ１８５として、更に、ヒト株化細胞ＣaＣo−
２はＡＴＣＣ ＨＴＢ３７として、ヒト株化細胞ＬoＶo
はＡＴＣＣ ＣＣＬ２２９として、ヒト株化細胞ＫＡＴ
Ｏ−IIIはＡＴＣＣ ＨＴＢ１０３として、ＡＴＣＣ(ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン)から自
由に入手することができる。

【００３７】本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリン
は、たとえばヒト大腸癌とくには結腸癌、肺癌、胃癌の
如きヒト癌への作用抗体またはそれ自体の作用でこれら
癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、ヒト体
外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補体もしくは
Ｔ−リンパ球の助けをかりて癌細胞の増殖抑制や癌細胞
死滅のはたらきをさせたりすることができる。更にま
た、ヒト体外で量産された癌特異的抗体をキヤリアーと
して利用して例えば化学療法剤結合−ヒト・モノクロー
ナル抗体、インターフエロン結合−ヒトモノクローナル
抗体、高分子毒素結合−ヒト・モノクローナル抗体、薬
物入りリポゾーム結合−ヒト・モノクローナル抗体など
の形で癌細胞の増殖抑制や死滅のはたらきをさせたりす
るのに有用である。また、本発明で得られるヒト・モノ
クローナル抗体をキヤリアーとして利用し、これに放射
線感受性物質を結合させて患者に投与し、癌細胞に選択
的に集まる性質を利用して患部を検知し放射線療法に利
用することができる。このような癌に対する利用に際し
ては、ヒト・モノクローナル抗体として完全な抗体を用
いてもよいし、抗体を化学的な手法で特異的抗原認識部
位を含むより小さな分子に切断して用いたり、或いは、
そのような小さな分子もしくは特異的抗原認識部位のみ
を他の抗体の非特異的抗原認識部分と結合させて、より
有効性のある修飾ヒト・モノクローナル抗体を化学的手
法で創製して用いることもできる。

【００３８】

【実施例】以下、実施例により、本発明の実施の一態様
をさらに詳しく述べる。

【００３９】実施例１ 結腸癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手
した。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ内部のリン
パ球を培地ＲＤＦ(ＲＰＭＩ１６４０:ＤＭＥ:Ｆ−１２
＝２:１:１)に分散させ、続いて２重のガーゼを用いて
濾過を行い脂肪層を除いた後に、濾液中の細胞(リンパ
球＞８０％)を遠心法によつて集める。その後、この癌
患者由来のリンパ球分画(ドナーＢセル)を２０％牛胎児
血清および１０％ジメチルスルホオキサイド(ＤＭＳＯ)
を含むＲＤＦ培地中で凍結(−１３０℃)し、細胞融合を
行う日まで保存した。

【００４０】ドナーＢセルと免疫ブロブリン生産能を実
質的に欠損している融合パートナー(ＵＣ７２９−６)の
それぞれを１.３×１０⁷及び２.３×１０⁷個混合し、３
５％ポリエチレングリコール１５４０を含有する水溶液
で融合を完了させた。その後、１００×g、１０分間の
遠心処理を行ってポリエチレングリコールを除き、１０
％牛胎児血清及びヒポキサンチン、アメソプテリン、チ
ミジン(ＨＡＴ)を含むＲＤＦ培地を加える。この細胞群
を含む培養液１５０μｌ(この中には１.２×１０⁵の細
胞を含む)づつを、９６個の穴をもつミクロプレート３
枚の各穴に分注し、約３週間３７℃、５％ ＣＯ₂条件
下のインキユベータで培養した。この間、ＨＡＴ及び１
０％牛胎児血清を含むＲＤＦ培地を約３日に１度交換し
た。３週間培養の後、ミクロプレート３枚の２８８個の
穴の中に５個のハイブリドーマのサブクローンが見られ
た。このうち１個のハイブリドーマサブクローンはＨＡ
Ｔ及び１０％牛胎児血清を含むＲＤＦ培地中で更にクロ
ーン化されＣoＬＮＥ１０と命名された。

【００４１】このＣoＬＮＥ１０がハイブリドーマであ
ることをさらに確認するために、細胞内ＤＮＡ含量を調
べた。その方法を以下に説明する。

【００４２】遠心管の中に培養細胞液(ＣoＬＮＥ１０)
を入れ遠心処理により、上清を除去する。７０％エタノ
ール溶液で３０分以上固定を行う。遠心処理により上清
を除きＲＮＡ分解酵素(ＲＮase)溶液を加え、静かに振
盪しＲＮＡを分解する。３７℃で３０分間反応させた
後、再蒸留水で２度洗浄する。プロピデイウムイオダイ
ド(ＰＩ)を加え、室温で２０分間染色した後再蒸留水で
２度洗浄する。再蒸留水で希釈し、flow cytometerを
用いて分析した結果、ＣoＬＮＥ１０にはドナーＢセル
の約２倍のＤＮＡ含量が認められた。

【００４３】以上の結果よりＣoＬＮＥ１０はハイブリ
ドーマであることが確認された。

【００４４】このＣoＬＮＥ１０がヒト免疫グロブリン
(ＨuＩg)を産生していることを酵素抗体法を用いて確め
た。以下その方法を説明する。

【００４５】ミクロタイタプレートの中に抗ヒト免疫ブ
ロブリン抗体を滴下(５０μｌ)し、３７℃で１時間プレ
ートに吸着させる。０.３％のゼラチンを含む１０mＭＰ
ＢＳ(ゼラチン緩衝液)で３回洗浄した後、５％牛血清ア
ルブミン溶液を滴下(２００μｌ)し、３７℃で１時間吸
着させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のもの
を除去する。次に検液(培養上清)を滴下(５０μｌ)し
て、３７℃で１時間反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄
する。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン
抗体を滴下(５０μｌ)して、３７℃で３０分間反応さ
せ、検液中のヒト免疫グロブリンと結合させる。ゼラチ
ン緩衝液で３回洗浄後、過酸化水素とo−フエニレンジ
アミンを含む基質溶液を加え暗室で１０分間反応させ
る。５Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄(５０μｌ)を加え、反応を止める。
検液中のヒト免疫グロブリンの量に比例して４９０nmに
吸収をもつ黄色の基質反応物が生産される。この量を吸
光光度計を用いて測定し、予め濃度のわかつたヒト免疫
グロブリンの吸光度と比較することによつて、検液中の
ヒト免疫グロブリン濃度を知ることができる。

【００４６】以上の測定方法を用いた結果、ＣoＬＮＥ
１０はヒトＩgＡを生産していることが分かった(ドナー
Ｂセルと同形質の免疫グロブリン)。

【００４７】１ケ月後にＣoＬＮＥ１０を２４個の穴を
もつミクロプレート(２ml／穴)に植えかえた後に、さら
に１週間培養を続けた。その培養液の上清を採取し種々
の株化細胞を標的細胞としてＣoＬＮＥ１０から生産さ
れるＩgの特異性を調べた。その方法を以下に説明す
る。

【００４８】ヒトの種々の株化培養細胞をＤＦ培地(Ｄ
ＭＥ:Ｆ−１２＝１:１)に１０％牛胎児血清を加えた培
地で培養する。細胞の数が５×１０⁶〜１×１０⁷になつ
た段階でトリプシンを用いて、細胞をシヤーレの底面か
らはがし、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく洗浄
する。９６個の穴をもつミクロタイタプレートの各穴に
細胞を一定数(１０⁵／１００μｌ)ずつ分注し３７℃で
１晩プレートに吸着させる。次に、３％グルタルアルデ
ヒド溶液(５０μｌ)を滴下し、３７℃で３０分間細胞の
固定を行う。遠心法(２００g,１０分間)で細胞をさらに
固定し、ゼラチン緩衝液で３回洗浄した後、５％牛血清
アルブミン溶液を滴下(２００μｌ)し、３７℃で１時間
プレートに吸着させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、
未吸着のものを除去する。その後検液(培養上清)を細胞
の上に滴下(５０μｌ)し、３７℃で１時間反応させ、ゼ
ラチン緩衝液で３回洗浄する。続いてペルオキシダーゼ
結合抗ヒトＩg抗体を滴下(５０μｌ)し、３７℃で３０
分間反応させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄を行った
後、先の酵素抗体法で述べた方法によつて細胞に結合す
る培養液中のヒトＩgの量を測定する。

【００４９】以上の方法によつてＣoＬＮＥ１０が産出
するＩgＡの標的細胞特異性を調べた結果、ＣoＬＮＥ１
０の培養液中のＩgＡは、ヒト結腸癌由来の株化細胞Ｃa
Ｃo−２(ＡＴＣＣ ＨＴＢ３７)、ＬoＶo(ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ２２９)ヒト肺癌由来の株化細胞Ａ５４９(ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１８５)、ヒト胃癌由来の株化細胞ＫＡＴＯ−I
II(ＡＴＣＣ ＨＴＢ１０３)に対して結合力を有してい
ることがわかつた。

【００５０】すなわち、ドナーＢセルは体内に結腸癌を
もつ患者から採取されたものであるので、細胞融合法に
よつて作り出された自己増殖性をもつハイブリドーマの
クローンからは、ドナーＢセルと同形質のかつ特定の抗
原結合部位をもつモノクローナル(単一)抗体を生産して
いることを示している。のみならず他種の癌腫にも反応
することが分った。

【００５１】約４週間後にハイブリドーマの培地からＨ
ＡＴを除き、インシユリン、トランスフエリン、亜セレ
ン酸ナトリウム、エタノールアミン、β−メルカプトエ
タノール及び血清アルブミンを含むＲＤＦ培地で３７
℃、５％ＣＯ₂条件下で培養し、１×１０⁶個／mlで増殖
する時約２.２μg／mlの量でヒトＩgＡを生産し続け
た。上記培養での培加時間は約２０時間であつた。

【００５２】ハイブリドーマの多量培養液を７０％の硫
酸アンモニウムで沈澱させ、粗Ｉg分画を得た。得られ
た沈澱を生理食塩水に溶かし、ヤギ抗ＩgＡ抗体を結合
させたセフアロースを用いてアフイニテイクロマトグラ
フイーの手法でＩgＡを精製した。ＣoＬＮＥ１０の培養
液１ｌから精製したＩgＡ０.７mgが得られた。この精製
したＩgＡ標品をＳＤＳ−電気泳動法で分析した結果、
分子量約６万、２万、１万５千のサブユニツトを含むＩ
gＡを生産していることが確かめられた。

【００５３】実施例２ 実施例１において融合パートナーとして用いたＵＣ７２
９−６株の代りに、ＨＩＨ／ＴＯ１株を融合パートナー
として用い、更に、実施例１において融合操作を完了し
たのちポリエチレングリコールを除いて加えたＲＤＦ培
地の代りに、ウワバインを更に含有させたＲＤＦ培地を
用いたほかは、実施例１と同様に行ってハイブリドーマ
サブクローンを得た。このハイブリドーマを実施例１と
同様にしてクローン化し、ＴＯＣo／Ａ１と命名し且つ
同様にしてハイブリドーマであることが確認された。

【００５４】実施例１と同様の処理を行って、該ＴＯＣ
o／Ａ１はヒトＩgＡを生産していることがわかつた。更
に、実施例１と同様な方法でＴＯＣo／Ａ１の産生する
ＩgＡの標的細胞特異性を調べた結果、実施例１の場合
と同様な結果が得られた。更に、実施例１と同様にして
ＩgＡの生産を行った結果、約２.０μg／mlの量でヒト
ＩgＡを生産し続けた。実施例１と同様の処理を行って
同様なサブユニツトを含む精製ＩgＡ１.０mgが得られ
た。

【００５５】参考例１．ヒトＢセル‐リンパ芽球細胞株
ＨＩＨ／ＴＯ１。

【００５６】ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２
(微工研寄託受託拒否通知書、通知番号:６０微寄文第１
６２１号)を、基礎培地ＲＤＦ中にインシユリン、トラ
ンスフエリン、セレニウム、エタノールアミン、β−メ
ルカプトエタノール及び牛血清アルブミンの適量を含有
する無血清培地で培養適応させる。該無血清培地を分注
した９６穴マイクロタイタープレートに１cell／wellと
なるように植えこみ、５％ＣＯ₂、３７℃の条件下で限
界稀釈法によりクローニング操作を行なう。約１ケ月経
過後、増殖してきた５０穴より免疫グロブリンＩgＧ及
びＩgＭを実質的に培地中に生産していないクローンを
１つ選び出した。

【００５７】このクローンを、まず０.１μＭの６−チ
オグアニンを含む前記と同様な無血清培地中で培養適応
させる。培養は５％ＣＯ₂、３７℃の条件下で、継代培
養をくり返すごとに、６−チオグアニン濃度を０.２μ
Ｍ、０.５μＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭ、１０μＭ、
１５μＭ、２０μＭと段階的に上げて行ない、最終的に
２０μＭの６−チオグアニン含有無血清培地中で増殖可
能な単クローンを、前記と同様な限界稀釈法によるクロ
ーニング操作で選別する。

【００５８】この細胞を、１μg／ｍｌの突然変異剤Ｍ
ＮＮＧ(Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン)を含有する基礎培地ＲＤＦ中で、５％ＣＯ₂、３７
℃の条件下で３時間培養した後、前記と同様な無血清培
地で洗浄し、洗浄した細胞を２０μＭの６−チオグアニ
ン及びウワバインを含む前記と同様な無血清培地中で培
養適応させる。培養は５％ＣＯ₂、３７℃の条件下で、
継代培養をくり返すごとに、ウワバインの濃度を０.１
μＭ、０.２μＭ、０.５μＭ、１μＭ、５μＭと段階的
に上げて行ない、最終的に２０μＭの６−チオグアニン
及び５μＭのウワバインを含む無血清培地中で増殖可能
な単クローンを、前記と同様な限界稀釈法によるクロー
ニング操作で選別し、ＨＩＨ／ＴＯ１株が得られた。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト大腸癌患者のヒトＢ−セルとヒトリ
   ンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／ヒト融合細胞
   株であって、抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有
   することを特徴とするヒト／ヒトハイブリドーマＣoＬ
   ＮＥ１０。
2. 【請求項２】 （ａ）ヒト免疫グロブリンＡ(ＩgＡ)を
   分泌（生産）し、かつ（ｂ）上記ヒト免疫グロブリンＡ
   (ＩgＡ)はヒト株化細胞ＣaＣo−２(結腸癌)及びヒト株
   化細胞Ａ５４９(肺癌)に対して結合性を示す細胞生化学
   的性質を有する請求項１記載のヒト／ヒトハイブリドー
   マＣoＬＮＥ１０。