JPS59137497A - 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 - Google Patents
抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体Info
- Publication number
- JPS59137497A JPS59137497A JP58006603A JP660383A JPS59137497A JP S59137497 A JPS59137497 A JP S59137497A JP 58006603 A JP58006603 A JP 58006603A JP 660383 A JP660383 A JP 660383A JP S59137497 A JPS59137497 A JP S59137497A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- cells
- immunoglobulin
- cell
- hybridoma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫グロブリン生産能を有するヒトトセル(A
)と免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しているし)
B−セル(B)との新しいタイプのヒト/ヒト融合細胞
クローン、それらが生産した抗原特異的ヒト免疫グロブ
リン、更には、該ヒト免疫グロブリンの製法に関する。
)と免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しているし)
B−セル(B)との新しいタイプのヒト/ヒト融合細胞
クローン、それらが生産した抗原特異的ヒト免疫グロブ
リン、更には、該ヒト免疫グロブリンの製法に関する。
更に詳しくは、本発明はヒト子宮癌患者のヒトB−セル
(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン1ヒ)暑
3−セル(B)1とのヒト/ヒト融合細胞株であって抗
原特異的ヒト免疫グロブリン生産11ヒを有するヒト/
ヒトハイブリドーマに関する。本発明はまた1、該ヒト
/ヒト融合細胞株か生産した抗MC4i)異的ヒト免疫
グロブリンに関する。更に、本発明は該ヒト/ヒト融合
細胞株を培地に培養し、その培五物より抗原特異的ヒト
免疫グロブリンを採取針ることを特徴とする特許 ロブリ/の製法にも関する。
(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン1ヒ)暑
3−セル(B)1とのヒト/ヒト融合細胞株であって抗
原特異的ヒト免疫グロブリン生産11ヒを有するヒト/
ヒトハイブリドーマに関する。本発明はまた1、該ヒト
/ヒト融合細胞株か生産した抗MC4i)異的ヒト免疫
グロブリンに関する。更に、本発明は該ヒト/ヒト融合
細胞株を培地に培養し、その培五物より抗原特異的ヒト
免疫グロブリンを採取針ることを特徴とする特許 ロブリ/の製法にも関する。
該抗原1、r異的ヒト免疫グロブリンは、例えばヒト子
宮頚部癌、ヒト子宮腺癌、前立腺癌などの予防、治療、
診断の如き医学及び薬学分野や生化学的試薬、生木高分
子の精製試薬などの薬理学分野、生化学分野%,;;の
広い分野において有用である。
宮頚部癌、ヒト子宮腺癌、前立腺癌などの予防、治療、
診断の如き医学及び薬学分野や生化学的試薬、生木高分
子の精製試薬などの薬理学分野、生化学分野%,;;の
広い分野において有用である。
従来、抗原によって感作されたマウス13−セルと骨髄
性1′」血病(a+yelo+na)マウスがらマウス
13−セルとの融合細胞をマウス体外で形成し、」二足
抗原にλ・jするマウス免疫グロブリン生産能を有し且
つ自己増殖性を有するマウス/マウス融合細胞を形成し
た報告は知られている(例えば、Nature, Vo
l.256.1975年、4 9 5 − 4 9 7
@;Proc。
性1′」血病(a+yelo+na)マウスがらマウス
13−セルとの融合細胞をマウス体外で形成し、」二足
抗原にλ・jするマウス免疫グロブリン生産能を有し且
つ自己増殖性を有するマウス/マウス融合細胞を形成し
た報告は知られている(例えば、Nature, Vo
l.256.1975年、4 9 5 − 4 9 7
@;Proc。
NaL!.Acad.Sci.tJSA,\7o1.7
5,NO7.1978年、3 4 0 5〜3 4 (
1 9頁;等)。
5,NO7.1978年、3 4 0 5〜3 4 (
1 9頁;等)。
又、抗原によって感作されたヒ}B−セルと骨髄性白血
病マウスからのマウスBーセルとの融合細胞を体外で形
成し、上記抗原に対するヒト免疫グロブリン生産能を有
し且つ自己増殖性を有するヒト/マウス融合細胞を形成
した報告も知られている(例えば、F’roc.Nat
l.Acad.Sci.USA。
病マウスからのマウスBーセルとの融合細胞を体外で形
成し、上記抗原に対するヒト免疫グロブリン生産能を有
し且つ自己増殖性を有するヒト/マウス融合細胞を形成
した報告も知られている(例えば、F’roc.Nat
l.Acad.Sci.USA。
\7ol.77,N o 11,1.Sノ 8 ()年
、 68−1 1 −68 /l 5 @;Tbe
Journal of I mmunology
+’\′01。
、 68−1 1 −68 /l 5 @;Tbe
Journal of I mmunology
+’\′01。
125、NO3、] 9 8 0年、1037〜104
3@等)。
3@等)。
しかしながら、ヒト免疫グロブリン生産能を有する融合
細胞を取得しようと,)ウ上記後者の試みに於では、経
時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グロブリン生産
能が経時的に喪失し、免疫グロブリン生産能が極めて不
安定である致命的な欠陥を−(+・;−る。
細胞を取得しようと,)ウ上記後者の試みに於では、経
時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グロブリン生産
能が経時的に喪失し、免疫グロブリン生産能が極めて不
安定である致命的な欠陥を−(+・;−る。
ヒ1免投クロ7リン生産能を有するヒト/ヒト融合細胞
を形成する試みとしで、抗原としてハシ力・ヒール又又
はハプテン(hapl、en) [2+ 4−ノニトロ
フェニル]によって感作されたヒト13−セルをドナー
として使用しこれと骨髄性、白血病患者からのヒト免疫
グロブリン生産能を有するセル・ライン(ヒI暑う一セ
ル)(親株)との融合細胞をヒト体外−〔・形成し、−
]二二足原に対するヒト免疫グロブリンlI:+!i:
’能を有し且つ自己増殖性を有するヒト/ヒト融合細胞
を形成した報告が知られている(Na−1、ure、
Vol、288 、1980年、488−489す(及
びしrock、Naj、1.Acad、Sci、 LJ
S A +\’of、 7’? 、 N (”19
、198 (i年、5429−5□4.31 頁)。
を形成する試みとしで、抗原としてハシ力・ヒール又又
はハプテン(hapl、en) [2+ 4−ノニトロ
フェニル]によって感作されたヒト13−セルをドナー
として使用しこれと骨髄性、白血病患者からのヒト免疫
グロブリン生産能を有するセル・ライン(ヒI暑う一セ
ル)(親株)との融合細胞をヒト体外−〔・形成し、−
]二二足原に対するヒト免疫グロブリンlI:+!i:
’能を有し且つ自己増殖性を有するヒト/ヒト融合細胞
を形成した報告が知られている(Na−1、ure、
Vol、288 、1980年、488−489す(及
びしrock、Naj、1.Acad、Sci、 LJ
S A +\’of、 7’? 、 N (”19
、198 (i年、5429−5□4.31 頁)。
しかしながら、この雑文の方法によれば、親株である後
者のセル・ライン(ヒ)B−セル)がドナーである11
11者のヒ)B−セルとは異なるヒト免疫グロブリン生
産能を有するために、得られるヒト/ヒト融合細胞は両
者のヒ)B−セルの免疫グロブリン形質を有するものの
混合体となる。このためにかがるヒト/ヒト融合細胞か
ら採取される免疫グロブリンは幾つかの形質の免疫グロ
ブリンの混合体となり、リンパ球()\)と同形質の免
疫グロブリンが一定の特異的形質を維持しながらがつ単
一抗体として産生されることが不可能となる。
者のセル・ライン(ヒ)B−セル)がドナーである11
11者のヒ)B−セルとは異なるヒト免疫グロブリン生
産能を有するために、得られるヒト/ヒト融合細胞は両
者のヒ)B−セルの免疫グロブリン形質を有するものの
混合体となる。このためにかがるヒト/ヒト融合細胞か
ら採取される免疫グロブリンは幾つかの形質の免疫グロ
ブリンの混合体となり、リンパ球()\)と同形質の免
疫グロブリンが一定の特異的形質を維持しながらがつ単
一抗体として産生されることが不可能となる。
この結果、例えばリンパ球(A)と同形質の抗原特異的
ヒト免疫グロブリンを用いようとしても、辿の形質の免
疫グロブリンが干渉することとなり、目的とする治療、
予防、検査、精製等の遂行が困難となる。
ヒト免疫グロブリンを用いようとしても、辿の形質の免
疫グロブリンが干渉することとなり、目的とする治療、
予防、検査、精製等の遂行が困難となる。
その上、」二足の雑文で用いられた親株であるセル・ラ
イン(ヒ)B−セル)は薬剤感受性が可逆的で・あって
、感受性を喪失する頻度が高く、一旦このような現象が
生じると所望の融合細胞をドナ〜及び親株として用いた
ヒ)B−セルから分離し、採取することが困難となる。
イン(ヒ)B−セル)は薬剤感受性が可逆的で・あって
、感受性を喪失する頻度が高く、一旦このような現象が
生じると所望の融合細胞をドナ〜及び親株として用いた
ヒ)B−セルから分離し、採取することが困難となる。
さらに、親株であるセル・ラインの培養中に凝集塊を形
成し易く、その結果、融合細胞を産生する確率が低いと
いう難点もある1゜ 斯くて、ドナーとして用し・るヒトリンパ球の13−セ
ル(A)と同形質の抗原特異的ヒト免疫グロブリンをそ
の一定の形質を維持しつつ生産可能なヒト/ヒト融合4
+11胞株、とくに、抗原特異的単一 クローン性抗本
(モノクローナル抗体)の恒常的生産能をイjL 1.
’1.っ自己増殖性を有するヒト/ヒト単一クローン化
融合細胞株を創造し、モアクローナル抗体の工丈的生産
を1」能とすることが切望されている。
成し易く、その結果、融合細胞を産生する確率が低いと
いう難点もある1゜ 斯くて、ドナーとして用し・るヒトリンパ球の13−セ
ル(A)と同形質の抗原特異的ヒト免疫グロブリンをそ
の一定の形質を維持しつつ生産可能なヒト/ヒト融合4
+11胞株、とくに、抗原特異的単一 クローン性抗本
(モノクローナル抗体)の恒常的生産能をイjL 1.
’1.っ自己増殖性を有するヒト/ヒト単一クローン化
融合細胞株を創造し、モアクローナル抗体の工丈的生産
を1」能とすることが切望されている。
本発明者は、そのような要望にこたえるべく (iJi
究を行ってきた。その結果、ヒト子宮頚部癌患者の例え
ば末梢血リンパ球、リンパ筋などから得られるヒト13
−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のザブローン〔ヒ
)B−セル(B)〕とを人間の体外で融合することによ
り新規なヒト/ヒト融合細胞を産生で゛きることを発見
し且つ抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能、とくに抗
原特異的モノクローナル抗木生産能を有するそのような
ヒト/ヒトハイブリドーマの産生に成功した。
究を行ってきた。その結果、ヒト子宮頚部癌患者の例え
ば末梢血リンパ球、リンパ筋などから得られるヒト13
−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のザブローン〔ヒ
)B−セル(B)〕とを人間の体外で融合することによ
り新規なヒト/ヒト融合細胞を産生で゛きることを発見
し且つ抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能、とくに抗
原特異的モノクローナル抗木生産能を有するそのような
ヒト/ヒトハイブリドーマの産生に成功した。
更に、該ヒト/ヒトハイブリドーマはヒト子宮頚部癌患
者のヒ)B−セル(A)の免疫学的形質を有し且つその
ような形質を安定に持続し得ること及び該ヒト/ヒトハ
イブリドーマはヒト免疫グロブリンM(IgM)もしく
はヒト免疫グロブリンG(Igに)生産能を有し汀つ生
産されたこれら抗体はヒI・子宮頚部癌細胞に結合性を
示す抗原特異的モアクローナル抗体であることを発見し
且つそのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造に
成功した。
者のヒ)B−セル(A)の免疫学的形質を有し且つその
ような形質を安定に持続し得ること及び該ヒト/ヒトハ
イブリドーマはヒト免疫グロブリンM(IgM)もしく
はヒト免疫グロブリンG(Igに)生産能を有し汀つ生
産されたこれら抗体はヒI・子宮頚部癌細胞に結合性を
示す抗原特異的モアクローナル抗体であることを発見し
且つそのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造に
成功した。
又更に、上記の新しいタイプのヒト/ヒトハイブリドー
マは、ヒト子宮頚部癌患者のヒ)B−セル(A)を含有
するヒト細胞群とヒトリンパ芽球細胞株のす7クローン
〔ヒ)B−セル(B)〕を含有するヒト細胞群とを、人
間の体外で融合しでヒトB−セル(A)とヒト13−セ
ル(B)との融合細胞を産生じ、得られる融合細胞を上
記ヒ)B−セル(A)を含有するヒト細胞群及び上記ヒ
)B−セル(B)を含有するヒト細胞群は増殖停止又は
死滅するが詠融合細胞は増殖しイ:する培地中で培養し
て融合細胞クローンを取引することにより産生でトるこ
とを発見し11.0そのような手法で上記ヒト/ヒトハ
イブリドーマを産生することに成功した。
マは、ヒト子宮頚部癌患者のヒ)B−セル(A)を含有
するヒト細胞群とヒトリンパ芽球細胞株のす7クローン
〔ヒ)B−セル(B)〕を含有するヒト細胞群とを、人
間の体外で融合しでヒトB−セル(A)とヒト13−セ
ル(B)との融合細胞を産生じ、得られる融合細胞を上
記ヒ)B−セル(A)を含有するヒト細胞群及び上記ヒ
)B−セル(B)を含有するヒト細胞群は増殖停止又は
死滅するが詠融合細胞は増殖しイ:する培地中で培養し
て融合細胞クローンを取引することにより産生でトるこ
とを発見し11.0そのような手法で上記ヒト/ヒトハ
イブリドーマを産生することに成功した。
従って、本発明の]」的はヒト子宮頚部癌患者のヒト1
3−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
〔ヒト13−セル(B ) )とのヒト/ヒト融合細胞
株であって抗原特異的ヒト免疫グ07リン生産能を有す
るヒト/ヒトハイ7リドーマを提供するにある。
3−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
〔ヒト13−セル(B ) )とのヒト/ヒト融合細胞
株であって抗原特異的ヒト免疫グ07リン生産能を有す
るヒト/ヒトハイ7リドーマを提供するにある。
本発明の池の目的は、上記ヒト/ヒトハイ7リドーマを
月1いて、ヒト子宮頚部癌細胞に結合性を示す抗1工;
(特異的ヒト免疫グロブリン(モノクローナル杭木)を
製造する方法及び該ヒト免疫グロブリンを提供するにあ
る。
月1いて、ヒト子宮頚部癌細胞に結合性を示す抗1工;
(特異的ヒト免疫グロブリン(モノクローナル杭木)を
製造する方法及び該ヒト免疫グロブリンを提供するにあ
る。
本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、r、下の記載から一層明らかとなるであろう。
は、r、下の記載から一層明らかとなるであろう。
本発明のヒト/ヒトハイブリドーマは、ヒト子宮癌患者
、たとえば、子宮腺癌患者、子宮頚部癌患者などのヒ)
B−セル(A)たとえば該患者の血中リンパ球、リンパ
節、肺臓、骨髄などから得ることのできるヒト13−セ
ル(A>とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン〔ヒト
B−セル(B)〕、たとえばUC729−6株(ATC
CCRL 8061;微工研寄託拒否通知書通知番号、
57微寄文@664号)とのヒト/ヒト融合細胞株であ
って、ヒト子宮癌細胞に結合性を示を抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能(モノクローナル抗体生産能)を有
する。
、たとえば、子宮腺癌患者、子宮頚部癌患者などのヒ)
B−セル(A)たとえば該患者の血中リンパ球、リンパ
節、肺臓、骨髄などから得ることのできるヒト13−セ
ル(A>とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン〔ヒト
B−セル(B)〕、たとえばUC729−6株(ATC
CCRL 8061;微工研寄託拒否通知書通知番号、
57微寄文@664号)とのヒト/ヒト融合細胞株であ
って、ヒト子宮癌細胞に結合性を示を抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能(モノクローナル抗体生産能)を有
する。
本発明者の知るかぎり、上記ヒ)B−セル(A)をドナ
ーとして用い、これを」二足ヒトB−セル(B)の如き
免疫グロブリン生産能を実質的に欠損している親株と、
人間の体外で融合してヒト/ヒトハイブリドーマを産生
させることに成功した実例は、これまで全く知られてい
ない。更に、このようなヒト/ヒトハイブリドーマから
分泌(生産)されるヒト免疫グロ7リンが本人(患者)
および本人以外のそれと同形質の抗原(癌組、11)と
特異的に反応する、−とは未だ報告されたことかない。
ーとして用い、これを」二足ヒトB−セル(B)の如き
免疫グロブリン生産能を実質的に欠損している親株と、
人間の体外で融合してヒト/ヒトハイブリドーマを産生
させることに成功した実例は、これまで全く知られてい
ない。更に、このようなヒト/ヒトハイブリドーマから
分泌(生産)されるヒト免疫グロ7リンが本人(患者)
および本人以外のそれと同形質の抗原(癌組、11)と
特異的に反応する、−とは未だ報告されたことかない。
本発明者の研究により、ヒト子宮癌患者のヒト13−セ
ル(A)を用い1、−れを免疫グロブリン生産能を天質
的に欠損L′ζいるヒトリンパ芽球細胞株のサックロー
ン〔ヒト13−セル(I:3 ) )と人間の体外で融
合させて抗Iにξ特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有
するヒト/ヒトハイブリドーマが初めて産生され、この
ヒト/ヒトハイフリドーマが゛生産した抗原特異的ヒト
免疫グロブリンが患者本人(A u to l oI(
ous )の抗ノJハ及びこれと同形質の本人以外のヒ
ト抗原にヌ=l してq、lf異的に反応することか発
見され且−ノ確認されtこ、 この融合細胞を産生する融合操作それ自体は、公知の如
何なる方法で行ってもよい。例えば、融合操作は液媒中
で融合促進剤の存在下に、ヒト子宮頚部癌患者のヒ)
B−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
〔ヒ)13−セル(B)〕とを接触させることにより行
うことができる。このような融合促進剤の例としては、
仙台ビールス()−1VJ)、ポリエチレングリコール
などを例示することがでトる。例えば、水性媒体中、上
記例示の如き融合促進剤の存在下、所望によりおだやか
な攪拌を加えて系を均一にし、次いで、前記ヒ)B−セ
ル(A)の1ケと前記ヒト13−セル(B)の1ケか
□ら成る融合細胞が産生される時
間、たとえば数分間のオーダーで静置することにより、
所望の融合細胞か産生できる。液媒の例としては水、生
理食塩水、5%ツメチルスルホキシド水溶液、5%グリ
セロール水溶液などを例示することができる。
ル(A)を用い1、−れを免疫グロブリン生産能を天質
的に欠損L′ζいるヒトリンパ芽球細胞株のサックロー
ン〔ヒト13−セル(I:3 ) )と人間の体外で融
合させて抗Iにξ特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有
するヒト/ヒトハイブリドーマが初めて産生され、この
ヒト/ヒトハイフリドーマが゛生産した抗原特異的ヒト
免疫グロブリンが患者本人(A u to l oI(
ous )の抗ノJハ及びこれと同形質の本人以外のヒ
ト抗原にヌ=l してq、lf異的に反応することか発
見され且−ノ確認されtこ、 この融合細胞を産生する融合操作それ自体は、公知の如
何なる方法で行ってもよい。例えば、融合操作は液媒中
で融合促進剤の存在下に、ヒト子宮頚部癌患者のヒ)
B−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
〔ヒ)13−セル(B)〕とを接触させることにより行
うことができる。このような融合促進剤の例としては、
仙台ビールス()−1VJ)、ポリエチレングリコール
などを例示することがでトる。例えば、水性媒体中、上
記例示の如き融合促進剤の存在下、所望によりおだやか
な攪拌を加えて系を均一にし、次いで、前記ヒ)B−セ
ル(A)の1ケと前記ヒト13−セル(B)の1ケか
□ら成る融合細胞が産生される時
間、たとえば数分間のオーダーで静置することにより、
所望の融合細胞か産生できる。液媒の例としては水、生
理食塩水、5%ツメチルスルホキシド水溶液、5%グリ
セロール水溶液などを例示することができる。
所望の融合細胞か産生された系を、例えば、遠心分離し
て細胞群を採取し、再び過当な培地【こ、たとえば10
%仔牛血清含有RPM[164(,1液体培地中に前記
例示の如き試薬を加え、採取した該細胞群を分散させ、
この分散液を例えばマイクロ・タイター・プレートの穴
に、夫々、一定量つつ分取注入し、例えば、5%CO2
の存在下、3’7 ’Cてjlを養を行う。各穴中の培
養液を、例えば3111rjに新しいi1シ養液と収り
かえ、例えば2週間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合
細胞の有無を調べ、コロニーの認められた試料の培養液
を採収し、ヒ)・免疫グロブリンの有無を、例えば+=
″)を用いtこランA・イミュノ・アッセイにより検出
することかできる。
て細胞群を採取し、再び過当な培地【こ、たとえば10
%仔牛血清含有RPM[164(,1液体培地中に前記
例示の如き試薬を加え、採取した該細胞群を分散させ、
この分散液を例えばマイクロ・タイター・プレートの穴
に、夫々、一定量つつ分取注入し、例えば、5%CO2
の存在下、3’7 ’Cてjlを養を行う。各穴中の培
養液を、例えば3111rjに新しいi1シ養液と収り
かえ、例えば2週間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合
細胞の有無を調べ、コロニーの認められた試料の培養液
を採収し、ヒ)・免疫グロブリンの有無を、例えば+=
″)を用いtこランA・イミュノ・アッセイにより検出
することかできる。
このようにして、ヒト免疫グロブリンの生産の認められ
たコロニーを、新しい培養液に移して培養し、融合細胞
を増殖させることにより融合細胞クローンを取得するこ
とができる。更に、必要に応じて、サブ・クローニング
して、所望のヒト子宮癌患者のヒトB−セル(A)と同
形質の抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性クローンを
得ることができる。ヒトリンパ芽球細胞株のザブクロー
ン[ヒトB−セル(B)]は、例えば、(イ)適当な培
地中で自己増殖性を有し且つ(ハ)免疫グロブリン生産
能を実質的に欠損しているが下記(ロ)の性質を有しな
いヒトB−セルを採取し、これに(ロ)特定の試薬の存
在下又は特定の成分の不存在下で増殖停止又は死滅する
感受性を、ヒト体外で賦与することができる。この態様
の実施に際しては、例えば下記文献により公知の手法を
利用することができる。)lybridoma in
CancerQiagnosis and Trea
tment ed、 M、 S、 Mトtchell
and H,F、 0ettoen Raven
PressNew Yo+l+ (1982)
、+3+) 125−132cたとえは、上記文献に
記載の手法を利用して、町原なヒ1〜肺臓からバイオプ
シー(31opsy )により、リンパ芽球、骨髄性白
血病患者のリンパ球などの如きリンパ系細胞をとり、そ
の中の免疫グロブリン生産能を実質的に有しないBセル
リンパ球を選別分離し、たとえば6−チオグアニン、8
−アザグアニン、5〜70モデオキシウリジンの如き酵
素変異原含有培地で培養すると、適当な培地中で自己増
殖性を有し、免疫グロブリンを産生ゼず且つHAT培地
中では死滅する感受性を有す゛るヒl−8−ヒル(B)
を得ることかできる。1伺えば、後記実施例で利用した
ヒトBセルUC729−6は上記リンパ芽球を用いて6
−チオクアニン含有培地で培養して1qることができる
。
たコロニーを、新しい培養液に移して培養し、融合細胞
を増殖させることにより融合細胞クローンを取得するこ
とができる。更に、必要に応じて、サブ・クローニング
して、所望のヒト子宮癌患者のヒトB−セル(A)と同
形質の抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性クローンを
得ることができる。ヒトリンパ芽球細胞株のザブクロー
ン[ヒトB−セル(B)]は、例えば、(イ)適当な培
地中で自己増殖性を有し且つ(ハ)免疫グロブリン生産
能を実質的に欠損しているが下記(ロ)の性質を有しな
いヒトB−セルを採取し、これに(ロ)特定の試薬の存
在下又は特定の成分の不存在下で増殖停止又は死滅する
感受性を、ヒト体外で賦与することができる。この態様
の実施に際しては、例えば下記文献により公知の手法を
利用することができる。)lybridoma in
CancerQiagnosis and Trea
tment ed、 M、 S、 Mトtchell
and H,F、 0ettoen Raven
PressNew Yo+l+ (1982)
、+3+) 125−132cたとえは、上記文献に
記載の手法を利用して、町原なヒ1〜肺臓からバイオプ
シー(31opsy )により、リンパ芽球、骨髄性白
血病患者のリンパ球などの如きリンパ系細胞をとり、そ
の中の免疫グロブリン生産能を実質的に有しないBセル
リンパ球を選別分離し、たとえば6−チオグアニン、8
−アザグアニン、5〜70モデオキシウリジンの如き酵
素変異原含有培地で培養すると、適当な培地中で自己増
殖性を有し、免疫グロブリンを産生ゼず且つHAT培地
中では死滅する感受性を有す゛るヒl−8−ヒル(B)
を得ることかできる。1伺えば、後記実施例で利用した
ヒトBセルUC729−6は上記リンパ芽球を用いて6
−チオクアニン含有培地で培養して1qることができる
。
前述の手法により、ヒト子宮頚部偏平上皮癌患者のヒト
B−セル(A>とヒトリンパ芽球細胞株のザブクローン
[ヒトB−セル(B)]]UC/29−6株ATCCC
RL 8061)から産生された抗原特異的免疫グロ
ブリン生産性ヒト、′ヒトハイフリドー? (Huma
n hy11四don+a) CL N、/ S U
Z H5株[微工研寄託受託拒否通知書通知番号:5
7微寄文第637号コ及びヒト2/ヒトバイブリド−v
cLN/5tJZ 811株[微工研寄託受託拒否通
知書通知番号:57微寄文第638号]の細胞生化学的
性質を以下に示す。
B−セル(A>とヒトリンパ芽球細胞株のザブクローン
[ヒトB−セル(B)]]UC/29−6株ATCCC
RL 8061)から産生された抗原特異的免疫グロ
ブリン生産性ヒト、′ヒトハイフリドー? (Huma
n hy11四don+a) CL N、/ S U
Z H5株[微工研寄託受託拒否通知書通知番号:5
7微寄文第637号コ及びヒト2/ヒトバイブリド−v
cLN/5tJZ 811株[微工研寄託受託拒否通
知書通知番号:57微寄文第638号]の細胞生化学的
性質を以下に示す。
ヒト7/ヒトハイブリドーマCLN、”SUZ H5
ニー (1)染色体a!?92゜ (2〉ヒト免疫グロブリンM (I gM >分泌(生
産 ン 。
ニー (1)染色体a!?92゜ (2〉ヒト免疫グロブリンM (I gM >分泌(生
産 ン 。
(3)倍加時間(ダブリング・タイム237時間。
(4〉リンパ球系シンクルセル。
(5)DNA含憬が正常ヒトリンパ球の2倍以上、たと
えば2〜2.5倍。
えば2〜2.5倍。
(6)上記(2ンのIQMはヒト子宮頚部癌細胞に結合
性を示す。
性を示す。
更に、上記ヒト2/ヒトバイブリド−7CLNSUZ
H5株は (7) H△ゴー選択培地(ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミン含有培地)中で分裂増殖可能。
H5株は (7) H△ゴー選択培地(ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミン含有培地)中で分裂増殖可能。
ヒh、″ヒ1−ハイアリドーマCL N 、7 S U
Z ト111ニー (1)染色体数92゜ 〈2〉′ ヒト免疫グロブリンG(IgG>分泌(生産
)。
Z ト111ニー (1)染色体数92゜ 〈2〉′ ヒト免疫グロブリンG(IgG>分泌(生産
)。
< 3 > 18加詩間〈タブリング・タイム>371
間。
間。
(71)リンパ球系シングルセル。
(5)DNAIMが正常ヒトリンパ球の218以上、た
とえば2〜2.5倍。
とえば2〜2.5倍。
<6)’ h記(2)′のIuGはヒl〜子富頚部癌
細胞に結合性を示す。
細胞に結合性を示す。
更に、上記ヒト7′ヒトハイブリドーマCL N 、/
SUZ HI3株は (7) −1−I A−I−選択倍地中で分裂増殖可能
。
SUZ HI3株は (7) −1−I A−I−選択倍地中で分裂増殖可能
。
尚、相対DNA含m(正常ヒトリンパ球のON△含量と
対する比率〉は、ハイブリドーマを70ビジユウム・ア
イオフイドで染色したのち、Cy−tOflLI01゛
Oメーターで分離分析する方法によって決定された。
対する比率〉は、ハイブリドーマを70ビジユウム・ア
イオフイドで染色したのち、Cy−tOflLI01゛
Oメーターで分離分析する方法によって決定された。
本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンは、ヒト子宮癌
患者のヒトB−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサ
ブクローン[ヒトB−セル(s>:どのヒト、/ヒト融
合細胞株であって抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能
を有する細胞株を培地に培養し、その培養物より抗原特
異的ヒト免疫グロブリンを採取することにより製造でき
る。
患者のヒトB−セル(A)とヒトリンパ芽球細胞株のサ
ブクローン[ヒトB−セル(s>:どのヒト、/ヒト融
合細胞株であって抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能
を有する細胞株を培地に培養し、その培養物より抗原特
異的ヒト免疫グロブリンを採取することにより製造でき
る。
例えば前述のようにして産生できるヒト7/ヒ1ヘハイ
ブリドーマを、適当な培地、たとえば10%仔牛血清含
有RPMf−1640培地で培養し、培養液を採取する
ことによりヒトB−セル<A)と同形質の抗原特異的免
疫グロブリン含有物質を得ることができる。更に、所望
により、精製して精製免疫グロブリンとすることもでき
る。精製は、たとえば、硫安分画法、アフィニティーク
ロマ]〜グラフィー、ゲル)濾過、−イオン交換クロマ
1〜グラフイー、電気泳動法なとの如き生体液がrう免
疫グロブリンを採取、精製する際に利用できると同蜂な
VFj製手段を利用り゛ることができる。
ブリドーマを、適当な培地、たとえば10%仔牛血清含
有RPMf−1640培地で培養し、培養液を採取する
ことによりヒトB−セル<A)と同形質の抗原特異的免
疫グロブリン含有物質を得ることができる。更に、所望
により、精製して精製免疫グロブリンとすることもでき
る。精製は、たとえば、硫安分画法、アフィニティーク
ロマ]〜グラフィー、ゲル)濾過、−イオン交換クロマ
1〜グラフイー、電気泳動法なとの如き生体液がrう免
疫グロブリンを採取、精製する際に利用できると同蜂な
VFj製手段を利用り゛ることができる。
本発明によれば、前述した融合細胞クローン又はその培
養液73口らと1・予言癌患者のヒトB−セル<A>と
同形質の抗原特異的ヒ1へ免疫グロブリン含有物質又は
該免疫グロブリンを取1! するに際し、抗原性組織(
例えば癌組織〉を一度、免疫物質生産1jシを欠如づ−
るか若しくは極めて弱い生体例えばヌード+−,7ウス
(nude mouse)等に植えっ(プ組織を相持し
た後、その組織に対して或いはiBM系にもどされた組
織に対して反応するヒト免疫グロブリン(抗体)を探し
出し、これを分離するのが有利である。
養液73口らと1・予言癌患者のヒトB−セル<A>と
同形質の抗原特異的ヒ1へ免疫グロブリン含有物質又は
該免疫グロブリンを取1! するに際し、抗原性組織(
例えば癌組織〉を一度、免疫物質生産1jシを欠如づ−
るか若しくは極めて弱い生体例えばヌード+−,7ウス
(nude mouse)等に植えっ(プ組織を相持し
た後、その組織に対して或いはiBM系にもどされた組
織に対して反応するヒト免疫グロブリン(抗体)を探し
出し、これを分離するのが有利である。
上記ヒト、ヒ1〜ハイブリドーマの培養に利用できる培
地の他の例としては、10%ウシ胎児血清含有R’P
M I −1640培地、[)ulbeco培地及びト
1△N4培地の三習混合培地(混合比2:1 :1)で
あるRDF培地、及びトランスフェリン、インシュリン
、セレン酸ナトリウム、エタノールアミンならびにβ−
メルプトール添加のRDF培地などを例示することがで
きる。又、培養条件としては、たとえば5%Co 2の
存在下、37′Cの条件を例示できる。
地の他の例としては、10%ウシ胎児血清含有R’P
M I −1640培地、[)ulbeco培地及びト
1△N4培地の三習混合培地(混合比2:1 :1)で
あるRDF培地、及びトランスフェリン、インシュリン
、セレン酸ナトリウム、エタノールアミンならびにβ−
メルプトール添加のRDF培地などを例示することがで
きる。又、培養条件としては、たとえば5%Co 2の
存在下、37′Cの条件を例示できる。
上述のようにして1qることのできる本発明の抗原特異
的ヒト免疫グロブリンの例として、前述したヒト7・′
ヒトハイブリドーマCLN/SUZ H5及びヒト7
・/ヒトハーイブリドーマCL N 、、/ S U
ZHllを用いて得られる本発明グロブリンを例示でき
る。その特性を以下に示す。ヒト7/ヒ1〜ハイブリト
ーマCLN/SUZ H5の生産する抗原特異的ヒト
免疫グロブリンニー (イ)ヒト免疫グロブリンIvl(IgM)であって、
く口)正常繊維芽細胞(Vl−38)に対する結合力に
比して株化細胞)1 eta及びCaskに対してより
強い結合力を有し、 (ハ)ヒト赤血球には反応せず且つヒト赤血球に対りる
凝集反応を示さず、 (ニ)H鎮(beavy chain )及びL鎖(l
iglltcl+ain )より成り、分子量が約18
万(単量体ンであって、培養液中では5量体として存在
づる。
的ヒト免疫グロブリンの例として、前述したヒト7・′
ヒトハイブリドーマCLN/SUZ H5及びヒト7
・/ヒトハーイブリドーマCL N 、、/ S U
ZHllを用いて得られる本発明グロブリンを例示でき
る。その特性を以下に示す。ヒト7/ヒ1〜ハイブリト
ーマCLN/SUZ H5の生産する抗原特異的ヒト
免疫グロブリンニー (イ)ヒト免疫グロブリンIvl(IgM)であって、
く口)正常繊維芽細胞(Vl−38)に対する結合力に
比して株化細胞)1 eta及びCaskに対してより
強い結合力を有し、 (ハ)ヒト赤血球には反応せず且つヒト赤血球に対りる
凝集反応を示さず、 (ニ)H鎮(beavy chain )及びL鎖(l
iglltcl+ain )より成り、分子量が約18
万(単量体ンであって、培養液中では5量体として存在
づる。
上記\へ’ I 38はATCCCCL−75として
、又、上記He1a (子宮頚部癌株化細胞)はAT
CCCCL−2として、さらに上記Cask(子宮頚部
癌株化細胞)はATCCCRL−1550としてアメリ
カン・タイプ・カルチト一・コレクションから自由に入
手することができる。
、又、上記He1a (子宮頚部癌株化細胞)はAT
CCCCL−2として、さらに上記Cask(子宮頚部
癌株化細胞)はATCCCRL−1550としてアメリ
カン・タイプ・カルチト一・コレクションから自由に入
手することができる。
更に、上記ヒl−1gMは(ホ)PC−3(ヒ1〜前立
腺癌株化細1121+ATCCCRL−1435として
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから自
由に入手することができる)に対しても、〜へ/l−3
8に対する結合力に比してより強い結合ノjを示づ−。
腺癌株化細1121+ATCCCRL−1435として
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから自
由に入手することができる)に対しても、〜へ/l−3
8に対する結合力に比してより強い結合ノjを示づ−。
ヒ1〜′ヒトハーイフリトーマCLN、′SUZ H
llの生産づる抗原特異的ヒト免疫グロブリンニー(イ
)′ ヒト免疫グロブリンG (1gG>であって、 (ロ)正常繊維芽細胞1/ I −3E5’)に対する
結合ノコに比して株化細胞Hela及びCaskに対し
てより強い結合力を有し、 (ハ〉ヒト赤血球には反応ゼず且つヒ1〜赤血球に対す
る凝集反応を示さず、 <二) ’ H@ (heavy chain )及び
L鎖(ligl+tchain )より成り、分子量が
約15万である。
llの生産づる抗原特異的ヒト免疫グロブリンニー(イ
)′ ヒト免疫グロブリンG (1gG>であって、 (ロ)正常繊維芽細胞1/ I −3E5’)に対する
結合ノコに比して株化細胞Hela及びCaskに対し
てより強い結合力を有し、 (ハ〉ヒト赤血球には反応ゼず且つヒ1〜赤血球に対す
る凝集反応を示さず、 <二) ’ H@ (heavy chain )及び
L鎖(ligl+tchain )より成り、分子量が
約15万である。
更に、上記ヒt−1gGも(ホ)PC−3に対して、W
l−38に対する結合力に比してより強い結合力を示す
。
l−38に対する結合力に比してより強い結合力を示す
。
本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンはヒト子宮癌た
とえば子宮腺癌、子宮頚部癌などの如きヒト子宮癌への
作用抗体或は前立腺癌に作用抗体それ自体の作用でこれ
ら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、ヒト
体外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補体もしく
はT−リンパ球の助けをかりて癌細胞の増殖抑制や癌細
胞死滅のはたらきをさけたりJることかできる。更にま
た、ヒ1〜体外で量産された癌特異的抗体をキャリアー
として利用して例えは化学療法剤結合−ヒ[〜・モノク
ローナル抗体、インターフェロン結合−ヒ1〜・モノク
ローナル抗体、高分子毒素結合−ヒ1〜・モノクローナ
ル抗体、薬物人すポソーム結合−ヒ1〜・モノクローナ
ル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制ヤシL減のはたらき
をさせたりするのに有用である。また、本発明方法で得
られるヒトモノクローナル抗体をキャリアーとして利用
し、これに放射線感受性物質を結合させて患者に投与し
、癌細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を検知し
、故tJJ線療法に利用することができる。このような
癌に対する利用に際しては、ヒト・七ツク[」−ナル抗
体として完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な
手法で特異的抗原認識部位を含むより小さな分子に切断
して用いたり、或はそのような小さな分子もしくは特異
的抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分
と結合さゼて、より有効性のある修飾ヒト・モノクロー
ナル抗体を化学的手法で創製すること、もてきる。
とえば子宮腺癌、子宮頚部癌などの如きヒト子宮癌への
作用抗体或は前立腺癌に作用抗体それ自体の作用でこれ
ら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、ヒト
体外で量産されたこれらの癌組織認識抗体に補体もしく
はT−リンパ球の助けをかりて癌細胞の増殖抑制や癌細
胞死滅のはたらきをさけたりJることかできる。更にま
た、ヒ1〜体外で量産された癌特異的抗体をキャリアー
として利用して例えは化学療法剤結合−ヒ[〜・モノク
ローナル抗体、インターフェロン結合−ヒ1〜・モノク
ローナル抗体、高分子毒素結合−ヒ1〜・モノクローナ
ル抗体、薬物人すポソーム結合−ヒ1〜・モノクローナ
ル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制ヤシL減のはたらき
をさせたりするのに有用である。また、本発明方法で得
られるヒトモノクローナル抗体をキャリアーとして利用
し、これに放射線感受性物質を結合させて患者に投与し
、癌細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を検知し
、故tJJ線療法に利用することができる。このような
癌に対する利用に際しては、ヒト・七ツク[」−ナル抗
体として完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な
手法で特異的抗原認識部位を含むより小さな分子に切断
して用いたり、或はそのような小さな分子もしくは特異
的抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分
と結合さゼて、より有効性のある修飾ヒト・モノクロー
ナル抗体を化学的手法で創製すること、もてきる。
以下、実施例により、本発明方法実施の数例をざらに詳
しく述べる。
しく述べる。
実施例1
予言頚部に偏平上皮癌をもつ患者から、予言体全体およ
びリンパ節を摘出する手術の際に、癌組織およびリンパ
節を入手した。後者のリンパ節をハサミで細く切りきざ
み、内部のリンパ球を培養液(RPMI−1640)中
に分散させ、続いて2重のカービを用いて口過を行い、
脂肪層を除いた後に)r′液液中細胞(リンパ球〉80
%)を遠心法によって集める[ヒトB−Cell ドナ
ーを含むヒトリンパ球分画(ドナーB−セル)〕。その
後このリンパ球分画を10%仔牛血清および10%のク
リセロールを含むRPMI−1640培地中で凍結(−
70℃)し、細胞融合を行う日まで保存 し・ Iこ
。
びリンパ節を摘出する手術の際に、癌組織およびリンパ
節を入手した。後者のリンパ節をハサミで細く切りきざ
み、内部のリンパ球を培養液(RPMI−1640)中
に分散させ、続いて2重のカービを用いて口過を行い、
脂肪層を除いた後に)r′液液中細胞(リンパ球〉80
%)を遠心法によって集める[ヒトB−Cell ドナ
ーを含むヒトリンパ球分画(ドナーB−セル)〕。その
後このリンパ球分画を10%仔牛血清および10%のク
リセロールを含むRPMI−1640培地中で凍結(−
70℃)し、細胞融合を行う日まで保存 し・ Iこ
。
ドナーリンパ球と免疫グロブリン生産能を実質的に欠損
している親ヒh B−セル(UC729−6)のそれぞ
れを1X10’個および5 X ’106個混合し、3
5%ポリエチレングリコールの存在下に10%の永続血
清を含むRP N−11−1640培地中で融合を完了
させる。その後、800G、10分間の遠心処理を行っ
てポリエチレングリコールを除き、新たに10%仔牛永
続を含むRPMl−1640およびヒポキサンチン、/
アミノプテリン、・′チミジン(HAT)を含む培地を
加える。
している親ヒh B−セル(UC729−6)のそれぞ
れを1X10’個および5 X ’106個混合し、3
5%ポリエチレングリコールの存在下に10%の永続血
清を含むRP N−11−1640培地中で融合を完了
させる。その後、800G、10分間の遠心処理を行っ
てポリエチレングリコールを除き、新たに10%仔牛永
続を含むRPMl−1640およびヒポキサンチン、/
アミノプテリン、・′チミジン(HAT)を含む培地を
加える。
この細胞群を含む培養液200μm (この中には1.
5X10’個のCe1lを含む)ツツを96個の穴をも
つミクロプレートに分注し、約2週間37℃、5%co
2インキュベーターで培養した。
5X10’個のCe1lを含む)ツツを96個の穴をも
つミクロプレートに分注し、約2週間37℃、5%co
2インキュベーターで培養した。
この間、HATを含む10%仔牛永続−RPMI−16
40培地を3日に1回交替した。親日−セル(UC72
9−6)はアミノプテリン存在ではヒボキサンチンホス
ホリボシールトランスフエラーゼを欠損しでいるため、
生きることが出来ない。
40培地を3日に1回交替した。親日−セル(UC72
9−6)はアミノプテリン存在ではヒボキサンチンホス
ホリボシールトランスフエラーゼを欠損しでいるため、
生きることが出来ない。
またリンパ球(A)は通常の培地たとえばRPMI−1
640+10%仔牛血清中では永続的に増殖し生きのひ
ることができない。よって、HATを含む培地で永続的
に増殖した細胞はリンパ球(A)とB−Cell (
B)の融合した細胞である。
640+10%仔牛血清中では永続的に増殖し生きのひ
ることができない。よって、HATを含む培地で永続的
に増殖した細胞はリンパ球(A)とB−Cell (
B)の融合した細胞である。
2週間培養の後、9.61111のミクロプレート6個
にハイブリドーマのクローンが見られた。この6個のミ
クロプレートのハイブリドーマのうち2個のミクロプレ
ートのハイブリドーマは更にクローン化され、それぞれ
、CLN、/SUZ )15及びCLN/SUZ
Hllと命名された。これらがヒト免疫グロブリン(1
−1tl IQ >を産生じ・ていることを固定化ラジ
オイムノアッセイおよび固定化酵素抗体法を用いて確め
た。以下その方法を説明する。
にハイブリドーマのクローンが見られた。この6個のミ
クロプレートのハイブリドーマのうち2個のミクロプレ
ートのハイブリドーマは更にクローン化され、それぞれ
、CLN、/SUZ )15及びCLN/SUZ
Hllと命名された。これらがヒト免疫グロブリン(1
−1tl IQ >を産生じ・ていることを固定化ラジ
オイムノアッセイおよび固定化酵素抗体法を用いて確め
た。以下その方法を説明する。
カラスフィルターの上に、ハイブリドーマの培養e ヲ
fi下(50μm)し、乾燥することによって、培養液
中の蛋白質を固定化する。その後、12S(結合抗ヒト
免疫グロブリン血清(ラジオイムノアッセイ法)あるい
はベルオキシターゼ結合抗ヒト免疫クロプリン血清を滴
下〈50μm)して(酵素抗体法)、培養液中にあるべ
きヒト1oと結合させる。空温で30分間反応後、生理
食塩水でよく洗った後、ラジオイムノアッセイの場合は
グラスフィルターの上に残ったlZs Iの放射能をγ
−7Jウンターで定量することによって、ハイブリj・
−マ培養液中に含れるヒト1gの量を知る。一方、酵素
抗体法の場合は、さらに過酸化水素どO−フェニレンジ
アミンを含む基質溶液を加え、暗室で30分間反応させ
る。もしグラスフィルターの上にベルオキシダ、−ゼ結
合抗ヒトIu血清が残っている場合、すなわちグラスフ
ィルターの上でヒ1−19、抗ヒトIu血清が反応した
場合には吸光廉490nmで検出される黄色の基質反応
物が生産される。この量を吸光度計を用いることによっ
て測定し、ハイブリドーマ培養液中に含れるヒトIりの
量を知る。ハイブリドーマ培養液中にヒトIgが存在し
ない場合には、抗ヒト1g面清は洗滌の段階でグラスフ
ィルターを通して洗い流される。
fi下(50μm)し、乾燥することによって、培養液
中の蛋白質を固定化する。その後、12S(結合抗ヒト
免疫グロブリン血清(ラジオイムノアッセイ法)あるい
はベルオキシターゼ結合抗ヒト免疫クロプリン血清を滴
下〈50μm)して(酵素抗体法)、培養液中にあるべ
きヒト1oと結合させる。空温で30分間反応後、生理
食塩水でよく洗った後、ラジオイムノアッセイの場合は
グラスフィルターの上に残ったlZs Iの放射能をγ
−7Jウンターで定量することによって、ハイブリj・
−マ培養液中に含れるヒト1gの量を知る。一方、酵素
抗体法の場合は、さらに過酸化水素どO−フェニレンジ
アミンを含む基質溶液を加え、暗室で30分間反応させ
る。もしグラスフィルターの上にベルオキシダ、−ゼ結
合抗ヒトIu血清が残っている場合、すなわちグラスフ
ィルターの上でヒ1−19、抗ヒトIu血清が反応した
場合には吸光廉490nmで検出される黄色の基質反応
物が生産される。この量を吸光度計を用いることによっ
て測定し、ハイブリドーマ培養液中に含れるヒトIりの
量を知る。ハイブリドーマ培養液中にヒトIgが存在し
ない場合には、抗ヒト1g面清は洗滌の段階でグラスフ
ィルターを通して洗い流される。
以上の測定方法を用いた結果、CLN、・′5uzH5
はヒトIgMを生産しており、CL N 、、/ S
UZ HllはヒトIgGを生産していることが分っ
た(ドナーB−セルと同形質の1(+>。2週間後ニ、
CLN、/SU、Z H5及ヒCL N 、/’ S
U Z811のそれぞれを24個の穴をもつミクロプ
レート(2mじ/穴)に植えかえた後さらに1週間培養
を続けた。融合後3:I5間目に、培養液の上清を採取
、種々の株化細胞を標的細胞としてヒト7/ハイブリド
ーマから生産されるIgの特異性を調べた(一定の形質
をもつIgまたは特定の形質をもつIg>。
はヒトIgMを生産しており、CL N 、、/ S
UZ HllはヒトIgGを生産していることが分っ
た(ドナーB−セルと同形質の1(+>。2週間後ニ、
CLN、/SU、Z H5及ヒCL N 、/’ S
U Z811のそれぞれを24個の穴をもつミクロプ
レート(2mじ/穴)に植えかえた後さらに1週間培養
を続けた。融合後3:I5間目に、培養液の上清を採取
、種々の株化細胞を標的細胞としてヒト7/ハイブリド
ーマから生産されるIgの特異性を調べた(一定の形質
をもつIgまたは特定の形質をもつIg>。
その方法を以下説明する。
人間の種々の株化培養細胞(これらはATCCより入手
可能)をDME : F−12=1 : 1の合成培地
に10%仔牛永続を加えた培地で培養する。
可能)をDME : F−12=1 : 1の合成培地
に10%仔牛永続を加えた培地で培養する。
細胞の数が5X106〜lX10”になった段階て、ト
リプシンを用いずに細胞をシト−レの底面から剥がし、
底部にカラスフィルターをもつ96大のミクロタイター
プレートを用いて一定数(約5X104)をクラスフィ
ルターの上に載せ、乾燥して、細胞をグラスフィルター
の上に固定化づる。その後、CLN、/SUZ H5
およびCLN、/SUZ Hllのそれぞれについて
、培養上清(50μm)を細胞の上に滴下し、室温で反
応させた後、1251−結合抗ヒト[1血清、あるいは
ペルオキシダーゼ結合抗ヒトI(+血清を滴下して室温
で反応させる。充分に洗滌をおこなった後、先述のラジ
オイムノアッセイ法および酵素抗体法で述べた方法によ
って細胞に結合した培養液中のヒトIaの量を測定する
。
リプシンを用いずに細胞をシト−レの底面から剥がし、
底部にカラスフィルターをもつ96大のミクロタイター
プレートを用いて一定数(約5X104)をクラスフィ
ルターの上に載せ、乾燥して、細胞をグラスフィルター
の上に固定化づる。その後、CLN、/SUZ H5
およびCLN、/SUZ Hllのそれぞれについて
、培養上清(50μm)を細胞の上に滴下し、室温で反
応させた後、1251−結合抗ヒト[1血清、あるいは
ペルオキシダーゼ結合抗ヒトI(+血清を滴下して室温
で反応させる。充分に洗滌をおこなった後、先述のラジ
オイムノアッセイ法および酵素抗体法で述べた方法によ
って細胞に結合した培養液中のヒトIaの量を測定する
。
以上の方法によってCLN/SUZ H5のIgMの
標的細胞特異性およびCL N 、/’ S U Z)
(11の[Gの標的細胞特異性をそれぞれ調ぺ−た結果
、CL N 、、/ S U Z H5(7)培養液
中のIgM、およびCLN、、/SUZ Hllの培
養液中のIgGは、いずれも子宮頚部癌由来の、株化細
胞HelaおよびCaskに対して結合力を有しており
、本発明者の検討によれば子宮癌以外の株化細胞、而立
腺癌株化細胞PC−3に対しても結合力を有するが、T
222(肺癌株化細胞)およびW I −38(正常ヒ
1〜繊維芽細胞)とは結合力を有していなかった。
標的細胞特異性およびCL N 、/’ S U Z)
(11の[Gの標的細胞特異性をそれぞれ調ぺ−た結果
、CL N 、、/ S U Z H5(7)培養液
中のIgM、およびCLN、、/SUZ Hllの培
養液中のIgGは、いずれも子宮頚部癌由来の、株化細
胞HelaおよびCaskに対して結合力を有しており
、本発明者の検討によれば子宮癌以外の株化細胞、而立
腺癌株化細胞PC−3に対しても結合力を有するが、T
222(肺癌株化細胞)およびW I −38(正常ヒ
1〜繊維芽細胞)とは結合力を有していなかった。
すなわち、ドナーB−セルは、体内に子宮頚部癌をもつ
患者から採取されたものであるので、細胞融合法によっ
て作り出された自己増殖性をもつハイブリドーマのクロ
ーンからは、ドナーB−セルと同形質のかつ特定の抗原
決定部位をもつモノクローナル(単一)抗体を生産して
いることを示している。同患者より、採取した癌組織を
培養に移した細胞を標的細胞として用いて、CL N
、−′SUZ H5及びC,LN、’SUZ Hl
lの特異性を上記と同様の方法で調べた結果、結合力を
有していることが分った。
患者から採取されたものであるので、細胞融合法によっ
て作り出された自己増殖性をもつハイブリドーマのクロ
ーンからは、ドナーB−セルと同形質のかつ特定の抗原
決定部位をもつモノクローナル(単一)抗体を生産して
いることを示している。同患者より、採取した癌組織を
培養に移した細胞を標的細胞として用いて、CL N
、−′SUZ H5及びC,LN、’SUZ Hl
lの特異性を上記と同様の方法で調べた結果、結合力を
有していることが分った。
このことは、癌をもつ患者の体内で癌組織は、抗原とし
て働き、同患者の免疫監視機構によって、癌特異的抗体
を生産しうる能力があることをしめしている。
て働き、同患者の免疫監視機構によって、癌特異的抗体
を生産しうる能力があることをしめしている。
約3週間後に、ハイブリドーマの培地からHATを除き
RPMI−1640+10%仔牛血清で培養1{8加詩
間37時間で、CL N 、、、、/ S U Z
ト(5はI X 1061[1iI、/ml細胞が培地
で生育する時約3μリ /mlの量でヒl−1(] M
を生産し続けており、CLN、/SUZ Hllは1
×10ら個/111の細胞が培地で生育する時約4μす
、’ m lの量でヒi〜IgGを生産し続けている。
RPMI−1640+10%仔牛血清で培養1{8加詩
間37時間で、CL N 、、、、/ S U Z
ト(5はI X 1061[1iI、/ml細胞が培地
で生育する時約3μリ /mlの量でヒl−1(] M
を生産し続けており、CLN、/SUZ Hllは1
×10ら個/111の細胞が培地で生育する時約4μす
、’ m lの量でヒi〜IgGを生産し続けている。
ハイブリ1−一ンの多量培養液を50%の硫酸アンモニ
ウムで沈殿さゼ、粗■9分画を集めた。得られた沈殿を
生理食塩水に溶かし、IgGはヒツジの抗ヒトIgG血
清中のIgGを用い、N+Mはヒツジの抗ヒt−1gM
血清中のlqGを結合させたセファロースを用いてアフ
イニイテイクロマトグラフイーの手法で精製された。収
率はCLN、’SUZ H5の培養8!11から2.
21110のIgM、CLN/SUZ Hllの培養
液11から3.0mgのIgGが得られた。これらのア
ライニイテイクロマI〜グラフィを用いて精製したIg
標品を5DS−電気泳動法で分析した結果、ヒト1(l
と同形質の分子量15万のIgG(CLN、−′SUZ
H5)および分子量18万(単量体)のIgM(C
LN、/SUZ Hll)を生産していることが確め
られた。また、両ヒトパイブリドーマは、N ude
n+ouseの腹腔内で増殖させることが可能であり腹
水51中に2〜10mgのヒトIgを生産させることが
できる。
ウムで沈殿さゼ、粗■9分画を集めた。得られた沈殿を
生理食塩水に溶かし、IgGはヒツジの抗ヒトIgG血
清中のIgGを用い、N+Mはヒツジの抗ヒt−1gM
血清中のlqGを結合させたセファロースを用いてアフ
イニイテイクロマトグラフイーの手法で精製された。収
率はCLN、’SUZ H5の培養8!11から2.
21110のIgM、CLN/SUZ Hllの培養
液11から3.0mgのIgGが得られた。これらのア
ライニイテイクロマI〜グラフィを用いて精製したIg
標品を5DS−電気泳動法で分析した結果、ヒト1(l
と同形質の分子量15万のIgG(CLN、−′SUZ
H5)および分子量18万(単量体)のIgM(C
LN、/SUZ Hll)を生産していることが確め
られた。また、両ヒトパイブリドーマは、N ude
n+ouseの腹腔内で増殖させることが可能であり腹
水51中に2〜10mgのヒトIgを生産させることが
できる。
実施例2
子宮頚部に上皮性腺癌をもつ患者から、手術の際にリン
パ節を入手、実施例1で用いた方法と同様の方法でリン
パ球を調製した。本実施例ではリンパ球を凍結保存する
ことなしにRPMI−1640+10%仔牛血清中で1
8培養した後、親日−セル(UC729−6)を用いて
、実施例1と同様の方法で細胞融合を行った。その結果
、96穴のうら16個の穴にハイブリドーマのクローン
が認められ、ラジ第2イムノアッセイを用いる検出方法
によって′16個の穴のうち5個の穴のハイブリドーマ
がヒl−1gへ11を生産しており、16個の穴のうら
211υの穴のハイブリトーマがヒトIgGを生産して
いることが認められた。
パ節を入手、実施例1で用いた方法と同様の方法でリン
パ球を調製した。本実施例ではリンパ球を凍結保存する
ことなしにRPMI−1640+10%仔牛血清中で1
8培養した後、親日−セル(UC729−6)を用いて
、実施例1と同様の方法で細胞融合を行った。その結果
、96穴のうら16個の穴にハイブリドーマのクローン
が認められ、ラジ第2イムノアッセイを用いる検出方法
によって′16個の穴のうち5個の穴のハイブリドーマ
がヒl−1gへ11を生産しており、16個の穴のうら
211υの穴のハイブリトーマがヒトIgGを生産して
いることが認められた。
実施例3
子宮頚部1こ1扁平上皮癌をもつ患者からヘパリン存在
下末梢血(50ml)を採取し、フィコールによって末
梢血中のリンパ球を分離し、実施例1で)ホl\た方法
によって、細胞融合日まで凍結保存を行った。融合日に
、融解してRP NII I −1640でドナーB−
ピルを2回洗った後、実施例1と同様の方法て細IIP
I融合を行った。その結果9G個の穴を有するミクロタ
イタープレー(〜のうち4個の穴にハイブリドーマのク
ローンが見出され、この・1個穴のうち1個の穴のハイ
ブリドーマがヒトIpMを生産していることか検出され
た。
下末梢血(50ml)を採取し、フィコールによって末
梢血中のリンパ球を分離し、実施例1で)ホl\た方法
によって、細胞融合日まで凍結保存を行った。融合日に
、融解してRP NII I −1640でドナーB−
ピルを2回洗った後、実施例1と同様の方法て細IIP
I融合を行った。その結果9G個の穴を有するミクロタ
イタープレー(〜のうち4個の穴にハイブリドーマのク
ローンが見出され、この・1個穴のうち1個の穴のハイ
ブリドーマがヒトIpMを生産していることか検出され
た。
実施例1において得られたハイブリドーマCLN、’s
uz l−111株の25代継代株(20%FBS、
20%グリヒリン含有RDF培地中に一192℃で凍結
保存せるもの)を解凍し、10%ウシ胎児血清(Fe2
)含有RDF培地へ移し、遠心分離(800+・、p1
m5分間)して沈降させた細胞を10%FC3含有RD
F培地に分散させ細胞懸濁液を調製する。別に予しめ、
8牛血清アルブミン、ヒ1ヘトランスフェリン、インシ
ュリン(コラシフ、セレン酸ナトリウム、エタノールア
ミン、β−メルカプ1〜−ル含有RDF培地約81を調
製しておく、この培地へ上記細胞懸濁液を細胞濃度lX
104〜5X104Pi!度になるように加え均一に分
散させ、回転培養ビン(ローラーボトル、イ虱約12C
111円筒部長さ約500m)10本に約6001づつ
分注し、5%Co 2インクベーター中で回転培養を行
なう(37℃約2 、’ 3 r、p、口1.)。約6
日間の培養で細胞温度約1X10aに達した培養液を遠
心分離して細胞を除き培養液約61を得た。これを吸引
)濾過()戸紙N0.131>しt/’液を更に1.2
μ〜5.0μのミクロフィルターで精密濾過して)戸液
約61を得た。これに硫安を加え70%飽和となし、沈
でんを遠心分離し、相免疫グロブリンfqG含有物を得
た。同様にしてCLN、/5LIZ H11株30代
軽代株、35代継代株より粗免疫グロブリンIgG含有
物を分離し、合計的181の培養液中より粗免疫クロプ
リン含有物を収iqシた。これを10mM燐酸緩衝液(
PBS、 +11−17.0)約2001111に溶
解し、)濾過後、枦液を1 Q n+ M P B S
に対して透析を行い(24時間×2回)、透4ti内液
約2001111を(■たく免役グロブリン含イ1透析
d々)。別に抗にhJ!JGを結合させたC N B
l=−活性化セファローズ−4Bグル(B ed容積3
QIll+)ノコラムを調製しておき、10mfvlP
BSを流し洗滌と平衡化をツる。これに上記透析内液を
ゆっくりと注油し、IgGを吸着させ、吸着カラムを1
0mMPBS約3001で洗滌。次いで3.5.czl
llOc 12含有10a1〜IPBS約40m1を
用いて溶出させた。溶出液のチェックは28011 M
における吸光度の測定により行った。有効画分は3.5
μIll!JC12溶出区分に集中した。これを集めて
3QllIlのIgG含有画分を1号だ。これを予じめ
調製せるセファデックスG−257Jラム(ベット容積
150m1>へ流し、クリシン、D−マンj〜−ル含有
10111Mリン酸緩衝液で溶出させ、脱塩された精製
fgG含有区分約30m1をiF4だ。
uz l−111株の25代継代株(20%FBS、
20%グリヒリン含有RDF培地中に一192℃で凍結
保存せるもの)を解凍し、10%ウシ胎児血清(Fe2
)含有RDF培地へ移し、遠心分離(800+・、p1
m5分間)して沈降させた細胞を10%FC3含有RD
F培地に分散させ細胞懸濁液を調製する。別に予しめ、
8牛血清アルブミン、ヒ1ヘトランスフェリン、インシ
ュリン(コラシフ、セレン酸ナトリウム、エタノールア
ミン、β−メルカプ1〜−ル含有RDF培地約81を調
製しておく、この培地へ上記細胞懸濁液を細胞濃度lX
104〜5X104Pi!度になるように加え均一に分
散させ、回転培養ビン(ローラーボトル、イ虱約12C
111円筒部長さ約500m)10本に約6001づつ
分注し、5%Co 2インクベーター中で回転培養を行
なう(37℃約2 、’ 3 r、p、口1.)。約6
日間の培養で細胞温度約1X10aに達した培養液を遠
心分離して細胞を除き培養液約61を得た。これを吸引
)濾過()戸紙N0.131>しt/’液を更に1.2
μ〜5.0μのミクロフィルターで精密濾過して)戸液
約61を得た。これに硫安を加え70%飽和となし、沈
でんを遠心分離し、相免疫グロブリンfqG含有物を得
た。同様にしてCLN、/5LIZ H11株30代
軽代株、35代継代株より粗免疫グロブリンIgG含有
物を分離し、合計的181の培養液中より粗免疫クロプ
リン含有物を収iqシた。これを10mM燐酸緩衝液(
PBS、 +11−17.0)約2001111に溶
解し、)濾過後、枦液を1 Q n+ M P B S
に対して透析を行い(24時間×2回)、透4ti内液
約2001111を(■たく免役グロブリン含イ1透析
d々)。別に抗にhJ!JGを結合させたC N B
l=−活性化セファローズ−4Bグル(B ed容積3
QIll+)ノコラムを調製しておき、10mfvlP
BSを流し洗滌と平衡化をツる。これに上記透析内液を
ゆっくりと注油し、IgGを吸着させ、吸着カラムを1
0mMPBS約3001で洗滌。次いで3.5.czl
llOc 12含有10a1〜IPBS約40m1を
用いて溶出させた。溶出液のチェックは28011 M
における吸光度の測定により行った。有効画分は3.5
μIll!JC12溶出区分に集中した。これを集めて
3QllIlのIgG含有画分を1号だ。これを予じめ
調製せるセファデックスG−257Jラム(ベット容積
150m1>へ流し、クリシン、D−マンj〜−ル含有
10111Mリン酸緩衝液で溶出させ、脱塩された精製
fgG含有区分約30m1をiF4だ。
この液を試料として5DS−ポリアクリルアミドスラブ
電気泳動にかけた。ヒトrill G (Capl)−
ei社製〉を標準品とし、標準蛋白質としてフォスフォ
リラーゼ6分子194000、アルブミン分子量670
00、卵白アルブミン分子量43000、カルボニック
アンヒドラーゼ分子量30000.1−リブシンインヒ
ビター分子量20100、α−ラクトアルブミン144
00(何れもファルマシアファインケミカル製)を用い
た。
電気泳動にかけた。ヒトrill G (Capl)−
ei社製〉を標準品とし、標準蛋白質としてフォスフォ
リラーゼ6分子194000、アルブミン分子量670
00、卵白アルブミン分子量43000、カルボニック
アンヒドラーゼ分子量30000.1−リブシンインヒ
ビター分子量20100、α−ラクトアルブミン144
00(何れもファルマシアファインケミカル製)を用い
た。
上記で1qた電気泳動図は、試料中には標準品ヒt−[
Gのハンドと一致する2本のバンド[H鎖(heavy
chain )及びL鎖(light cl+ain
) ]のみを示した。また標準山白質と対比し・て分
子量約15万のJgGの存在することがわかった。この
分子量はゲルクロマトグラフィによっても確認されIこ
。
Gのハンドと一致する2本のバンド[H鎖(heavy
chain )及びL鎖(light cl+ain
) ]のみを示した。また標準山白質と対比し・て分
子量約15万のJgGの存在することがわかった。この
分子量はゲルクロマトグラフィによっても確認されIこ
。
上記精製IgG含有液中の蛋白質の含量を1o−Wl’
y法により、ヒト! U G (Cappe1社製)ヲ
用いて作成した倹聞線より求めた結果的56mgであっ
た。即ちハイブリドーマCLN、、/SUZ 811
株の25・〜35代経継代の培養液約181よりヒ11
!IGが約5611fJ産生じたことを示し、培養′a
I当り約3mgのヒトIgGを産生ずることかわかる。
y法により、ヒト! U G (Cappe1社製)ヲ
用いて作成した倹聞線より求めた結果的56mgであっ
た。即ちハイブリドーマCLN、、/SUZ 811
株の25・〜35代経継代の培養液約181よりヒ11
!IGが約5611fJ産生じたことを示し、培養′a
I当り約3mgのヒトIgGを産生ずることかわかる。
このことは、本ハイブリドーマCL N 、−’SU、
Z Hllは経代培養を行ってもIqGの産生には変
動かないことを示している。
Z Hllは経代培養を行ってもIqGの産生には変
動かないことを示している。
上記精製1gG含有液を用い実施例1に記載した方法に
より標的細胞特異性を調べた結果、本ハイブリドーマC
LN、−’SH2)−111の形成に用いたリンパB−
セル供与患者の子宮頚部偏平上皮癌細胞、子宮頚部偏平
上皮癌細胞由来の株化細胞He1a及びCa5k+に対
し、正常繊維芽細胞(Wf−38ンに対する結合力に比
してより強い結合力を示した。即ちCLN、、/SU、
Z Hllの産生するヒ1〜1gGは抗原特異的ヒト
I(IGである。
より標的細胞特異性を調べた結果、本ハイブリドーマC
LN、−’SH2)−111の形成に用いたリンパB−
セル供与患者の子宮頚部偏平上皮癌細胞、子宮頚部偏平
上皮癌細胞由来の株化細胞He1a及びCa5k+に対
し、正常繊維芽細胞(Wf−38ンに対する結合力に比
してより強い結合力を示した。即ちCLN、、/SU、
Z Hllの産生するヒ1〜1gGは抗原特異的ヒト
I(IGである。
実施例5
実施例1において得られたハイブリドーマCLN 、、
/ S U Z H5株の30代継代株(20%FB
S、20%グリセリン含有RDF培地中に一192℃で
凍結保存せなるもの)を解凍し10%FC5含有RDF
培地へ移し遠心分離し沈降せる細胞を10%FC8含有
RDF培地に分散させ細胞懸濁液を調製する。800m
1培養ビン20本に5%FC8含有RDF培地約150
m1を分注し、細胞懸濁液を細胞温度約lX10’/m
lになるように添加し、5%CO2インキュベーター内
で37℃で培養を行なう。約1週間の培養で細胞温度約
1×107 ′m1に達した。培養液を遠心分離し細胞
を除さ18首液杓31を得た。これを吸引)濾過(i/
’t−1iNo、 131 ) L、)/”aヲ更ニ
1 、2 u〜5.0μのミクロフ、fルターで精密)
濾過し、枦液約31を14だ。これに硫安を加え50%
飽和となし、沈でんを分離し、粗免疫グロブリン[1M
含有物を1qた。同様にしてCLN、’SUZ H5
株の35代継代株及び40代継代株より相免役りロフリ
ンf gN’I含有物を分離し、合計的91のハイブリ
ドーマCL N 、、’ S U Z )−15株培
養液より粗免疫グロブリンlqM含有物を収得した。こ
れを10 at fVl燐09緩衝液(10m MPB
S 1lH7,0>約100m + +、=HH解し、
濾過l、10mMPBSに対し透析を行い(24的間×
2回)透析内液約10(]nl余を得たく免疫グロブリ
ン含有透析液)。
/ S U Z H5株の30代継代株(20%FB
S、20%グリセリン含有RDF培地中に一192℃で
凍結保存せなるもの)を解凍し10%FC5含有RDF
培地へ移し遠心分離し沈降せる細胞を10%FC8含有
RDF培地に分散させ細胞懸濁液を調製する。800m
1培養ビン20本に5%FC8含有RDF培地約150
m1を分注し、細胞懸濁液を細胞温度約lX10’/m
lになるように添加し、5%CO2インキュベーター内
で37℃で培養を行なう。約1週間の培養で細胞温度約
1×107 ′m1に達した。培養液を遠心分離し細胞
を除さ18首液杓31を得た。これを吸引)濾過(i/
’t−1iNo、 131 ) L、)/”aヲ更ニ
1 、2 u〜5.0μのミクロフ、fルターで精密)
濾過し、枦液約31を14だ。これに硫安を加え50%
飽和となし、沈でんを分離し、粗免疫グロブリン[1M
含有物を1qた。同様にしてCLN、’SUZ H5
株の35代継代株及び40代継代株より相免役りロフリ
ンf gN’I含有物を分離し、合計的91のハイブリ
ドーマCL N 、、’ S U Z )−15株培
養液より粗免疫グロブリンlqM含有物を収得した。こ
れを10 at fVl燐09緩衝液(10m MPB
S 1lH7,0>約100m + +、=HH解し、
濾過l、10mMPBSに対し透析を行い(24的間×
2回)透析内液約10(]nl余を得たく免疫グロブリ
ン含有透析液)。
別に抗ヒl−1(l N−1(Catll)e1社製)
を結合させたCNBI・−活性化セファローズ−4Bゲ
ルを1%ヒ1へ結成アル7ミンートリスー1−1cI緩
tiiF2(pト18.0>で凪理したゲル(B ec
l容偵12m1)カラムを調製し、10n+MPBSを
流し、洗滌と平衡化を行った後、これに上記透析内液を
ゆっくりと注油しIqMを吸着させアフィニティークロ
マトクラティによる精製を行った。即ち吸着カラムを1
0mfvlPBS約2QQmlで次いで、3.5Mn1
gC+、含有10m MPBS30nllで、280
nMにおける吸光度でチェックしながら溶出させた。
を結合させたCNBI・−活性化セファローズ−4Bゲ
ルを1%ヒ1へ結成アル7ミンートリスー1−1cI緩
tiiF2(pト18.0>で凪理したゲル(B ec
l容偵12m1)カラムを調製し、10n+MPBSを
流し、洗滌と平衡化を行った後、これに上記透析内液を
ゆっくりと注油しIqMを吸着させアフィニティークロ
マトクラティによる精製を行った。即ち吸着カラムを1
0mfvlPBS約2QQmlで次いで、3.5Mn1
gC+、含有10m MPBS30nllで、280
nMにおける吸光度でチェックしながら溶出させた。
有効画分は3.5MmgC12溶出画分に集中し、約2
0m1のIpM含有画分を得た。これを別に調製したセ
ファデックスG−25カラム(ベッド容積100m1)
へ流し、グリシン、D−マニトール含有10・m Mリ
ン酸緩衝液で溶出させ、脱塩された精製I M含有画分
約201111を得た。
0m1のIpM含有画分を得た。これを別に調製したセ
ファデックスG−25カラム(ベッド容積100m1)
へ流し、グリシン、D−マニトール含有10・m Mリ
ン酸緩衝液で溶出させ、脱塩された精製I M含有画分
約201111を得た。
この液を試料としてSO3−ポリアクリルアミドスラブ
電気泳動にかけた。ヒトI gM (Capp−eI社
製)を標準品とし、実施例4と同じ標準蛋白質を用いた
。
電気泳動にかけた。ヒトI gM (Capp−eI社
製)を標準品とし、実施例4と同じ標準蛋白質を用いた
。
上記で得た電気泳動図は、試料中には標準品ヒトIgM
のバンドと一致する2本のバンド[H鎖及びL鎖1のみ
を示した。また標準蛋白質と対比し【分子量約18万の
1 o Mの存在することがわかった。この分子量はゲ
ルクロマトクラフイによる分子量約900000 (5
量体)によって確認された。
のバンドと一致する2本のバンド[H鎖及びL鎖1のみ
を示した。また標準蛋白質と対比し【分子量約18万の
1 o Mの存在することがわかった。この分子量はゲ
ルクロマトクラフイによる分子量約900000 (5
量体)によって確認された。
上記績’FI I !J N=I含有液中の蛋白質の含
有量を1owry法により、と!−1gM (Capp
e1社製ンを用いて作成した検量線より求めた結果的2
0111!7であった。即らハイブリ1−一マCLN−
’SUZ H5株の35代継代株及び40代継代株の
培養成約91よりヒl−1g Mが約20mg産生され
たことを示し、培養液1当り約2.2111(]のヒ1
〜■gNJ1を産生することかわかる。このことは、本
バイブリド=7CLN、’SUZ H5株は経代培養
を行ってもI(IMの生産には変動がないことを示して
いる。
有量を1owry法により、と!−1gM (Capp
e1社製ンを用いて作成した検量線より求めた結果的2
0111!7であった。即らハイブリ1−一マCLN−
’SUZ H5株の35代継代株及び40代継代株の
培養成約91よりヒl−1g Mが約20mg産生され
たことを示し、培養液1当り約2.2111(]のヒ1
〜■gNJ1を産生することかわかる。このことは、本
バイブリド=7CLN、’SUZ H5株は経代培養
を行ってもI(IMの生産には変動がないことを示して
いる。
上記精製1gN11含有液を用い、実施例1に記載ゼる
方法により標的細胞特異性を調ぺた結果、実施例4にお
ける1gGの場合と同様な抗原特異的結合力を示した。
方法により標的細胞特異性を調ぺた結果、実施例4にお
ける1gGの場合と同様な抗原特異的結合力を示した。
即らCLN、/SUZ 1−15の産生するヒトIo
Mは抗原特異的ヒトI(IMである。
Mは抗原特異的ヒトI(IMである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヒト子宮癌患者のヒ)B−セルとヒトリンパ芽球細
胞株のサブクローンとのヒト/ヒト融合細胞株が生産し
た抗原特異的ヒト免疫グロブリン。 2、ヒト/ヒトハイブリドーマCLN/5UZtl 5
株及びCI−N/SUZ Hl 1株よりなるノ(Yか
らえらばれた細胞株か生産した特許請求の範囲第1項記
I賎の抗原特異的ヒト免疫グロブリン。 3、該免疫グロブリンか、 (イ)ヒト免疫グロブリンM(IgM)であって、(ロ
)正常繊細、芽細胞(Wl−38)に月する結合力に比
して株化細胞He l a及びCaskに月してより強
い結合力を有し、 (ハ)ヒト赤血球には反応せず且つヒト赤血球に利する
凝集反応を示さず、 (ニ)H鎖(heavy cl+ain)及びL鎖(l
igl+L cl+ain)より成り、分子量が約18
万(単量体)であって、培養液中では5量体として存在
する ヒト/ヒトハイブリドーマCLN/SUZ 85株が
生産した特許請求の範囲第1項記載の抗原特異的ヒト免
疫グロブリン。 4、該免疫グロブリンが、 (イ)′ヒト免疫グロブリンG(IgG)であって、(
ロ)正常繊維芽細胞(Wl−38)に対する結合力に比
して株化細胞He l a及びCa5kに対してより強
い結合力を有し、 (ハ)ヒト赤血球には反応せず且つヒト赤血球に対する
凝集反応を示さず、 (ニ)′H鎖(beavy cl+aio)及びL鎖(
ligI+L cbai−■)より成り、分子量が約1
5万であるヒト/ヒトハイブリドーマCLN/SUZ
811株が生産した特許請求の範囲第1項記載の抗原
特異的ヒト免疫グロブリン。 5、ヒト子宮癌患者のしトB−セルとヒトリンパ芽球細
胞株のサックローンとのヒト/ヒト融合細胞株であって
抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト/ヒ
トハイブリドーマ。 6、ヒト/ヒトハイ7リドーマCLJ/5UZ115株
及びヒト/ヒ1ハイブリドーマCLN/5UZIIII
株よりなる群からえらばれた特許請求の範囲第5項記載
のヒト/ヒトハイブリドーマ。 7、上記 (1)染色体数 92、 (2)ヒト免疫グロブリンM(IgM)分5姓(生産)
、(3)倍加時間(ダブリング・タイム)37時間、(
,1,)リンパ球系シングルセル、 (5)l’)NA含量か正常ヒトリンパ球の2倍以」二
、(6)Ix記(ン)のIgMはヒト子宮頚部癌細胞に
結合性を示す、 の細胞生化学的性質を有する特許請求の範囲第6項記載
のヒト/ヒトハイブリドーマCLN/5LIZH5株。 8、上記 (1)染色体数 sr 2、 (2)′ヒト免疫グロブリンG(Igに)分法(生産)
、(3)倍加時間(ダブリング・タイム)37時間、(
4)リンパ球系シングルセル、 (5)DNA含量が正常ヒ) l)ンパ球の2倍以上、
(6)′上記(2)′のI8Gはヒト子宮頚部癌細胞に
結合性を示す、 の細胞生化学的性質を有する特許請求の範囲第6項記載
のヒト/ヒトハイブリドーマCLN/5IJZ)111
株。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58006603A JPS59137497A (ja) | 1983-01-20 | 1983-01-20 | 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
PH28943A PH23031A (en) | 1982-05-21 | 1983-05-20 | Human-human hybridomas for cervical carcinoma |
PH32453A PH21344A (en) | 1982-05-21 | 1985-06-25 | Human-human hybridomas for cervical carcinoma |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58006603A JPS59137497A (ja) | 1983-01-20 | 1983-01-20 | 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59137497A true JPS59137497A (ja) | 1984-08-07 |
Family
ID=11642916
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58006603A Pending JPS59137497A (ja) | 1982-05-21 | 1983-01-20 | 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59137497A (ja) |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60260597A (ja) * | 1984-01-31 | 1985-12-23 | アクゾ ナムローゼ フェンノートシャップ | 自己由来のワクチン |
JPS61152281A (ja) * | 1984-12-26 | 1986-07-10 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法 |
JPS61152280A (ja) * | 1984-12-26 | 1986-07-10 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生する形質転換細胞及びその製造法並びにその使用方法 |
JPS61204134A (ja) * | 1984-10-15 | 1986-09-10 | ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シテイ−・オブ・カリフオルニア | 癌細胞に対する抗体を産生するヒト−ヒトハイブリド−マ細胞系 |
JPS6270400A (ja) * | 1985-09-25 | 1987-03-31 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
JPS6299332A (ja) * | 1985-10-26 | 1987-05-08 | Hagiwara Yoshihide | 悪性腫瘍用ヒトモノクロナル抗体複合剤 |
JPS62187417A (ja) * | 1985-12-10 | 1987-08-15 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレ−シヨン | 緑膿菌血清型に対する交さ反応性かつ交さ防御性単クロ−ン性抗体 |
JPS6359898A (ja) * | 1986-08-30 | 1988-03-15 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
JPS63290898A (ja) * | 1987-05-23 | 1988-11-28 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
JPS6467199A (en) * | 1987-09-08 | 1989-03-13 | Agency Ind Science Techn | Human igg1 type monoclonal antibody, production thereof and hybridoma capable of producing said antibody |
WO1992020799A1 (en) * | 1991-05-22 | 1992-11-26 | Hagiwara, Yoshihide | Amino acid sequence of anticancer human monoclonal antibody and dna base sequence coding for the same |
JPH05207876A (ja) * | 1991-11-25 | 1993-08-20 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ |
JPH05268988A (ja) * | 1992-03-05 | 1993-10-19 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
US5589573A (en) * | 1993-10-06 | 1996-12-31 | Yoshihide Hagiwara | Amino acid sequences of anti-idiotypic antibodies against anti-cancer human monoclonal antibody, and DNA base sequences encoding those sequences |
-
1983
- 1983-01-20 JP JP58006603A patent/JPS59137497A/ja active Pending
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60260597A (ja) * | 1984-01-31 | 1985-12-23 | アクゾ ナムローゼ フェンノートシャップ | 自己由来のワクチン |
JPS61204134A (ja) * | 1984-10-15 | 1986-09-10 | ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シテイ−・オブ・カリフオルニア | 癌細胞に対する抗体を産生するヒト−ヒトハイブリド−マ細胞系 |
JPH0355106B2 (ja) * | 1984-12-26 | 1991-08-22 | ||
JPS61152281A (ja) * | 1984-12-26 | 1986-07-10 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法 |
JPS61152280A (ja) * | 1984-12-26 | 1986-07-10 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生する形質転換細胞及びその製造法並びにその使用方法 |
JPS6270400A (ja) * | 1985-09-25 | 1987-03-31 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
JPS6299332A (ja) * | 1985-10-26 | 1987-05-08 | Hagiwara Yoshihide | 悪性腫瘍用ヒトモノクロナル抗体複合剤 |
JPS62187417A (ja) * | 1985-12-10 | 1987-08-15 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレ−シヨン | 緑膿菌血清型に対する交さ反応性かつ交さ防御性単クロ−ン性抗体 |
JPS6359898A (ja) * | 1986-08-30 | 1988-03-15 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
JPS63290898A (ja) * | 1987-05-23 | 1988-11-28 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
JPS6467199A (en) * | 1987-09-08 | 1989-03-13 | Agency Ind Science Techn | Human igg1 type monoclonal antibody, production thereof and hybridoma capable of producing said antibody |
JPH05304981A (ja) * | 1987-09-08 | 1993-11-19 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規なハイブリドーマ |
WO1992020799A1 (en) * | 1991-05-22 | 1992-11-26 | Hagiwara, Yoshihide | Amino acid sequence of anticancer human monoclonal antibody and dna base sequence coding for the same |
JPH05207876A (ja) * | 1991-11-25 | 1993-08-20 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ |
JPH05268988A (ja) * | 1992-03-05 | 1993-10-19 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
US5589573A (en) * | 1993-10-06 | 1996-12-31 | Yoshihide Hagiwara | Amino acid sequences of anti-idiotypic antibodies against anti-cancer human monoclonal antibody, and DNA base sequences encoding those sequences |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI86077B (fi) | Monoklonala antikroppar och metod att producera dessa. | |
JPS61500789A (ja) | モノクロ−ナル抗−ヒト乳癌抗体 | |
JPS59137497A (ja) | 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 | |
JPH05276983A (ja) | モノクローナル抗体 | |
KR930012104B1 (ko) | 암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린 및 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마 | |
Hutt-Fletcher et al. | Studies of the Epstein Barr virus receptor found on Raji cells. II. A comparison of lymphocyte binding sites for Epstein Barr virus and C3d. | |
KR880001567B1 (ko) | 경부암을 위한 인체-인체융합세포 | |
EP0363703B1 (en) | Method of producing human-human hybridomas, the production of monoclonal and polyclonal antibodies therefrom, and therapeutic use thereof | |
US5330896A (en) | Monoclonal antibodies to an autocrine growth factor antigen that binds to activated lymphocytes and cancer cells | |
JPS62155083A (ja) | 新規なヒトbセル・リンパ芽球細胞変異株、そのヒト/ヒト・ハイブリド−マ及びその生産する抗体 | |
Shienvold et al. | Human pancreatic cell surface antigens with homologous expression in liver, sweat glands, and other exocrine tissues | |
JPS6270400A (ja) | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 | |
JP2509191B2 (ja) | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン | |
Gilbert et al. | Differential binding of IgG subclasses to enzyme‐treated human lymphocytes | |
JPH05207876A (ja) | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ | |
JPH07119240B2 (ja) | 抗原特異的ヒト免疫グロブリン | |
Bhattacharya et al. | Production of murine monoclonal antibodies against cell‐surface antigens of human ovarian carcinoma | |
JPH05268988A (ja) | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン | |
Dubois | The Isolation and Characterization of an Organ-Specific Neoantigen from a Human Lung Cancer Cell Line Grown in Tissue Culture | |
JPS63254992A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
JPH08224079A (ja) | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ | |
JPH06153932A (ja) | 抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト/ヒトハイブリドーマ | |
JPS6356299A (ja) | 腫よう関連抗原 | |
JPH03155799A (ja) | ヒト子宮頸部腺癌由来培養細胞株omc―4に対するモノクローナル抗体 | |
JPH06205689A (ja) | 抗ヒト癌細胞ヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ |