KR880001567B1 - 경부암을 위한 인체-인체융합세포 - Google Patents

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캘리포니아 대학교 재단이사회
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Abstract

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Description

경부암을 위한 인체-인체융합세포
본 발명은 경부암의 진단 및 치료를 위한 인체-인체융합세포에 관한 것이다.
포유류의 면역계는 아미노산 및 당의 서열에서 발견되는 것과 같이 특수한 공간적 및 극성 구조에 대한 특수성 및 결합성을 가진 분자를 생성하는 우수한 능력을 갖는다. 오랜기간동안, 사람들은 생체내의 면역계를 이용하는 항체의 형성에 의존해 왔다. 형성된 폴리클로날 항체는 특이항원에 대한 높은 특이성을 나타내지만, 항원의 각종 부위를 구별할 수 없으며, 더우기 특이성 및 결합성이 다른 항체의 혼합물이다. 그러므로 전 조성물을 평균한것 및 특이항체의 특성을 나타내지 않는 것이 관찰된다.
밀스테인 및 콜러에 의한 생식적 연구에 의해, B-림파구를 골수세포와 융합하여 융합세포(하이브리도마)를 형성함으로써 항체의 균일한 조성물을 생산할 수 있게 되었다. 대부분, 이 기술의 이용은 생쥐의 세포에 제한되어 왔으며, 안정한 골수선은 융합짝으로써 작용하여 높은 효능으로 생산할 수 있으며 오랜기간동안 생산적 실제로서 유지될 수 있는 안정한 융합세포를 제공한다. 고등동물, 특히 인체는 융합짝 및 융합세포를 개발하는데 더 많은 난점을 가지고 있다. 그러나, 1980년에 최초의 인체 융합짝이 올손 및 카플란 박사에 의해 보고되었으며, 그때 이후 몇 인체융합짝이 더 보고 되었다. 그럼에도 불구하고 인체-인체 교차에 의한 융합세포의 생산은 융합의 효율성, 세포의 배양 및 생산 능력의 유지로 문제로 인한 난점을 갖고 있다. 그러나 특히 생체에 적용할때 한 인체와 동종인 항체를 형성하는 인체융합세포가 가진 많은 잇점 때문에, 인체융합세포는 큰 관심을 갖게 한다. 다른 경우, 인체-인체교차가 가진 난점에도 불구하고, 인체융합세포는 이중교차에 바람직하며, 이때 생성된 융합세포는 얼마 경과후 모노 클로날 항체에 대한 유전정보를 잃을 수 있다.
모노클로날 항체를 사용하는 영역중의 하나는 암의 진찰 및 치료이다. 이런 목적을 위한 모노클로날 항체는 특정 숙주암세포에 대해 특이하기보다는 특정 종류의 암 또는 암의 부위에 대해 특이하다. 그러므로 인체암의 진단 및 치료에 사용될 수 있는 모노클로날 항체를 개발하는 것이 요청된다.
노빈스키(Nowinski)등은 사이언스(1980) 210 : 537∼539에서 포스만(Forssman) 항원에 대한 인체 모노클로날 항체에 대해 보고하였다. 크로세(Croce)등은 내춰(1980) 288 : 488∼489에서 홍역 비루수에 항체를 분비하는 인체융합세포에 대해 보고하였다. 올손 및 카플란은 PNAS USA (1980) 77 : 5429∼5431에서 항체를 형성하는데 사용되는 융합짝 뿐만 아니라 상술한 항원 특이성을 가진 모노클로날 항체를 형성하는 인체-인체 융합세포에 대해 보고하였다. 또한 1981년 3월 26일에 출원되어 심사중인 출원 제247,652를 참고로 한다. 슈롬은 PANS USA (1980)77 : 6841∼6845에서 유방암 및 시코라(Sikora)에 대한 모노클로날 향체에 대해 보고 하였으며 또한 브리티시. 저널 어브캔서 (1981) 43 : 696에서 암으로 부터 림파구를 분리하여 암에 대해 특이한 항체를 제공하는 것에 대해 보고하였다. 제15회 류코사이트 컬쳐 컨퍼런스에서 파커 및 오브리엔은 윌리 인터사이언스, N. Y., Dec. 5∼10, 1982에 본 융합세포에 대해 기재하였다.
신생체 인체숙주로 부터 뽑아낸 림파구는 인체융합짝과 융합하여 신생체 세포에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 분비하는 인체×인체 융합세포를 제공함으로써 희생된다. 특히, 경부암세포와 같이 경질 종양 세포에 특이한 모노클로날 항체는 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
경질 종양으로 부터의 신생세포에 대해 특이성을 갖는 인체 모노클로날 항체는 B 림파구를 사용한 인체×인체융합, 예를 들어 경질 종양을 배농한 림프절로 부터 얻어진다. 특히 림프절은 면역 적합 숙주의 림프절 근처에서 종양세포의 괴사를 일으키는 활성을 나타내는 것으로 선택된다.
배농 림프절은 각종 인체조직, 예를 들어 목, 유방, 결장, 폐, 전립선, 피부등의 연결부에서 분리될 수 있다. 특히, 척추부분으로 부터의 림프절이 흥미롭다.
융합짝은 면역글로블린, 그의 각 사슬 또는 단편을 분비하지 않으며, HAT 배지에 의해 선택될 수 있으며 높은 융합 효능을 갖는 어떤 편리한 희생된 B-세포일 수 있다. 융합짝의 예를 들면, 임파아구종세포주 UC 729-6, 골수종세포주J-4 (SKO-007) 및 임파아구종세포주 GM 1500 6TG-A12가 있다.
융합은 문헌에 기재된 바와 같이 푸조겐(fusogen)으로써 PEG 1500을 사용하고, 다수의 웰의 HAT배지에서 세포를 플레이팅한 후, 상충액을 항체를 필요로 하는 생존 세포웰에 스크린하여 수행된다. 반응성을 나타내는 웰은 희석을 제한함으로써 클로닝한 후 넓게 편다.
신규 융합세포 CLNH 5 및 CLNH 11, CLNH5 및 CLNH 11로 부터 얻어진 융합세포, 이 융합세포로 부터 유도된 항체, 이 항체의 유도체 및 진단 및 치료를 위한 항체 및 그 유도체의 이용에 대한 특별한 관심이 주목된다. CLNH 5(ATCC HB 8206, KFCC-10441) 및 CLNH 11(ATCC HB 8307, KFCC-10442)은 융합짝 UC 729-6을 경부암에 걸린 환자의 림프절 세포로 부터의 림파구와 융합함으로써 얻어진다. UC 729-6은 A. T. C. C에 기탁번호 CRL8061로 기탁되어 있다. UC 729-6은 미국 출원번호 247,652과 연결된 특허 목적으로 기탁되었다.
융합에 사용된 림파구는 경부암을 가진 환자의 척추 배농 림프절로 부터의 림파구 및 말초혈액 림파구이다. 융합은 HEPES 완충 RPMI 1640에 녹인 약 35% 폴리에틸렌 클리콜용액에서 림프절로 부터의 환자의 림파구를 융합짝 UC 729-6과 약 2 : 1의 비율로 배합함으로써 수행된다. 세포 혼합물을 적당히 선택한 배지, 특히 약 10% 태내 송아지 혈청을 함유한 HAT 배지에 현탁시킨 후, 웰당 약 105세포를 세포가 성장하기에 충분한 시간동안 웰에서 배양한다. 선택된 배지는 때때로 바꿔준다.
상기 융합한 웰은 CLNH5 및 11로 정의된 숙주환자의 경부암세포와 특이하게 반응하는 클론을 제공한다. 이들 웰은 인체 IgM 및 IgG 모노클로날 항체를 제공하며, 이 항체들은 각종 경부암 및 다른 종양세포선, 예를 들면 폐의 소세포암에서 발견되는 항원과 반응하나 시험된 정상조직 및 정상 세포선과는 반응하지 않는다.
융합세포 및 모노클로날 항체는 각종 방법으로 특히 유전 물질의 재료로써, 시약으로써 및 시약으로써 사용할 수 있는 생성물을 위한 전구체로써 사용될 수 있다.
본 융합세포는 유전물질의 재료로써 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 융합세포는 다른 융합짝과 융합하여 CLNH5 및 11과 같은 분비능력을 가진 신규 융합세포를 제공하며, 신규 융합세포는 같은 특이성을 가진 항체를 제공한다. 이와 같은 융합은 다른 종류 또는 아류의 항체, 예를 들면 IgG, IgA 또는 IgM을 제공하기 위한 다른 중사슬을 가진 항체를 생산하게 된다.
융합세포는 또한 DNA의 재료로써 사용될 수 있으며, 혼성 DNA 조작에 의해 유전자는 삭제되어 적당한 벡터에 도입된 후 성숙한 항체의 생산을 위한 림파종의 형질 전환을 위해 사용된다.
모노클로날 항체는 치료 뿐만 아니라 생체내 및 시험관내 진단을 위한 각종 방법에 사용될 수 있다. 여러가지 목적을 위해, 항체는 검출표시의 제공, 세포독성제공 편재된 전자파 방사선의 제공등과 같이 항체에 바람직한 특성을 주는 화합물로 라벨링 된다.
라벨은 방사선핵종, 효소, 형광물질, 독소 또는 독소의 세포독성단편, 입자, 금속, 유금속등 일 수 있다. 항체는 리포소옴막에 삽입되거나 지방과 함께 변형되어 리포소옴막에 삽압될 수 있다. 항체 그 자체 또는 라벨된 항체는 경부암과 같은 신생물과 관련된 항원의 존재를 측정하기 위해 시험관내 진단에 또는 PBS와 같은 생리적으로 무독인 담체에서 숙주에 정맥내 도입하기 위한 생체내 진단을 위해 사용될 수 있으며 또는 같은 방법으로 치료를 목적으로 도입될 수 있다.
항체 그 차제 또는 라벨된 항체는 또한 경부암, 전립선 종양, 결장암, 폐암, 유방암 및 흑색종과 같은 인체숙주의 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 생리식염수에 쉽게 용해되므로 염수용액 또는 액제로서 정맥내 또는 근육내 주사될 수 있다. 더우기, 본 발명의 항체는 연고 또는 좌약의 형태로 사용될 수 있다.
사용되는 항체의 양은 용도에 따라 변화된다. 진단 및 치료를 목적으로 하는 항체의 도입은 문헌에 광범위하게 기재되어 있다.
완전한 항체는 사용될 필요가 없으며, 많은 경우, 손상되지 않은 부분을 가진 한 단편만으로도 충분하다.
예를 들면, Fab 단편, F(ab')2단편, 또는 Fv 단편이면 충분하다.
[실시예]
세포융합 및 융합세포의 선택
RPMI 1640 배지에서 림프절을 누젠트 집게(nugent forcep)로 자극하여, 유리된 림파구를 10% 태내 송아지 혈청(FCS) 및 2mM L-글루타민을 함유한 RPMI 1640 배지에서 37℃ 및 5% CO2로 밤새 배양한다.
림파구 수를 측정하고 인체 림파아세포성 B 세포주 UC 729-6〔Handley 및 Royston, 1982, "암진단 및 치료에 있어서의 융합세포(Hybridomas in Cancer Diagnosis and Treatment)" 페이지 125∼132, Reven Press, N. Y.〕와 2 : 1 의 비율로 혼합한 다음, 게프터(Gefter) 등의 방법〔체세포 유전학 (Somatic cell Genetics)(1977) 3 : 321∼336〕을 수정하여 폴리에틸렌 글리콜 1500으로 융합한다. 융합된 세포는 10% FCS 및 L-글루타민을 함유한 하이포크 산틴-아메톱테린-티미딘 (HAT, Littlefield, Science (1964) 145 : 709∼710) 첨가 RPMI 1640 배지를 코스타(costar) 96 웰 마이크로티터 플레이트에 105세포/웰 (well)이 되도록 깐다.
10∼20일 이내에 융합세포 성장에 대해 양성인 웰은 효소면역분석(EIA)에 의해 인체항체생산 및 제한된 인체세포 패널(panel)에 대한 그들의 반응성을 분석한다.
반응성에 양성인 웰은 피더(feeder) 층의 사용없이 희석을 제한하여 클로닝하고 더 이상의 연구룰 위해 퍼지게 한다.
효소면역분석(Enzyme Immunoassay)
인체 단일클론항체(MoAbs) 및 세포에 대한 그들의 반응성은 상기한 EIA〔Handley 등, J. of Immunologic Methods (1982) 54 : 291∼296의 방법, Glassy 등 J. of Immunologic Method (1983) 발행중의 방법에 의해 수정됨〕의 수정된 방법으로 검사한다.
간단하게 말하면 특히 정제된 염소의 항-인체 Ig 또는 4×106목적세포/ml 현탄액 50μl를 면역여과 분기관(Immunofiltration manifold)의 3중 웰 〔부화실 및 여과 분기관(VP no. 107 : V and P Scientific 샌디에고, 캘리포니아)으로 쓰이는 특별히 고안된 마이크로티터 플래이트〕에 고정화시켰다. 각 웰의 바닥은 0.6mm 구멍을 가지며 그 위에는 0.6mm 직경의 유리섬유 필터를 장치한다.
표면장력은 진공이 걸릴때까지는 구멍을 통해 뽑아내는 유체부피가 100μl 보다 적게 해준다.
진공이 걸리면 유체는 필터를 써서 작은 흡입구를 통해 필터에 입자상 물질을 남기며 빠져나간다.
융합세포 부유액 50μl은 인산염으로 완충된 식염수의 0.3% 젤라틴 용액으로 3번 세척한 후에 실온에서 30분간 방치한다.
필터는 세척하여 염소 항-인체 Ig와 접합된 서양매운냉이(horseradish) 과산화효소 50μl와 함께 30분간 더 방치한다.
필터는 다시 세척하여 시트르산 완충액에 오르소-페닐렌 디아민 400μg/ml 용액 150μl와 함께 방치한다. 각 웰 100μl를 2.5M H2SO450μl를 함유하는 새플레이트에 이동시키고, 다이나텍(알렉산드리아 VA) MR 580 마이크로엘리사 리더(reader)로 492nm에서 측정하였다.
융합세포 배양유체를 50% 황산암노늄으로 침전시키고, 조(crude) Ig분획을 선택한다. 침전물은 생리적 식염수에 용해하고, IgG와 S-아우레우스 단백질 A를 붙힌 세파로스, 및 IgM과 세파로스-(양(sheep) 항-(인체 IgM)항체)를 사용한 친화성 크로마토그라피에서 정제한다. CLNH 5의 배양용액 1ι로 부터 2.2mg의 IgM을 수득하고, CLNH 11의 배양용액 1ι에서는 3.0mg의 IgG를 수득한다.
표 1은 항-경부편평세포암(SCCC)인체 단일클론항체를 생산하려는 세포융합의 결과를 나타낸다.
CLNH 5 및 11을 만드는 세포융합 즉SCCC 세포계열과 반응하는 단일 면역글로부린 M(MoIgM) 및 단일 면역글로부린 G(MoIgG)를 분비하는 인체-인체융합세포는 플래이팅 된 80개의 웰 중 6개가 성장에 대해 양성을 나타낸다. 융합세포 CLNH 5 및 CLNH 11은 클로닝되어, 경부압세포주, CaSki 및 Hela 등과 반응하게 될때 퍼지게 된다.
[표1]
인체 MoAbs의 발생 및 동정]
Figure kpo00001
기록된 각 세포주에 결합된 상대적인 인체 MoAb의 양은 EIA에 의해 측정한다.
CLNH 5에 의해 분비된 항체(IgM)는 경부(CaSki, Hela) 암, 폐(T293, Calu-1 및 SK-MES-1)암, 흑색종양(SK-MEL-28) 암 및 전립선(prostate) (LnCap) 암과 양성반응을 보이며, 정상인 섬유아세포, T 림파구 및 말초성 혈액림파구에 대해서는 음성이었다. CLNH 11에 의해 분비된 항체(IgG)는 경부암(CaSki, Hela) 암, 전립선(pc-3) 암, 유방(ZR-76-1) 암, 결장(Colo-205) 암 및 흑색종양(G-361) 암과 양성반응을 보이며, 정상인 섬유아세포(WI-38 및 MRC-9), T 림파구 및 말초성 혈액 림파구에 대해 음성이였다.
본 발명의 융합세포의 세포생물화학적 성질은 하기한 바와 같다.
융합세포 CLNH 5 :
(1) 염색체의 수 : 60∼90(최대주기 80).
(2) 이것은 인체 면역글로부린 M(IgM)을 분비한다.
(3) 배가시간(doubling time) : 30∼40시간
(4) 임파구성 단세포
(5) 이의 DNA 함량은 보통의 인체 림파구의 그것의 2배 이상 예를 들면 2∼2.5배이다.
(6) 상기 IgM (2)는 인체 경부암세포 및 상기한 다른 암세포들에 흡착하는 성질을 나타낸다.
이외에 (7)상기 융합세포 CLNH 5는 HAT 배지(하이포크 산틴 아메톱테린, 및 티미딘을 함유하는 배지)에서 증식될 수 있다.
융합세포 CLNH 11 :
(1) 염색체의 수 : 60∼90(최대주기 80)
(2) 이것은 인체 면역글로부린 G(IgG)를 분비한다.
(3) 배가시간 : 30∼40시간
(4) 림파구성 단세포
(5) 이것의 DNA 함량은 보통의 인체 림파구의 그것의 2배 이상 예를 들면 2∼2.5배이다.
(6) 상기 IgG (2)는 인체 경부암 세포 및 상기한 다른 암세포들에 흡착하는 성질을 나타낸다.
이외에 (7)상기 융합세포 CLNH 11은 HAT 배지에서 증식 될 수 있다.
상대적인 DNA 함량(보통 인체 림파구의 함량에 대한 비)은 융합세포를 염색한 후, 분리 및 그를 사이토플루오로미터에 의한 분석을 포함하는 방법에 의해 결정한다.
본 발명에 따른 모노클로날 인체 면역글로부린의 성질은 하기한 바와 같다. 융합세포 CLNH 5에 의해 생성된 모노클로날 인체 면역글로부린은,
(a) 인체 면역글로부린 M(IgM)이다.
(b) 정상 섬유아세포(WI-38)보다 세포 계열 Hela 및 CaSki에 잘 흡착되는 더욱 강력한 힘을 가지고 있다.
(c) 인체 적혈구와는 반응하지 않고, 인체 적혈구에 응고반응을 나타내지 않는다.
(d) 중사슬(H 사슬) 및 경사슬(L 사슬)로 구성되며, 분자량 약180,000(단량체)을 가지며, 배양액 내에 펜타머로 존재한다.
융합세포 CLNH 11에 의해 생성되는 모토클로날 인체면역 글로부린은,
(a) 인체 면역 글로부린 G(IgG) 이다.
(b) 정상 섬유 아세포(WI-38)보다 Hela 및 CaSki 세포계열에 잘 흡착되는 강력한 힘을 가지고 있다.
(c) 인체 적혈구와는 반응하지 않으며, 인체 적혈구에 응고 반응을 나타내지 않는다.
(d) 중사슬(H 사슬) 및 경사슬(L 사슬)로 구성되며 분자량 약 150,000(단량체)을 가지며, 배양액내에 모노머로 존재한다.
정상인 세포와 구별되는 신생세포의 인체 모노클로날 항체의 결합 활성은 하기한 바와 같이 측정될 수 있다.
예를 들면 암세포 및 보통 세포를 포함하는 원(original) 인체조직 부분을 글루탈알데히드에 의해 유리 플레이트에 고정시킨 후, Sternberger 등의 J. Hist. Cyto 18, 315(1970) 방법에 따른 효소 면역 분석에 의해 염색한다.
본 모노클로날 항체는 진단, 모사 및 가능하다면 경부암 및 다른 반응성 종양의 치료에 유용하다.
이종숙주로 부터의 경부암 영역에 대한 모노클로날 항체의 특이성 때문에, 본 항체는 항원의 숙주 소스에 만이기 보다는 이종숙주에 사용될 수 있다. 본 항체는 인체에 대한 것이기 때문에, 생체내에서의 진단 및 치료에 적용하였을때에 심각한 면역 반응을 잘 나타내지 않는다.
상기의 발명은 설명 및 이해를 돕기 위한 목적으로 실시예에 의해 자세히 기술되었지만, 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한 하는 것은 아니다.

Claims (16)

  1. 인체 신생체세포와 그에 상응하는 정상 인체세포를 구별할 수 있는 인체 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인체의 경질 종양 세포와 그에 상응하는 정상 인체세포를 구별할 수 있는 인체 모노클로날 항체.
  3. 제1항에 있어서, 인체 경부 암세포와 정상 인체 경부세포를 구별할 수 있는 인체 모노클로날 항체.
  4. 제3항에 있어서, 인체융합세포 CLNH 5(KFCC-10441) 또는 CLNH 5에서 유도된 융합세포에서 얻어진 인체 모노클로날 항체.
  5. 제3항에 있어서, 인체융합세포 CLNH 11(KFCC-10442) 또는 CLNH 11에서 유도된 융합세포에서 얻어진 인체 모노클로날 항체.
  6. 제1 내지 5항중 어느 한항에 있어서, 탐지 가능한 시그날을 줄 수 있는 라벨(label)을 라벨링(labeling)한 인체 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 라벨이 방사성 핵종인 인체 모느클로날 항체.
  8. 제1 내지 5항중 어느 한항에 있어서, 독소를 라벨링한 인체 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
  9. 신생체를 가지고 있다고 생각되는 숙주로 부터의 샘플과 제1 내지 5항중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 그의 단편, 또는 탐지 가능한 시그날을 줄 수 있는 라벨로 라벨링한 상기 항체 또는 단편과 결합시키고, 상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편, 또는 그의 등종항원에 탐지 가능한 시그날을 줄 수 있는 라벨로 라벨링한 상기 항체 또는 그의 단편을 검출함을 특징으로 하는 신생체의 존재 결정 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 샘물이 숙주 조직인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 신생체가 경질종양인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 경질종양이 경부암, 전립선암, 결장암. 페암,유방암 또는 흑색 종양암인 방법.
  13. 인체숙주에서의 신생체와 관련된 인체림프질, 인체림프선, 인체골수, 인체척추 또는 인체혈에서 얻은 B 림프구를 인체융합짝과 융합하여 융합세포를 제조하고, 상기 융합세포를 클로닝하여 각개의 클론(clone)을 형성하여, 상기 종양세포 및 다른 숙주의 동일한 조직에서 얻은 종양세포에 특이한 모노클로날 항체를 위한 상기 클론을 스크린 한 후, 상기 특이한 클론을 성장시켜 상기한 모노클로날 항체를 생산함을 특징으로 하는 정상 세포와 다른 신생체세포에 특이하고, 비인체항원에는 자유로운 인체 모노클로날 항체의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신생체가 인체숙주의 경질암인 방법.
  15. 제13항에 따른 세포를 성장시킴을 특징으로 하는, 정상 세포와는 다른 경질 종양세포에는 특이하며 비인체항원에는 자유로운 모노클로날 항체의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 종양이 경부암인 방법.
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