KR930012104B1 - 암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린 및 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마 - Google Patents

암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린 및 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마 Download PDF

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Description

암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린 및 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마
본 발명은 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간 B세포 및 면역 글로불린을 생산하는 능력이 실질적으로 결여된 인간 B세포로부터 유래된 신규 인간/인간 융합 세포 클론, 인간/인간 융합 세포 클론에 의해 생산된 항원-특이적 인간 면역 글로불린, 및 인간 면역 글로불린을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세히 설명하면, 본 발명은 간암 환자의 인간 B세포 및 인간 임파아세포주의 서브클론에서 유래된 인간/인간 융합 세포주인, 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간/인간 융합 세포주에 의해 생산된 항원-특이적 인간 면적 글로블린에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간/인간 융합 세포주를 배양 배지 중에서 배양하고, 배양 브로쓰로부터 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 분리함을 특징으로 하는 항원-특이적 인간 면역 글로불린의 제조 방법에 관한 것이다.
항원-특이적 면역 글로불린은 의학, 약학 및 생화학분야, 예를 들면 인간 간암의 예방, 치료 및 진단, 생화학제 및 생물중합체의 제조 및 암 항원의 정제에 유용하다.
암 또는 다른 항원으로 감작화한 생쥐 B세포와 골수종 생쥐에서 얻은 생쥐 B세포를 생쥐의 체외에서 융합시켜 상기 항원에 대해 특이적인 생쥐 면역 글로불린을 생산하는 능력 및 자가-복제성을 갖는 생쥐/생쥐 융합 세포를 생산하는 것이 이미 보고되어 있다［예. ＂Koehler G. and Milstein C. : Nature, 256, 495(1975) and Dippold, E. G., Lloyd, K. O., Li, L, T. C., Ikeda, H., Oettgen, H. F. and Old, L. J. : Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 77, 6114(1980)］.
항원으로 감작화한 인간 B-세포 및 골수종 생쥐에서 얻은 생쥐 B세포를 체외에서 융합시켜 항원에 특이적인 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력 및 자가-복제성을 갖는 인간/생쥐 융합 세포를 생산하는 것도 보고되어 있다［예. Schlom, J., Wenderrich, P., and Teramoto, Y. A. : Proc, Nat. Acad. Sci., U.S.A., 77(11), 6841(1984).
그러나, 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 융합 세포를 얻고자 하는 후자의 시도에 있어서는, 시간에 따라 염색체가 손실되고, 인간 면역 글로불린을 생산하는 융합 세포의 능력이 시간 경과에 따라 상실된다. 따라서, 후자의 시도에 의해 얻어진 융합 세포는 면역 글로불린을 생산하는 능력이 매우 불안정한 심각한 결점을 갖는다.
인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 융합 세포를 형성하기 위한 시도로서는, 마진 비루스 또는 합텐(2, 4-디니트로페닐)으로 감작화한 인간 B세포를 공여체로 사용하여, 골수종 환자에게서 얻은 인간 면역 글로불린을 생산할 수 있는 능력을 갖는 세포주(인간 B세포, 모 세포주)와 체외에서 융합시켜 상기 항원에 특이적인 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력 및 자가 복제성을 갖는 인간/인간 세포를 생산하는 것이 보고되어 있다.［예. Croce, C. M., Linnenbach, A., Hall, W., Steplowski, Z., au Koprowski, H. : Nature, 288, 488(1980), and Olsson, L. and Kaplan, H. S. : Proc Nat. Aead. Sci., U.S.A., 7(9), 5429(1980)].
상술한 방법에 의해 얻어지는 생쥐/생쥐 하이브리도마는 오직 생쥐 면역 글로불린만을 생산할 수 있다. 생쥐/인간 하이브리도마를 배양하면, 생쥐에서 유래된 생성물의 형성이 배양중에 불가피하게 형성되며, 인간 염색체의 손실과 더불어 하이브리도마가 인간 면역 글로불린의 생산 능력을 상실한다. 이러한 이유 때문에, 인간/인간 융합 세포로부터 인간 면역 글로불린을 생산하는 것이 요구되고 있다. 인간/인간 하이프리도마로부터 생산된 인간 면역 글로불린을 보고하는 상술한 논문은 암세포에 대한 면역 글로불린의 결합성의 증거를 전혀 나타내지 못하고 있다. 특히, 이들 논문은 간암 세포 및 간암 조직에 대한 면역 글로불린의 결합성에 대해 전혀 언급하지 못하고 있다.
본 출원의 한 발명가는 자궁암 환자로부터 얻은 인간 B세포 및 인간 임파아 세포주의 서브클론에서 유래된 인간/인간 융합 세포이고 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마를 창조했다(일본국 특허 공개 제137497/1984호). 이 특허 서류에는 하이브리도마에 의해 생산된 인간 면역 글로불린이 자궁 유상피 암세포 및 상기 세포로부터 유래된 세포주 헬라(Hela) 및 카스키(Caski)에 대해 정상 섬유 아세포(W1-38)보다 더 강한 결합력을 나타낸다고 기재되어 있다. 그러나 인간 간암 세포 및 인간 간암 조직에 대한 결합성은 전혀 언급하지 못하고 있다.
일본국 특허 공개 제44900/1986호(유럽 특허 공개 제171083호)에는 췌장암, 대장암 및 간암과 관련된 항원과 특이적으로 반응하는 단클론성 항체가 기재되어 있으며, 단클론성 항체를 생산하는 융합 세포는 항체-생산 세포를 바람직하게는 동종의 동물에서 유래된 골수 세포와 융합시킴으로써 얻어진다고 언급하고 있다. 이 특허 서류는 특히 생쥐/생쥐 융합 세포주만을 기재하고 있다.
일본국 특허 공개 제167699/1986호 및 36398/1987호는 식도암, 허파암, 위암 및 간암과 특이적으로 반응하는 단클론성 항체, 및 단클론성 항체를 생산할 수 있는 융합 세포가 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 얻어진다고 언급하고 있다. 이 특허 서류는 특히, 생쥐/생쥐 융합 세포주만을 기재하고 있다. 이 특허 서류는 생쥐/생쥐 융합 세포에 의해 생산된 단클론성 항체의 인간 간암 세포(HEK)에 대한 결합성만을 간암 세포에 대한 결합성의 특별한 예로 나타낸다. 그들은 기타 간암 세포 또는 인간 간암 조직에 대한 결합성에 대해서는 전혀 언급하지 못하고 있다. 그들은 인간/인간 하이브리도마에 의해 생산된 단클론성 항체 및 그것의 간암 세포 또는 조직에 대한 결합성에 대해서는 아무것도 나타내지 않고 있다.
본 발명가들은 연구를 통해 인간/인간 하이브리도마를 제조했으며, 간암 환자의 인간 B세포 및 인간 임파아세포의 서브클론으로부터 유래된 인긴/인간 융합 세포이고, 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마를 창조하는 데 성공했다.
본 발명가들은 각각 하나의 인간/인간 하이브리도마가 간암 환자의 인간 B세포의 면역학적 특성을 갖고 이 특성을 계속해서 안정하게 갖을 수 있으며, 또한 상기 인간/인간 하이브리도마가 인간 면역 글로불린 A(IgA)를 생산하는 능력을 갖고 생산된 항체는 인간 간암 세포에 대한 결합성을 나타내는 항원-특이적 단클론성 항체임을 발견했다. 또한 본 발명가들은 이러한 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 성공적으로 제조하였다.
본 발명가들은 또한 상술한 신규 인간/인간 하이브리도마를 간암 환자로부터 얻은 인간 B세포를 포함하는 인간 세포군을 인간 임파아세포의 서브클론(인간 B세포)을 포함하는 인간 세포군과 인체외에서 융합시킴으로써 인간 B세포와 인간 B세포와의 융합 세포를 제조하고, 융합 세포를 HATO 배지에서 통상적인 방법으로 배양하고, 융합 세포 클론을 분리함으로써 제조할 수 있음을 발견하였다. 본 발명가들은 상기 방법에 의해 상기 인간/인간 하이브리도마(예. TOH/B9)를 창조하는데 성공했다.
더군다나, 본 발명가들은 또 다른 형의 인간/인간 하이브리도마가 간암 환자로부터 얻은 인간 B세포의 면역학적 특성을 갖고 이러한 특성을 계속해서 안정하게 갖을 수 있으며; 상기 인간/인간 하이브리도마가 인간 면역 글로불린 G(IgG)를 생산하는 능력을 갖으며; 이 항체는 인간 간암 세포 및 그것을 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀 내에 봉매시킴으로써 얻어진 인간 간암 조직의 슬라이스에 대해 결합성을 나타내는 항원-특이적 단클론성 항체임을 발견했다. 본 발명가들은 또한 이러한 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 생산하는데 성공했다.
본 발명가들은 또한 상기 신규형의 인간/인간 하이브리도마를 간암 환자로부터 얻은 인간 B세포를 포함하는 인간 세포군을 인간 임파아세포(인간 B세포)의 서브클론(인간 B세포)을 포함하는 인간 세포군과 인체외 융합시킴으로써 융합 세포를 형성하고, 융합 세포를 HATO 배지에서 통상적인 방법으로 배양하고, 융합 세포 클론을 분리함으로써 제조할 수 있음을 발견하였으며, 상기 인간/인간 하이브리도마(예. TOH/D5)를 상기 방법으로 창조하는데 성공했다.
그러므로, 본 발명의 목적은 간암 환자로부터 얻은 인간 B세포 및 인간 임파아세포의 서브클론(인간 B세포)에서 유래된 인간/인간 융합 세포이고 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간/인간 하이브리도마를 사용하여 인간 간암 세포 또는 인간 간암 조직에 대해 결합성을 나타내는 암-관련 항원에 대해 특이적인 인간 면역 글로불린(단 클론 성 항체)을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
그의 잇점과 함께 본 발명의 상기 및 또 다른 목적들은 하기 서술에서 더 명백해진다.
본 발명의 인간/인간 하이브리도마는 간암 환자의 혈액, 임파절, 비장, 골수 등에서 얻어질 수 있는 인간 B세포 및 예를 들면 HIH/TO1(FERM BP-1884)와 같은 인간 임파아세포의 서브클론(인간 B세포)에서 유래된 인간/인간 융합 세포이고 인간 간암 세포 또는 인간 간암 조직과의 결합성을 나타내는 항원-특이적 인간 면역 글로불린(단클론성 항체)을 생산하는 능력을 갖는다.
본 발명가들은, 우선, 간암 환자의 인간 B세포를 실질적으로는 면역 글로불린을 생산하는 능력이 결여된 임파아세포의 서브클론(인간 B세포)과 융합시킴으로써 간암과 같은 암-관련 항원에 특이적으로 결합하는 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마를 제조했다.
융합 세포를 제조하는 융합 조작은 어떤 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면 간암 환자의 인간 B세포를 융합 촉진제의 존재하 용매내에서 인간 임파아 세포의 서브클론과 접촉시킴으로써 수행한다.
융합 조작전에, 간암 환자의 인간 B세포를 인간 B세포 성장 인자(인간 BCGF) 및 항-인간 IgM 항체(항-μ)의 존재하에서 전 배양처리시키는 것이 바람직하다. 전 배양 처리는, 예를 들면, 인간 BCGF 및 항-μ를 함유하는 적당한 기본 배지 또는 그의 변형 배지를 이용하여 5％ CO₂를 함유하는 대기내 약 30℃±3℃의 온도에서 약 5~7일 동안 수행한다. 예를 들면, 일본국 특허 공개 제51983/1987호에 예시된 공지된 기본 배지 또는 그의 변형 배지를, 기본 또는 변형 배지로 사용할 수 있다. 배양 배지는 예를 들면, 기타 공지된 성장인자, 아미노산, 비타민, 미네랄, 당, 보효소 및 지방산을 함유할 수 있다. 인간 BCGF 및 항-μ는 상업적으로 구할 수 있고, 그의 제조 방법도 공지되어 있다. 전자로는 예를 들면 문헌(Abbby Maizel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., Vol. 79. 5998~6002(1982)]를 참조하고, 후자로는, 예를 들면, 문헌［Immunochemistry Japanese-lanuguage publication, Shunsuke Uda 편집, p51~63, Nakayama Shoten 출판(1972)］를 참고한다. 이 물질의 양은 실험적으로 쉽게 선택할 수 있다. 예를 들면, 배지의 부피에 기초하여, 인간 BCGF 약 5~20부피％ 및 약 5~100μg/ml-항-μ배지를 사용할 수 있다.
본 발명에서, 융합 세포는 간암 환자의 인간 B세포를 용매내에서 센다이 비루스(Sendai virus, HVJ) 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합 촉진제를 사용하거나 또는 전기 융합 장치를 사용하여 인간 임파아세포의 서브클론과 접촉시킴으로써 제조할 수 있다.
예를 들면, 상기 인간 B세포 및 서브클론을 융합 촉진제 존재하에서 수성 배지 내에 담고, 계를 임의적으로 부드럽게 교반하여 균질상으로 만든다. 하나의 인간 B세포 및 하나의 서브클론(인간 B세포)으로부터 융합 세포를 생산하는데 충분한 시간, 예를 들면 수분 동안 방치하여 목적 융합 세포를 수득한다. 용매는, 예를 들면, 물, 생리적 식염수, 5％ 디메틸 술폭시드 수용액, 또는 5％ 글리세롤 수용액일 수도 있다.
목적 융합 세포가 생산되어 있는 계를 예를 들면 원심 분리하고 세포를 수확한다. 이들을 10％ 송아지 또는 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 액체 배지에 HATO 시약을 가하여 얻은 배지 같은 적절한 배지에 분산시킨다. 분산 액을 고정된 비율로 마이크로타이터 플레이트의 웰에 나누어 주입하고, 예를 들면 37℃에서 5％ CO2존재하에 배양한다. RPMI-1640, DME 및 F-12의 혼합물(2 : 1 : 1)로 이루어진 배지(RDF)를 상술한 RPMI-1640 배지 대신에 사용할 수 있다. 각 웰의 배양액을 매 사흘마다 새로운 것으로 바꾸고, 예를 들면 2주일간 계속 배양한다. 융합 세포의 형성을 현미경하에서 검사한다. 융합 세포 군락의 형성이 관찰되는 웰의 세포액을 취한다. 배양액 중의 인간 면역 글로불린의 존재는 예를 들면125I를 이용하는 방사선 면역 분석법 또는 효소-표지화 항체 기술에 의해 검출할 수 있다.
인간 면역 글로불린의 생산이 관찰되는 군락을 새로운 배지에 옮기고 배양한다. 결과로서, 융합 세포가 증식되고, 융합 세포 클론을 얻을 수 있다. 필요에 따라서는, 서브-클로닝에 의해, 인간 간암 같은 암-관련 항원에 특이적으로 결합되는 인간 면역 글로불린을 생산할 수 있는 능력을 갖는 클론을 얻을 수 있다.
이 구현예의 실시에 있어서, 문헌［Glassy, M. C., Handley, H. H., Hagiwara, H. and Royston, I. : Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 80, 6327(1983) 및 ＂Koso Kotai Ho＂(Enzyme-Labelled Antibody Technique), Keiichi Watanabe 편집, Gakusai Kikaku, p 33~118(1956)]에 기재되어 있는 기술을 이용할 수 있다.
예를 들면 생검에 의해 건강한 사람의 비장으로부터 임파아세포를 얻거나 또는 골수종 환자로부터 임파구 같은 임파세포를 얻는다. 실질적으로 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖지 못하는 B세포 임파구를 선택 및 분리한다. 그렇게해서, 6-티오구아닌 및 와바인에 대해 내성이고 HATO 배지에서 죽는 민감성을 가진 인간 B세포를 얻을 수 있다. 예를 들면 이하의 예에서 사용되는 인간 B세포인 HIH/TO1은 하기 참고예 1에서 나타낸 것처럼 6-티오구아닌 및 와바인을 함유하는 배지중에서 상술한 임파아구를 배양함으로써 얻을 수 있다.
간암 환자의 인간 B세포 및 인간 임파아세포의 서브클론 HIH/TO1(FERM BP-1884)로부터 생산된, 항원-특이적 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마 TOH/B9(FERM BP-1883) 및 TOH/D5(FERM BP-1882)의 세포 생화학적 특성을 다음에 기술하였다.
인간/인간 하이브리도마 TOH/B9
(1) 인간 면역 글로불린 A(IgA) 분비(생산)
(2) 배가 시간 : 약 37시간
(3) DNA 함량은 정상인의 임파구의 DNA 함량의 약 2배, 예를 들면 1.5~2.5배이다.
(4) 상기 (1)항의 IgA는 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포)(간암)에 대해 결합성을 나타낸다.
(5) HATO 배지(히포크산틴, 아메토프테린, 티미딘 및 와바인을 함유하는 배지)에서 분할 및 증식될 수 있다.
인간/인간 하이브리도마 TOH/D5
(1) 인간 면역 글로블린 G(IgG) 분비(생산)
(2) 배가 시간 : 약 37시간
(3) DNA 함량은 정산인의 임파구의 DNA 함량의 약2배, 예를 들면 1.5~2.5배이다.
(4) 상기(1)항의 IgG는 인간 세포주 PLC/PRE/5(알렉산더 세포) 또는 인간 간암 조직의 포르말린-고정 파라핀-봉매 슬라이스에 대해 결합성을 나타낸다.
(5) HATO 배지(히포크산틴, 아메토프테린, 티미딘 및 와바인을 함유하는 배지)에서 분할 및 증식될 수 있다.
상대 DNA 함량(정상인의 임파구의 DNA 함량에 대한 비율)은 시료를 프로피듐 요오다이드로 염색한 후에 유동 혈구계산기를 이용한 분석에 의해 결정한다.
본 발명의 항원-특이적 인간 면역 글로불린은 인간 간암 환자의 인간 B세포 및 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 생산할 수 있는 능력을 가진 인간 임파아세포의 서브클론(인간 B세포)으로부터 유래된 융합 세포를 배양하고, 배양 브로쓰로부터 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 회수함으로써 생산할 수 있다.
예를 들면 상술한 대로 생산한 인간/인간 하이브리도마를 10％ 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지 같은 적절한 배지에 배양하고, 인간 간암 세포 같은 암-관련 항원에 특이적으로 결합되는 면역 글로불린을 함유하는 물질을 배양 브로쓰로부터 얻을 수 있다. 무혈청 배지를 인간/인간 하이브리도마의 배양에 이용할 수 있으며, 이것은 생성된 면역 글로불린을 쉽게 정제할 수 있게 하기 때문에 유리하다. 이러한 무혈청 배지는 예를 들면 본 출원인과 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허 공개 제51983/1987호(일본국 특허 출원 제192145/1985호)에 기술되어 있다. 필요에 따라서는 상기 물질을 정제하여 정제된 면역 글로불린을 형성할 수 있다. 정제는 생물학적 액체로부터 면역 글로불린을 정제하는데 이용될 수 있는 정제법, 예를 들면 황산암모늄법, 친화력 크로마토그래피, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 전기영동에 의해 수행할 수 있다.
본 발명에 따라 인간 간암 세포 같은 암-관련 항원에 특이적으로 결합되는 면역 글로불린 또는 융합 세포 클론 또는 그의 배양물에서 유래된 면역 글로불린을 함유하는 물질을 얻는데 있어서, 누드(nude) 생쥐 같은 면역 글로불린 물질을 생산하는 능력이 없거나 또는 그 능력이 매우 약한 동물에 항원 조직(예, 암조직)을 접종하고, 접종 조직을 유지하고, 이렇게 유지되거나 또는 배양계에 되돌려진 조직계와 반응하는 인간 면역 글로불린(항제)을 탐색하고 그것을 분리하는 것이 유리하다.
인간/인간 하이브리도마를 배양하는데 이용될 수 있는 배지의 다른 예에는 10％ 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지, 둘베코배지 및 HAM 배지의 2 : 1 : 1 혼합물로 이루어진 RDF 배지, 및 트란스페린, 인슐린, 소듐 셀레나이트, 에탄올아민 및 베타-메르캅토 에탄올을 함유하는 RDF 배지가 포함된다. 배양은 37℃에서 5％ CO2존재하에 수행할 수 있다.
상술한 바와 같이 얻을 수 있는 본 발명의 암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린의 예는 상술한 인간/인간 하이브리도마 TOH/B9 및 인간/인간 하이브리도마 TOH/D5를 이용하여 얻는 면역 글로불린이다. 그의 특성을 다음에 나타내었다.
인간/인간 하이브리도마 TOH/B9에 의해 생산된 암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린
(a) 인간 면역 글로불린 A(IgA)이다.
(b) 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포)(간암)에 대하여 결합력을 갖는다.
(c) 약 60,000의 분자량을 갖는 중사슬(heavy chain) 및 약 20,000의 분자량을 갖는 경 사슬(light chain)을 포함한다.
인간/인간 하이브리도마 TOH/D5에 의해 생산된 암-관련 항원-특이적 인간 면역 글로불린
(a) 인간 면역 글로불린 G(IgG)이다.
(b) 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포) 또는 인간 간암 조직에 대하여 결합력을 나타낸다.
(c) H- 및 L-사슬로 구성되어 있으며 약 150,000의 분자량을 갖는다.
인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포)(간암)은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 ATCC CR1, 8024로서 무상으로 공급받을 수 있다.
본 발명의 항원-특이적 인간 면역 글로불린은 그들 자신의 작용 또는 인간 간암 세포 같은 인간 암세포에 작용하는 항체의 작용에 의해 인간 간암 세포 같은 인간 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 죽일 수 있다. 한편, 본체 또는 T-임파구의 도움에 의해, 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 죽일 수 있다. 덧붙여, 이들은 인체 외에서 대량으로 생산되는 암-특이적 항체를 담체로 이용하는 화학요법제-결합 인간 단클론성 항체, 인터페론-결합 인간 단 클론성 항체, 고분자 독소-결합 인간 단클론성 항체, 약-함유 리포 좀-결합 인간 단클론성항체의 형태로서 사용될 때 암세포의 증식을 억제하거나 또는 암세포를 죽이는데 유용하다. 담체로 사용되는 본 발명에서 얻은 인간 단 클론 성 항체에 방사선-민감성 물질을 결합시키고 이를 암 환자에 투여하면, 단 클론 성 항체는 암세포에 선택적으로 모여들게 된다. 이는 질병 부위의 검출을 가능하게 하며 방사선 치료법에 이용될 수 있다. 본 발명의 면역 글로불린을 암에 대하여 사용하는데 있어서는, 오직 완전히 단 클론 성인 항체만을 사용할 수 있다. 항체를 특이적 항원인지 부위를 함유하는 더 작은 분자로 절단하거나 또는 이러한 작은 분자 또는 특이적 항원 인지 부위만을 다른 항체의 비 특이적 항원인지 부위에 결합시킴으로써 화학적 방법에 의해 보다 효과적인 변형 인간 단클론성 항체를 창조할 수 있고 변형 인간 단클론성 항체를 이용할 수 있다.
하기 예는 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
[참고 예 1］
인간 B세포-임파아세포 HIH/TO1
인간 B세포-임파아세포 WI-L2［＂Journal of the National Cancer Institute＂, Vol. 46, No. 3, pp. 647-654(1971)］를 배양하고, 적당량의 인슐린, 트란스페린, 셀레늄, 에탄올아민, 베타-메르캅토에탄올 및 소 혈청 알부민을 기본 배지 RDF에 가하여 얻은 무혈청 배지에 적응시킨다. 배양 브로쓰를 1세포/웰의 비율로 무혈청 배지를 함유하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 접종하고, 37℃에서 5％ CO₂ 존재하에 한계 희석법에 의해 클로닝 조작을 수행한다. 약 1개월이 경과된 후에, 배지중에서 면역 글로불린 IgG 및 IgM을 실질적으로 생산하지 않는 한 클론을 상기 세포가 증식된 50웰로 부터 선택한다.
이 선택된 클론을 배양하고, 0.1μM 6-티오구아닌을 함유하는 상기와 동일한 무혈청 배지에 적응시킨다. 5％ CO₂ 존재하에 37℃에서 배양을 수행한다. 매 시간 마다 계대배양을 반복하고, 6-티오구아닌의 농도를 0.2μM에서부터 단계적으로 0.5, 1, 2, 4, 10, 15 및 20μM로 증가시킨다. 최종적으로, 20μM의 6-티오구아닌을 함유하는 무혈청 배지에서 복제될 수 있는 단클론을 상기한 것과 동일한 한계 희석법에 의해 클로닝하여 선택한다.
클론을 1μg/㎖의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG, 돌연변이제)을 함유하는 기본 배지 RDF 중에서 5％ CO₂ 존재하에 37℃에서 3시간 동안 배양한다. 세포를 상술한 것과 동일한 무혈청 배지로 세척하고, 배양하고 20μM의 6-티오구아닌 및 와바인을 함유하는 상기한 것과 동일한 무혈청 배지에 적응시킨다. 5％ CO₂ 존재하에 37℃에서 배양을 실시하고 매시간 마다 계대배양을 반복하고, 와바인의 농도를 0.1μM에서부터 단계적으로 0.2, 0.5, 1 및 5μM로 상승시킨다. 최종적으로, 20μM 6-티오구아닌 및 5μM 와바인을 함유하는 무혈청 배지에서 복제될 수 있는 단클론을 상기한 것과 동일한 한계 희석법에 의해 클로닝하여 선택함으로써 HIH/TO1을 수득한다.
[실시예 1］
작업 시 간암 환자로부터 암조직의 말초 부분에서 임파절을 수득하고, 가위로 미세한 조각으로 절단한다. 임파절 안쪽의 임파구를 RDF 배지(RPMI-1640, DME 및 F-12의 2 : 1 : 1 혼합물로 구성됨)에 분산시킨다. 이중 거즈를 사용하여 분산액을 여과하여 지방층을 제거한다. 여과액중의 세포(임파구 ＞80％)를 원심 분리에 의해 수거한다［인간 B세포 공여체(공여 B세포)를 함유한 인간 임파구 분획］. 임파구 분획을 20％의 소 태아 혈청 및 10％의 디메틸 술폭시드를 함유한 RDF 배지에서 동결(-130℃)시키고, 세포융합일까지 저장한다.
1.0×107공여 B세포를 5％ 인간 BCGF(Cellular Products, Inc. and Biotech Research Labs 제조 B세포 성장인자) 및 20μg/ml 염소 항-인간 IgM(Cappel Company 제조) 항체를 함유하는 RDF 배지에서 5％ CO₂ 존재하에 37℃로 배양하고, 7일 후, 100G에서 15분 동안 원심 분리하여 공여 B세포를 수거하고, RDF 배지로 한 번 세척한다.
공여 임파구(1.0×107) 및 면역 글로불린을 생산하는 능력이 실질적으로 결여된 인간 모 B세포(HIH/TO1)(1.0×107)를 혼합하고, 50％ 폴리에틸렌글리콜 1500 존재하에 융합시킨다. 생성물을 30G에서 15분 동안 원심 분리하여 폴리에틸렌글리콜을 제거하고, 새로이 10％ 소 태아 혈청 및 히포크산틴, 아메토프테린, 티미딘 및 와바인(HATO)을 함유하는 RDF 배지를 가한다. 이들 세포를 함유한 배양액을 96-웰 마이크로 타이터 플레이트에 웰당 200μl(1.5×105세포 함유)의 비율로 주입한다. 4주 후, 플레이트를 37℃의 인큐베이터에서 5％ CO2존재하에 보온한다. 이 기간 동안 HATO 및 10％ 소 태아 혈청을 함유한 RDF 배지를 4~5일에 한번씩 교환한다. 모 B세포(HIH/TO1)는 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제가 부족하기 때문에 아메토프테린 존재하에 생존할 수 없다. 임파구는 10％ 소 태아 혈청을 함유한 RDF와 같은 통상의 배지에서 오랜 기간 동안 중식 및 생존할 수 없으며, 더욱이 와바인 존재하에서 죽는다. 따라서 HATO를 함유한 배지에서 장기간 동안 증식된 세포는 임파구와 모 B세포의 융합세포이다. 4주 동안 배양시킨 후, 5개의 하이브리도마가 수득된다. 이들 하이브리도마가 인간 면역 글로불린을 생산하는지의 여부는 효소 표지와 항체 방법에 의해 결정한다. 이 방법을 하술한다.
항-인간 면역 글로불린 항체(항-인간 Ig 항체)(50μl)를 마이크로타이터 플레이트에 적가하고, 37℃에서 1시간 동안 유지하여 플레이트에 흡착시킨다. 플레이트를 0.3％ 젤라틴을 함유한 10mM PBS(젤라틴 완충액)으로 3번 세척하고, 5％ 소 혈청 알부민 용액을 플레이트에 적가(200μl)한 후, 플레이트를 37℃에서 0.5시간 동안 유지하여 플레이트에 흡착시킨다. 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척하고 흡착되지 않은 물질을 제거한다. 분석용액(배양 상층액)을 적가(50μl)를 하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척한다. 퍼옥시다아제-접합 항-인간 Ig 항체(50μl)를 적하고, 37℃에서 30분간 반응시켜 이를 배양 상층액중에서 인간 Ig에 결합시킨다(효소-표지화 항체 기술). 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척하고, 과산화수소 및 ｏ-페닐렌디아민을 함유한 기질용액을 가한 후, 어두운 방에서 10분 동안 반응시킨다. 5N H2SO4(50μl)를 가하여 반응을 중단시킨다. 퍼옥시다제-접합 염소 항-인간 Ig 항체가 마이크로타이터 플레이트에 남아 있을 때, 즉 항체에 결합된 인간 Ig가 남아 있을 때, 490nm에서 흡광도를 갖는 황색 기질 반응 생성물이 생성된다. 생성물의 양을 흡광계에 의해 측정하여 하이브리도마 배양 상층액에 포함된 인간 Ig의 양을 결정한다. 하이브리도마 배양 상층액에 인간 Ig가 존재하지 않을 때, 퍼옥시다아제-접합 염소 항-인간 Ig 항체는 세척 단계에서 세척되어 없어진다.
상기의 측정 방법을 사용함으로써, 5개의 하이브리도마 클론 중 3개가 항체를 생산한다는 것을 알 수 있다. 인간 IgA를 생산하는 클론은 TOH/B9으로 명명하고, 인간 IgG를 생산하는 클론을 TOH/D5로 명명한다.
4주 후, 각 하이브리도마를 24-웰 마이크로타이터 플레이트에 웰당 2ml의 비율로 접종하고, 배양을 1주일 동안 더 계속한다. 배양 상층액을 수거하고, 각종 세포주 또는 암 조직에 대한 인간 하이브리도마로부터 생산된 Ig의 특이성을 시험한다(고정된 특성을 갖는 Ig 또는 특이적 특성을 갖는 Ig). 그 방법은 하술 한다.
DF 배지(DME : F-12=1 : 1)에 10％ 소 태아 혈청을 가함으로써 제조된 배지에서 각종 세포주(ATCC로부터 이용)를 배양한다. 세포의 수가 5×106내지 1×107에 도달했을 때, 트립신을 사용하여 페트리접시의 바닥으로부터 세포를 제거하고, 원심 분리에 의해 세포를 수거하여 배양배지로 잘 세척한다. 일정한 수(105/100μl의 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 주사하고, 37℃에서 밤새 유지하여, 이들을 플레이트에 흡착시킨다. 3％ 글루타르알데히드 용액(50μ1)을 적가 하고, 37℃에서 20분간 유지하여 세포를 고정시킨다. 세포를 원심분리방법(200G, 10분)에 의해 제거하고, 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척한다. 1％ 소 혈청 알부민 용액(200μl)을 적가하고, 37℃에서 1시간 동안 유지하여, 플레이트에 흡착시킨다. 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척하여 흡착되지 않은 물질을 제거한다. 분석용액(배양 상층액)을 세포에 50μl의 양으로 적가 하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척하고, 이어서 퍼옥시다제-접합 항-인간 Ig 항체 50μl를 적가 한후, 37℃에서 30분 동안 반응시킨다. 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척한다. 세포에 결합된 배양액중의 인간 Ig의 양을 효소-표지화 항체 기술에 따라 상술한 방법에 의해 측정하고, 세포주에 대한 그의 특이성을 검사한다.
더욱이, 포르말린으로 고정되어 파라핀에 봉매 된 암조직의 슬라이스를 에탄올 용액으로 처리하여 파라핀을 제거하고, 분석용액(배양 상층액)을 가한 후, 하이브리도마에 의해 생산된 Ig의 특이성을 벡타레보레토리즈사의 시판 키트 ＂벡타스타인 ABC 키트(Vectastain ABC kit)＂를 사용하여 검사한다. 그 결과, TOH/B9에 의해 생산된 IgA가 인간 간암으로부터 유도된 세포주 PLC/PRF/5(ATCC CRL 8024)에 대해 결합력을 가짐이 발견되었다. TOH/D5에 의해 생산된 IgG는 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포) 또는 인간 간암 조직에 대해 결합력을 가짐이 발견되었다.
이것은 공여 B세포가 간암 환자로부터 얻어지기 때문에, 세포 융합에 의해 생산된 자가 복제성을 갖는 하이브리도마의 클론은 공여 B세포와 같은 특성 및 특이적 항원 결합 부위를 갖는 단클론성 항체를 생산한다는 것을 나타낸다.
더욱이, 세포 융합에 의해 수득된 세포가 하이브리도마라는 것을 확인하기 위해 세포의 DNA 함량을 하기의 방법에 의해 검사한다.
세포 배양액을 원심분리 튜브에 넣고, 원심분리 처리한 후, 상층액을 제거한다. 세포를 70％ 에탄올 용액으로 4℃에서 30분 이상 고정시킨다. 상층액을 원심분리 처리에 의해 제거하고, RNase의 용액을 가한다. 혼합물을 서서히 진탕하여 RNA를 분해한다. 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 반응 혼합물을 증류수로 2번 세척한다. 피리피듐 요오다이드(PI)를 가하고, 세포를 실온에서 20분 동안 염색한다. 이들을 증류수로 2번 세척하고, 증류수로 희석한다. 세포 분류기에 의해 분석하면 TOH/D5 및 TOH/D9 모두에게 DNA의 함량이 모 인간 B세포(HIH/TO1)의 DNA 함량의 약 2배라는 것이 나타난다. 그러므로, 이들 세포는 하이브리도마라는 것을 알 수 있다.
3주후, 하이브리도마의 배양 배치로부터, HATO를 제거하고, 하이브리도마를 RDF 및 10％ 소 태아 혈청으로 구성도니 배지에서 배양한다. 1.0×106세포가 배지에서 성장할 때 TOH/B9은 약 1.3μg/ml의 인간 IgA를 생산하며, TOH/D5는 약 0.15μg/ml의 IgG를 생산한다.

Claims (11)

  1. 간암 환자로부터 얻은 인간 B세포 및 인간 임파아세포주의 서브클론으로부터 유도된 인간/인간 융합 세포주에 의해 생산된 항원-특이적 인간 면역 글로불린.
  2. 제1항에 있어서, 인간/인간 융합 세포주가 인간/인간 하이브리도마 TOH/B9인 항원 특이적 인간 면역 글로불린.
  3. 제1항에 있어서, 인간/인간 융합 세포주가 인간/인간 하이브리도마 TOH/D5인 항원 특이적 인간 면역 글로불린.
  4. 인간/인간 하이브리도마 TOH/B9에 의해 생산된 하기의 생화학적 특성을 갖는 항원 특이적 인간 면역 글로불린.
    (a) 인간 면역 글로불린 A(IgA)이다.
    (b) 인간 간암에서 유도된 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포)에 대한 결합성을 나타낸다.
  5. 인간/인간 하이브리도마 TOH/D5에 의해 생산된 하기의 생화학적 특성을 갖는 항원 특이적 인간 면역 글로불린 :
    (a) 인간 면역 글로불린 G(IgG)이다.
    (b) 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포) 또는 인간 간암 조직에 대한 결합성을 나타낸다.
  6. 간암 환자로부터 얻은 인간 B세포 및 인간 임파아세포주의 서브클론으로부터 유도된 인간/인간 융합 세포주인, 항원 특이적 인간 면역 글로불린을 생산하는 능력을 갖는 인간/인간 하이브리도마.
  7. 제6항에 있어서, 인간/인간 하이브리도마 TOH/B9인 인간/인간 하이브리도마.
  8. 제6항에 있어서, 인간/인간 하이브리도마 TOH/D5인 인간/인간 하이브리도마.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 하기의 세포 생화학적 특성 (1)~(5)을 갖는 인간/인간 하이브리도마.
    (1) 인간 면역 글로불린 A(IgA)를 분비(생산)한다.
    (2) 약 37시간의 배가 시간을 갖는다.
    (3) 정상 인간 임파구보다 약 2배 많은 DNA 함량을 갖는다.
    (4) 상기 (1)에서 설명된 IgA는 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포)(인간 간암에서 유도)에 대한 결합성을 나타낸다.
    (5) 히포크산틴, 아메토프테린, 티미딘 및 와바인을 함유한 배지에서 분할 및 증식될 수 있다.
  10. 제6항 또는 제8항에 있어서, 하기의 세포 생화학적 특성 (1)~(5)을 갖는 인간/인간 하이브리도마.
    (1) 인간 면역 글로불린 G(IgG)를 분리(생산)한다.
    (2) 약 37시간의 배가 시간을 갖는다.
    (3) 정상 인간 임파구보다 약 2배 많은 DNA 함량을 갖는다.
    (4) 상기 (1)에서 설명된 IgG는 인간 세포주 PLC/PRF/5(알렉산더 세포) 또는 인간 간암 조직에 대한 결합성을 나타낸다.
    (5) 히포크산틴, 아메토프테린, 티미딘 및 와바인을 함유한 배지에서 분할 및 증식될 수 있다.
  11. 제6항의 하이브리도마를 배양 배지에서 배양하고, 배양 브로쓰로부터 항원-특이적 인간 면역 글로불린을 회수함을 특징으로 하는 항원 특이적 인간 면역 글로불린의 제조 방법.
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