JPH05268988A - ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽
球細胞株のサブクローンとのヒト／ヒト融合細胞株が生
産した抗原特異的ヒト免疫グロブリン。 【効果】 該免疫グロブリンは、ヒト癌への作用抗体、
癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅等に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、免疫グロブリン生産能を有する
ヒトＢ−セルと免疫グロブリン生産能を実質的に欠損し
ているヒトＢ−セルとの新しいタイプのヒト／ヒト融合
細胞クローンが生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリン
に関する。

【０００２】更に詳しくは、本発明は、ヒト肝癌患者の
ヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンと
のヒト／ヒト融合細胞株であって抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマが生
産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンに関する。

【０００３】該抗原特異的免疫グロブリンは、例えばヒ
ト肝癌などの予防、治療、診断の如き医学及び薬学分
野、生化学的試薬、生体高分子の精製試薬などの薬学分
野、さらには、癌抗原の精製などの生化学的分野の研究
等の広い分野において有用である。

【０００４】従来、癌その他の抗原によって感作された
マウスＢ−セルと骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｍａ）マウ
スからのマウスＢ−セルとの融合細胞をマウス体外で形
成し、上記抗原に対するマウス免疫グロブリン生産能を
有し、且つ自己増殖性を有するマウス／マウス融合細胞
を形成した報告は知られている［例えば、ケーラ・ジ
ー、ミルスタイン・シー、ネイチャ（Ｋｏｅｈｌｅｒ
Ｇ．，ＭｉｌｓｔｅｉｎＣ．，Ｎａｔｕｒｅ）、２５
６、４９５（１９７５）；デイポールド・イー・ジー、
ロイド・ケー・オー、リー・エル・ティー・シー、イケ
ダ・エイチ、エットゲン・エイチ・エフ、オールド・エ
ル・ジェイ、プロシーディング オブ ナショナル ア
カデミイ オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド
ステートオブ アメリカ（Ｄｉｐｐｏｌｄ，Ｅ．
Ｇ．，Ｌｌｏｙｄ，Ｋ．Ｏ．，Ｌｉ，Ｌ．Ｔ．Ｃ．，Ｉ
ｋｅｄａ，Ｈ．，Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｈ．Ｆ．＆ Ｏｌ
ｄ，Ｌ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ）、７７、６１１４（１９８０）；等］。

【０００５】また、抗原によって感染されたヒトＢ−セ
ルと骨髄性白血病マウスからのマウスＢ−セルとの融合
細胞を体外で形成し、上記抗原に対するヒト免疫グロブ
リン生産能を有し且つ自己増殖性を有するヒト／マウス
融合細胞を形成した報告も知られている［例えばシュロ
ーム・ジェイ、ワンダーリッヒ・デイー、アンド テラ
モト・ワイ・エイ プロシーディング オブ ナショナ
ル アカデミイ オブサイエンス オブ ザ ユナイテ
ッド ステート オブ アメリカ（Ｓｃｈｌｏｍ
Ｊ．，Ｗｕｎｄｅｒｒｉｃｈ Ｐ．，ａｎｄ Ｔｅｒａ
ｍｏｔｏ Ｙ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）、７７（１１）、６８４１（１９８
０）］。

【０００６】しかしながら、ヒト免疫グロブリン生産能
を有する融合細胞を取得しようという上記後者の試みに
おいては、経時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グ
ロブリン生産能が、経時的に喪失し、免疫グロブリン生
産能が極めて不安定である致命的な欠陥を有する。

【０００７】ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／
ヒト融合細胞を形成する試みとして、抗原としてハシカ
・ビールス又はハプテン（ｈａｐｔｅｎ）［２，４−ジ
ニトロフェニル］によって感作されたヒトＢ−セルをド
ナーとして使用し、これと骨髄性白血病患者からのヒト
免疫グロブリン生産能を有するセルライン（ヒトＢ−セ
ル、親株）との融合細胞をヒト体外で形成し、上記抗原
に対するヒト免疫グロブリン生産能を有し、且つ自己増
殖性を有するヒト／ヒト融合細胞を形成した報告が知ら
れている［例えば、クロッチェ・シー・エム、ライネン
バッハ・エイ、ホール・ダブリュ、ステプレスキー・ゼ
ット、コプロウスキー・エイチ、ネイチャー（Ｃｒｏｃ
ｅ，Ｃ．Ｍ，Ｌｉｎｎｅｎｂａｃｈ，Ａ．，Ｈａｌｌ，
Ｗ．，Ｓｔｅｐｌｏｗｓｋｉ，Ｚ ＆ Ｋｏｐｒｏｗｓ
ｋｉ，Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ、２８８、４８８（１９８
０）；オルソン・エル、カプラン・エイチ・エス、プロ
シーディング オブ ナショナル アカデミイ オブ
サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステート オブ
アメリカ（Ｏｌｓｓｏｎ，Ｌ ＆ Ｋａｐｌａｎ，
Ｈ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．）、７（９）、５４２９（１９８０）；等］。

【０００８】しかしながら、上述の方法のうちマウス／
マウスハイブリドーマを用いる方法は、マウスの免疫グ
ロブリンを作製する方法であり、また、マウス／ヒトハ
イブリドーマを用いる方法は、マウス由来の生産物が細
胞培養中に生成することは避けられないし、さらにヒト
染色体の欠失に伴いヒト免疫グロブリン生産の消失が起
こる場合もある。これがヒト／ヒト融合細胞から採取さ
れるヒト型免疫グロブリンの生産が望まれる理由であ
る。しかしながら、上記のヒト／ヒトハイブリドーマか
ら生産されるヒト免疫グロブリンに関する報告は癌細胞
に対する結合性についてはなんら実証例を提示していな
い。とくに肝癌細胞及び肝癌組織への結合性についての
記載はない。

【０００９】本発明者らの一人によって、ヒト子宮癌患
者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロー
ンとのヒト／ヒト融合細胞株であって抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマ
が創造された（特開昭５９−１３７４９７号公報）。そ
して、該免疫グロブリンは子宮頸部偏平上皮癌細胞、該
細胞由来の株化細胞Ｈｅｌａ及びＣａｓｋｉに対し、正
常繊維芽細胞（ＷＩ−３８）に対する結合力に比してよ
り強い結合力を示したことが報告された。しかしなが
ら、ヒト肝癌細胞、ヒト肝癌組織などへの結合性に関し
ては言及していない。

【００１０】又、特開昭６１−４４９００号公報には、
膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原に対して特異的に反
応するモノクローナル抗体に関して記載され、それを生
産する融合細胞は、抗体産生細胞と骨髄細胞の融合によ
って得られるが、それらは同種動物由来のものであるこ
とが好ましいと記載されている。しかしながら、この提
案において具体的に開示されているのはマウス／マウス
融合細胞株のみである。

【００１１】更にまた、特開昭６１−１６７６９９号公
報、特開昭６２−３６３９８号公報には、食道癌、肺
癌、胃癌、肝癌に対して特異的に反応するモノクローナ
ル抗体に関して記載され、それを生産する融合細胞は、
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合によって得られるが、
この提案において具体的に開示されているのはマウス／
マウス融合細胞株のみである。さらにここで肝癌細胞と
の結合性について具体的に示された例では、マウス／マ
ウス融合細胞株についてのヒト肝癌細胞（ＨＥＫ）に対
する結合性のみしか示されておらず、他の肝癌細胞やヒ
ト肝癌組織との結合性については全く言及されていない
し且つヒト／ヒトハイブリドーマ株の生産するモノクロ
ーナル抗体及びそのヒト肝癌細胞もしくは組織に対する
結合性については、何も示されていない。

【００１２】本発明者等は、ヒト／ヒトハイブリドーマ
の創製研究を行ってきた。その結果、ヒト肝癌患者のヒ
トＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとの
ヒト／ヒト融合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマの創
製に成功した。

【００１３】本発明の該ヒト／ヒトハイブリドーマの一
種は、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルの免疫学的形質を有
し且つそのような形質を安定に持続し得ること及び該ヒ
ト／ヒトハイブリドーマは、ヒト免疫グロブリンＡ（Ｉ
ｇＡ）生産能を有し且つ生産された抗体はヒト肝癌細胞
に結合性を示す抗原特異的モノクローナル抗体であるこ
とを発見し且つそのような抗原特異的ヒト免疫グロブリ
ンの製造に成功した。また更に、上記の新しいタイプの
ヒト／ヒトハイブリドーマは、ヒト肝癌患者のヒトＢ−
セルを含有するヒト細胞群とヒトリンパ芽球細胞株のサ
ブクローン［ヒトＢ−セル］を含有するヒト細胞群と
を、人間体外で融合してヒトＢ−セルとヒトＢ−セルと
の融合細胞を産生し、常法のＨＡＴＯ培地中で培養して
融合細胞クローンを取得することにより産生できること
を発見し且つそのような手段で上記ヒト／ヒトハイブリ
ドーマ（たとえば、ＴＯＨ／Ｂ９）を創製することに成
功した。

【００１４】また更に、本発明の該ヒト／ヒトハイブリ
ドーマの他の一種は、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルの免
疫学的形質を有し且つそのような形質を安定に持続し得
ること及び該ヒト／ヒトハイブリドーマはヒト免疫グロ
ブリンＧ（ＩｇＧ）生産能を有し且つ生産されたこれら
の抗体はヒト肝癌組織のホルマリン固定後パラフィン包
埋切片に結合性を示す抗原特異的モノクローナル抗体で
あることを発見し且つそのような抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンの製造に成功した。

【００１５】更に、上記の新しいタイプのヒト／ヒトハ
イブリドーマは、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルを含有す
るヒト細胞群とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
［ヒトＢ−セル］を含有するヒト細胞群とを、人間体外
で融合してヒト−Ｂ−セルとヒトＢ−セルとの融合細胞
を産生し、常法のＨＡＴＯ培地中で培養して融合細胞ク
ローンを取得することにより産生できることを発見し且
つそのような手法で上記ヒト／ヒトハイブリドーマ（例
えば、ＴＯＨ／Ｄ５）を創製することに成功した。

【００１６】従って、本発明の目的はヒト肝癌患者のヒ
トＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン［ヒ
トＢ−セル］とのヒト／ヒト融合細胞株であって、抗原
特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒトハ
イブリドーマを提供するにある。

【００１７】本発明の他の目的は、上記ヒト／ヒトハイ
ブリドーマを用いて、ヒト肝癌細胞或いはヒト肝癌組織
などに結合性を示す癌関連抗原特異的ヒト免疫グロブリ
ン（モノクローナル抗体）を製造する方法及び該ヒト免
疫グロブリンを提供するにある。

【００１８】本発明の上記目的及び更に多くの目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるであろ
う。

【００１９】本発明のヒト／ヒトハイブリドーマは、ヒ
ト肝癌患者のヒトＢ−セル、たとえば該患者の血中、リ
ンパ節、脾臓、骨髄などから得ることができるヒトＢ−
セルと、ヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン［ヒトＢ
−セル］、たとえばＨＩＨ／ＴＯ１株（微工研寄託拒否
通知書通知番号、６０微寄文第１１９８号―微工研条寄
第１８８４号）とのヒト／ヒト融合細胞株であって、ヒ
ト肝癌細胞或いはヒト肝癌組織などに結合性を示す抗原
特異的ヒト免疫グロブリン生産能（モノクローナル抗体
生産能）を有する。

【００２０】本発明者等の研究により、ヒト肝癌患者の
ヒトＢ−セルを用い、これを免疫グロブリン生産能を実
質的に欠損しているヒトリンパ芽球細胞株のサブクロー
ン［ヒトＢ−セル］と人間の体外で融合させ、肝癌など
の癌関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン生
産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマが初めて産生さ
れた。

【００２１】この融合細胞を産生する融合操作はそれ自
体は、公知の如何なる方法で行ってもよい。例えば、融
合操作は液媒中で融合促進剤の存在下に、ヒト肝癌患者
のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン
とを接触させることにより行なうことができる。

【００２２】この際、融合操作を行なうに先立って、ヒ
ト肝癌患者のヒトＢ−セルを、ヒトＢセル増殖因子（ヒ
トＢＣＧＦ；Ｂ−Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏ
ｒ）及び抗ヒトＩｇＭ抗体（ａｎｔｉ−μ）の存在下で
予備培養処理することが望ましい。予備培養処理は、た
とえば、上記ヒトＢＣＧＦ及びａｎｔｉ−μを含有する
適当な基礎培地やその改質培地を利用し、たとえば５％
ＣＯ₂雰囲気下で約３７℃±３℃の如き条件下、約５〜
約７日の培養条件で行なうことができる。利用する基礎
培地やその改質培地の例としては、特開昭６２−５１９
８３号公報に例示されているような公知の基礎培地及び
その改質培地を挙げることができる。また、それ自体公
知の他の培地用成長因子、アミノ酸類、ビタミン類もし
くはミネラル類、該酸誘導体類、糖類、補酵素類、脂肪
酸類を更に含有することができる。上記ヒトＢＣＧＦ及
びａｎｔｉ−μは市場で入手可能であり、その調製法も
知られており、前者については例えば、ＡＢＢＹ ＭＡ
ＩＺＥＬ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．７９、５９９８−６００
２（１９８２）に、又、後者については、例えば「免疫
化学」（右田俊介編）中山書店（１９７２）ｐ５１−６
３に記載されている。その使用量は実験的に容易に選択
できるが、たとえば培地容量に対して約５〜約２０容量
％のヒトＢＣＧＦ及び約５〜約１００μｇ／ｍｌ−培地
のａｎｔｉ−μの如き使用量を例示できる。

【００２３】本発明において、融合細胞を産生する融合
操作それ自体は、たとえば、溶媒中で融合促進剤の存在
下にヒト肝癌患者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞
株のサブクローンを接触させることにより行なうことが
できる。このような融合方法の例としては、仙台ビール
ス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコールなどの融合促進
剤を用いる方法や高電圧で電気的に融合する方法などを
例示することができる。

【００２４】例えば、水性媒体中、上記例示の如き融合
促進剤の存在下、所望によりおだやかな撹拌を加えて系
を均一にし、次いで、前記ヒトＢ−セルの１個と前記サ
ブクローン（ヒトＢ−セル）の１個から成る融合細胞が
産生される時間、たとえば数分間のオーダーで静置する
ことにより、所望の融合細胞が産生できる。溶媒の例と
しては、水、生理食塩水、５％ジメチルスルホキシド水
溶液、５％グリセロース水溶液などを例示することがで
きる。

【００２５】所望の融合細胞が産生された系を、例え
ば、遠心分離して細胞群を採取し、再び適当な培地に、
たとえば１０％仔牛もしくは牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−
１６４０液体培地中にＨＡＴＯ試薬を加えた培地に、採
取した該細胞群を分散させ、この分散液を例えばマイク
ロ・タイター・プレートの穴に、それぞれ一定量づつ分
取注入し、例えば、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃で培養
を行なうことができる。上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に
代えて、ＲＰＭＩ−１６４０：ＤＭＥ；Ｆ−１２＝２：
１：１の混合培地（ＲＤＦ）を利用することもできる。
各穴中の培養液を例えば３日毎に新しい培養液と取りか
え、例えば２週間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細
胞の有無を調べ、コロニーの認められた試料の培養液を
採取し、ヒト免疫グロブリンの有無を例えば¹²⁵Ｉを用
いたラジオ・イムノ・アツセイや酵素抗体法により検出
することができる。

【００２６】このようにして、ヒト免疫グロブリンの生
産の認められたコロニーを、新しい培養液に移して培養
し、融合細胞を増殖させることにより融合細胞クローン
を取得することができる。更に、必要に応じてサブ・ク
ローニングして、所望のヒト肝癌などの癌関連抗原に特
異的に結合するヒト免疫グロブリン生産性クローンを得
ることができる。

【００２７】この態様の実施に際しては例えば下記文献
により公知の手法を利用することができる。グラッシイ
・エム・シー・ハンドレイ・エイチ・エイチ、ハギワラ
・エイチ，アンド ロイストン・アイ，プロシーディン
グ オブ ナショナル アカデミイ オブ サイエンス
オブ ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ
（Ｇｌａｓｓｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｈａｎｄｌｅｙ，Ｈ．
Ｈ．，Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｒｏｙｓｔｏ
ｎ，Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．），８０，６３２７（１９８３）及び「酵素抗
体法」（編集渡辺慶一）学際企画ｐ３３−１１８（１９
５６）。

【００２８】たとえば、上記文献に記載の手法を利用し
て、健康なヒト脾臓からバイオプシー（Ｂｉｏｐｓｙ）
により、リンパ芽球、骨髄性白血病患者のリンパ球など
の如きリンパ系細胞をとり、その中の免疫グロブリン生
産能を実質的に有しないＢセルリンパ球を選別分離し、
たとえば６−チオグアニン及びウワバイン耐性でＨＡＴ
Ｏ培地中では死滅する感受性を有するヒトＢ−セルを得
ることができる。例えば後記実施例で利用したヒトＢセ
ルＨＩＨ／ＴＯ１は、後記参考例１に示したように、上
記リンパ芽球を用いて６−チオグアニン、ウワバイン含
有培地で培養して得ることができる。

【００２９】前述の手法により、ヒト肝癌患者のヒトＢ
−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンＨＩＨ／
ＴＯ１株［微工研究寄託受託拒否通知書通知番号：６０
微寄文第１１９８号］から産生された抗原特異的免疫グ
ロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ（Ｈｕｍａｎ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）ＴＯＨ／Ｂ９［微工研寄託受託
拒否通知書通知番号：６２微寄文第５号―微工研条寄第
１８８３号］及びＴＯＨ／Ｄ５［微工研寄託受託拒否通
知書通知番号：６２微寄文第６号―微工研条寄第１８８
２号］の細胞生化学的性質を以下に示す。

【００３０】ヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＨ／Ｂ９ （１）ヒト免疫グロブリン（ＩｇＡ）分泌（生産）、
（２）倍加時間（ダブリング・タイム）約３７時間、
（３）ＤＮＡ含量が正常ヒトリンパ球の約２倍、たとえ
ば１．５〜２．５倍、（４）上記（１）のＩｇＡはヒト
株化細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ
ｃｅｌｌｓ）（肝癌）に対して結合性を示す、（５）Ｈ
ＡＴＯ含有培地（ヒポキサンチン、アメソプテリン、チ
ミジン、ウワバイン含有培地）中で分裂増殖可能であ
る。

【００３１】ヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＨ／Ｄ５ （１）ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分泌（生産）、
（２）倍加時間（ダブリング・タイム）約３７時間、
（３）ＤＮＡ含量が正常ヒトリンパ球の約２倍、たとえ
ば１．５〜２．５倍、（４）上記（１）のＩｇＧはヒト
肝癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片に対して
結合性を示す、（５）ＨＡＴＯ含有培地（ヒポキサンチ
ン、アメソプテリン、チミジン、ウワバイン含有培地）
中で分裂増殖可能である。

【００３２】尚、相対ＤＮＡ含量（正常ヒトリンパ球の
ＤＮＡ含量に対する比率）は、ハイブリドーマをプロビ
ジュウムアイオダイドで染色したのち、ｆｌｏｗ ｃｙ
ｔｏｍｅｔｅｒで分離分析する方法によって決定され
た。

【００３３】本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリン
は、ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞
株のサブクローン［ヒトＢ−セル］とのヒト／ヒト融合
細胞株であって抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を
有する細胞株を培地に培養し、その培養物より抗原特異
的ヒト免疫グロブリンを採取することにより製造でき
る。

【００３４】例えば前述のようにして産生できるヒト／
ヒトハイブリドーマを適当な培地、たとえば１０％仔牛
血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、培養液を採
取することによりヒト肝癌などのガン関連抗原に特異的
に結合する免疫グロブリン含有物質を得ることができ
る。上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に際して、無
血清培地を用いることもでき、得られる免疫グロブリン
の精製が容易となるので有利である。このような無血清
培地の例として、同一出願人の出願に係わる特開昭６２
−５１９８３号公報（特願昭６０−１９２１４５号）に
提案された無血清培地を挙げることができる。更に、所
望により精製して精製免疫グロブリンとすることもでき
る。精製はたとえば、硫安分画法、アフィニティークロ
マトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、電気泳動法などの如き生体液から免疫グロブリン
を採取、精製する際に利用できると同様な精製手段を適
宜に利用することができる。

【００３５】本発明によれば、前述した融合細胞クロー
ンまたはその培養液からヒト肝癌などのガン関連抗原に
特異的に結合するヒト免疫グロブリン含有物質又は該免
疫グロブリンを取得するに際し、抗原性組織（例えば癌
組織）を一度、免疫物質生産能を欠如するかもしくは極
めて弱い生体例えばヌード・マウス（ｎｕｄｅ ｍｏｕ
ｓｅ）等に植えつけ組織を維持した後、その組織に対し
て或いは、培養系にもどされた組織に対して反応するヒ
ト免疫グロブリン（抗体）を探し出し、これを分離する
のが有利である。

【００３６】上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に利
用できる培地の他の例としては、１０％ウシ胎児血清含
有ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｄｕｌｂｅｃｏ培地及びＨ
ＡＭ培地の三者混合培地（混合比２：１：１）であるＲ
ＤＦ培地、及びトランスフエリン、インシュリン、亜セ
レン酸ナトリウム、エタノールアミン並びにβ−メルカ
プトエタノール添加のＲＤＦ培地などを例示することが
できる。また、培養条件としては、たとえば５％ＣＯ₂
の存在下、３７℃の条件を例示できる。

【００３７】上述のようにして得ることのできる本発明
のガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリンの例として、
前述したヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＨ／Ｂ９或いは
前述したヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＨ／Ｄ５を用い
て得られる本発明グロブリンを例示できる。その特性を
以下に示す。

【００３８】ヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＨ／Ｂ９の
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン： （イ）ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）であって、
（ロ）ヒト株化細胞ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）（肝癌）に対して結合力を有す
る、（ハ）分子量約６万のＨ鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉ
ｎ）、分子量約２万のＬ鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）
を含有する。

【００３９】ヒト／ヒトハイブリドーマＴＯＨ／Ｄ５の
生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン： （イ）ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であって、
（ロ）ヒト肝癌組織に対して結合性を示す、（ハ）Ｈ鎖
（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）及びＬ鎖（ｌｉｇｈｔ ｃ
ｈａｉｎ）より成り、分子量が約１５万である。

【００４０】上記ヒト株化細胞ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（Ａ
ｌｅｘａｎｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）（肝癌）は、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ ８０２４としてＡＴＣＣ（アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション）から自由に入手するこ
とができる。

【００４１】本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリン
は、たとえばヒト肝癌の如き、ヒト癌への作用抗体或い
はそれ自体の作用でこれら癌細胞の増殖抑制、癌細胞の
死滅を行わせたり、ヒト体外で量産されたこれらの癌組
織認識抗体に補体もしくは、Ｔ−リンパ球の助けをかり
て癌細胞の増殖抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせたり
することができる。更にまた、ヒト体外で量産された癌
特異的抗体をキャリヤーとして利用して例えば化学療法
剤結合−ヒト・モノクローナル抗体、インターフェロン
結合−ヒトモノクローナル抗体、高分子毒素結合−ヒト
・モノクローナル抗体、薬物入りリポゾーム結合−ヒト
・モノクローナル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制や死
滅のはたらきをさせたりするのに有用である。また、本
発明方法で得られるヒト・モノクローナル抗体をキャリ
ヤーとして利用し、これに放射線感受性物質を結合させ
て患者に投与し、癌細胞に選択的に集まる性質を利用し
て患部を検知し放射線療法に利用することができる。こ
のような癌に対する利用に際しては、ヒト・モノクロー
ナル抗体として完全な抗体を用いてもよいし、抗体を化
学的な手法で特異的抗原認識部位を含むより小さな分子
に切断して用いたり、或いは、そのような小さな分子も
しくは特異的抗原認識部位のみを他の抗体の非特異的抗
原認識部分と結合させて、より有効性のある修飾ヒト・
モノクローナル抗体を化学的手法で創製して用いること
もできる。

【００４２】以下、実施例により本発明方法、実施の一
態様をさらに詳しく述べる。

【００４３】

【実施例】

参考例１ ヒトＢセル・リンパ芽球細胞株ＨＩＨ／ＴＯ１。

【００４４】ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＷＩ−Ｌ２
（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：６０微寄文第
１６２１号）を、基礎培地ＲＤＦ中にインシュリン、ト
ランスフェリン、セレニウム、エタノールアミン、β−
メルカプトエタノール及び牛血清アルブミンの適量を含
有する無血清培地で培養適応させる。該無血清培地を分
注した９６穴マイクロタイタープレートに１ｃｅｌｌ／
ｗｅｌｌとなるように植えこみ、５％ＣＯ₂、３７℃の
条件下で限界希釈法によりクローニング操作を行なう。
約１ケ月経過後、増殖してきた５０穴より免疫グロブリ
ンＩｇＧ及びＩｇＭを実質的に培地中に生産していない
クローンを１つ選び出した。

【００４５】このクローンを、まず０．１μＭの６−チ
オグアニンを含む前記と同様な無血清培地中で培養適応
させる。培養は５％ＣＯ₂、３７℃の条件下で、継代培
養をくり返すごとに、６−チオグアニン濃度を０．２μ
Ｍ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭ、１０μＭ、
１５μＭ、２０μＭと段階的に上げて行ない、最終的に
２０μＭの６−チオグアニン含有無血清培地中で増殖可
能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法によるクロ
ーニング操作で選別する。

【００４６】この細胞を、１μｇ／ｍｌの突然変異剤Ｍ
ＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン）を含有する基礎培地ＲＤＦ中で、５％ＣＯ₂、
３７℃の条件下で３時間培養した後、前記と同様な無血
清培地で洗浄し、洗浄した細胞を２０μＭの６−チオグ
アニン及びウワバインを含む前記と同様な無血清培地中
で培養適応させる。培養は５％ＣＯ₂、３７℃の条件下
で、継代培養をくり返すごとに、ウワバインの濃度を
０．１μＭ、０．２μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ
と段階的に上げて行ない、最終的に２０μＭの６−チオ
グアニン及び５μＭのウワバインを含む無血清培地中で
増殖可能な単クローンを、前記と同様な限界希釈法によ
るクローニング操作で選別し、ＨＩＨ／ＴＯ１株を得
た。

【００４７】実施例１ 肝癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手し
た。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ、内部のリン
パ球を培地ＲＤＦ（ＲＰＭＩ１６４０：ＤＭＥ：Ｆ−１
２＝２：１：１）中に分散させ、続いて２重のガーゼを
用いて、濾過を行い、脂肪層を除いた後に、濾液中の細
胞（リンパ球＞８０％）を遠心法によって集める［ヒト
Ｂ−セルドナーを含むヒトリンパ球分画（ドナーＢ−セ
ル）］。その後、このリンパ球分画を２０％牛胎児血清
および、１０％ジメチルスルホオキサイド（ＤＭＳＯ）
を含むＲＤＦ培地中で凍結（−１３０℃）し、細胞融合
を行う日まで保存した。１．０×１０⁷個のドナーＢ−
セルを５％ヒトＢＣＧＦ（Ｂ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ）（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｓ社製）および２０μｇ／ｍｌヤギ抗ヒト
ＩｇＭ（Ｃａｐｐｅｌ社製）抗体を含有するＲＤＦ培地
で３７℃ ５％ＣＯ₂条件下で培養し、７日後１００
Ｇ、１５分間の遠心処理を行いドナーＢセルを集め、Ｒ
ＤＦ培地で１度洗浄する。

【００４８】その後ドナーリンパ球と免疫グロブリン生
産能を実質的に欠損している親ヒトＢ−セル（ＨＩＨ／
ＴＯ１）のそれぞれを１．０×１０⁷および１．０×１
０⁷個混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００
の存在下に融合を完了させる。その後、３０Ｇ、１５分
間の遠心処理を行ってポリエチレングリコールを除き、
新たに、１０％牛胎児血清および、ヒポキサンチン、ア
メソプテリン、チミジン、ウワバイン（ＨＡＴＯ）を含
むＲＤＦ培地を加える。この細胞群を含む培養液２００
μｌ（この中には１．５×１０⁵個のセルを含む）づつ
を９６個の穴をもつミクロプレートに分注し、約４週
間、３７℃、５％ＣＯ₂条件下のインキュベーターで培
養した。この間、ＨＡＴＯ及び１０％牛胎児血清を含む
ＲＤＦ培地を４〜５日に１度交換した。親Ｂ−セル（Ｈ
ＩＨ／ＴＯ１）はアメソプテリン存在ではヒポキサンチ
ンホスホリボシールトランスフェラーゼを欠損している
ために生きることができない。またリンパ球は通常の培
地たとえばＲＤＦ＋１０％牛胎児血清中では永続的に増
殖し生きのびることができないのに加えてウワバイン存
在下で死滅する。よってＨＡＴＯを含む培地で永続的に
増殖した細胞はリンパ球と親Ｂ−セルの融合した細胞で
ある。４週間培養の後、５個のハイブリドーマが得ら
れ、これらのハイブリドーマがヒト免疫グロブリンを産
出しているかどうかを酵素抗体法を用いて調べた。以
下、その方法を説明する。

【００４９】ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫
グロブリン抗体（抗ヒトＩｇ抗体）を滴下（５０μｌ）
し、３７℃で１時間プレートに吸着させる。０．３％の
ゼラチンを含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ゼラチン緩衝液）で
３回洗浄した後、５％牛血清アルブミン溶液を滴下（２
００μｌ）し、３７℃で０．５時間吸着させる。ゼラチ
ン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する。次に
検液（培養上清）を滴下（５０μｌ）して、３７℃で１
時間反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。ペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体を滴下（５０μｌ）し
て、３７℃で３０分間反応させ、培養上清中のヒトＩｇ
と結合させる（酵素抗体法）。ゼラチン緩衝液で３回洗
浄後、過酸化水素とｏ−フェニレンジアミンを含む基質
溶液を加え、暗室で１０分間反応させる。５Ｎ−Ｈ₂Ｓ
Ｏ₄（５０μｌ）を加えて反応を止める。もしミクロプ
レート上にペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体が
残っている場合、すなわちそれに結合されるヒトＩｇが
残っている場合には４９０ｎｍに吸収をもつ黄色の基質
反応物が生産される。

【００５０】この量を吸光度計を用いて測定し、ハイブ
リドーマ培養上清中に含まれるヒトＩｇの量を知る。ハ
イブリドーマ培養上清中にヒトＩｇが存在しない場合に
は、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト１ｇ抗体は洗浄の
段階で洗い流される。

【００５１】以上の測定方法を用いて結果、５個のうち
３個のハイブリドーマのクローンが抗体を産生してお
り、そのうちヒトＩｇＡを産生するものをＴＯＨ／Ｂ
９、ヒトＩｇＧを産生するものをＴＯＨ／Ｄ５と命名し
た。

【００５２】４週間後にそれぞれのハイブリドーマを２
４個の穴をもつミクロプレート（２ｍｌ／穴）に植え替
えた後、さらに１週間培養を続けた。培養液の上清を採
取、種々の株化細胞或いは癌組織に対するヒトハイブリ
ドーマから生産されるＩｇの特異性を調べた（一定の形
質をもつＩｇまたは特定の形質をもつＩｇ）。その方法
を以下に説明する。

【００５３】ヒトの種々の株化培養細胞（これらはＡＴ
ＣＣより入手可能）をＤＦ培地（ＤＭＥ：Ｆ−１２＝
１：１）に１０％牛胎児血清を加えた培地で培養する。
細胞の数が５×１０⁶〜１×１０⁷になった段階で、トリ
プシンを用いて細胞をシヤーレの底面から剥がし、遠心
法を用いて細胞を集め、培地でよく洗浄する。９６個の
穴を持つミクロタイタープレートの各穴に細胞を一定数
（１０⁵／１００μｌ）ずつ分注し、３７℃で１晩、プ
レートに吸着させる。次に、３％グルタルアルデヒド溶
液を滴下（５０μｌ）し、３７℃で２０分間、細胞の固
定を行う。遠心法（２００ｇ、１０分間）で細胞をおと
し、ゼラチン緩衝液で３回洗浄した後、１％牛血清アル
ブミン溶液を滴下（２００μｌ）し、３７℃で１時間プ
レートに吸着させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未
吸着のものを除去する。その後、検液（培養上清）を細
胞の上に滴下（５０μｌ）し、３７℃で１時間反応さ
せ、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。続いてペルオキシ
ダーゼ結合抗ヒト１ｇ抗体を滴下（５０μｌ）し、３７
℃で３０分間反応させる。ゼラチン緩衝液で３回洗浄を
行った後、先述の酵素抗体法で述べた方法によって細胞
に結合する培養液中のヒトＩｇの量を測定することによ
って株化細胞に対する特異性をみた。又、癌組織をホル
マリン固定後パラフィン包埋した切片をエタノール溶液
を用いて脱パラフィン処理を行った後検液（培養上清）
を加え、市販のキット（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴ
ＯＲＩＥＳ社製「ベクタステインＡＢＣキット」）を用
いてハイブリドーマから生産されるＩｇの特異性をみ
た。以上の結果、ＴＯＨ／Ｂ９の生産するＩｇＡはヒト
肝癌由来の株化細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ８０２４）に対して結合力を有することがわかっ
た。またＴＯＨ／Ｄ５の生産するＩｇＧはヒト肝癌組織
に対して結合力を有することがわかった。

【００５４】すなわち、ドナーＢ−セルは体内に肝癌を
もつ患者から採取されたものであるので、細胞融合法に
よって作り出された自己増殖性をもつハイブリドーマの
クローンからはドナーＢ−セルと同形質のかつ特定の抗
原結合部位をもつモノクローナル（単一）抗体を生産し
ていることを示している。これらが、ハイブリドーマで
あることをさらに確認するために細胞内、ＤＮＡ含量を
調べた。その方法を以下に説明する。

【００５５】遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理に
より上清を除去する。７０％エタノール溶液で４℃３０
分以上固定を行う。遠心処理により上清を除き、ＲＮＡ
分解酵素（ＲＮａｓｅ）溶液を加え、静かに振盪し、Ｒ
ＮＡを分解する。３７℃で３０分間反応させた後、再び
蒸留水で２度洗浄する。プロピジウムイオダイド（Ｐ
Ｉ）を加え、室温で２０分間、染色した後、さらに蒸留
水で２度洗浄する。蒸留水で再希釈し、セルソーターを
用いて分析した結果、ＴＯＨ／Ｄ５、ＴＯＨ／Ｂ９とも
に親ヒトＢ−セル（ＨＩＴ／ＴＯ１）の約２倍量のＤＮ
Ａ含量が認められ、これらの細胞がハイブリドーマであ
ることが確認された。

【００５６】約３週間後に、それぞれのハイブリドーマ
の培地からＨＡＴＯを除きＲＤＦ＋１０％牛胎児血清で
培養を行った。１．０×１０⁶個／ｍｌ細胞が培地で生
育する時、ＴＯＨ／Ｂ９は約１．３μｇ／ｍｌの量のヒ
トＩｇＡを、ＴＯＨ／Ｄ５は約０．１５μｇ／ｍｌのＩ
ｇＧを生産した。また、上記とまったく同じ方法を用い
た結果ＴＯＨ／Ｄ５と同性質をもつＴＯＨ／Ｇ２［微工
研寄託受託拒否通知書通知番号；６２微寄文第７号］が
得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/24 15/07 // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト肝癌患者のヒトＢ−セルとヒトリン
   パ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／ヒト融合細胞株
   が生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンであって、該
   ヒト免疫グロブリンが、 （イ） ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であり、 （ロ） ヒト肝癌組織に対して結合性を示す、 の生化学的性質を有することを特徴とする抗原特異的ヒ
   ト免疫グロブリン。
2. 【請求項２】 該ヒト／ヒト融合細胞株がヒト／ヒトハ
   イブリドーマＴＯＨ／Ｄ５である請求項１記載の抗原特
   異的ヒト免疫グロブリン。