JPH07121221B2 - 抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、免疫グロブリン生産能を異にす
る二種のヒトＢ−セル、とくに、免疫グロブリン生産能
を有するヒトＢ−セル（Ａ）と免疫グロブリン生産能を
実質的に欠損しているヒトＢ−セル（Ｂ）との新しいタ
イプの融合細胞のクローンに関する。該融合細胞クロー
ンにより生産されるヒト免疫グロブリンは、例えば、人
の抗原性病気の予防、治療、診断などの医学及び薬学分
野や生化学的試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学
分野、生化学分野等の如き広い分野に於て有用である。

【０００２】更に詳しくは、本発明は (ａ) 腫瘍患者のリンパ節から採取された、腫瘍由来の
抗原によって感作さ れ且つ該抗原に対して特異的な免疫
グロブリン生産能を有するヒトリンパ球 のヒトＢ−セル
（Ａ）と、 (ｂ) (イ) 適当な培地中で自己増殖性を有し、 (ロ) 特定の試薬の存在下で又は特定の成分の不存在下
で増殖停止又 は死滅する実質的に非可逆的な感受性を有
し、 (ハ) 免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しており、
且つ (ニ) 適当な培地及び培養条件下で単一細胞（シングル
セル）として 増殖可能である 永久分裂能をもつ骨髄様ヒ
トリンパ球のヒトＢ−セル（Ｂ）とのヒト／ヒト融合細
胞株であって抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有
するヒト／ヒトハイブリドーマ に関する。

【０００３】従来、抗原によって感作されたマウスＢ−
セルと骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｍａ）マウスからのマ
ウスＢ−セルとの融合細胞をマウス体外で形成し、上記
抗原に対するマウス免疫グロブリン生産能を有し且つ自
己増殖性を有するマウス／マウス融合細胞を形成した報
告は知られている（例えば、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．２
５６、１９７５年、４９５〜４９７頁：Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．７５、Ｎ
ｏ．７、１９７８年、３４０５〜３４０９頁、等）。
又、抗原によって感作されたヒトＢ−セルと骨髄性白血
病マウスからのマウスＢ−セルとの融合細胞を体外で形
成し、上記抗原に対するヒト免疫グロブリン生産能を有
し且つ自己増殖性を有するヒト／マウス融合細胞を形成
した報告も知られている（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．７７、Ｎｏ．
１１、１９８０年、６８４１〜６８４５頁：Ｔｈｅ ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．
１２５、Ｎｏ．３、１９８０年、１０３７〜１０４３
頁、等）。

【０００４】しかしながら、ヒト免疫グロブリン生産能
を有する融合細胞を取得しようという上記後者の試みに
於ては、経時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グロ
ブリン生産能が経時的に喪失し、免疫グロブリン生産能
が極めて不安定である致命的な欠陥を有する。

【０００５】ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／
ヒト融合細胞を形成する試みとして、抗原としてハシカ
・ビールス又はハプテン（ｈａｐｔｅｎ）［２,４−ジ
ニトロフェニル］によって感作されたヒトＢ−セルをド
ナーとして使用し、これと骨髄性白血病患者からのヒト
免疫グロブリン生産能を有するセル・ライン（ヒトＢ−
セル）（親株）との融合細胞をヒト体外で形成し、上記
抗原に対するヒト免疫グロブリン生産能を有し且つ自己
増殖性を有するヒト／ヒト融合細胞を形成した報告が知
られている（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．２８８、１９８０
年、４８３〜４８３頁：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．７７、Ｎｏ．９、１９８
０年、５４２９〜５４３１頁）。

【０００６】しかしながら、この報文の方法によれば、
後者の親株であるセル・ライン（ヒトＢ−セル）が前者
のドナーであるヒトＢ−セルとは異なるヒト免疫グロブ
リン生産能を有するために、得られるヒト／ヒト融合細
胞は両者のヒトＢ−セルの免疫グロブリン形成を有する
ものの混合体となる。このためにかかるヒト／ヒト融合
細胞から採取される免疫グロブリンは幾つかの形質の免
疫グロブリンの混合体となり、リンパ球（Ａ）と同形質
の免疫グロブリンが一定の特異性形質を維持しながらか
つ単一抗体として産生されることが不可能となる。

【０００７】この結果、例えばリンパ球（Ａ）と同形質
の抗原特異的ヒト免疫グロブリンを用いようとしても、
他の形質の免疫グロブリンが干渉することとなり、目的
とする治療、予防、検査、精製等の遂行が困難となる。

【０００８】その上、上記の報文で用いられた親株であ
るセル・ライン（ヒトＢ−セル）は薬剤感受性が可逆的
であって、感受性を喪失する頻度が高く、一旦このよう
な現象が生じると所望の融合細胞をドナー及び親株とし
て用いたヒトＢ−セルから分離し、採取することが困難
となる。さらに、親株であるセル・ラインの培養中に凝
集塊を形成し易く、その結果融合細胞を産生する確率が
低いという難点もある。

【０００９】本発明者は、ドナーとして用いるヒトリン
パ球のＢ−セル［以下Ｂ−セル（Ａ）ともいう］と同形
質の抗原特異的ヒト免疫グロブリンをその一定の形質を
維持しつつ生産可能のヒト／ヒト融合細胞を産生し、こ
れから単一形質の免疫グロブリンを生産する目的で研究
を行った。

【００１０】その結果、腫瘍患者のリンパ節から採取さ
れた、腫瘍由来の抗原によって感作され且つ該抗原に対
して特異的な免疫グロブリン生産能を有するヒトリンパ
球のヒトＢ−セル（Ａ）と、免疫グロブリン生産能を実
質的に欠損している永久分裂能をもつ骨髄様ヒトリンパ
球のヒトＢ−セル（Ｂ）とを人間の体外で融合すること
により新規なヒト／ヒト融合細胞を産生することができ
ること、そして産生されたこのヒト／ヒト融合細胞は該
ヒトＢ−セル（Ａ）の免疫学的形質を有し且つそのよう
な形質を安定に持続し得ることを発見した。更に、この
新しいタイプのヒト／ヒト融合細胞を効率よく産生する
ことが容易であって、且つ融合細胞形成確率も高く、そ
して体外でヒト免疫グロブリンの大量生産を可能とする
ユニークなヒト／ヒト融合細胞であることを知った。

【００１１】上記の新しい諸知見に基いて更に研究を進
めた結果、本発明によれば、(ａ) 腫瘍患者のリンパ節から採取された、腫瘍由来の
抗原によって 感作され且つ該抗原に対して特異的な 免疫
グロブリン生産能を有するヒトＢ−セル［以下ヒトＢ−
セル（Ａ）ともいう］を含有するヒト細胞群と、 (ｂ) (イ) 適当な培地中で自己増殖性を有し、 (ロ) 特定の試薬の存在下又は特定の成分の不存在下で
増殖停止又は死滅する感受性を有し、且つ (ハ) 免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しており、
且つ(ニ) 適当な培地及び培養条件下で単一細胞（シングル
セル）として増 殖可能である 永久分裂能をもつ骨髄様ヒ
トリンパ球のヒトＢ−セル（Ｂ） ［以下ヒトＢ−セル
（Ｂ）ともいう］を含有するヒト細胞群とを人間の体外
で融合して、ヒトＢ−セル（Ａ）とヒトＢ−セル（Ｂ）
との融合細胞を産生し、得られる融合細胞を、上記
（１）のヒト細胞及び上記（２）のヒト細胞群は増殖停
止又は死滅するが該融合細胞は増殖し得る培地中で培養
して融合細胞クローンを取得し、この融合細胞クローン
からの前記Ｂ−セル（Ａ）と同形質の抗原特異的ヒト免
疫グロブリン含有物質又は免疫グロブリンを採取するこ
とによって、所望の且つ一定の免疫形質を有するヒト免
疫グロブリンを再現性よく取得できることを発見した。

【００１２】かくして、一人の患者から採られたリンパ
球を用いて本発明により生産した抗体がその本人（Ａｕ
ｔｏｌｏｇｏｕｓ）の抗原及びこれと同形質のヒト抗原
に対して特異的に反応することが実験的に判明した。

【００１３】本発明者の知る限り、前記（１）のヒトＢ
−セルをドナーとして用い、これを前記（２）のヒトＢ
−セルの如く免疫グロブリン生産能を実質的に欠損して
いる親株と、人間の体外で、融合してヒト／ヒト融合細
胞を産生させることに成功した例はこれまで全く知られ
ていない。加えて、この融合細胞から生産されるヒト免
疫グロブリンが本人（患者）および本人以外のそれと同
形質の抗原（組織）と特異的に反応することは未だ報告
されていない。

【００１４】しかるに本発明者は前記（１）の適当なヒ
トＢ−セルをドナーとして用い、これを前記（２）の免
疫グロブリン生産能を実質的に欠損しているヒトＢ−セ
ル（親株）と、人間の体外で融合することにより融合細
胞を産生することができること、そして産生された融合
細胞は親株のＢ−セルとは試薬又は培地成分に対する感
受性が異なり、しかもドナーであるＢ−セルは増殖能が
乏しいために之等のＢ−セルと分離することが可能であ
ること、さらに分離された融合細胞を別の培地で培養す
るとその多くのものは増殖が停止し又は死滅するが、そ
の一部には安定に増殖してクローンを形成するものがあ
ること、そしてこのクローンを形成する融合細胞は長期
間継代増殖が可能であることを発見するに至った。

【００１５】従って、本発明の目的は、抗原特異的ヒト
免疫グロブリンを生産することができる新しいタイプの
融合細胞のクローンを提供するにある。

【００１６】本発明に於て、融合細胞の産生に用いる免
疫グロブリン生産能を有するヒトＢ−セル（Ａ）は、腫
瘍患者のリンパ節から採取された、腫瘍由来の抗原によ
って感作され且つ該抗原に対して特異的な免疫グロブリ
ン生産能を有するヒトリンパ球のヒトＢ−セルであるこ
とができる。このようなヒトＢ−セル（Ａ）は人間の体
外では継代的自己増殖性を実質的に有しないものが好ま
しい。

【００１７】本発明に於ては、ヒトＢ−セル（Ｂ）とし
て免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しているヒトＢ
−セル（Ｂ）を用い、ヒトＢ−セル（Ａ）として免疫グ
ロブリン生産能を有するヒトＢ−セル（Ａ）を用いるの
で、これから生産された融合細胞のクローンから上記ヒ
トＢ−セル（Ａ）の生産するヒト免疫グロブリンの形質
を適宜選択することにより、所望の抗原特異的ヒト免疫
グロブリンを生産することができる利点がある。

【００１８】本発明に於て、ヒトＢ−セル（Ａ）は、腫
瘍（殊に癌）細胞によって感作され且つ癌抗原に対して
特異的な免疫グロブリン生産能を有するヒトリンパ節ヒ
トリンパ球のＢ−セルであってもよいし、或は又、採取
されたヒトリンパ球のＢ−セルを、ヒト体外で、例え
ば、増殖性因子によって増殖及び／又は抗原性物質で感
作する、などの手法を利用して得られる免疫グロブリン
生産能が増強されたヒトＢ−セルであってもよい。この
ような増殖性因子の例としては、リポポリサッカライド
類、レクチン類などを例示することができる。

【００１９】上記生産能増強の操作は例えば下記文献に
より知られており、本発明において利用することができ
る。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ、Ｖｏｌ．７７、ｐｐ１１３９−１１４３（１９８
０）Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈｏｆｆｍａｎ；“Ｎａｔｕｒ
ｅ”、Ｖｏｌ．２８２、（１９７９）、Ｒｏｂｉｎ
Ｅ．Ｃａｌｌａｒｄ。好ましい一態様によれば、上記の
如き増殖性因子たとえばＲＰＭＩ−１６４０（１０％仔
牛血清含有）を含有する液体培地で、前記の如き採取源
から分離採取されたヒトＢ−セル（Ａ）を培養し、次い
で該培地に抗原性物質を添加して更に培養してもよい
し、または両者を含む液体培地中で培養してもよい。培
養条件としては、たとえば、３７℃で約５〜７日の如き
条件を例示できる。

【００２０】本発明に於て用いる前記ヒトＢ−セル
（Ｂ）は、下記（イ）〜（ニ）の要件を満足するヒトＢ
−セルであれば如何なるものでもよく、適宜に選択利用
することができる。

【００２１】(イ) 適当な培地中で自己増殖性、好まし
くは倍加時間（ダブリング・タイ ム）が４８時間以内の
自己増殖性を有し、 (ロ) 特定の試薬の存在下又は特定の成分の不存在下で
増殖停止又は死滅する感受性を有し、且つ (ハ) 免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しており、
且つ (ニ) 適当な培地及び培養条件下で単一細胞（シングル
セル）として増殖可 能であること 。

【００２２】上記ヒトＢ−セル（Ｂ）は、適当な採取
源、たとえばヒトリンパ節、ヒトリンパ腺、ヒト脾臓、
ヒト血液、ヒト骨髄などのリンパ球から採取し、又はこ
れをヒト体外で増殖もしくは増殖及び分化したものから
選択することができる。上記（イ）、（ロ）、（ハ）及
び（ニ）の要件を満足するヒトＢ−セル（Ｂ）を直接選
択することができるが、操作上の見地からは、上記
（イ）、（ロ）、（ハ）及び（ニ）の要件中、一つもし
くは二つの要件のみを満足するヒトＢ−セルを最初に採
取し、欠如している他の要件を満足するまで、増殖又は
分化等の処理を施すのが好ましい。

【００２３】例えば、（イ）適当な培地中で自己増殖性
を有し且つ（ハ）免疫グロブリン生産能を実質的に欠損
しているが（ロ）の性質を有しないＢ−セルを採取し、
これに（ロ）特定の試薬の存在下又は特定の成分の不存
在下で増殖停止又は死滅する感受性を、ヒト体外で賦与
することができる。この態様の実施に際しては、例えば
下記文献により公知の手法を利用することができる。Ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｅｄ．Ｍ．Ｓ．
Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ａｎｄ Ｈ．Ｆ．Ｏｅｔｔｇｅｎ
ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８
２）、ｐｐ１２５−１３２。

【００２４】たとえば、上記文献に記載の手法を利用し
て、健康なヒト脾臓からバイオプシー（Ｂｉｏｐｓｙ）
により、リンパ芽球などの如きリンパ系細胞をとり、そ
の中の免疫グロブリン生産能を実質的に有しないＢセル
リンパ球を選別分離し、たとえば６−チオグアニン、８
−アザグアニン、５−ブロモデオシウリジンの如き酵素
変異原含有培地で培養すると、選当な培地中で自己増殖
性を有し、免疫グロブリンを産生せず且つＨＡＴ培地中
では死滅する感受性を有するヒトＢ−セル（Ｂ）を得る
ことができる。例えば、後記実施例で利用したヒトＢセ
ルＵＣ７２９−６は上記リンパ芽球を用いて６−チオグ
アニン含有培地で培養して得ることができる。

【００２５】上記ヒトＢセルＵＣ７２９−６は工業技術
院微生物工業技術研究所長発行の寄託受託拒否通知書を
受けた。

【００２６】又、例えば、（イ）適当な培地中で自己増
殖性を有し、（ロ）及び（ハ）の性質を有しないヒトＢ
−セルを採取し、これに上記と同様な手法で（ロ）の性
質を賦与したのち、それを培養増殖させ、増殖物をそれ
自体公知のサブ・クローニングの手法によりスクリーニ
ングして（ハ）の性質を満足するヒトＢ−セルをえらび
出すことができる。

【００２７】ヒトＢ−セル（Ｂ）の要件（イ）の自己増
殖性は、ヒトＢ−セル（Ａ）とヒトＢ−セル（Ｂ）との
融合細胞に受継がれる形質であるので、できる限り長期
間の自己増殖性、好ましくは実質的に永久的な自己増殖
性を有するヒトＢ−セル（Ｂ）を選択するのが好まし
い。工業的には、少なくとも１００回、より好ましくは
少なくとも２００回、とくには少なくとも５００回以上
の自己増殖を繰りかえすものを選択するのがよい。

【００２８】更に、要件（イ）の自己増殖性に関連し
て、自己増殖の倍加時間（ダブリング・タイム）が約４
８時間以下、更には約２０時間以下であるような自己増
殖性を有するヒトＢ−セル（Ｂ）の利用が好ましい。こ
の倍加時間が小であるという性質も、ヒトＢ−セル
（Ａ）とヒトＢ−セル（Ｂ）との融合細胞に受継がれる
形質であるので、融合細胞のクローンの生産する所望の
ヒト免疫グロブリンの生産量の増大を達成できることに
なる。従って、前記自己増殖性が長期間維持され且つ上
記倍加時間が小であるヒトＢ−セル（Ｂ）を選択するこ
とによって、とくに優れたヒト免疫グロブリンの生産方
法を提供することができる。

【００２９】又、要件（ロ）の特定の試薬の存在下で又
は特定の成分の不存在下で増殖停止又は死滅する感受性
は、後に詳しく述べる所望の融合細胞クローンを取得す
るためのスクリーニングを可能とするために必要な性質
である。上記特定の試薬の例としては、アミノプテリ
ン、アランシン、ウァバインなどを例示することができ
る。

【００３０】上記感受性は、ヒトＢ−セル（Ａ）とヒト
Ｂ−セル（Ｂ）とから産生された融合細胞に於て、可逆
的に要件（ロ）を満足しない状態に戻る所謂“バック・
ミューティション”（復帰突然変異）を生ずる場合があ
るので、本発明においては、特定の試薬の存在下で又は
特定の成分の不存在下で増殖停止又は死滅する非可逆的
な感受性を有するヒトＢ−セル（Ｂ）を選ぶのが有利で
ある。

【００３１】本発明で融合細胞（ハイブリドーマ）を産
生するのに用いる上述のヒトＢ−セル（Ｂ）は、適当な
培地及び培養条件下でシングルセルとして増殖可能なも
の、すなわちセル凝集塊を形成しないことが望ましい。
ヒトＢ−セル（Ｂ）の培地としては、例えば、仔牛血
清、ヒト血清、新生仔牛血清、ウマ血清などの如き血清
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などを例示できる。又、培
養条件としては、例えば、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃
の条件を例示できる。

【００３２】本発明に於いては、上述の如き免疫グロブ
リン生産能を有するヒトＢ−セル（Ａ）を含有するヒト
細胞群と、上述の如き（イ）、（ロ）、（ハ）及び
（ニ）を満足するヒトＢ−セル（Ｂ）を含有するヒト細
胞群とを、人間の体外で融合してヒトＢ−セル（Ａ）と
ヒトＢ−セル（Ｂ）との融合細胞を産生する。

【００３３】この融合細胞を産生する融合操作は公知の
如何なる方法でもよい。融合操作は、液媒中、融合促進
剤の存在下に、ヒトＢ−セル（Ａ）とヒトＢ−セル
（Ｂ）とを接触させて行うことができる。このような融
合促進剤の例としては、仙台ビールス（ＨＶＪ）、ポリ
エチレングリコールなどを例示することができる。例え
ば、水性媒体中、上記例示の如き融合促進剤の存在下、
所望によりおだやかな撹拌を加えて系を均一にし、次い
で、ヒトＢ−セル（Ａ）の１ケとヒトＢ−セル（Ｂ）の
１ケから成る融合細胞が産生される時間、たとえば数分
間のオーダーで静置することにより、所望の融合細胞が
産生できる。液媒の例としては水、生理食塩水、５％ジ
メチルスルホキシド水溶液、５％グリセロール水溶液な
どを例示することができる。

【００３４】所望の融合細胞が産生された系を、例え
ば、遠心分離して細胞群を採取し、再び適当な培地に、
たとえば前記例示の如き血清含有ＲＰＭＩ−１６４０液
体培地中に前記例示の如き試薬を加え、採取した該細胞
群を分散させ、この分散液を例えばマイクロ・タイター
・プレートの穴に、夫々、一定量ずつつ分取注入し、例
えば、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃で培養を行う。各穴
中の培養液を、例えば３日毎に新しい培養液と取りか
え、例えば２週間培養を続けたのち、顕微鏡下で融合細
胞の有無を検べ、コロニーの認められた試料の培養液を
採取し、ヒト免疫グロブリンの有無を、例えば¹²⁵Ｉを
用いたラジオ・イミュノ・アッセイにより検出すること
ができる。

【００３５】このようにして、ヒト免疫グロブリンの生
産の認められたコロニーを、新しい培養液に移して培養
し、融合細胞を増殖させることにより融合細胞クローン
を取得することができる。更に、必要に応じて、サブ・
クローニングして、所望のヒトＢ−セル（Ａ）と同形質
の抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性クローンを得る
ことができる。

【００３６】本発明によれば、上述のようにして得られ
る融合細胞クローンを適当な培地、たとえば１０％血清
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、培養液を採取す
ることによりヒトＢ−セル（Ａ）と同形質の抗原特異的
免疫グロブリン含有物質を得ることができる。更に、所
望により、精製して精製免疫グロブリンをすることもで
きる。精製は、たとえば、硫安分画法、アフィニティー
クロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、電気泳動法などの如き生体液から免疫グロブ
リンを採取、精製する際に利用できると同様な精製手段
を利用することができる。

【００３７】本発明によれば、前述した融合細胞クロー
ン又はその培養液からヒトＢ−セル（Ａ）と同形質の抗
原特異的ヒト免疫グロブリン含有物質又は該免疫グロブ
リンを取得する場合、抗原が分離できる場合にはその抗
原と反応するヒト免疫グロブリン（抗体）を探し出し、
また抗原が分離できない場合には抗原性組織（例えば癌
組織）を一度、免疫物質生産能を欠如するか若しくは極
めて弱い生体例えばヌード・マウス（ｎｕｄｅ ｍｏｕ
ｓｅ）等に植えつけ組織を維持した後、その組織に対し
て或いは培養系にもどされた組織に対して反応するヒト
免疫グロブリン（抗体）を探し出し、これを分離するの
が有利である。

【００３８】本発明で用いるヒトＢ−セル（Ａ）は人間
の体外では自己増殖性を実質的に示さず、たとえば高々
数回の分裂を行う場合がある程度のものが好ましい。

【００３９】前記ヒトＢ−セル（Ａ）とヒトＢ−セル
（Ｂ）とを人間の体外で融合して産生される本発明の融
合細胞（ハイブリドーマ）の例として、後に実施例に示
すヒト／ヒトハイブリドーマ（Ｈｕｍａｎｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ）ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５株及びヒト／ヒトハイブ
リドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１株の細胞学的性質を以
下に示す。

【００４０】ヒト／ヒトハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ
Ｈ５：− (１) 染色体数９２ (２) ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）分泌（生産） (３) 倍加時間（ダブリング・タイム）３７時間 (４) リンパ球系シングルセル ヒト／ヒトハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１：− (１) 染色体数９２ (２) ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分泌（生産） (３) 倍加時間３７時間 (４) リンパ球系シングルセル 上記両者のヒト・ハイブリドーマは、工業技術院微生物
工業技術研究所長発行の寄託受託拒否通知書を受けた。
しかし、その後上記ヒト・ハイブリドーマはＡＴＣＣに
寄託されて、上記ヒト／ヒトハイブリドーマＣＬＮ／Ｓ
ＵＺ Ｈ５はＡＴＣＣ ＨＢ８２０６として、またヒト
／ヒトハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１はＡＴＣＣ
ＨＢ８３０７として受託されている。

【００４１】本発明のハイブリドーマを用いれば、臨床
及び基礎医学分野をはじめ製薬及び薬理的分野、生化学
分野その他の広い分野においてユニークな且つ注目すべ
き有用性を有するヒト免疫グロブリンを、とくに所望の
且つ一定形質の抗原特異的ヒト免疫グロブリンを、体外
に於て工業的に有利に製造することができる。

【００４２】かくして、本発明のヒト／ヒト・ハイブリ
ドーマから生産される単一抗体（モノクロナル抗体）
は、例えば癌に代表されるような人間に起る治療困難な
疾患の処置および治療を包含する製薬、医学、薬理学、
生化学その他の広い分野において新規且つ注目すべき有
用性を有する。

【００４３】例えば、マウス／マウス・モノクロナル抗
体では、人間にマウス抗体を投与することになるから、
当然、アレルギ症状やショック症状を伴う危険が予想さ
れるし、又、ヒト／マウス・モノクロナル抗体では、上
記と同様の危険のほかにハイブリドーマの安定性に難点
があるため、均一の標品を長期にわたって生産させるこ
とはできない。更に、ヒト／ヒト・モノクロナル抗体の
場合に於ても、細胞融合に用いる親株であるヒトＢ−セ
ル（Ｂ）に該当するＢ−セルが抗体生産能を有する場合
には、そのような抗体を充分に除去するのが好ましい。
しかしながらヒト／ヒトモノクロナル抗体であるので、
他人に投与してもその抗原性は低く、前記のマウス／マ
ウスモノクロナル抗体におれるような重大な危険はな
い。

【００４４】最も望まれる特性は、患者本人のリンパ系
が生産する抗体と同一形質の抗原特異的抗体（免疫グロ
ブリン）をヒト体外で量産させ、再び本人の対内に、何
等の副作用の危惧なしに戻すことを可能とすることであ
る。そして、本発明によってはじめて、そのような抗原
特異的免疫グロブリンをヒト体外で工業的に生産させる
ことが可能となった。

【００４５】本発明のヒト／ヒトハイブリドーマを用い
て、例えば、以下に例示するような広汎な分野において
利用できる癌抗原特異的ヒト免疫グロブリンをヒト体外
で生産することができる。

【００４６】例えば、癌などの自己体内で変化した細胞
（ａｌｔｅｒｅｄ ｓｅｌｆ）に対する抗体をヒト体外
で生産することができる。

【００４７】癌に対する例について、更に詳しくは例示
すると、ヒト体外で量産された癌特異的抗体それ自体の
作用で癌細胞の増殖抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、
ヒト体外で量産された癌組織認識抗体に補体もしくはＴ
−リンパ球の助けをかりて癌細胞の増殖抑制や癌細胞死
滅のはたらきをさせたりすることができる。更にまた、
ヒト体外で量産された癌特異的抗体をキャリアーとして
利用して例えば化学療法剤結合−ヒト・モノクロナル抗
体、インターフェロン結合−ヒト・モノクロナル抗体、
高分子毒素結合−ヒト・モノクロナル抗体、薬物入りポ
ゾーム結合−ヒト・モノクロナル抗体などの形で癌細胞
の増殖抑制や死滅のはたらきをさせたりするのに有用で
ある。また、本発明のハイブリドーマを用いて得られる
ヒトモノクロナル抗体をキャリアーとして利用し、これ
に放射線感受性物質を結合させて患者に投与し、癌細胞
に選択的に集まる性質を利用して患部を検知し、放射線
療法に利用することができる。このような癌に対する利
用に際しては、ヒト・モノクロナル抗体として完全な抗
体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法で特異的抗原
認識部位を含むより小さな分子に切断して用いたり、或
はそのような小さな分子もしくは特異的抗原認識部位の
みを他の抗体の非特異的抗原認識部分と結合させて、よ
り有効性のある修飾ヒト・モノクロナル抗体を化学的手
法で創製することもできる。

【００４８】さらに、本発明のヒト／ヒトハイブリドー
マから産生することができるヒト免疫グロブリンを利用
して人の癌抗原性疾患の診断、予防などに利用すること
ができる。この利用態様によれば、癌に伴って生体内に
現われる生体高分子に対する特異的抗体を本発明のハイ
ブリドーマを用いて作製し、得られた抗体に例えばアイ
ソトープもしくは類似の追跡物質（感受性物質）を結合
させ、該抗体の存在を検出できるようにしておき、これ
を体内に注入してその結合場所を検出することにより体
内の病巣、病原体を検知したり、体外で組織の抽出液の
中に存在する抗原を検出定量したりする方法で病気の診
断、予防に利用することができる。このような方法によ
って、例えば癌患者の手術後の転移の様子をモニターし
たり、癌の早期発見に利用したり、或はまた癌の治ゆの
程度を確認したりすることができる。

【００４９】また、組織培養されたヒト細胞に対して、
本発明により得ることのできるヒト／ヒト単一抗体がど
のような作用を示すかを調べることによって、抗体の医
療への応用に役立つ基礎知識、たとえば細胞の増殖や分
化におよぼす因子の解明、細胞構成成分の定性と定量な
どの細胞生物学的基礎知識の解明に有用であり、さら
に、酵素、蛋白質、核酸の精製、生体高分子の構成と機
能の解析、ＤＮＡ、ＲＮＡの抽出など広い生化学領域に
おいて利用することもできる。

【００５０】以下、実施例により、本発明についてさら
に詳しく述べる。

【００５１】

【実施例】実施例１ 子宮頸部に偏平上皮癌をもつ患者から、子宮体全体およ
びリンパ節を摘出する手術の際に、癌組織およびリンパ
節を入手した。後者のリンパ節をハサミで細く切りきざ
み、内部のリンパ球を培養液（ＲＰＭＩ−１６４０）中
に分散させ、続いて２重のガーゼを用いてロ過を行い、
脂肪層を除いた後に濾過中の細胞（リンパ球＞８０％）
を遠心法によって集める［ヒトＢ−Ｃｅｌｌドナーを含
むヒトリンパ球分画（ドナーＢ−セル）］。その後この
リンパ球分画を１０％仔牛血清および１０％のグリセロ
ールを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で凍結（−７０
℃）し、細胞融合を行う日まで保存した。

【００５２】ドナーリンパ球と免疫グロブリン生産能を
実質的に欠損している親ヒトＢ−セル（ＵＣ７２９−
６）のそれぞれを１×１０⁷個および５×１０⁶個混合
し、３５％ポリエチレングリコールの存在下に１０％の
仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で融合を完了
させる。その後、８００Ｇ、１０分間の遠心処理を行っ
てポリエチレングリコールを除き、新たに１０％仔牛血
清を含むＲＰＭＩ−１６４０およびヒポキサンチン／ア
ミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）を含む培地を加え
る。この細胞群を含む培養液２００μｌ（この中には
１.５×１０⁵個のＣｅｌｌを含む）づつを９６個の穴を
もつミクロプレートに分注し、約２週間３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂インキュベーターで培養した。この間、ＨＡＴを含
む１０％仔牛血清−ＲＰＭＩ−１６４０培地を３日に１
回交替した。親Ｂ−セル（ＵＣ７２９−６）はアミノブ
テリン存在ではヒポキサンチンホスホリボシールトラン
スフェラーゼを欠損しているため、生きることが出来な
い。またリンパ球（Ａ）は通常の培地たとえばＲＰＭＩ
−１６４０＋１０％仔牛血清中では永続的に増殖し生き
のびることができない。よって、ＨＡＴを含む培地で永
続的に増殖した細胞はリンパ球（Ａ）とＢ−Ｃｅｌｌ
（Ｂ）の融合した細胞である。２週間培養の後、９６個
のミクロプレート６個にハイブリドーマのクローンが見
られた。この６個のハイブリドーマのうち２個のハイブ
リドーマ（それぞれ、ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５及びＣＬＮ
／ＳＵＺ Ｈ１１と称す）がヒト免疫グロブリン（Ｈｕ
ｌｇ）を産生していることを固定化ラジオイムノアッセ
イおよび固定化酵素抗体法を用いて確めた。以下その方
法を説明する。

【００５３】ガラスフィルターの上に、ハイブリドーマ
の培養液を滴下（５０ｕｌ）し、乾燥することによっ
て、培養液中の蛋白質を固定化する。その後、¹²⁵Ｉ結
合抗ヒト免疫グロブリン血清（ラジオイムノアッセイ
法）あるいはペルオキシターゼ結合抗ヒト免疫グロブリ
ン血清を滴下（５０ｕｌ）して（酵素抗体法）、培養液
中にあるべきヒトＩｇと結合させる。室温で３０分間反
応後、生理食塩水でよく洗った後、ラジオイムノアッセ
イの場合はグラスフィルターの上に残った¹²⁵Ｉの放射
能をγ−カウンターで定量することによって、ハイブリ
ドーマ培養液中に含れるヒトＩｇの量を知る。一方、酵
素抗体法の場合は、さらに過酸化水素とＯ−フェニレン
ジアミンを含む基質溶液を加え、暗室で３０分間反応さ
せる。もしグラスフィルターの上にペルオキシダーゼ結
合抗ヒトＩｇ血清が残っている場合、すなわちグラスフ
ィルターの上でヒトＩｇ、抗ヒトＩｇ血清が反応した場
合には吸光度４９０ｎｍで検出される黄色の基質反応物
が生産される。この量を吸光度計を用いることによって
測定し、ハイブリドーマ培養液中に含れるヒトＩｇの量
を知る。ハイブリドーマ培養液中にヒトＩｇが存在しな
い場合には、抗ヒトＩｇ血清は洗滌の段階でグラスフィ
ルターを通して洗い流される。

【００５４】以上の測定方法を用いた結果、ＣＬＮ／Ｓ
ＵＺ Ｈ５はヒトＩｇＭを生産しており、ＣＬＮ／ＳＵ
Ｚ Ｈ１１はヒトＩｇＧを生産していることが分った
（ドナーＢ−セルと同形質のＩｇ）。２週間後に、ＣＬ
Ｎ／ＳＵＺ Ｈ５及びＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１のそれぞれ
を２４個の穴をもつミクロプレート（２ｍｌ／穴）に植
えかえた後さらに１週間培養を続けた。融合後３週間目
に、培養液の上清を採取、種々の株化細胞を標的細胞と
してヒト／ハイブリドーマから生産されるＩｇの特異性
を調べた（一定の形質をもつＩｇまたは特定の形質をも
つＩｇ）。

【００５５】その方法を以下説明する。

【００５６】人間の種々の株化培養細胞（これらはＡＴ
ＣＣより入手可能）をＤＭＥ：Ｆ−１２＝１：１の合成
培地に１０％仔牛血清を加えた培地で培養する。細胞の
数が５×１０⁶〜１×１０⁷になった段階で、トリプシン
を用いずに細胞をシャーレの底面から剥がし、底部にガ
ラスフィルターをもつ９６穴のミクロタイタープレート
を用いて一定数（約５×１０⁴）をグラスフィルターの
上に載せ、乾燥して、細胞をグラスフィルターの上に固
定化する。その後、ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５及びＣＬＮ／
ＳＵＺ Ｈ１１のそれぞれについて、培養上清（５０ｕ
ｌ）を細胞の上に滴下し、室温で反応させた後、¹²⁵Ｉ
−結合ヒトＩｇ血清、あるいはペルオキシダーゼ結合ヒ
トＩｇ血清を滴下して室温で反応させる。充分に洗滌を
おこなった後、先述のラジオイムノアッセイ法および酵
素抗体法で述べた方法によって細胞に結合した培養液中
のヒトＩｇの量を測定する。

【００５７】以下の方法によってＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５
のＩｇＭの標的細胞特異性およびＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１
１のＩｇＧの標的細胞特異性をそれぞれ調べた結果、Ｃ
ＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５の培養液中のＩｇＭ、およびＣＬＮ
／ＳＵＺ Ｈ１１の培養液中のＩｇＧは、いずれも子宮
頸部癌由来の、株化細胞ＨｅｌａおよびＣａｓｋｉに対
して結合力を有しており、本発明者の検討によれば子宮
頸部癌以外の株化細胞、Ａ４３１（外陰部癌）、リンパ
性腫瘍およびＷ１・３８（正常ヒト線維芽細胞）等とは
結合力を有していなかった。

【００５８】すなわち、ドナーＢ−セルは、体内に子宮
頸部癌をもつ患者から採取されたものであるので、細胞
融合法によって作り出された自己増殖性をもつハイブリ
ドーマのクローンからは、ドナーＢ−セルと同形質のか
つ特定の抗原決定部位をもつモノクローナル（単一）抗
体を生産していることを示している。一般に、癌をもつ
患者の体内で癌組織は、抗原として働き、同患者の免疫
監視機構によって、癌特異的抗体を生産しうる能力があ
ることをしめしている。

【００５９】同患者より、採取した癌組織を培養に移し
た細胞を標的細胞として用いて、ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５
及びＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１の特異性を上記と同様の方
法で調べた結果、結合力を有していることが分った。

【００６０】約３週間後に、ハイブリドーマの培地から
ＨＡＴを除きＲＰＭＩ−１６４０＋１０％仔牛血清で培
養、倍加時間３７時間で、ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５は２.４
μｇのＩｇＭ（ＨｕＭｏＩｇＭ）／１０⁶セル／ｍｌ／
ｄａｙの量でヒトＩｇＭを生産し続けており、ＣＬＮ／
ＳＵＺ Ｈ１１は２.６μｇのＩｇＧ（ＨｕＭｏＩｇＧ）
／１０⁶セル／ｍｌ／ｄａｙの量でヒトＩｇＧを生産し
続けている。

【００６１】ハイブリドーマの多量培養液を５０％の硫
酸アンモニウムで沈殿させ、粗Ｉｇ分画を集めた。得ら
れた沈殿を生理食塩水に溶かし、ＩｇＧはヒツジの抗ヒ
トＩｇＧ血清中のＩｇＧを用い、ＩｇＭはヒツジの抗ヒ
トＩｇＭ血清中のＩｇＧを結合させたセファロースを用
いてアフィニィティクロマトグラフィーの手法で精製さ
れた。収率はＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５の培養液１ｌから２.
２ｍｇのＩｇＭ、ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１の培養液１ｌ
から３.０ｍｇのＩｇＧが得られた。これらのアフィニ
ィティクロマトグラフィーを用いて精製した、Ｉｇ標品
をＳＤＳ−電気泳動法で分析した結果、ヒトＩｇと同形
質の分子量約１５万のＩｇＧ（ＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１
１）および分子量約１８万（単量体）のＩｇＭ（ＣＬＮ
／ＳＵＺ Ｈ５）を生産していることが確められた。ま
た、両ヒトハイブリドーマは、Ｎｕｄｅｍｏｕｓｅの腹
腔内で増殖させることが可能であり、腹水５ｍｌ中に３
〜１０ｍｇのヒトＩｇを生産させることができる。

【００６２】実施例２ 子宮頸部に上被性腺癌をもつ患者から、手術の際にリン
パ節を入手、実施例１で用いた方法と同様の方法でリン
パ球を調製した。本実施例ではリンパ球を凍結保存する
ことなしにＲＰＭＩ−１６４０＋１０％仔牛血清中で１
日培養した後、親Ｂ−セル（ＵＣ７２９−６）を用い
て、実施例１と同様の方法で細胞融合を行った。その結
果、９６穴のうち１６個にハイブリドーマのクローンが
認められ、ラジオイムノアッセイを用いる検出方法によ
って１６個のうち５個がヒトＩｇＭを生産しており、１
６個のうち２個がヒトＩｇＧを生産していることが確め
られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 ＰＲＯＣ．ＭＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，77（11），6841−6845 （1980) ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ＩＮ ＣＡＮＣ ＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＴＲ ＥＡＴＭＥＮＴ，ＥＤ．Ｍ．Ｓ．ＭＩＴＣ ＨＥＬ ＡＮＤ Ｈ．Ｆ．ＯＥ ＴＴＧＥ Ｎ，ＲＡＶＥＮ ＰＲＥＳＳ，ＮＥＷ Ｙ ＯＲＫ，（1982），Ｐ．125−132 ＮＡＴＵＲＥ，276，（1978），Ｐ．269 −270

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (ａ) 腫瘍患者のリンパ節から採取され
   た、腫瘍由来の抗原によって感作され且つ該抗原に対し
   て特異的な免疫グロブリン生産能を有するヒトリンパ球
   のヒトＢ−セル（Ａ）と、 (ｂ) (イ) 適当な培地中で自己増殖性を有し、 (ロ) 特定の試薬の存在下で又は特定の成分の不存在下
   で増殖停止又は死滅する実質的に非可逆的な感受性を有
   し、 (ハ) 免疫グロブリン生産能を実質的に欠損しており、
   且つ (ニ) 適当な培地及び培養条件下で単一細胞（シングル
   セル）として増殖可能である 永久分裂能をもつ骨髄様ヒトリンパ球のヒトＢ−セル
   （Ｂ） とのヒト／ヒト融合細胞株であって抗原特異的ヒト免疫
   グロブリン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマ。
2. 【請求項２】 ヒト／ヒトハイブリドーマがヒト／ヒト
   ハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ５である請求項１記
   載のヒト／ヒトハイブリドーマ。
3. 【請求項３】 ヒト／ヒトハイブリドーマがヒト／ヒト
   ハイブリドーマＣＬＮ／ＳＵＺ Ｈ１１である請求項１
   記載のヒト／ヒトハイブリドーマ。