JPS63501506A - ヒトプロゲステロン受容体に対する抗体及び試薬及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトプロゲステロン受容体に対する 抗体及び診断用物質及び方法 発明の背景 １、発明の分野 ヒトプロゲステロンあるいは、プロゲスチンの受容体（ｈＰＲ）を細胞から単離 する方法及び、このｈＰＲの抗体産生への利用について述べる。この抗体産生に は。

ヒトプロゲスチン受容体に特異的な多クローン性及び単クローン性の両抗体と、 産生された抗体を使ったヒトプロゲスチン受容体の検出および測定法が含まれる 。

２発明の背景 本発明は大部分、ヒトプロゲステロンあるいはプロゲスチンの受容体の単離、及 び、この受容体蛋白質の抗体分子産生における利用と関連がある。さらに特別な こととして、この発明は、ｈＰＲと特有の反応性を有する、斬新な抗体作製法を 提供し、かつ、免疫学的反応によるｈＰＲ蛋白質の検出及び定量化のための改良 試験法と試薬を提供する。

維持性ホルモンの全身的奪取の結果１組織の成長及び細胞増殖が退行するという 意味において、ある種の組織、注目すべきある種のヒト乳癌組織は、ステロイド ホルモン「依存性」と規定されてきた。この依存性の１例として、閉経後の女性 の進行した乳癌において。

両側副腎摘出が、顕著な緩解に効果を及ぼすことがあり、同様な緩解が下垂体切 除後にも観察されている。

エストロゲン産生に重要な役割を果たす組織の外科的切除による、エストロゲン 奪取及び／あるいは、内分必追加治療法が、進行した乳癌に現在利用できる最も 有効な治療となっている。不運なことに、閉経前の患者の半数未満及びさらに少 ない割合の閉経後患者がこのタイプの治療法に応答する。このことは、乳癌組織 は、常にエストロゲン様ホルそン依存性の細胞タイプに限らないことを示してい る。したがって１．ヒト乳癌の予後及び治療には、乳癌患者の切除した腫瘍組織 が。

主にエストロゲン依存性細胞タイプで構成されているか否かを確認できることが 重要である。そのような情報に基づけば、正しい切除応答を予測できるであろう 。

エストロゲン奪取のために、エストロゲン産生線を切除するのは、その方法によ るのが一番助かりそうな患者に限られる。それと関連して、他の乳癌患者は、本 質的に無益な外科手術の外傷から免れることができ。

直ちに放射線照射あるいは化学療法のような代替的治療プログラムに組み込まれ るであろう。

プロゲステロン受容体は、結合しているプロゲステロンまたは他のプロゲスチン に特異的な蛋白質と結合しているプロゲステロンに特異的で、ある組織において は、プロゲステロンに特異的な生物学的応答の刺激に関与して（、する。応答す るこのような標的組織は、プロゲステロンがプロゲステロン受容体に結合した結 果。

プロゲステロン受容体の複合体が細胞の染色質に固く結合して活性化を受けるも のであり、それにより、結果として細胞が、あるタイプのＲＮＡを合成する能力 が生じる。真核生物の細胞において、プロゲスチンおよび他のステロイドホルモ ンによるこの遺伝子表現の制御は、細胞間受容体蛋白質とステロイドホルモン及 びゲノム両者の相互作用に関与し、その結果何組かの特定の応答遺伝子が活性化 する（υ。

ホルモン受容体とステロイドホルモン間の相互作用の結果がＤＮＡ合成の変化で あり、　ＲＮＡ合成及び蛋白質産生の変化である。この蛋白質は、細胞増殖、分 化。

種々の組織における生理学的機能に関与している。エストロゲン産生そンは、プ ロゲステロン受容体蛋白質を誘発するが、その合成はエストロゲン受容体が染色 質に結合することによって、転写的に制御されるようである。さらに、そのよう なステロイドホルモンとその受容体は種々の腫瘍や腫瘍細胞系における異常な成 長の制御に関与しているようである（２）。幾つかの研究所のデータから（３） ステロイドホルモンの作用は、配位子が存在しない核成分（ステロイド）と弱（ 結びついている、細胞間受容体分子に直接ホルモンが結合することと関連がある ことが示唆される。ホルモンの配位子がその受容体と結合した結果、ステロイド −受容体複合体が今度は１つ以上の核成分と高い親和力で結びついた形に転換す る。ステロイド費容体に関してわかっていることは、主に生殖組織にみとめられ る、受容体蛋白質と結合している細胞間ステロイドを検出、定量化及び特性化す るための、放射性標識したホルモン（４）及びホルモン類似物質に由来している 。プロゲステロン受容体を含むすべてのステロイド受容体蛋白質に対して、ステ ロイドとＤＮＡ結合の明確な分域が存在すると仮定されてきたが、ステロイドホ ルモンとＤＮＡの両者に結合するサブユニットの構造、組成及び化学的特性に関 する詳細なデータはほとんど入手不能であり。

事実上、ステロイドホルモンに対する組織の応答に関係がある他の非ステロイド 結合成分の関与については何もわかっていない。

これまで、放射化学検定法を用いて、試料のステロイドホルモン受容体を定量的 に検出することにより、主として乳房腫瘍試料におけるステロイドホルモン依存 性組織の存在を確認してきた。放射性の（たとえばトリチウムを含む）プロゲス テロンを、均質化した組織試料の細胞質ゾル、あるいは上澄分画に加えるような 方法の１つによれば、トリチウムを含むプロゲステロンは、細胞質ゾルに存在す るどのようなｈＰＲにも可逆的に結合する。その標本を次に低塩のショ糖密度勾 配超遠心分離にかけると、受容体−プロゲステロン複合体は高分子なので、特性 的な速度で沈降する。放射能カウントは複合体を定量化するのに用いることがで きる。この方法は、非特異、的なすべての結合を同定したり除外したりするため に、適当と思われる特異的な結合の阻害剤が存在する場合にも、存在しない場合 にも、実施される。

上記の分析技術には、かなり複雑で、高価かつ一般的でない、超遠心分離器を使 用することが必要で、その操作には研究所従事者による高度の技術が要求される 。受容体検定に用いられる他の方法にも、類似した制限がある〔例えば、コレン マン（Ｋｏｒｅｎｍａｎ）ホカ。

ジャーナル−オブｅクリ；カルエンドクリノロジーφアンドΦメタボリズム（Ｊ 、Ｃｊｌｉｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　＆Ｍｅｔａｂ、）３０，６９９−６ ４５（１９７０）参照〕。結果として内分泌治療法に対する応答を予測する際に 、ｈＰＲの定量的検出が非常に有益なのにもかかわらず、先行する放射性化学検 定法の利用が、化学的、地理学的、かつ経済的見地によって制限されている。

ステロイドホルそン受容体に対する単クローン性抗体の産生は、近年、イー・ミ ルブロムが、ファーマ・テラビー（Ｐｈａｒｍａｃ　Ｔｈｅｒ、）、　２８　、 ３８９　（１９８５）に取り上げた。ヒトステロイド受容体蛋白質に関する敏感 な免疫学的検定法の成果については、フラン（Ｎｏｌａｎ）ほかが、乳癌におけ る現在の論争（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｎｔｒ。

ｖｅｒｓｉｅｓ　Ｉｎ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ、ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　 ｏｆ　ＴｅｘａｓＰｒｅｓｓ、　１９８４　）％に述べている。免疫化学的方法 を、エストロゲン受容体の構造と機能の分析に応用することは、ジー、エル、グ リーン（Ｃ）、Ｌ、　Ｇｒｅｅｎｅ）がバイオケミカル・アクションズ・オプΦ ホルモンズ（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎ ｅｓ）　、　１１巻８章（１９８１）に述べている。乳癌の管理における受容体 の重要性は、ハウキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ　）が、ザ・ブリティッシュ・ジャー ナル・オブ・ホスピタル学メデイシン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｈｏ５ｐ ｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　、　Ｐｌ　６０　、　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１ ９８５に示している。

癌がホルモン応答性のものか否かを決定する臨床的利用については、内分泌治療 法に対する患者の応答と、乳癌中のヒトプロエストロゲン受容体（ｈＥＲ）及び ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の含有量との相関関係で示されている。こ れらの研究で、　ｈＥＲとｈＰＲの生化学的検定法の重要性と利用が明らかに立 証された。非選択の乳癌患者では、わずか２５−３０％が、種々の内分泌治療法 の結果、転移性疾患の客観的緩解を得たにすぎないのに対して、　ｈＥＲ及びｈ ＰＲの両者が癌に含まれている患者では７５％以上が緩解したが（５）、２つの ステロイド受容体のうち一方しか存在しない患者では応答率は３，３％にすぎな かった（６）。さらに、ｈＥＲ／　ｈＰＲがの最終生産物として）は、エストロ ゲン受容体ヨリ、乳癌患者における好ましい予後と内分泌応答性の一層すぐれた マーカーであることを示している。以前に、ｈＥＲとｈＰＲを測定した受容体結 合検定法は、放射標識したステロイドホルモン、あるいは適切な受容体蛋白質の 類似物質の飽和結合によるものであった。この検定法は実験室的技量と努力をか なり必要とするので、免疫学的診断法の利用は、ステロイド受容体の存在の一確 認をはるかに容易にするであろう。

ｈＰＲ検出のための免疫化学的方法が利用可能であれば、より簡単で、より安価 な分析方法を提供し、かつより広く臨床的に使用できることが知られていた。し かし今まで、ｈＰＲに対する抗体を生じることができて。

効果的にヒトの組織や細胞のｈＰＲの検出に使用できる確実な証明のなされた技 法が提供されていなかった。

事実、　ｈＰＲの単離が難しいので、いつの日か首尾よ（展開されるのは疑わし かった。

他のステロイド受容体、抗体依存性検定法が開発されている。十分に明らかにな っているｈＥＲ抗体の生産については、最初にグリーン（Ｃ）ＲＥＥＮＥ’）ら が報告している（口）。゛多クローン性体はグルココルチコイド受容体を一部精 製した調製品（１ｇ−１５）、子牛及びヒトのエストロゲン受容体（１６、１７ ）、及びウサギとモルモットの子宮（１８、１９人及びひな鳥の卵管（２０）か ら単離したプロゲステロン受容体に対して生じる。さらにヒト血清ではアンドロ ゲン受容体に対する自己免疫性抗体が発見されているぐυ。抗体が他の種類の相 当する受容体に結合することもある。しかしサブユニットに結合しているステロ イドに対して方向づけられている抗体はすべて、ホルモン特異性のようである。

単りローン性抗体ハエストロゲン受容体（２２−２４）、ｆルココルチコイド受 容体（２５−２７，２８人及びウサギのプロゲステロン受容体に対して作製され ている。ウサギのプロゲステロン受容体に対する抗体はｈＰＲと交叉反応するが 、その親和性は非常に低いと報告されている。単クローン性抗体は、ニワトリの 卵管ＰＲのＢ−サブユニット３０及びＡ−サプユニツ）（３１）の、推定上の非 ホルモン結合形に対して準備されているが、これらＢ及びＡ「抗原」と、サブユ ニットに結合しているステロイドとの関係は立証されていない。多クローン性（ ３２）及び単クローン性〔３３〕抗体は両者とも、ステロイド受容体と密接に結 合している蛋白質に対して準備されているが、それ自身はホルモンと結合しない 。

発明の要約 ヒトのプロゲスチン受容体の単離方法及び、単離したプロゲスチン受容体を、ヒ トのプロゲスチン受容体に特異的な免疫グロブリン産生に利用する方法を提供す る。さらに特別なことに、プロゲスチン受容体の精製調製品で免疫化された動物 血清からも、プロゲスチン受容体を免疫原体として用いて産生じた単クローン性 抗体からも、免疫グロブリンが得られた。この発明で産生された免疫グロブリン は各々、次の特徴を持つている。

（ａ）　プロゲスチン受容体を流体から免疫的に沈降させる能力； （ｂ）　高速で沈降する免疫グロブリン・プロゲスチン受容体複合体を形成する 能力； （Ｃ）　生物学的抽出物からプロゲスチン受容体を吸着する能力；及び （（１）　透過可能にされた組織、腫瘍切片あるいは個体の細胞において、プロ ゲスチン受容体に結合する能力。

この発明の免疫グロブリンはＩｇＡ　、　ＩｇＧ　、　ＩｇＭ　。

ＩｇＤ、あるいシまＩｇＥでよく、それらは単クローン法あるいは多クローン法 のいずれによって産生されてもよい。この発明のもう１つの具象化は、ヒトのプ ロゲスチン受容体を蛋白質の２％以上に精製することである。

さらに高い評価に値するのは、精製したプロゲスチン受容体は２０％以上純粋で あり、最も高い評価に値するのは６０％以上純粋である。さらに１本発明のもう １つの具象化には、抗ヒトプロゲスチン受容体と検出可能なマーカーとの結合が 含まれる。さらに本発明のもう１つの実施例は、ヒトプロゲスチン受容体が検出 可能な粒子などの担体と、あるいはクロマトグラフィーに適する基質に結合する ことである。本発明のもう１つの実施例は抗−ヒトプロゲスチン受容体免疫グロ ブリンな、ヒトの癌組織のような生物学的試料中の、ヒトプロゲスチンの受容体 の存在を検出して、診断上の検定法に用いることである。さらに、本“発明のも う１つの実施例は、ヒトプロゲスチン受容体に特異的な免疫グロブリン類を獲得 する方法で、その方法では受容体は、動物の機構では免疫原体として、また生体 内あるいは生体外で、感作リンパ球における免疫原体として用いられている（６ ）。本発明にはまだ、被感作リンパ球を用いてハイプリドーマ細胞系形成による 単クーロン性抗体の産生方法がある。本発明の他の特徴は、組織、細胞あるいは 生物学的流体におけるグロゲステローン受容体を測定する、組織学的方法であり １．その方法では、検出可能なマーカーをつげている抗体に特異的なヒトプロゲ ステロン受容体は、接触してプロゲステロン受容体を同定する。本発明の最終的 な目的は、ヒトプロゲステロン受容体の検出に有益な診断用キットの調製であり 、検出可能なマーカーや選択的であるが適切な担体溶液と結合したヒトプロゲス テロン受容体に対する抗体を含むキットの調製である。発明のそれ以上の特徴と 利点は、本発明の独特な具象化に関する次の記述を考慮する技術に熟達している 人達に明らかになるであろう。

独特な態様に関する記述 現行のｈＥＲ及びｈＰＲ検定法の価値にもかかわらず。

乳癌及び他の婦人科学的な癌に対する応答の正確さと予後の予測を改善する必要 がある。５００例以上の乳癌において、生化学的ｈＥＲ検定と定量的かつ細胞化 学的な免疫学的ｈＥＲ検定間に見られる良好な相関関係（３Ａ　−３６）は、内 分泌応答性癌においてステロイド受容体分析を免疫化学的に研究する潜在的価値 を示している。ｈＰＲは予後及び診断上、重要な腫瘍マーカーでもあるので、放 射標識したホルモンの結合に依存しないで、ｈＰＲの測定を位置づけ、精製する 方法は、ある種の癌の受容体介在事象とホルモン応答性に関する我々の知識を広 げることは明らかである。ｈＰＲに対する単クローン性抗体を利用することは、 プロゲスチンホルモンの存在下でも不在下でも、ｈＰＲの配置特異性と親和性を 測定するのにすぐれた方法である。その上、特定の抗体は受容体蛋白質の精製と 定量を促進するために、すでに固定されている。それらは、組織、培養細胞ある いは無細胞抽出物において、受容体を局在化及び／あるいは定量化するために、 指示薬酵素、電子不伝導性物質あるいは放射性同位元素で標識した。

ｈＰＲの免疫化学的検定は比較的簡単で、迅速、敏感かつ特異的、容易に標準化 でき、操作中の受容体の変性による影響が少なく、かつ試料中に存在する、結合 あるいは非結合の総ステロイド受容体を測定することができる。さらに、免疫細 胞化学的検定は、周囲の正常な組織におけるものと同様に、腫瘍においても、ｈ ｐｐ含有細胞の不均衡な分布に関する情報を提供する。その情報は、応答性腫瘍 細胞の集団の中に、ホルモンに無感応な腫瘍細胞の亜集団が存在することを確認 するのに重要である。同様な原理体系によって、腫瘍のｈＥＲ及びｈＰＲを同時 に評価することは、腫瘍の状態の補足的指示薬としてのパラメーター及び種々の 治療方法に対する応答性の両者の評価を可能にする。このような二重検査は時間 、労力及び診療研究室における２つのタイプの受容体検定法の維持費を節約する 。

プロゲステロン受容体の抗体は、他に、細胞間、液体中及び特定の組織において プロゲステロン受容体の位置の探知と定量化にも用いられる。この抗体は、組織 を含む非プロゲステロン受容体を、組織を含むヒトプロゲステロン受容体と識別 するのにも有益である。

抗体に特異的なヒトのプロゲステロン受容体は、血液あるいは他の体液中のｈＰ Ｒの存在を確認するのにも用いられる。このような確認は、細胞を含むｈＰＲが 傷ついているか、死んでいるのかを決めるのに有益である。

プロゲステロン受容体の抗体は１手術中あるいは頚管拡張術及び掻爬術中の子宮 組織のｈＥＲ量を定量化するのにも用いられる。さらに、ｈＰＲ抗体は、薬剤設 計の領域にも用いられる。ｈＰＲ抗体および、特定の抗体を用いて単離したプロ ゲステロン受容体は、結合している親和力を評価することによって、プロゲスチ ン作動薬あるいは拮抗薬の設計に有益である。

特定のｈＰＲ多クローン性及び単クローン性抗体の産生には、　ｈＰＲの単離と 精製が必要である。一度精製、あるいは部分的精製をすると、ｈＰＲは多クロー ン性あるいは単クローン性抗体の産生に使用される。

この抗体は、　ｈＰＲまたは、結合プロゲステロンを含むｈＰＲ複合体に応答す ることができる、適格な免疫機構を持つあらゆる動物で産生される。中でもより 高く評価される動物の種類は、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、 ウシあるいはブタのような哺乳類である。抗体の分類の中では、ＩｇＧ　’、　 ＩｇＡ　、　ＩｇＭ　。

ＩｇＤ及びＩｇＥに限られず、すべての免疫グロブリンタイプが含まれる。抗体 全部が使われる必要はなく、むしろ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２．ＦＶあるいは類 似物のようなフラグメントにすぎない。検定に使用する重要な因子は、ｈＰＲＩ ｃ特異的な抗体フラグメントの親和性である。

プロゲステロン受容体自体は高張の溶液中では、４Ｓで沈降し、低張の溶液中で は８−１０３で沈降する。免疫原体として用いる場合には、プロゲステロン受容 体は本来の状態であっても、変性した状態でもよい。変性は、熱、ｐＨ，あるい は有機溶剤を用いる化学的変性でもよい。免疫原体として用いる場合、プロゲス テロン受容体はプロゲステロンあるいはプロゲステロン類似物との複合体でもよ い。さらに、プロゲステロン受容体はリン酸化されていても、リン酸化されてい な（でもよい。

ｈＰＲに対する抗体は、ヒトの組織、癌及び培養した腫瘍または腫瘍でない細胞 株から得た、細胞間プロゲスチン結合受容体蛋白質の結合に特異的である。この ょ５にｈＰＲに特異的な抗体は、　ｈＰＲで免疫化された動物の血清中に発見さ れるか、あるいは、動物の膵臓リンパ球が融合した組織培養細胞から得られて、 骨髄腫細胞と融合しているか、あるいは生体外で形質転換したリンパ球の組織培 養細胞から得られる。単クローン性抗体は、ウィルスの微粒子、突然変異誘発物 質、あるいは他の形質転換剤によって形質転換した。哺乳動物のリンパ球から得 られる。すべての骨髄腫細胞はｈＰＲ抗体な産生ずる組織培養細胞の産生に用い られるが、５Ｐ２１０−　Ａｇ１４あるいはＸ６３　＝Ａｇ８　（丁寧に言うと 、ＡＴＣＯナンバーＣＲＬ−１５８１及び０ＲＬ−１５８０）骨髄腫細胞株が最 も望ましい。

多クローン性抗体も単クローン性抗体も共に次の特性を持っている；ヒトの組織 、腫瘍及びその抽出物中の特定なプロゲスチン受容体に存在するエビトムプに特 異的に結合する能力で、　１．ａ）によって確認される。（ａ）抗体及び、抗体 受容体複合体な塩析できる最初の免疫グロブリンに対して方向づけられた、非対 応性抗体のような試薬を１つ以上添加して、流体中のプロゲステロン受容体を免 疫的に沈降させること；（ｂ）超遠心分離で分析すると異なった沈降速度を持ち 、ゲル濾過あるいは立体化学的エクスクル−ジョン・クロマトクラフィーで分析 すると異なった溶離特性を持っｈＰＲと複合体を形成する能力；（Ｃ）不溶性の サポートあるいは表面または表面につながった、黄色ブドウ球菌蛋白質Ａのよう な抗体と結合している不溶性のサグ−上に吸着されている場合に、細胞抽出物ま たは他の流体からｈＰＲを吸着する能力；（ｄ）透過性のある組織、腫瘍切片、 あるいは個体細胞のｈＰＲに結合する能力。

上に記述した抗体はいずれも、放射性同位元素または比色定量試薬（色素原）、 および電子不伝導物質（コロイド状金）、あるいは他の免疫化学的に活性あるい は不活性な物質のように、検出可能なマーカーと結合する。このことは形成した 抗体受容体複合体の存在あるいは量を、検出または測定する方法を提供する。

ｈＰＲ自身は、プロゲステロン（４−プレグネン−３゜２０−ジオン）、プロメ グステロン１フ、２１−ジメチル−１９−ノルプレダン−４，９−ジエン−３， ２０−ジオン、（Ｒ−５０２０）；１６アルフアーエチルー２１−ヒドロキシ− １９−ノルプレダン−４−エン−３，２゜−ジオン；　０ＲＧ２０５８　；エス テロン、酢酸メトロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン 。

ノルエチンドロン、ヌレチノドレル、二酢酸エチノジオール、シドロゲステロン 、ジメチステロン、エチニルエストレノール、酢酸メゲストロールあるいはノル ゲストレルのような他のプロゲスチンまたはプロゲステロン類似物などの合成あ るいは天然プロゲスチンを含むマーカーで標識される。

本発明によって、精製したｈＰＲ−プロゲスチン複合体で免疫化した動物の血清 の免疫グロブリン分画、あるいは類似したハイプリドーマ細胞株から得た免疫グ ロブリンを使用した場合、非特異的抗体または免疫グロブリンの他の蛋白質を除 去する前処理をしてもしな（ても、斬新な免疫学的試薬を提供するものである。

これら免疫グロブリンは、安定化した免疫学的に不活性な粒状物質のように、免 疫学的に不活性な粒状物質の感作に用いられる。例えば、安定化した赤血球（例 えば、合衆国特許５７１４３４５；３７１５４２７；および／あるいは３９２４ ５４１の方法に従って調製される）、ベントナイト、コロジウム、結晶コレステ ロール、水晶、合成樹脂、色々な種類の合成ラテックス（例えば合衆国特許３５ ５１５５５参照）、ポリスチレンのビーズ、あるいは、−リン脂質および、放射 性物質を含んでいるかまたは遊離基を含んでいるリポソームを含むステロールか ら調製したリポソームである。このような感作粒子は１組織試料中のｈＰＲが粒 子の凝集体に結合し、影響する。直接凝集検定に用いた時に有益で、標準的な免 疫検定技術によって複合体な定量化することができる。かわりに、放射性物質あ るいは遊離基含有粒子の感作に抗体を用いた時には、均質化した組織試料のｈＰ Ｒ含有量は、このような粒子を試料に加え１粒子を凝集体として除去して測定で きる。さらに、放射化学的に標識をつけた免疫グロブリン、あるいは酵素と結合 した免疫グロブリン、さもなければ検出可能な抗ｈＰＲ免疫グロブリンを用いた 方法は、ｈＰＲを検出するｈＰＲ検定の基礎を提供することになる。試料中のプ ロゲステロンのｈＰＲとの可逆的結合に依存しない方法にともなう、大きな利点 が期待されている。特に、このような方法で、すでに非放射性の内因性プロゲス チンと結合しているｈＰＲと同様に、結合していないｈＰＲ量の検出もできるに 違いない。

さらにもう１つの適用としては、抗ｈＰＲが、癌組織の病理学的切片標本におけ るｈＰＲ検出と定量化のための特別な免疫化学的方法の基礎を提供することであ る。

この切片を抗体の溶液とともにインキュベートし、緩衝液で洗浄した後、蛍光標 識した２番目の抗体（免疫グロブリンに対する）か、またはベルオキシダーゼー 抗ペルオキシダーゼと複合した。２番目の抗体のいずれかと一緒にインキュベー トする。さらに洗浄した後。

蛍光顕微鏡検査か、またはベルオキシダーゼ染色後に光学顕微鏡で、その切片の 、ｈＰＲの存在を調査する。

この方法で、癌の診断を行っている、同一の外科的病理学的研究所で５組織の切 片標本のｈＰＲを検出することができる。

さらに、腫瘍成分や部分的な分解成分がしばしば血液中に遊離しているので、免 疫反応性のフラグメントまたはｈＰＲを含む癌患者（あるいはその疑いのある） の血清中ｈＰＲ検定法は、転移性疾患の早期診断法を提供することができる。

定　義 あらゆる器官、組織、腫瘍、細胞あるいは、あらゆる器官、組織、腫瘍または細 胞の抽出物、あるいは。

あらゆる゛体液またはあらゆる体液の一部。

癌： あらゆる悪性の、増殖性、腫瘍性、前癌性または既往性の異常な細胞あるいは組 織。

クロマトグラフイｍ： 親和性、サイズ、エクスクル−ジョン、疎水性クロマトグラフィー、あるいはイ オン交換クロマトグラフ！Ｈ、１２５工、　ｔｉｔ　１　のようなあらゆる放射 性同位元素；フルオレセイン、フィコビリ蛋白質、希土類のキレート、ダンシル 、ローダミンのような蛍光発光体；酵素基質および阻害剤、ワサビ大根のペルオ キシダーゼ、グルコース酸化酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセチ ルコリンエステラーゼ等のような酵素；デキストランのような粒子、セファロー スのビーズ、ポリスチレンのビ、−ズ、アガロース、金属粒子。

磁性粒子と類似物。

単クローン性： 免疫グロブリンを用いて、単一クロー化細胞由来の細胞を産生じ、また、単一タ イプの抗体を産生ずる機構でしばしば、ハイプリドーマ細胞系のように、細胞融 合の結果である。

一般に免疫原体に対して複数の親和力を持つ、多（のタイプの細胞由来の免疫グ ロブリン産生機構で、一般に免疫化の結果、動物の生体内で産生される免疫グロ ブリンと関係がある。

プロゲスチン受容体： プロゲステロンに正常に結合している受容体であるが、あらゆるプロゲスチンと 結合できる。受容体はＡ−ポリペプチド、Ｂ−ポリペプチド、あるいはＡ−ポリ ペプチドとＢ−ポリペプチドの混合物から成っている。

脱　離： 蛋白質な含むあらゆる媒体は、細胞あるいは組織によって脱離する。

変性剤： あらゆる化学的突然変異誘発物質、突然変異を引き起こすあらゆる放射線、あら ゆるウィルスあるいは、結果として永久的な細胞株を作る。あらゆる細胞培養方 法。

次の実施例は例示の目的で提供するもので、これに限定されるものではない。

実施例１．抗体の精製： Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ寄託Ａ　ＨＴＢ、　１５３）　（７）、細胞質 ゾル及び核の形のｈｐＲｔｘ、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）２　Ｂにデ オキシコルチコステロンを結合させた市販の調製品である、ステロゲル（Ｓｔｅ ｒｏｇｅｌ）（３７Ｊに吸着させること及びセファロース４ＢＫ結合させた単ク ローン性抗体（ＪＵ６０１　）に吸着させることによって１部分的に精製した。

ｈＰＲ複合体は、２つの異なるサブユニットから成っているが、それは合成プロ ゲスチン　Ｈ−Ｒ５０２０で特異的に標識される。光親和性であって１分子量９ ５，０００（Ａサブユニット）および分子量＋２０．０００（Ｂサブユニット） で、還元ドデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルを、自動アジオグラムで視覚化 できる。これら２つの蛋白質は、異なる遺伝子産物または、ＡがＢから誘導され ることな表す。細胞質ゾルは、ｐＨ７で、１０ｍＭ　モリブデン酸ナトリウムと １０ｍＭチオグリセロールを含む、４倍量の５０　ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液 （緩衝液Ａ）中の細胞のホモシネ−ジョン及び、０．４Ｍ塩酸カリウムを含む緩 衝液Ａを用いた核顆粒抽出による被抽出物によって調製される。

ヒトグロゲステロン受容体含有量は％　ＢＨ−ＯＲＧ　２０５８（ＯＲ（）＊） 、または’Ｈ−Ｒ５０２０で標識した受容体を、コンドロールド・ポアΦグラス ーピーズに特異的に吸着させて１日常的に分析しており、これはエストロゲン受 容体検定法に似ている。この方法の妥当性は、標準ショ糖密度勾配及びｈＰＲの ためのデキストラン被膜木炭分析との比較によって変わる。代表的な精製（表１ ）では、９７００　ｐ：ｎｏｌ　（１）　ｈＰＲｆｉｌ含む１７６　’ｍｌの細 胞質ゾルが、ｊｏｍｌ　Ｏカラムを通夜４℃で通過した；この条件下で、入手可 能な受容体の９０％が吸着剤に結合した。負荷緩衝液で洗浄した後、結合した受 容体は、１０％グリセロール（緩衝液Ｂ）、１０％ジメチルホは、標識されてい ないプロゲステロンがｈＰＲの溶離に用いられた。溶離したステロイド−受容体 複合体は。

次にジエチルアミノエチルバイオゲル（ＤＥＡ１１ｉ！−Ｂ　ｉ　ｏ　ｇ　ｅ　 １　）クロマトグラフィーにかけ、０．２Ｍ食塩を含む緩衝液Ｂで段階的に溶離 した。緩衝液Ｂの中で４℃で５時間。

ＯＲＧ”または’Ｈ＝Ｒ５０２０と共にステロイド−受容体複合体をインキュベ ートすることによって、結合しているプロゲステロンは、すでに交換していた。

０．４Ｍ塩化カリウムを含む負荷緩衝液以外は同じ方法で、結合していない核Ｈ ＰＲｆｒ：精製した。２段階精製後の受容体（サブユニットも）生産は、３０− ７０％の範囲で。

される、特定の放射能の２−１Ｓ％であった。粗ｂＰＲと同様に、”Ｈ−Ｒ５０ ２０で光親和性標識した精製ｈｐＲは＋　２０　ｋＤａＱ３）および９５　ｋＤ ａ囚において２本の帯状に移動した。

表　１ Ｔ４７０細胞質ゾル、ヒトプロゲステロン受容体の精製 分　画　蛋白質　総ｈＰＲ＊　特異的活性　産生　純度０　精製因子（ｍｇ）　 ’　（ｎｍｏｌ）　（ｐｍｏｌ、／ｍｇ）　Ｃ％）　Ｃ％）１、細胞質ゾル　４ ０５　９．６８　２４　−−　０．２　１２ステロダ咽容離　−−６，１８−− ６ｄ　−−−−乙、　Ｔ）ＥＡＥ溶離　５．４８　４．８２　８８０　５０　８ ．８　３７＊　コンドロールド−ボア　ガラスピーズに特異的な結合によって測 定を行った。

０１つのｏＲＧ＊が分子量＋ｏｏ、ｏｏｏの蛋白質１つに結合すると仮定した（ 　ＳＤＳゲル上に、約平均ＤＥ旺バイオゲル（純度２−１５％）あるいはＪＵ６ ０１免疫吸着剤（純度２０−６０％）から溶離したＴ４７Ｄステロイド−受容体 複合物を皮下注射して免疫化した動物を、フロイント完全アジュバントまたは不 完全アジュバントのいずれかで乳化した。オスのルイスラット３匹（Ｘ、Ｗ）及 びＢａ１ｂ１０　マウス１匹が反応して、完全アジュバント中の３００−５００ 　ｐｍｏｌのステロイド−受容体複合物を最初に注射し、続いて不完全アジュバ ント中の１５０−５００　ｐｍｏｌ　の受容体を追加抗原した後。

血清稀釈が〉１：８００で検出可能な、　ｈＰＲに対する抗原を産生じた。動物 は、−匹（ラツ）ｋ）が、アジュバントに乳化する前に、１％ＳＤＳで熱変性し た受容体の注射を受けた点で異っていた。ｈＰＲと、ラツ血清を硫酸アンモニウ ム分別で一部精製した多クローン性抗体との免疫複合物質の形成は、次のことで 実証された。

（１）　ショ糖勾配において、ＯＲＧ＊−９戸Ｈ−Ｒ５０２０−，あるいは８Ｈ −グロゲステロンー受容体複合体−の沈降速度の増加。

（２）　ラットＩｇＧに対するヤギの抗体を、ラットの抗血清と標識したｈＰＲ の混合物に加えた時の、同−複合物の特異的な沈降 （６）高圧液体クロマトグラフィーの後、　ＴＳＫ４０００立体化学的エクスク ル−ジョンカラムの溶離物の排泄体積の中に、抗体−受容体複合体が出現するこ と。

ショ糖勾配で観察された免疫複合体のピークが広いことは、複数の抗体イディオ タイプの存在を示し、それぞれ、受容体分子の異なる部位を認知するものである 。実際、抗体と受容体との完全な反応は、これら抗体が両方のグロゲスチン結合 （旦およびΔ）を認めたことを示したものである。

実施例■　単クローン性抗体の調製 ２匹のルイスラット由来の１０と、Ｂａ１ｂ／’Ｃ由来の４つを含む、１４の単 クローン性抗体は、と）　（Ｔ４７Ｄ）プロゲステロン受容体の、ＡまたはＢス テロイド結合成分に対して調製したものである。これらの抗体の既知特性を表２ に要約しである。肺臓のリンパ球はＸ６３−Ａｇ３　、６５３−ｆウスの骨髄腫 （４１）、Ｐ　３”Ｘ　６３−Ａｇ８　細胞系の非分泌変種株と融合した。ハイ プリドーマ媒体、正常なラットの血清担体及びラットの免疫グロブリンに対する ヤギの抗体の存在下で、抗体産虫ノ・イブリドーマは、標識したｈＰＲの特定の 沈澱によって検出された。

検定は９６．のミクロ滴定板で申し分なく行われた。ハイブリドーマは、一定の 希釈をして、同筒状のピンの中に広げるか無胸腺マウスでは腹水腫瘍としてクロ ーン化した。ラットＩｇＧに対するヤギの抗体をカラムに免疫的吸着し、セファ ロース４Ｂに接続し、ＩｇＭｓ　の場合には続けて、バイオゲルＡ−１，５ｍを 通過させるゲルテ過を行うことによって、抗体を精製した。ＳＤＳゲルを還元す る際に、精製した抗体は２本の帯に移動した：　ＩｇＭｓ　では７０　ｋＤａ　 （ｍｕ鎖）及び２　ｓ　ｋＤａ　（カッパー鎖）、及びＩｇＧｓではｓｏ　ｋＤ ａ　（ガンマ鎖）及び２３　ｋＤａ　（カッパー）。

表２に掲げた抗体１４のうち、１３の認知されたエピトープは、ＡおよびＢに分 けられるが、Ｔ４７Ｄ及びＭＯＦ−７細胞質ゾルと核抽出物を、ＳＤＳゲル電気 泳動後、免疫プロット分析によって、また、’Ｈ−ＯＲＧ２０５８−ｈＰＲとの 相互作用を、ショ糖勾配分析することによって判定した。１つの抗体、ＫＣｌ４ ６は、Ｂ成分に特異的であった。ｂＥ１’ｌ単クローツクローン性抗体、ｈＰＲ 抗体は、結合していな、い受容体と同等の、ステロイド結合受容体に高い親和力 を示し、核および細胞質ゾルの両方の形が認知された。ウサギのグロゲステロン 受容体のＡ及びＢ成分と、３つの抗体が交叉反応を示し、このうち１つが（ＪＺ 　Ｂ、３９）がラット及び子牛の子宮グロゲステロン受容体であることも認めら れた。

しかし、ヒトＢ　（ＫＯ１４６）に特異的なマウスの単クローン性・抗体も、ラ ット及び牛の子宮及びニワトリの卵管から得た細胞質ゾルのＰＲのＢ成分である ことが認められた。含塩勾配において、これらの抗体はどれも、ＭＣＦ−７３Ｈ −エストラジオール−受容体複合体と反応しなかった。１４の抗体のうち１２が 、　ＳＤＳゲル電気泳動の後、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７抽出物の免疫プロット を行った際のｈＰＲＡおよび／またはＢ成分に特異的のようであったが、２つ（ ＪＵ１４５及びＪＵ６０１）は、少なくとも１つは、このプロット上では、他の 蛋白質であることが認められた。Ｔ４７Ｄプロゲステロン受容体が細胞質ゾルあ るいは核に存在する時には、抽出物を’Ｈ−Ｒ５０２０で光親和性標識をし、Ｏ ＮＢ　ｒ　活性化したセファロース４Ｂに接続した、ＪＵ６０１　ＩｇＭを含む 吸着剤で免疫精製したが、ＳＤＳゲルを還元すると、　５ＤＳ−溶離蛋白質は１ ２０　ｋＤａ及び９５　ｋＤａで２本の放射性の帯に移動した：　９５　ｋＤａ 帯が優勢であった。銀−スティンゲルでは、同一の帯が、低分子量の３本あるい は４本の劣勢の帯（非放射性）と共に現われた。

表　２ 単クローン性抗体のヒトプロゲステロン受容体に対する交叉作用 、ＴＵ　６０１　工ｇＭ＋−＋−− 、ＴＵ１４５　工ｇＭ　＋　−− ＪＺＢＳ９　工ｇＭ／工ｇＧｍ　＋　十　＋　＋　−ＪＺＢ　６　Ｓ　工ｇＭ　 ＋　−− ＫＣ３４工ｇＧ＋　＋　− ＫＣ７５工ｇＧ＋　十　＋　−− ＫＣｌＯ２工ｇＣ＋　＋　− ＫＯ１４６工ｇａ、　＋　＋　＋　＋　＋ＫＤ　３８　工ｇＧ＋ＡｇＧ２ａ　＋ 　−ＫＤ４２　工ｇＧ２ａ＋　−− ＫＤ６７　工ｇＧ２ａ＋ ＫＤ６８　工ｇＧ２ａ十− ＫＤＩＨｚｇ（）２ａ＋　− ＫＤ８３　工ｇＧ２ａ　十　一 実施例ＩＶ　−ｈＰＲ検定法の開−と　：細胞抽出物及び流体内のｈＰＲを定量 的に測定するために、ｈＫＲ酵素免疫検定法（ｈＥＲ−Ｅ工Ａ）のために開発さ れたものに類似した酵素免疫検定法を、ホルモン応答性癌の抽出物の分析のため に開発した。表１に掲げた抗体をいくつか組み合わせて、ポリスチレンビーズで テストをしたところ、少くとも１つの組み合わせ（ＫＤ６８／ＪＢＺ３９）が、 ｈ、ＰＲ７７”ｌ正確な測定に必要な感受性と特異性を持っているようであった 。２８例のヒト乳癌から得た細胞質ゾル（０，２ｍｌ）のｈＰＲ含有量を評価す るために、ポリスチレンビーズにＫＤ６８をコーティングし、ＪＺＢ３９をわさ び大根のベルオキシダーゼに結合させる、基本型の検定法を用いた。ｈＰＲに結 合しているステロイドのスキャッチャード（ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析にたよる 、ＮＥＮプロゲステロン受容体検定キットによって、同一の細胞質ゾルを分析し た。２つの方法で得られた結果を比較すると、相関係数０．９６が生じた。ｈＰ Ｒ−Ｅ工Ａの感度は２−１　ｆｍｏｌ　ｈＰＲ／ｍ’ｌであった。このように、 ｈＰＲ−Ｅ工Ａ分析は、乳癌抽出物のｈＰＲに関する従来からのステロイド結合 の結果と十分に相関関係があった。

その上、ｈＫＦｔ　−Ｅ工Ａの感度はり、ＥＲ−１１ＣＩＡ及び従来のｈＰＲ検 定法に匹敵するものであった。

ホルモン応答性組織及び癌において、局限化しているｈＰＲを測定する、間接的 な免疫ベルオキシダーゼ法を立証できる、実現可能性を判断するために、ヒトエ ストロゲン受容体免疫化学的検定法（ｈＥＲ−ＩＣＡ）に似ているので、固定し たＭＣＦ　−７、Ｔ４７Ｄ及びＭＤＡ　−ＭＢ−２３１細胞のｈＰＲと同様に、 種々のヒト組織および腫瘍の凍結切片における、免疫反応性ｈＰＲの局限化に、 ＪＺＢ　５９抗体を用いた。組織切片（８／ｍ）あるいは細胞を、ピクリン酸パ ラホルムアルデヒドに固定し、１０チの正常なりギ血清でブロックし、１０チの ヤギ血清を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＪ中で、ＪＺＢ　３９　ＩｇＧと共に 、室温で６０分間インキュベートした。他の段階はすべて、ＥＲで立証されてい るもの（８，９）と同じだった。各検体は、単りローン性Ｈ２２２工ｇＧを用い て免疫反応性ＥＲ分析した。エストロゲン受容体で確認された様に、ホルモンの 状態を無視すれば、ｈＰＲの特異的な染色は、染色されたすべての細胞の核にと どめられ、染色された腫瘍細胞の割合は、検体ごとにかなり異った。結腸上皮、 ｈＰＲの少ない乳癌及び非エストロゲン治療を行ったＭＣＦ　−７細胞のような 非標的組織では、染色はない。その上、一部組製したｈＰＲを一次抗体に添加す ることによって、特定の染色をなくすことができる。今まで調査してきた、あら ゆる組織あるいは腫瘍細胞において、ｈＰＲあるいはｈＥＲの細胞形質の染色は 、はとんど、またはまったく認められなかった。

、ｒＺＢ　Ｓ　９工ｇＧが、今までのところｈＰＲの局限化に最も有益であった が、ＫＤ６７及びＫＤ　６８抗体は同等あるいはそれ以上に作用する。入手可能 な抗体１４に関する特異性と染色特性の要約を表３に示す。ＪＵ１４５とＪＵ６ ０１工ｇＭだけがｈＰＲに対して必要な特異性を欠いている。マウスの抗体とＪ ＺＢ　６３は必要な感受性に欠けているが、ｈＰＲに対して特異的である。ｈＰ Ｒ−工ＣＡで５０例の乳癌を予備的に評価したところ、ステロイド結合検定法に よって測定した細胞質ゾルｈＰＲ含有量と、腫瘍細胞におけるｈＰＲに特異的な 染色が存在するが否かとは、統計学的に重大な関係が認められた。食い違いがあ るところではすべての場合、生化学的数値の低い時に、免疫反応性受容体が検出 された。ｈＰＲに関する免疫細胞化学的検定の正確な感度は確認されていないが 、これらの結果は特定の単クローン性抗体でｈＰＲの局限化が実現可能なことを 示している。

特に生化学的に決定された細胞質ゾルのｈＰＲおよび、ｈＥＲ−工ＣＡを用いた ｈＥＲ測定及び局限化を比べて、ＪＺＢ　３９抗体は乳癌のｈＰＲの精密検査に も用いられている。

１　ＤｏＣ分析による、ヒトプロゲステロン含有量が１０００　ｆｍｏｌ／ｍｇ 細胞質ゾル蛋白質よシ大きい。

２　ＤＣ！Ｏ検定による、ヒトプロゲステロン含有量が５　ｆｍｏｌ／ｍｇ細胞 質ゾル蛋白質より小さい。

３　増殖期の子宮内膜症。

引用した文献 １゜　ジー・エム・リンボルド（Ｇ、　Ｍ、　ＲｌｎｇＯｌｄ、Ａ、　Ｒｅｖ。

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４、イー・ディー・ジエンセンおよびエイチ・アイ・ジエイコブスン（Ｅ、　Ｖ 、　Ｊｅｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｈ，■、　ＪａｃｏｂｓＯｎ。

Ｒｅｃｅｎｔ　Ｆｒｏｇ、　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｓ、　１８ｊ８７−４１４（ １９６２））。

５、　イー・アール・デゾムバー、ピー・ビー・カーボン、イー・ディー・ジエ ンセン、ダブリュー・エル・マクガイアート、ニス・エイ・ウェルズ、ジエイ・ エル・ウィトリフおよびエム・ビー・リブセット（Ｅ、　Ｒ，Ｄｅｓｏｍｂｒｅ 、　Ｐ、　Ｐ、　Ｃａｒｂｏｎｅ、　Ｅ、　Ｖ、　Ｊｅｎｓｅｎ、　Ｗ、　Ｌ。

Ｍｃｇｕｉｒｅｄ、　ｓ、　Ａ、　Ｗｅｌｌｓ、　Ｊ、　Ｌ、　Ｗｉｔｔｌｉｆ ｆ　ａｎｄＭ、　Ｂ。

Ｌｉｐｓｅｔｔ、ＩＪｓｗ　Ｅｎｇｌ、、Ｊ、ｍｅｄ、　３０１．　１　０１　 １　（１９７９）　）　。

６、　イー・アー／ｌ／・デゾムバー（Ｅ、　Ｒ，Ｄｅｓｏｍｂｒｅ、　Ｃ１ｉ −ｎｔｃｅ　ｉｎ　０ｎｃｏ１．１．１９１　（１９Ｂ２）　）。

Ｚ　ニス・セーツ、シー・ショーヴエット、エム−マイヤーおよびエフーチェイ ク：ｘ、　（ｓ、　５ａｅｚ、　Ｃ！、　ｃｈｏｕｖｅｔ。

Ｍ、　Ｍａｙｏｒ　ａｎｄ　Ｆ、　ＣｈｅＬｘ、　Ｐｒｏｃ、　ＡＡＣＲａｎａ 　Ａｓ（１！０２ユ。

１　ｓｔ　（１９８０ン　）　。

８、　シー・ケイ・オズボーン、エム・ジー・ヨクモヴイツ、ダブリュー・エイ ・ナイトおよびダブリュー・エルー？クガイア−（Ｃ，Ｋ、　０ｓｂｏｕｒｎｅ 、　Ｍ、　Ｇ、　Ｙｏｃｈｍｏ−ｗｉｔｚ、　Ｗ、　Ａ、　Ｋｎｉｇｈｔ　ａｎ ｄ　Ｗ、　Ｌ、　Ｍｃｇｕｉｒｅ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ＋４６、２８８４　 （＋９８０）　）。

９　エイ・ハートウツイ、ビー・ヴエツオ一二およびイー−口７チ（Ａ＋Ｂｅｒ ｔｕｚｚｉ、　Ｐ、　Ｖｅｚｚｏｎｉ　ａｎｃｌ　Ｅ、　Ｒｏｎ−ｃｈｉ、　Ｐ ｒｏｃ、　ＡＡＣＲａｎｄ　ＡＳＣＯ２２，４４７（１９８０）　）。

１０、エム・エフ・ピコン、シー・パルード、エム・プルネットおよびイー・ミ ルブロム（Ｍ、　Ｆ、　Ｐｉｃｈｏｎ、　０゜Ｐａ１ｌｕｄ、　Ｍ、　Ｂｒｕｎ ｅｔ　ａｎｄ　Ｅ、　Ｍｉｌｇｒｏｍ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ８．４０　。

３３５７（１９８０））。

１１、エム・クラーク、ダブリュー・エル・マクガイアー、シー・エイ・へベイ 、オー・エイチ・パールソンおよびジェイ・ニス・マーシャル（Ｇ、　Ｍ、　Ｃ １ａｒｋ。

Ｗ、　Ｌ、　ＭｃＧｕｉｒｅ、　Ｃ，Ａ、　Ｈｕｂａｙ、Ｏ，Ｈ，Ｐｅａｒｓｏ ｎ　ａｎｄ　１．　Ｓ。

Ｍａｒｅｈａｌｌ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ　、Ｔ、　Ｍｅｄ、　３０９．１３４３　 （１９８３）　）。

１２、シー・エル瞭グリーン、エル・イー・クロス、エイチ・フレミング、イー ・アール・デゾムバーおよびイー・ディー・ジエンセン（Ｇ、　Ｌ、　Ｇｒｅｅ ｎｅ、Ｌ、　Ｅ。

Ｃ１ｏｓｓ、Ｈ，Ｆｌｅｍｉｎｇ、　Ｂ、　Ｒ＋ＤｅＳｏｍｂｒｅ　ａｎｄ　Ｅ 、　Ｖ、　Ｊｅｎｓｅｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４．３６８１−３６８ ５（１９７７）　）。

１３　ニス・オクレット、ジエイ・カールシュテットーデューク、オー・レンジ 、ケイ・カールンユトロムおよびジエイ”エイ・グスタフソン（Ｓ、　０ｋｒｅ ｔ、　Ｊ、　（ａｒｌ−ｅｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ、Ｏ，Ｗｒａｎｇｅ、に、Ｃａｒ ｌ、ｓｔｒｏｍ　ａｎｄ　Ｊ、Ａ。

１４エイチ・ジエイ・アイゼン（Ｊ（、Ｊ、　Ｒ１５ｅｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ；　Ｓｃｌ　ＵＳＡ　７７．３８９Ｊ１９８０））。

１５、エム・ディー・ゴヴインダｙ　（Ｍ、　Ｖ、　Ｇｏｖｉｎｄａｎ、　Ｊ。

５ｔｅｒｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１，３２３（１９７９））。

１６、シー・ラダニー、ジー・ンドーイル、イー・アイゲンマン、エム・シー・ レボ−、エフ・マソル、シー・セコ、イー・イー・バラリューおよびエイチ・リ チャードーフオイ（Ｃ，Ｒａｄａｎｙｉ、　Ｇ、　Ｒｅｄｅｕｉｌｈ、　Ｅ。

Ｋｉｇθｎｍａｎｎ、　Ｍ、　Ｃ，Ｌｅｂｅａｕ、　Ｎ、　Ｍａｓｓｏｌ、　Ｃ ，５ｅｃｃｏ、　’Ｂ。

Ｌ　Ｂａｕｌｉｅｕ　ａｎｄ　Ｈ，Ｒｌｃｈａｒｄ−Ｆｏｙ、　Ｃ！、　Ｒ，Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｐａ、ｒｉｅ　Ｓｅｒ、　Ｄ。２８８．２５５−２５８（１９７９））。

１７、エイ・アイ・コファ−，アール・ジエイ・ビー・キングおよびエイ・ジェ イ・ブロックス（Ａ、■、Ｃ０−ｆｆｅｒ、　Ｒ，Ｊ、　Ｂ、　Ｋｉｎｇ　ａｎ ｄ　Ａ、　Ｊ、　Ｂｒｏｃｋａｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

工ｎｔｅｒｎａｔ、＋　、　１２６−１３２　（１９８０）　）。

１８、エフ・ロギート、ティー・ディー・メイおよびイー・ミルブロム（Ｆ、　 Ｌｏｇｅａｔ、　Ｔ、　Ｖ、　Ｍａｉ　ａｎｄ　Ｅ、　Ｍｉｌ−１９ビー・ディ ー・フェイル（Ｐ、　Ｄ、　Ｆｅ１１．　Ｅｎｄｏｃｒｉ−２０、シェイ・エム ・ルノワール、シー・ラタニイ。

シー・アール・ヤング、イー・イー・バクロ−（Ｊ。

Ｍ、　Ｒｅｎｏｉｒ、　Ｃ！、　Ｒａｄａｎｙｉ、　Ｃ，Ｒ，Ｙａｎｇ、　Ｅ、 　Ｅ、　Ｂａｕｌｉｅｕ。

Ｆｕｒ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２７．、８１　（１９８２））。

２１、ニス・リア口、ディー・ウィッチ（Ｓ、　Ｌｉａｏ、　Ｄ。

Ｗｉｔｔｅ、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　８２　、　ｐ、　８３４５−８３４８ （１９８５）　）。

２２、ジー・エル・グリーン、シー・ノラン、ジェイ・ビー・エングラ−および イー・ディー・ジエンセン（Ｇ、　Ｌ、　Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｃ，Ｎｏ１ａｎ、　 Ｊ、　Ｐ、　Ｅｎｇ、ｌｅｒ　ａｎｄ　Ｌ　Ｖ。

Ｊｅｎｓｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７ ７゜５１１５−５１１９　（１９８０）　）。

２３、ビー・モンチャーモント、ジェイ・エル°スーおよびアイ・パリク（Ｂ、 　Ｍｏｎｃｈａｒｍｏｎｔ、　’Ｊ、　Ｌ、　Ｓｕ　ａｎａ工、　Ｐａｒｉｋｈ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ユ、６９１６　（１９８２））。

２４、ジー・エル・グリーン、エフ・ダブリュー・ツイツチおよびイー・ディー ・ジエンセン（Ｇ、　Ｌ、　Ｇｒｅｅ−ｎｅ、　Ｆ、　Ｗ、　Ｆｉｔｃｈ　ａｎ ｄ　Ｅ、　Ｖ、　Ｊｅｎｅｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、１５７−１６１（１９８０）　）。

２５、ビー・グランデイツクス、ディー・エル・ガツナーおよびジー・リトウア ツク（Ｐ、　Ｇｒａｎｄｉｃｓ、　Ｄ、　Ｌ。

２６、エイチ・エル俳つエストファル、シー・モルデンハウアーおよびエム・ビ ート（Ｈ，Ｍ、　Ｗｅｓｔｐｈａｌ、　Ｏ。

Ｍｏ１ｄｅｎｈａｕｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｂｅａｔｏ、　ＥＭＢＯＪ、　’１． １４６７（１９８２月。

２７、ニス・オクレット、エイ・シー・ウイクストローム、オー・レンジ、ビー ・アンダースンおよびジェイ・エイ・グスタフスン（Ｓ、０ｋｒｅｔ、　Ａ、　 Ｃ，Ｗｉｋｓｔｒｏｍ。

０、　Ｗｒａｎｇｅ、Ｂ、　ＡｎｄｅｒｓｓＯｎ　ａｎｄ　Ｊ、　Ａ、　Ｇｕｓ ｔａｆｓｓｏｎ、　Ｐｒ０ｃ＋Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８１．１６０ ９（１９８４０゜２８、エフ・ロギート、エム・ティー・ヴアルタイ、エイ・フ ォーニア−、ビー・レグレイン、ジー・ブチイン、およびイー・ミルブロム（Ｆ 、　Ｌｏｇｅａｔ、　Ｍ、　Ｔ。

Ｖｕｌｔａｉ、　Ａ、　Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、　Ｐ、　Ｌｅｇｒａｉｎ、　Ｇ、　 Ｂｕｔｔｉｎ　ａｎｄ２９−　イー°エイ・ピアース他（Ｅ、　Ａ、　Ｐｉｅｒ ｃｅ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、工ｐ、　８４２９−８４３３（１９８５）　）。

３０１．ディー・ビー・ニドワード、エフ・エル・ウィーゲル、ダブリュー・テ ィー・シュレーダー、ビー・ダブリュー・オマリーおよびダブリュー・エル・マ クガイアー（Ｄ、　Ｐ、　Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｎ、　Ｌ、　Ｗｅｉｇｅｌ、　Ｗ 、　Ｔ。

５ｃｈｒａｄｅｒ、’　Ｂ、　Ｗ、○’Ｍａｌｌｅｙ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｌ、　Ｍ ｃＧｕｉｒｅ、　ＢＬｏ−ｃｈｓｍｉｓｔｒｙ　１９８４２３．４４２７−４４ ３５９Ｎ’８４）　）。

３１、エイ・ビー・マクヘイル、グヴリュー・ティー・ンユレーダーおよびビー ・ダブリュー・オマリー（Ａ、　Ｐ、　ＭｃＨａｌｅ、　Ｗ、　Ｔ、　５ｃｈｒ ａｄｅｒ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｗ、σＭａｌｌｅｙ。

Ｐｒｏｃ、　ｏｆ　７ｔｈ工ｎｔｅｒ、　Ｃ！ｏｎｇ、　ｏｆ　Ｅｎｄ、ｏ、Ｑ ｕｅｂｅｃ　ｐ。

１０５９（１９８５）　、　Ｐｕｂ、Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉａ、　Ａｍ５ ｔｅｒｄ　）。

８０、ｐ、１８５４−２８５８　（［８３））。

３４、ダブリュー・ジエイ・キング、イー・アール・デゾムパー、イー・ヴイー ・ジエンセンおよびジー・エル・グリーン（Ｗ、　Ｊ、　Ｋｉｎｇ、　Ｅ、　Ｒ ，、ＤｅＳｏｍｂｒｅ、　Ｅ、　Ｖ。

Ｊｅｎｅｅｎ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｌ、　Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｅｅ、 　４５゜２９３−３０４　（１９８５）　）。

３５、イー・アール・デゾムバー、ニス・エム・トープ。

シー・ローズおよびダブリュー・ジエイ・キング（Ｋ、　Ｒ，ＤｅＳｏｍｂｒｅ 、　Ｓ、　Ｍ、　Ｔｈｏｒｐｅ、　Ｃ，Ｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｊ。

Ｋｉｎｇ、　Ａｂｓｔｒａｃｔ、　ＡＡＣＲＭｅｅｔｉｎｇ、　Ｈｏｕｓｔｏｎ 、　Ｔｅｘａｓ。

１９８５）。

６６、モノクロナール抗体によるエステローゲン受容体の決定についてのンンボ ジウム（Ｓｙｍｐｏｓ　ｉｕｍ　ｏｎＥｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｄ ｅｔｅｒｍｊ、ｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＭＯｎｏｃｌｏ−ｎａｌ　Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ、　Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｉｎ　Ｍｏｎｔｅ　０ａｒｌｏ、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１４．１９８４）。

３７、ビー・グランディクス、アール・ケイ・ビューリおよびディー・オー・ト フト（Ｐ、　Ｇｒａｎｄｉｃｅ、　Ｒ，Ｋ。

３８、ケイ・ビー・ホーヴイッッおよびビー・ニス・アレキサンダ−（Ｋ、　Ｂ 、　Ｈｏｒｗｉｔｚ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ。

３９　ヴイー・ディー・ホスペルホーン、ティー・シタ。

イー・アール・デゾムバーおよびイー・ヴイー・ジエンセン（Ｖ、　Ｄ、　Ｈｏ ５ｐｅｌｈｏｒｎ、　Ｔ、　５ｈｉｄａ、　Ｅ、　Ｒ，ＤｅＳｏｍ−ｂｒｅ　ａ ｎｄ　Ｂ、　Ｖ、　、ｒｅｎｓｅｎ、　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　６０ｔｈ　Ｍｅｅ ｔｉ’ｎｇＴｈｅ　Ｆｉｎｄｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｌｅｔｙ、　Ｍｉａｍｉ、　 １９７８．　ｐ、　３３５　）。

４０、ジエイ・エイ・ボルト、エム・エイ・ロリネズおよびヴイー・ディー・ホ スペルホーン（ｙ、　Ａ、　Ｈｏ１ｔ。

Ｍ、　Ａ、’　Ｌｏｒｉｎｅｚ　ａｎｄ　Ｖ、　Ｄ、　Ｈｏ５ｐｅｌｈｏｒｎ、 　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ６３ｒｄ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ 　５ｏｃｉｅｔｙ、　０１ｎｎｃｉ−ｎｎａｔｉ、　０ｈｉｏ、　ｐ、　１２５ 　）ｃ４１、ジエイ・エフ・カーニー、エイ・ラドプルツク。

ビー・す！スガングおよびケイ・ラジュースキー（：ｆ、　Ｆ、　Ｋｅａｒｎｅ ｙ、んＲａｄｂｒｕｃｈ、　Ｂ、　Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ　ａｎｄ４２、　７−ル ・エイ・ルーベン、ビー・”ｊ　７　ソ＋ビー・ボーレルンおよびアール・アー ル・ギレミン（Ｒ，ｐ、。

Ｌｕｂｅｎ、　Ｐ、　Ｂｒａｚｅａｕ、　Ｐ、　Ｂｏｈｌｅｌｎ　ａｎｄ　Ｒ， Ｒ，Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ　２１８．　ｐ、　８８７−８８９　（１９８２）　） 。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和６３４ｔら１月　４ 日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトプロゲスチンを含む免疫原体に応答する動物の機構で産生された免疫グ ロブリンを含む、ヒトプロゲステロン受容体に特異的な免疫グロブリン。 ２．次の特性を持つ、請求の範囲第１項に記載の免疫グロブリン： （ａ）前述の免疫グロブリンを添加すると、流体中の、前述のプロゲスチン受容 体の免疫沈降を引き起こす能力； （ｂ）より高い沈降速度と、前述のプロゲスチン受容体複合体にのみ匹敵する、 ゲル濾過クロマトグラフイー変法のプロフイールを持つ、免疫グロブリンプロゲ スチン受容体複合体を形成する能力；（ｃ）前述の免疫グロブリンが不溶性支持 器に結合しているとき、細胞抽出物または他の流体から前述のプロゲスチン受容 体を吸着する能力；（ｄ）透過可能な組織、腫瘍切片あるいは個体の細胞におい て、前述の受容体に結合する能力。 ３．前述の免疫グロブリンが、次に挙げる免疫グロブリンのタイプから選択され た、請求の範囲第１項記載の免疫グロブリン：ＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＤ またはＩｇＥ。 ４．前述の、動物の機構が多クローン性である、請求の範囲第１項記載の免疫グ ロブリン。 ５．前述の、動物の機構が単クローン性である、請求の範囲第１項記載の免疫グ ロブリン。 ６．前述の、免疫原体が２０％より純粋なヒトプロゲスチン受容体である、請求 の範囲第１項記載の免疫グロブリン。 ７．前述の、免疫原体が２０％より純粋なヒトプロゲスチン受容体である、請求 の範囲第６項記載の免疫グロブリン。 ８．前述の、免疫原体が６０％より純粋なヒトプロゲスチン受容体である、請求 の範囲第８項記載の免疫グロブリン。 ９．ヒトプロゲスチン受容体に対する、請求の範囲第ｌ項記載の免疫グロブリン を含む、検出可能なマーカーと結合した、免疫学的試薬。 １０．前述の検出可能なマーカーが、放射性同位元素である、請求の範囲第９項 記載の試薬。 １１．前述の検出可能なマーカーが、酵素である、請求の範囲第９項記載の試薬 。 １２．前述の検出可能なマーカーが螢光発光体である、請求の範囲第９項記載の 試薬。 １３．前述の検出可能なマーカーが、電子不伝導性物質である、請求の範囲第９ 項記載の試薬。 １４．前述の放射性同位元素が、放射標識をしたプロゲスチンあるいはプロゲス チン抗抗剤である、請求の範囲第１０項に記載の試薬。 １５．前述の抗プロゲスチン受容体の、請求の範囲第１項記載の免疫グロブリン を含む、担体と結合している免疫学的試薬。 １６．前述の担体が検出可能な粒子である、請求の範囲第１５項記載の免疫学的 試薬。 １７．前述の担体が、クロマトグラフイーに適している、水透過性の物質である 、請求の範囲第１５項記載の免疫学的試薬。 １８．前述の担体がヒトプロゲスチン受容体を含む溶液との接触に適している考 案物である、請求の範囲第１５項記載の免疫学的試薬。 １９．前述の担体が、条件つきで可溶性の、可溶性ポリマーである、請求の範囲 第１５項記載の免疫学的試薬。 ２０．生化学的試料におけるヒトプロゲスチン受容体の免疫学的検定法で、前述 の試料と請求の範囲第９項記載の試薬との接触及び、前述の結合している免疫グ ロブリンマーカーの検出を含むものである。 ２１．前述の生物学的試料がヒト癌組織である、請求の範囲第２０項記載に従う 免疫学的検定法。 ２２．次の段階を含む、ヒトプロゲスチン受容体を単離する方法 （ａ）細胞溶解産物または遊離物を含む媒体の調製；（ｂ）免疫グロブリン−プ ロゲスチン受容体複合物を形成するために、前述の媒体と請求の範囲第１項記載 の免疫グロブリンとの接触； （ｃ）前述の媒体からの、前述の複合体の分離；２３．特異的なプロゲスチン受 容体の抗体を含む免疫グロブリンの獲得方法で、前述の方法は次の段階をから成 る； （ａ）放射標識したプロゲスチンの存在下で、媒体を含むプロゲスチン受容体を インキユベートし、沈澱、ゲル濾過、電気泳動あるいはクロマトグラフイーによ つて、前述のインキユベートから、放射活性なプロゲスチンとプロゲスチン受容 体の複合体を単離することによる、精製した前述の複合体の調製； （ｂ）前述の複合体の、免疫学的に適格な動物への接種；および （ｃ）前述の動物からの、血清免疫グロブリンの単離。 ２４．前述の免疫グロブリンが、ハイブリドーマ細胞形成によつて産生された、 請求の範囲第２３項記載の方法で、前述の方法は、さらに次の段階が含まれる： （ｄ）前述の接種動物の免疫機構から除去された、感作リンパ球の単離； （ｅ）前述のリンパ球と骨髄腫細胞との融合；（ｆ）ヒトプロゲスチン受容体に 特異的な免疫グロブリンを産生できる交雑細胞の選択；および（ｇ）前途のハイ ブリドーマ細胞および、ハイブリドーマ細胞増殖培地からの、前述の免疫グロブ リンの単離。 ２５．段階（可及び（ｃ）の代わりに、さらに次の段階を含む、請求の範囲第２ ３項記載の方法： （ｅ）感作リンパ球を産生するための、前述の単離した複合体とリンパ球との接 触；および （１）ハイブリドーマ細胞を産生するための、前述の感作リンパ球と骨髄腫細胞 との融合；または（２）融合せずに免疫グロブリンを産生するための、感作リン パ球の形質転換； （ｆ）前述のハイブリドーマ細胞、前述の形質転換細胞、前述のハイブリドーマ 細胞および前述の形質転換細胞の増殖培地からの、免疫グロブリンの単離。 ２６．プロゲステロン受容体を含む前述の複合体が、前述の免疫学的に適格な動 物に接種する以前に変性している、請求の範囲第２３項記載の方法。 ２７．前述の、請求の範囲第１項記載の抗体が、クロマトグラフイーに適する水 透過性物質に結合している、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２８．組織あるいは細胞、あるいは体液中のプロゲステロン受容体の存在を確認 する方法で、次の段階から成る： （ａ）請求の範囲第９項記載の抗体と、前述の組織、細胞あるいは体液との接触 ；及び （ｂ）前述のマーカーの検出。 ２９．前述の組織あるいは細胞が癌にかかつている、請求の範囲第２８項記載の 方法。 ３０．免疫グロブリン及び担体溶液に結合した、前述の免疫グロブリンに適当な 、検出可能なマーカーを持つ、請求の範囲第１項記載の免疫グロブリンを含む、 ヒトプロゲステロン受容体の検出のための診断用キット。