JPH01500798A - 糸球体プロテオグリカン類に対して産生されたモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 糸球体プロテオグリカフ類に対して産生されたモノクローナル抗体 この発明は、ここで４Ｆ２および７Ｅ１２として同定されたモノクローナル抗体 に関する。これらの抗体は、ヘパラン硫散プロテオグリカン（Ｈ２ＰＯ）を含有 するウシ糸球体（ＢＧ）から単離された精製プロテオグリカン類（ＰＧ）Ｋ対し 、産生される。この発明は、また、このような抗体、これらを含有する組成物、 これらを製造するの忙有用なハイブリドーマ細胞系およびこれらを含有する診断 薬キットを製造し利用する方法に関する。

免疫すれたマウスのマウスミエローマ細胞と牌細胞を用いてハイブリドーマ細胞 系とモノクローナル抗体を産生ずる技術は、最初に、ケーラー（Ｋｈｏｌｅｒ　 ）とミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）によってネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　 ）２５６、４９５　（１９７５）に記載された。続いて、かなりの努力が、新規 細胞系とモノクローナル抗体の製造に費されてきた。このような製造に適用でき る一般的な技術は周知でありかつ理解されている。しかし、前記操作法の知識は 、成功を保証するものではない。多（の困難と予期せぬ障害がある。ある一定の ハイプリドーマを製造することを試みる前には、たとえ得られたにしてもこれが 抗体を産生ずるだろうという保証もなく、また、産生された前記抗体が、望まし い特異性を持つだろうという保証もない。成功の程度は、用いた抗原の型、適用 した融合技術、および望ましい特異性のハイプリドーマを同定しそして単離する ために用いる選択技術に依存し、このハイプリドーマは次に長期培養技術によっ て維持されなければならない。

Ｈ２ＰＯは、糸球体基底膜（ＧＢＭ）のひとつの主要成分である。これは、また 、他の組織の基底膜（ＢＭ）中にも存在する。連鎖球菌感染後糸球体腎炎の患者 血清がＨ８ＰＧに対する抗体を含むことが証明されており、１′（ｓＰＧに対す る自己免疫がヒト糸球体腎炎（ＧＮ）において重要であると示唆している。

ＢＧ組織から精製されたＨ８　ＰＧに対するモノクローナル抗体４Ｆ２と７Ｅ１ ２は、以下で検討する多（の目的にとって有用であることがわかった。

次に、本発明の実施に関連し利用されるさまざまな操作法について検討し、精製 Ｈ８ＰＧの調製法、前記精製Ｈ８ＰＧからモノクローナル抗体４Ｆ２と７Ｅ１２ を製造するために有用なハイブリドーマ細胞系の製造、前記抗体を検査し特性を 明らかとするために用いる種々の化学的および免疫学的操作を含める。

使用した試薬 ＤＥＡＥ−七７７　ｏ−ス（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ　−６Ｂとセファロ ースＣＬ−４Ｂはファルマシアファインケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉ ｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　（ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　 ニュージャージ（Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　）　Ｊより人手した。フンドロイチナ ーゼＡＢＣとへパリチナーゼは、マイルズラボラトリーズ社（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、　）　（ｘルクハート（Ｅｌｋｈａｒｔ　）、イ ンジアナ（Ｉｎｄｉａｎｎａ　）　）から購入した。ペプスタチンＡ、ベンズア ミジン−塩酸、６−アミノヘキサン酸、グアニジン−ＨＣｌ（１級）、フェニル メタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ　）　、Ｎ−エチルマレイミド（’ＮＥ Ｍ）、ヒアルロン酸（１級）、フンドロイチン硫酸（ＣＳ　）タイプＡ（Ｃ４− ８）、ＣＳタイプＣ（Ｃ６−Ｓ）、ＣＳタイプＢ　（ＤＳ　；デルマタン硫酸） 、および３，３−ジアミノベンチジン四塩酸（２級）は、シグマケミカル社（Ｓ ｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（セントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　 ）、ミズーリ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　）　）から入手した。ヘパラン硫酸（Ｈ８） は生化学工業■（東京、日本）から購入した。ハパインはフォーシントンバイオ ケミカル社（Ｗｏｒｔｈｊｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ　 ）　（７リーホールド（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ　）　、ニュージャージ（Ｎｅｗ　Ｊ ｅｒｓｅｙ　）　）からであった。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；分子量： ３−３７００）とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、アメリカンタイプ力ル チコーコレクシ＝ｙ　ｙ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ）（ｏソクビ＃　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　）　、メリーラ ンド（Ｍａｒｙｌａｎｄ　）　）から購入した。グルコース４．５９とペニシリ ン／ストレプトマイシン混合物含有ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）の修正イ ーグル（Ｅａｇｌｅ　）培地（ＤＭＥＭ　）は、ウィツトテーカ−Ｍ、　Ａ、バ イオプロダクン（Ｗｈｉｔｔ−ｔａｋｅｒ　Ｍ、　Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ ｓ　）　（ウォーカービＡ／　（Ｗａｌｋｅｒｓ−ｖｉｌｌｅ　）　、メリーラ ンド（Ｍａｒｙｌａｎｄ　）　）からであった。

馬血清、Ｌ−グルタミン、ヒポキサンチン−チミジン溶液（１００倍）およびア ミノプテリン（１００倍）は、へ−ゼルト／ダンチランド社（Ｈａｚｌｅｔｏｎ 　Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ、　Ｉｎｃ　）（デンバーコロラド（Ｄｅｎｖｅｒ　Ｃｏ １ｏｒａｄｏ　）　）がら入手した。アフイニテイ精製のフルオレセインまたは パーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスイムノ グロブリン（ＩｇＡ　十ＩｇＧ　＋　ＩｇＭ　、重鎖および軽鎖に！！！ｆ異的 ）のＦ（ａｂ）２７　：ｌＦグメントとアフィニティ精製のアルカリホスファタ ーゼを共役したヤギ抗マウ、ｘ、　ＩｇＧ　（重ｆｌｉに特異的）は、カツペル ワーシントンバイオケム（Ｃａｐｐｅｌ　Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ　）　（Ｔ　ルベーン、へｙ　シ＃ハニ７　（Ｍａｌｖｅｒｎ、　Ｐｅｎｎ ５ｙｌｖａｎｉａ　）　）から購入した。

プロテオグリカン類とその成分類の単離前記ＰＧｓは、フイリットら（Ｆｉｌｌ ｉｔ　ｅｔ　ａｌ、　）ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メデイスン（ Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　）、１６１．２７７　（１９８５）に記載されたように、ウシ糸球体 から精製した。手短かに言えば、糸球体は、ふるい法で新鮮ウシ腎から単離した 。〔ミスラ（Ｍｉｓｒａ　）　Ｒ。

Ｐ、：アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー（Ａｍ　Ｊ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ　）　５８　：　１３５．１９７２　）。

プロテアーゼインヒビター含有精製水（０，１Ｍ６−アミノヘキサン酸、０．０ １　Ｍ　ＥＤＴＡ　、　０．００５ベンズアミジン−塩酸）中で糸球体を低浸透 圧溶解後、グロテアーゼインとビター存在下で、ＰＧＳを４Ｍグアニジン−塩酸 、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，８で抽出した。ＰＧｓは、７Ｍ尿素、０ ．０５Ｍ）リス塩酸、ｐ）（７，０中のＤＥＡＥ−セ：ｙ　７　ｏ−ス（５ｅｐ ｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ　−６Ｂカラムから、同一緩衝液中の塩化ナトリウム濃 度の増加勾配を用いることＫよって、段階的に溶出し分画した。０．６Ｍ塩化す ）　ＩＪウム緩衝液に溶出した物質を精製水に対し徹底的に透析し、凍結乾燥し 、そして０．５Ｍ酢酸ナトリウム、Ｉ）Ｈ５，８中のセフ　７　ｏ−ス（５ｅｐ ｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ　−４Ｂカラム上のクロマトグラフィで、さらに精製し た。前記分画を、ホウＲ／カルバゾール法の一変法でウロン酸分析した。（Ｔ。

ピッター（Ｂｉｔｔｅｒ　）とＨ，Ｍ、　ミュア　（Ｍｕｉｒ　）　、７ナリテ イカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、４．３３０ 　（１９６２）　）。ヘキソサミン類は、４Ｍｍ酸中で’　１００℃で８時間加 水分解後に、テクニフｙ　（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ）ＴＳＭアミノ醗分析機で定量 した。（Ｆ、　Ｊ、キーラス（Ｋｉｅｒａｓ　）　、ジャーナル・バイオロジカ ル・ケミスリー　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２４９．７５０６　（１ ９７４）　）。タンパクは、修正ローリ−法で測定した。（Ｇ、　Ｒ，シャクタ ーレ−（５ｃｈａｃｔｅｒｌｅ　）とＲ，Ｌ、ボラック（Ｐｏ１ｌａｃｋ　）、 アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、 ５１．６５４　（１９７３）　） 糸球体ＰＧｓは、１０　ｍＭ　Ｎ　−ｘチルマレイミド、ｌ　ｍＭフェニルメタ ンスルホン酸フルオリド、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡと０．０３５　ｍＭベプスタチ ｙ　（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　）　Ａ含有０．１　Ｍトリス、０，１Ｍ酢酸ナトリ ウム、ｐＨ７，３中のフンドロイチナーゼＡ　Ｂ　ＣＯ，０５ＵＡ９で、３７℃ で１７時間消化した。前記消化物を、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，８中１ ７）セフ７　ｏ−ス（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ−４Ｂカラム（０，６９Ｘ １１０ｃｍ）でクロマトグラフィを行った。Ｈ２ＰＯは、ウロン酸アッセイとグ ルコサミン分析で検出し、および消化産物は、ウロン酸およびガラクトサミン分 析で行った。

前記糸球体ＰＧｓのフンドロイチナーゼＡＢＣ消化は、セフ７ｏ−ス（５ｅｐｈ ａｒｏｓｅ　）　ＣＬ−４Ｂ上で高イＫａｖ（第一ビーク）に前記ＰＧｓの一部 が移動する結果となり、少量のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在を示 した。Ｋａｖが０．６の第二ビークは、Ｈ２ＰＯの成分であるウロン酸、タンパ ク、グルコサミンを含有し、検出可能なガラクトサミンは含有しなかった。一方 、全量の近くに出現した第三ビークは、ガラクトサミンとウロン酸を含有し、Ｃ ８の７２グメントを示した。Ｈ８ＰＧ含有分画（ビークＢ上）をまとめ、透析、 凍結乾燥し、セして次に１プロテアーゼインヒビター存在下で、０．１Ｍ酢酸ナ トリウム、Ｑ、ＱＩＭ酢酸カルシウム、ｐＨ６，３中のヘノマリンリアーゼ（ヘ パリチナーゼ）３ＭＩＶηで消化した。消化したＨ８　ＰＧを、０．５Ｍ酢酸ナ トリウム、ｐＨ５，８中のセファｏ−ス（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ　−５ Ｂカラム（０，６９Ｘ　１１０　ｃｒｒＬ）上でクロマトグラフィを行った。こ の特異的処理により、この物質が完全に消化される結果となり、この物質が実際 Ｈ８ＰＧであることを示した。Ｋａｖ　−Ｑ、５５の第四ビーりは、Ｈ２ＰＯの コアプロティンを示し、第五ビークは、ＨＳフラグメントを示すグルコサミンと ウロン酸を含有することが生化学的分析で示された。このＨ８ＰＧファプロテイ ン調製物のへキソサミン分析から、元のＰＧのグルコサミンの２．５％がそのま ま残存していることが判明したが、恐らく前記ＰＧ槽構造一部であるオリゴ糖を 示している。Ｈ８ＰＧのコアプロティン（第四ビーク）含有分画、前記ＨＳフラ グメント類（第五ビーク）と前記ＣＳフラグメント（ｇｒａｆｍｅｎｔ　）　（ 第三ビーク）は、以下で述べるエリザ（ＥＬＩＳＡ　）法による阻害研究とイム ノプロット法に用いた。

以下で述べるウェスタンイムノプロットのため、糸球体ＰＧｓを、上述した操作 法を用いて、ヘパリチナーゼとフンドロイチナーゼＡＢＣで消化した。

免疫処置のスケジュール： 雌性Ｂａｌ　ｂ／ｃマウスを、上述したように単離した糸球体ＰＧで免疫した。

抗原を等量の完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ　）アジュバントと混合し、１００ μ９１０．２−をそれぞれのマウスの腹腔内に注射した。不完全アジュバント中 の同量の抗原の３−４週間隔での２回注射を次に行った。ＰＨ８中の前記抗原の 最終ブースター注射を、実際に融合操作を行う４日前に腹腔内に行った。

ハイブリッド形成： 免疫されたマウスの牌細胞を、ケージ−（Ｋｏｈｌｅｒ　）とミルステイｙ　（ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２５６．４９５　（１ ９７５）の基本的概略に従って、Ｂａｌ　ｂ／ｃ　マウスミエローマ系統Ｎ　Ｓ −１と融合させた。手短力・に言えば、前記洗浄した牌細胞をＨ５−１ミエロー マ細胞と３：１（牌：ミエローマ）の比で混合し、２３０９で１０分間遠心しペ レットとした。この細胞ペレットを、融合用混合液〔５％ＤＭＳＯ含有４０％Ｐ ＥＧまたは５０％ＰＥＧ：１１−中に室温下です早く再懸濁し、）くイアル回転 器〔テクニラプインスルメンソ社（ＴｅｃｈｎｉＬａｂ　Ｉｎ５ｔｒ。

Ｉｎｃ、　）ペクアノツク（Ｐｅｑｕａｎｎｏｃｋ　）　、ニュージャージ（Ｎ Ｊ））上で試験管を回転させて、この細胞を９０秒間ゆっくりとかくはんした。

この融合混合液を次に血清を含まないＤＭＥＭ中に１：１に希釈し１分間回転し 、同一媒質で１：３に希釈しさらに２分間回転し、そして最終的に融合混合液の １ニア希釈液と１：１５希釈液の各場合において、３分間回転を行った。最終の ２回希釈＆まＨＴ培地を用いた〔ヒボキサンチン、チミジン、１０％馬血清およ び抗生物質を補充したＤＭＥＭ　）。最終希釈に続いて、前記細胞を２３０ｇで １０分間遠心しペレットとし、４０−のＨＴ培地に再懸濁した。この細胞懸濁液 を、各ウェルにつき１００μｌずつ微量力価プレート〔リンズｏ　（Ｌｉｎｂｒ ｏ　）、フローラボ社（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、、　Ｉｎｃ、　）　ｖクリ−ｙ　（ ＭａｃＬｅａｎ　）　、バージニア（Ｖ’Ａ））に分注した。その翌日、二倍濃 度のアミノプテリン１００倍液含有ＨＡＴ培地１００μｌを、各ウェルに添加し た。融合後７日目から、２−３日おきに全ての細胞ＫＨＴ培地を補充した。

ハイブリッドコロニーが、融合後１０日目に、１１５０個のウェル９６０４個に 見られた。上清を、ターゲット器官として凍結ウシ腎切片を用いる間接ＩＰ技術 と、結合基質として糸球体ＰＧｓを用いるエリザ（ＢＬＩＳＡ　）法で検査した 。２６個のウェルからの抗体分泌クローンはウシ腎に免疫けい光結合を示し、こ れらのウェルのうち１３個がエリザ（ＥＬＩＳＡ　）試験で糸球体ＰＧに有意な 結合を示していることが見られた。選択したウェルからのハイブリドーマをクロ ーン化し、Ｂａｌ　ｂ／ｃマウス牌細胞を支持細胞として用い限界希釈技術によ りサブクローン化し、そして抗生物質補添ＤＭＥＭと１０％馬血清を用い大量培 養で成長させた。

前記抗体を、４０％硫酸アンモニウム水溶液による沈澱、１２．１００９におけ る遠心によって単離精製する。このペレフトを分離し、ｐＨ７，４のＰＢＳに再 懸濁後、２０リツトルのＰＢＳに透析し硫酸アンモニウムを除去する。

前記透析物質を次にＰＢＳで平衡としたプロティン−Ａ／セフ７０−ス（Ｐｒｏ ｔｅｉｎ−Ａ／５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）カラム上に移す。このプロティンＡ　（ Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　）は、Ｆｃレセプターを介し前記抗体をトラップする。抗 体は、ｐＨ３の０．１　ｍクエン酸緩衝液で溶出する。抗体分画を集め、ＰＢＳ 緩衝液中に再透析しｐＨ７，４Ｋ戻す。

他のアフイニテイクロマトグラフイ操作を、さらに精製するために用いることが できる。

酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ　：エリザ（ＥＬＩＳＡ　）は 、実質的にエングボール（Ｅｎｇ−ｖａｌｌ　）とパールｖ　：ｙ　（Ｐｅｒｌ ｍａｎ　）、シャー＋ルーオフ・イミュノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　） 、１０９．１２９　（１９７２）の方法に従い行った。ナンク（Ｎｕｎｃ　）イ ムノプレート〔インターメトド（Ｉｎｔｅｒｍｅｄ　）、デｙｖ−り（Ｄｅｎｒ ｒａｒｋ）：１を、０．３　ｒｎＭ　ＭｇＣｌ２含有０．１　Ｍ　）リス緩衝液 ｐＨ９，８中５μ９／−＝ｌ濃度の抗原５０μ！で、各ウェルを被覆し、４℃で 一装置いた。ＰＢＳＢでプレートをゆすぎ結合部位をＰＢＳＢでブロックするこ とを１回３０分間で２回行った後に、ＰＢＳＢ中に希釈された上清１００μｊを 各ウェルに添加し４℃で一晩インキュベート後に、３７℃で３０分間インキュベ ートした。ＰＢＳＢを３回交換しイムノプレートラ洗浄後、ＰＢＳＢ中に１　： 　５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧのアルカリホスファターゼ標識Ｆ　（ ａ　ｂ　）２フラグメント１００μｌを３７℃で１時間にわたり各ウェルに添加 した。洗浄に絖いて、前記酵素反応を、各ウェルに基質溶液（０，１Ｍジェタノ ールアミン緩衝ＨｐＨ９，８中１９４／ニトロフェニルリン酸〔シグマ（Ｓｉｇ ｍａ　）　（セントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　）、ミズーリ（ＭＯ））：１ ）１５０μｌを添加し、進行させた。光学密度は、タイターテンク（Ｔｉｔｅｒ ｔｅｋ　）　ｘリサ（ＥＬＩＳＡ　）プレートリーダーの４０５　ｎｍで、６時 間まで間隔をおいて測定した。

抗体のサブクラス： イムノグロブリンのサブクラスとこれらのモノクローナル抗体のイソタイプを決 定するため、マウスエρ、ＩｇＧ　２ａ　ＳＩｇＧ　ｚｂ　、　ＩｇＧ　ａ、Ｉ ｇＡ、ＩｇＭのＦｃＩ［に特異的でかつラムダおよびカッパ軽鎖に特異的なアフ ィニテイ精製ウサギ抗血清（抗マウス捕捉抗体）〔ハイオネテインクス（Ｂｉｏ ｎｅｔｉｃｓ　）、（チャールストｙ　（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ　）、バージニ ア（ＶＡ））：ｌ　１１００ｎを、４℃で一晩、炭酸ナトリウム結合緩衝液０． ０１　Ｍ　ＳｐＨ９，６中で微量力価プレート〔ナンク（Ｎｕｎｃ　）　、イン ターメト（Ｉｎｔｅｒｍｅｄ、　）デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ　）　）に吸着 させた。リン酸緩衝生理食塩水０．５％プリジ（Ｂｒ１ｊ　）　（ＰＢＳＢ　） 中で一回３０分のブロッキングを２回行い、抗マウス捕捉抗体の各パネルにハイ プリドーマ上清１００μｌを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄 後、アルカリホスファターゼに結合し、力価をあらかじめ検定しアフィニティで 精製したヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２　（バイオケミカル（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　）、（マルバ−ｙ　（Ｍａｌｖｅｒｎ　）、ぺ／シルバニア（ＰＡ））１ １００μｌを添加し３７℃で１時間インキュベートシた。本反応を上述のように エリザ（ＥＬＩＳＡ）法で進行させた。

ウェスタンイムノプロット： イムノプロットは、本質的にＭ、　Ｓ、ブレーク（Ｂｌａｋｅ　）、Ｋ、　Ｈ＋ ジ’ＥＩ７ストｙ　（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　）　、Ｇ、　Ｊ＋ラッセル−ジョーン ズ（Ｒｕ５ｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓ　）とＥ、　Ｃ，ゴットシュリソヒ（Ｇｏｔｓｃ ｈｌｉｃｈ　）　、アナリティカル・バイオケミストリ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　）、１３６．１７５　（１９８４）に述べられたように行った。ＳＤ Ｓ試料緩衝液（２５μｇ／１００μｌ）中のＰＧＳまたはプロテインニアを、初 めに、７％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。〔レムリ（Ｌａ ｅｍｍｌｉ　）、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ　）、２７．６８０（１９７０）　） 。プロッティング転写システム中のメタノール緩衝液中ニトロセルロース〔シュ ライシャー（Ｓｃｈｒｅｉ−ｃｈｅｒ　）とシュｘ　Ａ／　（５ｃｈｅｕｌｌ　 ）　）に、この物質を電気プｏ７トした。ＰＢＳ−０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０ 　（ＰＢＳＴ　）中でこのニトロセルロースを１回３０分、４回洗浄後、モノク ローナル抗体を添加しくＸ：ＳＯ，モノクローナル上清：　ＰＢＳＴ　）室温で 一晩回転した。１回５分で３回、ＰＢＳＴ中で洗浄後、１　：　１０００希釈の アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体〔シグマ（Ｓｉｇｍａ　） 、（セントルイｘ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　）、ミズーリ（ＭＯ）））を１時間 にわたり添加した。ＰＢＳＴで数回洗浄後、前記プロットを下記のように調製し た酵素基質溶液を添加し展開した。

Ｈ２Ｏ２中０．１％Ｗ／Ｖニトロブルーテトラゾリウム〔ジグｖ　（Ｓｉｇｍａ 　）　（セントルイス（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　）、ミズーリ−（ＭＯ）））１−と ０．５％ｗ／ｖ　５−プロモー４クロロ−３−インドリルリンｔＲ，０，１−を 無水ジメチルホルムアミド中で３　ｒｎＭ　Ｎ１ｇＣ１２を含有するｐＨ１０， ０の５００　ｍＭ　）リス９ｇｌ１に添加した。

組織処理： 用いたウシ、ヒト臓器小片とその他の組織を、ＯＣＴ培地（マイルズサイエンテ ィフインク（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ネーパービ、Ｉｔ／　（Ｎ ａｐｅｒｖｉｌｌｅ　）　、イリノイ（ＩＬ））中に包埋し、液体チッ素中で瞬 間凍結後−７０℃で保存した。

医院で採取した野生種試料をＯＣＴ培地中に包埋し、瞬間凍結後、−７０℃に保 存した。

イムノけい光（ＩＦ）技術： 結合しているモノクローナル抗体は、間接ＩＦ技術で決定した。４μｍの凍結切 片をｐＨ７，４のＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清〔ベーゼルト ン、ダッチランド＠　（Ｈａｚｅｌｔｏｎ、　Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ　Ｉｎｃ、　 ）デンバー（Ｄｅｎｖｅｒ）、コロラド（ＣＯ）”１ｌｌｏ分間プレインキュベ ージコンを行った。

次に、この切片を、室温で少なくとも３０分間、培養上清とインキュベートした 。ＰＢＳ中で洗浄後、ＰＢＳ中で１：４０希釈のヤギ抗マウスＩ−のフレオレ七 イン結合Ｆ（ａｈ）　２フラグメントで、３０分間、切片を重層した。この切片 を洗浄し、ＰＢＳ中５０％グリ七ロールで封入し、そして、適切な二色性フィル ター付きのニコンオブテイシヨット（Ｎ１ｋｏｎ　０ｐｔｉｓｈｏｔ　）顕微鏡 下で調べた。

二重免疫標識；凍結切片を１０％ヤギ血清とブレインキュベートし、次に、７Ｅ １２モノクローナル抗体上清中でに６０に希釈したローダミン共役抗ヒトＩｇＧ またはＣ３とプレインキュベーションヲ行った。

洗浄に絖いて、前記切片を、ＦＩＴＣ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ　（ヒトイムノ グロブリンと全く交差反応しない）Ｆ（ａｂ）２フラグメントとインキュベート した。

イムノパーオキシダーゼ（ＩＰ）技術：前記間接ＩＦ技術で述べたと同じように 、凍結切片をＰＢＳ中で洗浄し、１０％ヤギ血清とプレインキュベートシ、セし て上清とインキュベートした。第二抗体層が、パーオキシダーゼが結合した１４ ０希釈のヤギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ）　２フラグメントと３０分間インキュ ベーションすることによって形成された。基質の３，３′−ジアミノベンチジン テトラヒドロクロリド［：　Ｑ、　５　ｑ／ｄ、０゜０１％Ｈ２０□０．０５　 Ｍ　）リスーＤＣ／緩衝液、ｐＨ７，６］とのイインキュベートンを、グラハム （Ｇｒａｈａｍ　）とカルノアスキ（Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ　）　、ジャーナル・ オプ・ヒストケミストリ・エンド・サイトケミストリ（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｅｈｅ ｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）、１４．２９１　（１９６６）の方法に従って、５−１ ０分間行った。この切片をマイヤー（Ｍａｙｅｒ　）のヘマトキシリン〔シグマ （Ｓｉｇｒｒ＋ａ　）七／ト・ルイス（Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ　）、ミズーリ（ＭＯ））で対比染色し、脱水後封入した。

以下の開示は、観察した結果と上述した操作を完了１゜分析したことから到達し た結論を述べるものである。

糸球体プロテオグリカン類の単離と特性解析：上述したように−ｔ’７７０−ス （５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　ＣＬ−４Ｂを用いるＱ、　５　Ｍ　ＮａＣ４浴出液 のクロマドグ２フイでは、３つのプロティンビークが結果として生じ、そのうち ピ中 −り１とビーク２はＰＧｓであった。ここで述べかつクレームしているモノクロ ーナル抗体は、糸球体ＰＧｓに属していると言われるビーク２で免疫し産生され た。Ｋａｖが０．４８のこの物質は、プロティン、グルコサミンおよびガラクト サミンを９：１の比で含有し、かつヘキソサミンに対する比がおよそ１：１であ るウロン酸を含有することが示されたが、これはＰＧｓ　Ｋ　ｑ＃微的である。

プロテオグリカン類とその成分の単離の項で述べたように、特定の酵素処理に対 する糸球体ＰＧｓの酵素的耐性を用いて、前記精製物質の特性解析をさらに行っ た。フンドロイチナーゼＡＢＣに耐性のＰＧを含有するガラクトサミンが少量見 られた。

前記精製糸球体ＰＧｓのおよそ９０％がヘパリチナーゼ耐性のＨ２ＰＯであった 。

４Ｅ２と７Ｅ１２モノクローナル抗体のＨ８ＰＧ８Ｆ０：モノクローナル抗体４ Ｆ２と７Ｅ１２は、双方ともに、カッパ軽鎖を持つＩｇＧ１イムノグロブリンで ある。モノクローナル類の特異的反応性を決定するため、糸球体ＰＧを結合基質 として用い、４Ｆ２と７Ｅ】２を最初に工’）　ｆ　（ＥＬＩＳＡ　）系で試験 した。各モノクローナルは、糸球体ＰＧに有意な結合を示した。高濃度の塩（Ｉ ＭＮａＣｌ　）を前記検査系に添加したが、グロテオグリカンー抗体反応を阻害 せず、高陰イオンのプロテオグリカン類に対する前記モノクローナル抗体の結合 が非特異的な電荷相互作用によるものではないことが示された。糸球体ＰＧ量を 変化させ、前記抗体濃度を一定とする時、４Ｆ２および７Ｅ１２の双方で、明ら かな滴定効果が見られた。さらに、直接エリザ（ＢＬＩＳＡ　）で行われたこれ らの試験では、前記抗体は、タイプＩＶコラーゲンのラミニンとフィブロネクチ ンに交差反応を全（示さなかった。

糸球体ＰＧＳに対するこれらの抗体の特異的反応性を、競合的エリザ（ＥＬＩＳ Ａ　）阻害反応で確認した。各抗体の反応は糸球体ＰＧで有意に阻害されたが、 一方、ウシ鼻中隔軟骨ＰＧ　（５０μにり）はこの抗体結合を狙害しなかった。

抗体反応性が前記分子のＨ８鎖に対して起こったものであるか否かを決定するた め、４Ｆ２と７Ｅ１２ｍＡｂｓを異なる濃度のＨ８と混合し、前記エリザ（ＥＬ ＩＳＡ）において糸球体ＰＧに対する結合を試験した。この競合的エリザ（ＥＬ ＩＳＡ　）実験の結果は、抗体反応阻害がないことを示し、４Ｆ２と７Ｅ１２に より認識される抗原。

決定基が、前記分子のＨ８ｇ上にないことを示している。

免疫された糸球体ＰＧｓに対する前記抗体結合の性質と４Ｆ２と７Ｅ１２モノク ローナル抗体によって認識される抗原決定基部位を、上述の操作を用いて、ウェ スタンイムノプロットによって調べた。もとのままのインタクト（１ｎｔａｃｔ 　）ヘパランリアーゼとフンドロイチナーゼＡＢＣで消化されたＰＧｓをＰＡＧ Ｅ上で分離し、ニトロセルロース膜上で電気プロットした。前記モノクローナル 抗体をインタクトＰＧに対しプロットした時、ＰＧｓの電気泳動パターンに特徴 的な高分子量の点が各抗体で染色された。糸球体ＰＧのヘパランリアーゼ処理で 、抗体によって染色された高分子量物質がゲル中の低位置に有意な移動を示し、 ヘパランリアーゼ耐性のＨ８ＰＧのコアプロティンに、４Ｆ２と７Ｅ１２が反応 性であることを示している。これらの結果から予測されるように、前記ＰＧのフ ンドロイチナーゼＡＢＣによる消化は、前記モノクローナル抗体で染色されたＰ Ｇのプロッティングパターンに全く影響を及ぼさなかった。

これらのイムノプロントとエリザ（ＥＬＩＳＡ　）結果は、４Ｆ２と７Ｅ１２の 双方が糸球体由来のＨ２ＰＯＩｃ特異的で、これらが認識する抗原決定基が前記 分子のコアプロティン中に局在することが示されている。

正常組織中におけるＨ２ＰＯの免疫局在ウシ腎皮質中におけるＨ２ＰＯの免疫局 在を、上述の間接ＩＦとＩＰ技術双方で調べ、そして双方ともに、実質的に類似 の結果を示した。４Ｆ２と７Ｅ１２は、同一の染色パターンを呈した。これらは 、ＢＭｓだけを直線状に標識した。最大強度の染色は、ＧＢＭに沿って認められ た。尿細管上皮、ボーマンのうのＢＭおよび血管のＢＭ物質も含めて糸球体外の Ｂ４ｓに沿って、結合が同様に認められた。小動脈系では、中腹層で染色が強く 、内皮下領域で弱かった。メサンギウムマトリックスと傍系球体系（ＪＧＡ）は 、全く標識されないかあるいは極（わずかの標識しか示さなかった。また、糸球 体ＰＧ　（２０μ７／ｓ／　）　トＨ８ＰＧコアプロティン、インタクトなＨ８ による４Ｆ２　（ＰＢＳ中で１：５０）組織結合阻害を、間接ＩＦで調べた。先 の免疫化学実験に相関し、糸球体ＰＧとＨ２ＰＯ：Ｉアブロチインは、モノクロ ーナル抗体の腎組織結合を阻害したが、一方、Ｈ８は組織標識に全く効果がなか った。

また興なる種の正常腎切片に対する４Ｆ２と７Ｅ１２モノクローナル類の結合を 、調べた。ウサギとイヌの腎組織切片に４Ｆ２は強く結合し、そしてヒト腎組織 には全く反応を示さなかった。７Ｅ１２はヒト腎に対し強い交差反応を示した。

前記抗体のいずれも、ラットとマウス腎に対し交差反応を示さなかった。腎ＢＭ ｓ以外にこれらのモノクローナル抗体が結合するか否かを確認するため、ウシ脳 、華丸、心臓およびり７８節の凍結切片で免疫局在研究を行った。脳皮質および 脳白質内では、各抗体による染色は、小血管に対してのみ検出された。脳実質自 体では、全く染色を検出しなかった。また、前記結合は、心臓とリンパ節内の血 管ＢＭに限局されていた。

翠丸では、４Ｆ２と７Ｅ１２は双方とも小動脈壁と精管のＢＭを標識した。

ヒト腎生検試料中のＨ８ＰＧ免疫局在 さまざまな型の糸球体腎炎患者から得たヒト育生検試料中のＨ８ＰＧコアプロテ ィン分布を調べた。ヒト腎組織に対し強い交差反応を示すモノクローナル抗体７ Ｅ１２を、これらの研究に用いた。最小の変化しか起こしていない患者、連鎖球 菌感染後（ｐｏｓｔｒｅｐｔｏ　ｃｏｅｅａｌ　）のメサンギウム増殖性糸球体 腎炎（ＧＮ）の患者から得た生検試料中に、Ｈ８ＰＧのインタクトな染色が見ら れた。Ｈ８ＰＧ消失は、最小変化ＧＮの一症例に見られた退縮糸球体１個でのみ 、検出された。陰性染色は硬化部位に限局されていた。連鎖球菌感染後のＧＮ中 では、糸球体基底膜そのものが全体にＨ２ＰＯのインタクト染色を示し、重篤症 例で見られたクラブ状形態のメサンギウムの拡大が、糸球体中心で広範に陰性染 色されたメサンギウム領域として顕著に描出され、上述の二重免疫標識によると このメサンギウム領域はＣ３で充満していた。

膜性腎症の組織学的特徴を示す二生検試料中で、７Ｅ１２は、突起形成に関連し ＧＢＭ幅かび膜性に拡大していることを検出した。前記突起に加え、Ｈ２ＰＯｖ ａ性の肥厚ＧＢＭ中で、多数の１０′の形をしたＨ８　ＰＧ陰性病巣が見られ、 この病巣は、膜を面に平行に（ｅｎ　ｆａｃｅ　）切断した時、いわゆる泡状様 （ｂｕｂｂｌｉｎｇ　ａｐｐｅａｒａｎｃｅ　）を呈した。ＩｇＧまたはＣ３が 、二重免疫技術を用いて同一組織切片中で前記Ｈ８ＰＧとともに検出された時、 膜上突起間中かあるいは％０′の形をしたＨ８ＰＧ陽性ＧＢＭ伸展部中に免疫沈 着物が付着していることを明らかに示していた。

び膜性増殖性ループス腎炎中にに二重輪郭の１虫くい状’　（ｍｏｔｈ　ｅａｔ ｅｎ　）　５部、病巣の突起形成および１０′形状のＧＢＭ突起のような種々の 型の０８Ｍ異常が、７Ｅ１２で検出された。二重免疫標識研究から、観察された ＧＢＭ変化がイムノグロブリンまたはＣ３の沈着に関連していることを示した。

例えば、Ｃ３の膜内における車状付着が、′虫（い状′膜領域内の二重輪郭の膜 内および膜上Ｃ３顆粒領域内に観察された。膜内および膜上の免疫沈着は、異な る形態の不規則な０８Ｍ肥厚に関連していた。上述のＧＢＭ変化以外に１重篤な 増殖性ループス腎炎の一生検試料中で、Ｈ８ＰＧ消失が病巣の部分的壊死領域に 見られた。

上述の全ては、正常腎組織と異常腎組織の識別における７Ｅ１２の有用性を立証 する。

これまでの開示は、糸球体由来のＨ８ＰＧに対して産生されたこの発明によるモ ノクローナル抗体を用いて、異なる型の糸球体腎炎の患者から得た野生検試料中 と同様に、正常ウシ腎組織と正常ヒト腎組織中におけるＨ８　ＰＧの分布を述べ る。

上述のさまざまな操作を応用することによって、４Ｆ２と７Ｅ１２の双方が、ク シ糸球体から単離されたＨ８ＰＧファプロテインに特異的であることが観察され た。さらに、７Ｅ１２抗体がヒト腎組織のＢＭと、翠丸および肺のようなその他 のヒト臓器にも結合することが観察された。

前記二抗体は、ヒト組織に対する交差反応性の点で異なっている。７Ｅ１２抗体 はヒト腎と他のＢＭに結合する。したがって、これは、いくつかのヒト臨床研究 に応用できる。４Ｆ２抗体はヒト腎と交差反応しない。これは、エリザ（ＥＬＩ ＳＡ　）とウェスタンイムノプロットの双方で、Ｈ２ＰＯに対し、はるかに高い 活性を有している。

こレラの事実から、前記の二つのモノクローナル類が異なっており、Ｈ２ＰＯの コアプロティン上の異なる抗原決定基に特異的であることが、明らかに示される 。

この発明の新規モノクローナル抗体は多くの有用な目的のために使用できる。こ れらには、以下のものがあげられる。

１、そのような分子類の正常な解剖学的分布を明らかにするためのいろいろな組 織におけるＨ８　ＰＧの解剖学的検出。

２腎、心臓、脳および畢丸のよ５なＨ８ＰＧ金含有さまざまな臓器の疾病を含め て多種の疾患におけるＨ２ＰＯの、病理学的解剖学的分布を検出すること。

３、前記Ｈ８ＰＧが最初優先的に吸着されそして脱離するセファロース（５ｅｐ ｈａｒｏｓｅ　）のよ５な固相に対し、前記モノクローナル抗体が連結している アフィニテイクロマトグラフイな用いて、組織試料および他の生体液からＨ２Ｐ Ｏを単離すること。このようにして単離された前記Ｈ８ＰＧは、尿または血清（ ｕｒｕｍ　）のようなヒト体液中抗体を認識するために診断上用いることができ る。

４、脳を髄液、尿および血清のような生体液中で、ある疾患の検出のために、Ｈ ８ＰＧを検出すること。例えば、異常尿中におけるＨ８　ＰＧの検出は、ある型 の腎疾患の診断において有用である。

５、前記４Ｆ２は、ヒト体液中のＨ２ＰＯに対する抗体を検出するためのエリザ （ＥＬＩＳＡ　）およびイムノプロッティングのような免疫学的検査の標準化の ために用いることができる。

この発明のハイブリドーマ細胞系と新規抗体４Ｆ２および７Ｄ１２は、上述の技 術で製造できる。前記抗体は、標準的な操作法で単離し精製できる。典型的に有 用な操作法には、例えば、沈澱、透析、クロマトグラフィ１膜ろ過および電気泳 動が挙げられる。上述のほとんどの用途では、前記抗体を単離し精製する必要が ない。はとんどの検査は、種々の濃度の組成物を含有する抗体を用いて、行うこ とができる。

この発明の製造法は、モノクローナル抗体を培地中に分泌するハイプリドーマの 製造を可能とする。培地上清は、充分な濃度の前記モノクローナル抗体を含有す るので、この上清があたかも１個のモノクローナル抗体であるかのように、この 上清をほとんど全ての目的に使用できる。前記ハイプリドーマ培養は、公知でか つ容易に入手可能な多くの培地のいずれによる標準的操作法に関しても用いるこ とができ、前記ハイプリドーマを成長、すなわち増殖させてさらに抗体を産生ず ることができる。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスが今回の免疫化の好適対象であるが、その他のマウス系統も 用いることができ、およびその他のげつ歯類、特にラットもまた用いることがで きることがわかる。

今回用いたマウスミエローマＮ５−１細胞は、公共ノ培養寄託機関のような多く の方面から入手可能である。

しかし、その他の多くのミエローマ細胞系が公知で、例えば、寄託銀行から入手 可能である。これらは、この発明の実施において、使用できる。前記細胞系は、 非融合のミエローマ細胞が生存しないように、好ましくは、上記に例示した薬剤 耐性型であるべきである。最も一般的な株群は、酵素ＨＧＰＲＴを欠損し、その ためにＨＡＴ培地で増殖しない８−アザグアニノ耐性細胞系である。前記ミエロ ーマ細胞系は、また、細胞によって産生された抗体による前記モノクローナル抗 体の混入を避けるため、ここで述べた系統のようなイムノグロブリンを分泌しな い種類であることが好まれる。融合操作にとって、牌細胞のミエローマ細胞に対 する適切な比は、５：１から１：０５である。好適比は１：１である。

今回好適な融合プロモーターは、平均分子量が約１０００〜４０００のポリエチ レングリコールであるが、他の融合プロモーターも公知で、かつ使用できる。

この発明のモノクローナル抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　 ）に寄託され管理番号ＨＢ　９３３６とＨＢ　９３３？と指定されたハイブリド ーマ細胞系から製造できる。前者は７Ｅ１２を製造するのに使用され、後者は４ Ｆ２を製造するのに使用される。前記細胞系は、二つの方法のいずれかでさらに 抗体を製造するのに使用できる。

最も純度の高いモノクローナル抗体は、適切な培地中で適切な時間、選択ハイブ リドーマを立史上ユで培養することによって製造される。適切な製造法は周知で あり、または容易に決定できる。使用できるいくつかの培地で典型的であるのは 、ＭＡバイオプロダクツ（Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ　）、ウォーカーズビレ（ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ　）、メリーランド（Ｍｄ、）から入手可能なダルベ ツコの修正イーグル培地とＲＰＭＩ　１６４０である。

このｉｎ　ｖｉ土止技術は、本質的に単一特異性で、本質的に他の抗体を含まな いモノクローナル抗体を製造する。

しかし、このｉＨｖｉｊｒｏ法は、ある目的にとって充分な濃度の抗体を製造し ないことがあり、製造されたモノクローナル抗体の濃度は、約１−２０μｇ／− に過ぎない。

やや純度が劣るがはるかに高濃度のモノクローナル抗体を製造するため、選択さ れたハイプリドーマを、好ましくは同系かあるいは傾向系のマウスに腹腔内注射 した。

前記ハイプリドーマは、適切なインキュベーション時間後にマウス中に抗体産生 性腫瘍を誘発し、宿主マウスの血流中と腹水中に高濃度の期待された抗体（約５ −２０１−）が結果として生じる。宿主マウスもまた、その血中および腹水中に 正常抗体を有しているけれども、これらの正常抗体の濃度は、前記モノクローナ ル抗体濃度の約５％に過ぎない。

この発明のモノクローナル抗体組成物は、ヒト抗血清のような通常入手可能な抗 体組成物と区別される。この後者の組成物は、高度に精製された形態においても 、有意な量の混入抗体を含有する。それに比し、この発明の組成物は、本質的に 、混入抗体を全く含まない。したがって、当業者に容易に理解されるように、こ れらは、多くの医療用途に容易に用いることができる。前記組成物は、医学的に 不活性な培地、即ち毒性がなくかつ特定の目的において抗体の生理学的活性に悪 影響を及ぼすことのない培地における前記抗体より成る。多くの用途に選択され る組成物は、ハイブリドーマが成育し前記抗体を産生する培養液上清である。そ れは、また、水溶性の培地、即ち等張の生理食塩水またはグルツース溶液または ビーナツツあるいはゴマ油のような油である。

この発明の製造物について予測される重要な医療用途のひとつに、腎不全あるい は別の臓器の機能不全のある個人を検出することがある。この診断目的のため、 前記の選定された抗体を検査下の個人のＨ８ＰＧと反応させ、陽性個人の場合に は、検出可能な生成物が産生される。

陽性個人のＨ２ＰＯを、モノクローナル抗体と反応する抗原で特定する。全ての 検査に用いられる組成物含有の抗体は、検出可能な生成物を産生ずるため、抗原 に反応する充分な抗体を含有していなければならない。このような診断に効果的 な抗体の量は、当業者に周知の多（の因子によつ工評価可能な程変化する。これ らには、例えば、用いた検査の感度、使用可能な装置および検査下の試料量およ び例えば血清または尿などの試料の本体（１ｄｅｎｔｉｔｙ　）が挙げられる。

大多数の臨床検査の全てが、この発明のハイブリドーマと抗体を用いて行うこと ができる。典型的検査には、ラジオイムノアッセイ、酵素連結イムノアッセイ、 沈澱、凝集、直接および間接免疫けい光および補体結合が挙げられる。これらの 検査では、競合アッセイおよびサンドウィッチタイプのアッセイを用いることが できる。前記抗原、前記モノクローナル抗体あるいはヤギ抗マウス血清のような 抗抗体を４１１！識することができる。有用な標識として、フレオレ七イン、ロ ーダミンまたはオーラミンのようなけい光標識が挙げられる。１４Ｃ，１３１１ 、１２５１および２５Ｂのような放射性核種を用いることができる。

使用できる酵素標識として、例えば、β−グルカミダーゼ（β−ｇｌｕｃａｍｉ ｄａｓｅ　）、β−Ｄ−グｙ＝ｙシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレア ーゼ、グルコースオキシダーゼ＋パーオキシダーゼ、および酸またはアルカリホ スファターゼが挙げられる。細胞、抗体、抗原および抗血清のような生体産物を 標識する方法は周知であり、記載する必要がない。

これらの標識を検出する方法は現在いくつか入手可能であり、例えば、比色計、 分光光度計、分光けい光光度計、光度計およびガス圧技術、種々の放射性核種検 出の装置による方法があげられる。

この発明に関して有効に用いられる検査は全て、本発明のひとつのモノクローナ ル抗体とＨ８ＰＧを含有する検出可能な反応生成物を形成することに関連する。

もちろん、検出可能な反応生成物には、抗抗体のような他の成分もある。

前記４Ｆ２モノクローナル抗体は、ヒト血清あるいは他の体液中のＨ８ＰＧに対 する抗体を検出するため、エリザ（ＥＬＩＳＡ　）で標準試薬として用いること ができる。

このアッセイは以下のようである：前記Ｈ８ＰＧを用いるエリザ（ＥＬＩＳＡ　 ）は、０．１　Ｍ炭酸塩緩衝液中の５μり／−のＨ２ＰＯｐ）ｉ９．８とチック （Ｎｕｎｃ　）　（インターメト（Ｉｎｔｅｒ−ｍｅｄ　）　）イムノプレート を室温で１時間、４℃で一晩インキユベートした。このプレートをＰ　Ｂ　Ｓ　 −０，５％プリジ（Ｂｒ１ｊ　）　（ＰＢＳＢ　）で５回洗浄後、このプレート を希釈の異なるヒト抗血清とトリブリケント（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）でインキ ュベートした。トリブリケットの対照ウェルに、１００μｌの４Ｆ２モノクロー ナル抗体（ＰＢＳＢで１＝８０に希釈する）を添加した。このプレートを室温で １時間インキュベートし、ＰＢＳＢ中で５回洗浄し、アルカリホスファターゼ共 役ヤギ抗ヒ）Ｉρ抗抗体、ヒト血清含有ウェルに添加した。一方、アルカリホス ファターゼ共役ヤギ抗マウスエρ抗血清（ＰＢＳＢ中で１　：　１０００　）を 、４Ｆ２含有ウエルに添加した。プレートを再度室温で１時間インキュベートし 、ＰＢＳＢ中で５回洗浄した。最、後に、展開試薬（ジェタノールアミン中ニト ロフェニルリン酸）を添加し、このプレートを３７℃で１時間インキュベートし た。陽性ウェル中に出現した色反応の４０５　ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を タイターチック（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）（フロー（Ｆｌｏｗ　）　）のようなエリ ザ（ＥＬＩＳＡ　）リーダーで測定した。前記４Ｆ２含有ウエルでは、１，００ ０＋／−０，１０Ｄの読み取り値が、標準的読み取りとして得られた。この平均 的読み取りが得られない時は、プレートを廃棄し、アッセイを再度繰り返す。こ のようにして、ヒト血清中のＨ８ＰＧに対する抗体測定の個体群データが得られ 、そしてこの検査は、厳密な品質管理が必要である臨床検査室で、診断目的およ び予測目的のために使用される。このように、全ての因子によるアッセイの変更 が決定できる。

前記７Ｅ１２は、糸球体腎炎のような基底膜に影響を及ぼす疾患において、基底 膜の完全性、特に基底膜のＨ８ＰＧ成分の評価に有用である。この操作のため、 糸球体腎炎と臨床診断された患者から得た新鮮ヒト腎生検試料が用いられる。免 疫けい光技術が用いられた。この技術について、以下に詳細に述べる。イムノパ ーオキシダーゼおよび他の同様な標識技術もまた適合する。生検試料を、液体チ ッ素中でＯＣＴ培地上で瞬間凍結した。この生検試料をクライオスタンドで４μ ｍに切断し、顕微鏡スライド上に置いた。この切片をＰ　Ｂ　Ｓ　ｐＨ７，４中 で洗浄し、２０分間、１０％の正常ヤギ血清（ベーゼルトン（Ｈａｚｅｌｔｏｎ 　）　）でインキュベートした。切片を次にＰＢＳで１回５分の洗浄を３回行い 、ＰＢＳ中の７Ｅ１２モノクローナル抗体と３０分間イ／キュベートした。ＰＢ Ｓ中で３回洗浄後、切片を、ＰＢＳ中で１＝４０希釈のヤギ抗マウスＩｇＧのフ ルオレセイン結合Ｆ（ａｂ）　２フラグメ゛ントとインキュベートした。最後に 、切片をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中５中外０％グリセロール層した。カバ ーをかけ、適切な顕微鏡（例、適切なフィルター付きニコ７オブテイシＥｉ７ト （Ｎ１ｋｏｎ　０ｐｔｉｓｈｏｔ　）　）のエビフルオレセンス（ｅｐｉｆｌ’ ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　）で調べた。

正常ヒト腎では、糸球体基底膜と尿細管基底膜が、細い直線状に染色されている のが認められた。糸球体腎炎のように、基底膜に影響を及ぼす疾患では、基底膜 の変化が明らかに見られた。本検査は診断用にも用いることができ、その理由は 、あるパターンの染色は全体的に特定の型の糸球体腎炎に典型的であるからであ る。基底膜ろ過表面の全体的な完全性に関する臨床的・病理学的判定は、予後の 見地から臨床的意味を有するものであり、腎機能の臨床評価に関連して決定され る。他臓器からの生検試料についても、基底膜の完全性と病理学の指標として前 記７Ｅ１２モノクローナル抗体を用いて同様の病理学的研究を行うことができる 。

手　絖　補　正　書（自発） 昭和６３年１２月１５日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＳＰＧのコアプロテインに特異的に反応し、ヒト腎組織と反応しないハイ プリドーマ細胞系ＨＢ９３３７またはそのサブクローンに由来するモノクローナ ル抗体４Ｆ２。
2. ２．ハイプリトドーマ細胞系ＨＢ９３３７またはそのサブクローンおよびその培 養液よりなる組成物。
3. ３．ハイプリドーマ細胞系ＨＢ９３３７を培養液で培養しおよび前記培養液の上 清から抗体を回収することからなるＨＳＰＧコアプロテインと特異的に反応しヒ ト腎組織と反応しないモノクローナル抗体４Ｆ２の製造方法。
4. ４．充分量のモノクローナル抗体４Ｆ２含有組成物と下記試料を接触させてＨＳ ＰＧコアプロテインと検出可能であるように反応させることおよび反応生成物の 存在を検出することからなるＨＳＰＧ含有試料中におけるＨＳＰＧの存在を検出 する方法。
5. ５．ＨＳＰＧコアプロティンと検出可能なように反応する充分量のモノクローナ ル抗体４Ｆ２を含有するモノクローナル抗体組成物。
6. ６．ＨＳＰＧコアプロテインと特異的に反応しおよびヒト骨組織と特異的に反応 するハイプリドーマ細胞系ＨＢ９３３６またはそのサブクローン由来のモノクロ ーナル抗体７Ｅ１２。
7. ７．ハイプリドーマ細胞系ＨＢ９３３６またはそのサブクローンおよびその培養 液よりなる組成物。
8. ８．ハイプリドーマ細胞系ＨＢ９３３６を培養液で培養しおよび前記培養液の上 清から抗体を回収することからたるＨＳＰＧコアプロテインと特異的に反応しお よびヒト腎組織と特異的に反応するモノクローナル抗体７Ｅ１２の製造方法。
9. ９．充分量のモノクローナル抗体７Ｅ１２を含有する組成物と下記試料を接触さ せてＨＳＰＧのコアプロテインと検出可能であるように反応させることおよび反 応生成物の存在を検出することよりなるＨＳＰＧ含有試料中のＨＳＰＧ存在の検 出方法。
10. １０．ＨＳＰＧコアプロティンと検出可能なように反応する充分量のモノクロー ナル抗体７Ｅ１２を含有するモノクローナル抗体組成物。