JPS6378067A - 癌診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はモノクローナル抗体からなる新規な癌診断薬に
関する。

［従来の技術］ 癌とは特に上皮性の悪性Ｈａのことをいい、皮膚・粘膜
の上皮や各種腺上皮など、あらゆる種類の上皮から発生
する可能性がある。

ヒトで多発するのは胃癌、子宮癌、乳癌、肺癌、肝臓圧
、膵ｍ癌、食道癌、直腸癌、喉口癌などである。癌は発
育が速く浸潤性増殖・周囲組織の破壊及び転移を行ない
通常は発生の１年から２年で生体は死に至る。従って癌
の発生を初期のうちに認知することは癌の早期治療とい
う面で非常に重要であるが、従来の癌診断法例えば触診
、エックス線による診断などは癌組織が小ざな時期には
有効ではなく、内視鏡による観察などの補助的な手段が
必要な場合もある。また、内視鏡による観察も可能な組
織が消化器系等に限られ、被験者に対しても多大な苦痛
をあたえる。ところが最近癌細胞が産生ずる蛋白質や、
正常な固体の血液中にも存在するが癌に侵きれると血液
中の濃度が変化する蛋白質など（癌マーカーと呼ばれる
）が発見され、これらを測定することにより癌を診断す
る方法が注目されている。しかしながらこれら癌マーカ
ーを見出すことは容易でなく又発見できてもこれを測定
する有効かつ簡便な方法が開発されなければ、癌の診断
を効率よくおこなうことはできない。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは生体の基底膜組織に存在するＩＶ型コラー
ゲンに着目し研究を進めた結果、＋ｕ　織が癌に侵され
るとＩＶ型コラーゲンがコラーゲンの分解酵素であるコ
ラゲナーゼにより分解断片化され組織中のＩＶ型コラー
ゲンが減少すること、および分解された１■型コラ一ゲ
ン分解物が血液中に遊離してくることを見出した。

これらの知見に基づいて、■型コラーゲンの分解物は認
識しないがＩＶ型コラーゲンのみ認識するモノクローナ
ル抗体があれば正常組織と癌組織の識別は可能であるこ
と、またＩＶ型コラーゲン分解物を認識するモノクロー
ナル抗体があれば血液中に浸出してくる■型コラーゲン
分解物を」す定することにより癌の診断は可能であると
考えられた。

従来あるモノクローナル抗体には、ヒトＩｖ型コラーゲ
ンの分解物は認識しないがヒト■型コラーゲンのみ認識
するモノクローナル抗体および、ヒトＩＶ型コラーゲン
分解物を認識するモノクローナル抗体はなかった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは上記事情を鑑み鋭意研究を重ねた結果、上
記目的に合致するモノクローナル抗体を創成することに
成功し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は （１）下記性質を有するＪＫ１９９およびＫＪＩ３２か
らなる群より選ばれる抗ヒト■型コラーゲンモノクロー
ナル抗体からなる癌診断薬である。

（Ａ）ＪＫ１９９の性質 １）本質的にすべてのヒト■型コラーゲンと特異的に反
応する ２）分子量が５０００以上のヒトＩＶ型コラーゲン分解
物を特異的に認識する ３）分子量が１４００００〜１６００００　（ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動法）である ４）免疫グロブリンクラスがＩｇＧ２ａである（Ｂ）Ｊ
Ｋ１３２の性質 １）本質的にすべてのヒトＩＶ型コラーゲンと特異的に
反応する ２）２−メルカプトエタノールで還元された分子量が７
００００未満のヒトＩＶ型コラーゲン分解物を認識しな
い ３）分子量が１４００００〜１６００００　（ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動法）である ４）免疫グロブリンクラスがＩｇＧ２ａである以下、本
発明の構成について詳述する。

本発明の抗ヒトＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体は
ｌｖ型コラーゲンで哨乳動物を免疫し得られた免疫担当
細胞を継代培養可能な骨髄肝細胞と融合させハイブリド
ーマを形成させ、このハイブリドーマのなかから目的の
モノクローナル抗体のみを産生ずる細胞を選抜しこの細
胞を抗体を産生ずる条件下で大量に培養することにより
製造される。

また、本発明で用いられるヒトＩＶ型コラーゲンはたと
えば続生化学実験講座６下、４６５ページの塩分別沈澱
法により調整することがでとる。ヒトＩＶ型コラーゲン
の抽出材料としては動物組織のうち基底膜を含む組織で
あれば皮膚、腎臓、胎盤などどこでもよいが特にヒト由
来のものがよい。本発明において、ハイブリドーマの調
整は、公知の方法例えばＮａｔｕｒｅ２５６．４９５−
４９７　（１，９７５）に記載の方法に準じて行なわれ
る。

本発明で免疫される動物は豚、牛、兎、マウス、ラット
等、大以外の動物ならなんでもよいが抗体生産細胞の相
手となるミエローマ細胞がマウス由来のものであるため
特にマウスがよい。上記方法により調整したヒトＩＶ型
コラーゲンを５ｔａｈｌｉらの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｖｏｌ、３２，２９７−３０
４．１９８０）に従いマウスに皮下注射し免疫する。注
射方法はこれに限らず静脈注射や腹腔内注射でもよい。

マウスは必要に応じて追加免疫される。

最終免疫後３日目にこれらマウスより抗体を生産するリ
ンパ球を含む膠原を摘出する。摘出する組織はリンパ節
など末梢リンパ系組織ならどこでもよい。得られた組織
から例えば免疫実験操作法Ｂ（１９７４年日本免疫学会
発行１２５３ページ）に記載されている方法によりリン
パ球が単細胞として分離される。次にこのリンパ球が半
永久的に継代しうるように増殖能を与える。方法として
はＥ、Ｂ、−ｖｉｒｕｓやＡｂｅ　１ｓｏｎ−ｖ　１ｒ
ｕｓなどのウィルスにリンパ球を感染させ形質転換させ
る方法、仙台ウィルスや、ポリエチレングライコール存
在下ある種の癌細胞と細胞融合させる方法等がある。安
定した抗体を続けて産生きせるために同じマウスでも同
種のマウス由来の癌細胞たとえばマウスミエローマ細胞
がリンパ球の相手として用いられる。実際の細胞融合の
手法は一般的にＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ
、　３９，２８５〜３０８　（１９８０）に記載された
方法に準する。すなわち上記二種の細胞の融合はポリエ
チレングリコール存在下で行ないハイブリドーマのみ生
育可能なＨＡＴ培地（ここではヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジン添加培地）で生育きせる。ハイブリ
ドーマのコロニーが確認できるようになったらその培養
液中の抗体をスクリーニングする。スクリーニングの方
法としては例えばコラーゲン実験法（講談社４９６ペー
ジ）の方法に従えばよい。すなわちヒトＩＶ型コラーゲ
ンの１００μｇ／ｍｌ　リン酸緩衝液を塩化ビニル製マ
イクロプレートの各ウェルに１滴ずつ加え一晩４°Ｃで
放置する。ヒトＩＶ型コラーゲン溶液を除去した後に１
０％牛脂児血清−リン酸ｆｒ′Ｍ術液格ウェルに加えブ
ロッキングを行ない、ブロッキング溶液を除去した後、
各ハイブリドーマコロニー〇上清を１滴ずつ別々の所定
のウェルに加える。反応後上清を除去し洗浄した後、二
次抗体を加え目的の抗体を産生ずるハイブリドーマを確
認する。用いる二次抗体はハイブリドーマの産生ずる抗
体に結合する抗イムノグロブリンで、抗体と結合したこ
とがわかるように蛍光物質、酵素、放射性同位元素など
で標識されたものである。これは市販のものを使用して
もよいし、通常行なわれる方法によって自分で作成して
もよい。目的の抗体を産生ずるハイブリドーマは制限希
釈法を繰返すことにより最終的に単一のハイブリドーマ
（クローンと呼ぶ）からなるコロニーを得ることができ
る。クローンの作るモノクローナル抗体は細胞培養液か
ら分離精製することができるが一般的に抗体価が高いの
で目的によっては上清そのままでも使用できる。またプ
リスタン前処理のマウス腹腔にクローンを注入して生ず
る腹水、および血清中に存在する非常に血清価の高いモ
ノクローナル抗体を用いることも可能である。これら抗
体はざらに塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティ
ークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般手法
を適宜組合せて精製することができる。

なお本発明で使用される抗ヒト■型コラーゲンモノクロ
ーナル抗体とは上記のように精製したもののほか培養液
上清や血清、腹水の状態で得られる標品も含める。

本発明でいう癌診断薬は該モノクローナル抗体に蛍光標
識をつけたものを主たる構成成分とする直接蛍光抗体法
用の癌診断薬、該モノクローナル抗体および該モノクロ
ーナル抗体と結合し得る蛍光４．２３５を担持する二次
抗体を主たる構成成分とする間接蛍光抗体法用の癌診断
薬、該モノクローナル抗体を酵素標識したものを主たる
構成成分とする直接酵素抗体法用の癌診断薬、該モノク
ローナル抗体および該モノクローナル抗体と結合し得る
酵素標識を担持する二次抗体からなる間接酵素抗体法用
の癌診断薬、該モノクローナル抗体をラジオアイソーブ
で標識したものを主たる構成成分とする直接酵素抗体法
用の癌診断薬、該モノクローナル抗体および該モノクロ
ーナル抗体と結合し得るラジオアイソトープ標識を担持
する二次抗体からなる間接酵素抗体法用の癌診断薬であ
り、胃癌、子宮癌、乳癌、肺癌、肝臓圧、膵臓癌、食道
癌、直腸癌、喉口癌などほとんどの上皮性の悪性腫瘍の
診断に用いることができる、モノクローナル抗体に酵素
標識をつける方法は蛋白質核酸酵素、江。

（１１）、１００７〜１０１３．１９７５に・記載の方
法に準じて行えばよい。又、モノクローナル抗体に蛍光
標識をつけるには基礎生化学実験法６生化学的測定、１
６７ページに記載の方法に準じて行えばよい。また、モ
ノクローナル抗体をラジオアイソトープで標識するには
（クローン抗体バイプリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社、
１６９ページ）の方法に従えばよい。二次抗体を用いる
場合、使用される二次抗体はモノクローナル抗体と結合
力を持つ抗体であればなんでもよい。例えば、ＫＪ１９
９またはＫＪ１３２を抗原としてウサギ、ヤギ、マウス
、など大以外の動物を免疫して血清や腹水から得ること
もできるし、各アイソタイプごとに前記のモノクローナ
ル抗体に特異的に結合する抗体を購入して利用すること
も可能である。また、酵素標識、蛍光標識およびラジオ
アイソトープで標識した二次抗体は上記方法で作製して
もよいし市販のものを購入してもよい。

蛍光標識に用いられる蛍光物質としてはフルオレッセイ
ンイソチオシアネートやローダミン−β−イソチオシア
ネートが使用されるが、抗体を標識することができ標識
した抗体の蛍光が検出できるならどんな蛍光物質でもよ
い。酵素基質液は抗体に担持された酵素の種類によって
適宜選択される。酵素がホースラディツシュ　ペルオキ
シダーゼであれば、３．３’−ジアミノベンジヂン溶液
、　９−アミノ−９−エチルカルバゾール溶液など、ア
ルカリフォスファターゼであれば　５−ブロモ−４−り
ｒ：ＩＱ−３−インドリルフォスフェート　ｐ−ト、ル
イジン塩溶液などである。

発色剤も酵素によって適宜選択され酵素がホースラディ
ツシュ　ペルオキシダーゼであれば、５−アミノサリシ
リックアシッド、０−フェニレンジアミンなど、アルカ
リフォスファターゼであればｐ−ニトロフェニルフォス
フェートなどである。

ラジオアイソトープ標識に用いられるラジオアイソトー
プの種類としては代表的な例として１２５Ｉが挙げられ
る。

［実施例］ 以下に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明する。

［実施例１コ ａ）抗原となるヒト■型コラーゲンの調製新鮮なヒト胎
盤２７５０ｇをＮｉ断し洗浄、ポジトロンホモジナイザ
ーでホモジネートとしたのち冷凍遠心（１０，ＯＯＯｘ
ｇ、４０分）して、沈殿物集め０．０２Ｍ　リン酸ナト
リウム液に懸濁後、冷凍遠心を３＠繰返した。得られた
沈殿物を０．５Ｍの酢酸４Ｌに懸濁し塩酸でｐＨ３に調
製し、ペプシンを加え４°Ｃで７日間反応させた。遠心
（１０、０００ｘｇ　、　１時間）して上澄みを集め、
ペプシンを失活させるためにトリスと水Ｏｆｆ　化ナト
リウムを加えてｐＨを８．５に調整し２日放置した。中
和後項化ナトリウムを４旧こなるように加え、ざらに氷
酢酸を加えてｐＨ３とし一晩放置した。遠心後（１０，
ＯＯＯＸｇ、　１時間）上澄みを回収し、沈澱に０．５
Ｍ酢酸を加えて５時間撹拌した。遠心後（１０，ＯＯＯ
Ｘｇ、１時間）上澄みに塩化ナトリウムを１．２Ｍにな
るように加え、−晩装置した。遠心後（１０，ＯＯＯＸ
ｇ、１時間）沈澱を集め、０．５Ｍ酢酸を加えて溶かし
、溶けている部分（上澄み）のみを集める。上澄みを水
に対して透析し遠心によフて沈澱を除いた。得られた上
澄みにトリス−塩化ナトリウム溶液を加えてゆき最終的
にトリスが０．　ＩＭ、塩化ナトリウムが１．０Ｍにな
るようにした。溶けてない部分は遠心で除き、上澄みを
０゜００５Ｍトリス−１，５Ｍ塩化ナトリウムに対して
塩析した。遠心により沈殿物を集め、０．０５Ｍ）リス
−１，５Ｍ塩化ナトリウムに溶かした。これをフォスフ
ォセルロース力ラムクロマトグラフィーで精製し２３５
ｍｇのヒトＩＶ型コラーゲンを得た。

ｂ）免疫した牌細胞の調製 ヒトＩｖ型コラーゲンを１１００ｕ含む１００μｍのリ
ン酸緩衝液を調製し、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内注射
を行った。１週間後に同様の処置で２回目の免疫を行っ
た。１回目と２回目の免疫時にＢＡＣＴＯ−Ａｄｊｕｂ
ａｎｔ　（ＤＩＦＣＯ社製）を０　、１　ｔｒｉづつ同
時に腹腔内注射した。ざらに１週間後ヒトＩＶ型コラー
ゲン溶液で追加免疫を行った。最終追加免疫後　７２時
間目にこのマウスより膠原を無菌的に摘出し、ハサミで
切片としてさらにメツシュを通してリンパ球の懸濁液を
得た。

赤血球の混在を除くために溶血用バッファーに浮遊後１
５００ｒｐｍで５分間遠沈きせ、ＲＰＭＩ−１８４０培
養液で更に２回洗浄した。一方融合細胞としてのマウス
ミエローマ細胞（ＳＰ２１０）は、融合の前々日より１
０％牛脂児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰ旧−１６４０培養
液中で１０χＣ０２，３７６Ｃの条件で増殖させな。牌
細胞１００ＸＩＯ６個と、ミエローマ細胞１００×１０
６個を含む培養液を混合し、１５００ｒｐｍで３０分遠
心後、上清を捨て、５０％ポリエチレングリコール４０
００　（メルク社製）　１　ｔｒｉを１滴づつ滴下しな
がらゆっくりと細胞をほぐした。１分後、ＦＣ５含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培養液を１ｍｌゆっくりと滴下しなが
ら細胞を混合させ、同様の操作を１分間繰返した。ざら
にＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液７ｍＱ−を３
分間かけてゆっくりと遠心管を回転させながら加えた。

この時点で培養液をざらに加え２００Ｘ１０６個の細胞
が５０７＋ＩＱの培養液に含まれるように調製しこの細
胞懸濁ＷＪｉ　Ｏ、１ｍＬづつを９６穴マイクロプレー
トに分注し、１０％ＣＯＺ下で３７°Ｃ（１００％相対
湿度）で培養した。なおマイクロプレートには予めマウ
スの貧食細胞を１０４個／ウェルの割合で加えておき、
またＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液には分注時
に既にＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン　Ａニアミノプテリ
ンＴ：チミジン）を含むものを用いた。この改良法によ
ると少なくとも５日目まで培養液を換える必要がなく、
バクテリアの混在のチャンスも少なくすることが出来、
５日前後までにはハイブリドーマのコロニーが認められ
た。１０〜２５日後にこの培養液上清を０　、２　ｍＬ
取り目的抗体のスクリーニングに用いた。スクリーニン
グはコラーゲン実験法（講談社４９６ページ）の方法に
従った。すなわちヒトＩＶ型コラーゲンの１００μｇ／
ｍｌ、リン酸緩衝液溶液を塩化ビニル製マイクロプレー
トの各穴に１滴ずつ加え一晩４°Ｃで放置した。ヒトＩ
Ｖ型コラーゲン溶液を除去した後に１０％ＦＣＳ−ＰＢ
Ｓ溶液をピペットで３滴各穴に加え１時間ブロッキング
を行った。ブロッキング溶液を除去した後各ハイブリド
ーマコロニーの上清を１滴ずつ別々の所定の穴に加えた
。１時間反応させた後上清を除去しＰＢＳで３回洗浄し
た。

二次抗体としてＦＩＴＣ（フルオレッセイン　イソチオ
シアネート）でラベルした抗マウスＩｇＧ　（Ｆ　（Δ
Ｂ）２フラグメント）溶液を加え３０分放置し、二次抗
体溶液を除去して充分洗浄した。上記検体上清の中から
蛍光を発するものを選び、これに対応するハイブリドー
マを３種得、これらハイブリドーマを制限希釈法により
クローニングした。まずハイブリドーマが１ｗｅｌｌあ
たり０．３個、１．０個、３個となる様に培養液で希釈
した。このとき、１ｗｅｌｌあたり１００万個の胸腺細
胞を加えて正確に希釈できるようにした。マイクロプレ
ートは３７°Ｃで１０％ＣＯ２１００％相対湿度の条件
で培養した。５日目に検鏡し１ｗｅｌｌ中に１個のコロ
ニーを含むものをチェックしておき、２週間で生育した
ところで同様の制限希釈を繰返した。

この操作を３回繰返して最終的に１種類のコロニーを選
択し、コロニーを通常の培養器にうつしかえ、夫々５ｍ
ｌの培養液で５×１０６個／ｒｒＬになるまで培養した
。コロニーの培養１色を遠心管に移し１５００ｒｐｍで
５分間遠沈させ、上清と細胞を分離し、細胞にはＲＰＨ
Ｉ−１６４０培養液をあらたに０　、５　ｍＬ加えゆっ
くり懸濁させな。この細胞懸濁液に４．５ｍｌのＦＣＳ
を含むＲＰ１４Ｉ−１６４０培養液でを加え継代培養し
た。すなわち、１×１０６個を５ｍＬのＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ培養液に懸濁きせ５％Ｃ０゜３７°０１００％相
対湿度の条件で培養する。６０時間後５×１０６個に増
殖しこの操作で１代の培養となる。

この細胞を遠心分離で培養液と分離し新しい培養液を加
えて希釈する。１×１０６個／ｍＱ−に希釈された細胞
１芭濁液１ｍｌに４ｄの培養液を加えるという操作で継
代培養される。１０代継代培養された５０ｍＬの培養液
から遠心分離により５×１０７個の細胞を得、５店の培
養液に＋ｕ４濁させた。これを回転培養ビン１０本に分
注し５％Ｃ０９３７°Ｃ１００％相対湿度１ｒｐｍの条
件で５日間培養した。５×１０６個／ｍＬに達した培養
液から遠心分離で細胞を除き吸引濾過し、濾液に硫酸ア
ンモニウムを加え４５％として沈殿物をえた。沈殿物は
さらにプロティンＡにより精製した。計１５１の培養液
から７３ｍ＆の抗ヒトＶｌ型コラーゲンモノクローナル
抗体を粉末としてえた。この抗ヒトＶＩ型コラーゲンモ
ノクコーナル抗体１よ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動て単一のバンドでありＫＪ１９９と名付けた。

［実施例２］ ＫＪ　１９９の性質を調べた。

ａ）ＫＪ１９９の反応特異性 各種抗原を１μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝液に溶
解しこれらの溶液を０　、１　ｍＱ−正確に塩化ビニル
製マイクロプレートの各ウェルに滴下し４°Ｃで一夜放
置した。抗原溶液を除去した後１０χウシ胎児血清を０
．５ｒｒＬ各ウエルに加え、１時間ブロッキングした。

ブロッキング溶液を除去した後、１０μｇ／ｍｌに調製
したＫＪ　１９９を０　、１　ｍＬ各ワウエル滴下し１
時間反応させた。リン酸緩衝液でよく洗浄した後二次抗
体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃ
ａｐｐｅ！社製）を０．２ｍｌずつ各ウェルに加え１時
間反応させた。二次抗体溶液を除いた後、リン酸緩ｊｊ
液で４回洗；ヤし、０．００１χ過酸化水素を含む基質
溶液を０　、１　ｍＬ各ワウエル加えた。基質溶液は０
−フェニレンジアミンを使用直前に０．１Ｍクエン酸−
０，２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４，８）に溶解し０．４ｍ
ｇ／ｍＭとしたものを用いた。１０分後、各ウェルに２
０μｍの８Ｍ硫酸溶液を加え反応を停止させ、マイクロ
プレート光度計で４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果
を表１に示す。

（以下金白） （表１） 抗ヒト■型コラーゲンモノクローナル抗体ＫＪ１９９の
各種抗原に対する認識特異性 ＊数値は使用したリン酸緩衝液の４９２ｎｍの吸光度を
ｏ、ｏＯとした場　合の各サンプルの吸光度 ＊Ｓ　Ｐ　２　／　Ｏは対照としてミエローマ細胞の培
養液をサンプルとしたもの 表１から明らかなようにＫＪ１９９はヒト由来の他の型
のコラーゲン、すなわちヒト■型コラーゲン、ヒトＩＩ
Ｉ型コラーゲン、ヒト■型コラーゲンや、牛ｌＶ型コラ
ーゲン、は認識せず、ヒトフィブロネクチン、ヒトラミ
ニン、マウスラミニンも認識しなかった。

ｂ）組繊切片に対する反応特異性 ３８才女性の子宮頚部組織から採取されたヒト子宮頚癌
組織、ヒト子宮頚部正常組織の凍結切片（厚さ７μｍ）
をスライドグラスにのせ、０　、２　ｍＱ、のＫＪ１９
９溶液を滴下し室温で３０分放置したのも０゜１Ｍ　ｐ
Ｈ７，０の４９Ｃリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄し
た。これにフルオレツセイン標識抗マウスＩｇＧ抗体（
タボ社製）を０　、２　ｍＱ−滴下し室温で３０分放置
したのちリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。よく
水を切ったのも５０％グリセリンを滴下しカバーグラス
をかぶせた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）
で観察した。その結果ＫＪ１９９はヒト子宮頚部正常組
織では基底膜に沿ってＩＶ型コラーゲンに反応し帯状に
蛍光を発していたが、ヒト子宮頚癌組織では組織−面弥
漫性の蛍光発色を認め、明らかに正常組織と癌組織を識
別することが可能であった。０ 次に、ヒトＩＶ型コラーゲン分解物に対する反応特異性
を調べた。

Ｃ）ヒトｌｖ型コラーゲン分解物の調製ヒトＩＶ型コラ
ーゲンの５００μｇ／ｍｌ、０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝
液（５＋ｎＭ塩化カルシウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム
、１０ｍＭ　　Ｎ−メチルマレイン酸を含む）溶液に、
ＣｏｉｌａｇＣｏｌｌａ　ＦｏｒｍｌｌＩ　（ａｄｖａ
ｎｃｅ　ｂｉｏｆａｃｔ、ｕｒｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ社製）１００ユニツトを３７℃２時間作用させた
後４℃とじ１０ｍＭ　ＥＤＴＡを１滴加えて反応を停止
させた。

ｄ）ヒトＩＶ型コラーゲン分解物に対する反応特異性 実験方法はコラーゲン実験法（講談社５００ページ）に
記載のイムノブロッティング法に従った。上記方法で作
成したヒトＩＶ型コラーゲン分解物を定法により５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。このゲル
の上にニトロセルロース膜フィルターを二枚重ね、転移
用１１（［？ｒ！！、（１０％メチルアルコール−２５
ｍＭ　トリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８，３））で４０
ｍＡ、２時間泳動を行った。ゲルに接している側のフィ
ルターは免疫反応に、もう一枚は蛋白質バンドの染色用
に用いた。免疫反応用のフィルターは１０ｍ１の１０％
ＦＣＳ−リン酸緩衝液でブロッキングを行ないパラフィ
ルム上に乗せた。ＫＪ　１９９溶液を０．５ｍｌフィル
ター上に加えざらにバラフィルムをのせて１時間反応さ
せた。反応後、リン酸緩衝液で３回洗浄して、二次抗体
としてペルオキシダーゼＦ−６３抗マウスＩｇＧ抗体（
Ｃａｐｐｅ１社製）を０．５ｍｌ加え１時間反応させた
。反応後リン酸緩衝液で１回、Ｔｗｅｅｎ８０−リン酸
緩（チｊ液で２回、ざらにリン酸緩（φｉ液で１回洗浄
した。これに基質溶液として３ｍｇ／ｍｌ　　４−クロ
ロ−１−ナフトールのメチルアルコール溶液５ｍｌ、リ
ン酸緩衝（ｒ５．２５ｍ１．３０％過酸化水素水１０ｕ
ｌを直前に混合したものを加えて５分反応させフィルタ
ーを蒸留水中に移して反応を停止させた。これと蛋白質
バンドの染色の結果を比較するとＫＪＩ９９は分解され
たヒトＩＶ型コラーゲンの分子量５０００以上の断片を
認識していた。イムノブロツチングの結果を図１に示す
。ｅ）ＫＪ１９９の分子量ＫＪ　１９９の分子量は５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動から１４００００
〜１６００００であった。

ｆ）ＫＪ１９９の免疫グロブリン・クラスＫＪ１９９の
免疫グロブリン・クラスの同定はオクタコロニー二重免
疫拡散法により行ない、ＩｇＧ２ａであると判明した。

［実施例３１ モノクローナル抗体ＫＪ１９９を用いた直接蛍光抗体法
用の癌診断試薬を以下に述べる。

実施例１で得られたＫＪ１９９を２０ｍｇ秤量し２０ｍ
Ｌの０．０５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３−１４ａＨＣＯ３緩衝液
に溶解させた。２ｍｇのフルオレッセインイソシアネー
ト（以下ＦＴＴＣ，シグマ社製）を２０ｍＬの０．０５
Ｍ　Ｎａ２Ｃ０３−ＮａｌｔＣＯ３緩南液に溶ＭさせＫ
Ｊ１９９溶液と混合し、４°Ｃで撹拌しながら一晩反応
させた。反応生成物を０．ＯＩＭリン酸緩衝液で平衡化
した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５にかけ同じ０．０１Ｍ
リン酸緩衝液で溶出して未反応のＫＪ１９９とＦＩＴＣ
の結合したＫＪ１９９を溶出させた。次に、０．０１１
４リン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム
に溶出画分をかけ０．０１Ｍリン酸緩衝液で未反応のＫ
Ｊ１９９だけを溶出させた。カラムに残ったＦＩＴＣ結
合ＩｇＧは、０．０５ＨのＮａＣｌを含む０．０１１４
リン酸緩衝液で溶出して２０ｍｔの溶液として得られた
。２８０ｎｍの紫外吸収からＫＪ１９９を１０ｍｇ含む
ことがわかった。このＫＪ１９９溶液をリン酸緩ｔｌｊ
液で１００倍に希釈して癌診断薬ＫＪ１９９−ａとした
。

［実施例４コ 蛍光標識したＫＪ１９９−ａのヒト■型コラーゲンに対
する反応性を測定した。実施例１で調製したヒト■型コ
ラーゲンを用いて５　、０ｍｇ／　ｍｌ　、　２．５ｍ
ｇ／ｍＬ　、１　、０ｍｇ／　ｍｌのリン酸緩衝液溶液
を調製した。この抗原溶液をリン酸緩（ｇｊ液で希釈し
てゆき、５０００ｎｇ／ｍｉ、２５００ｎｇ／ｍｔ、１
１０００ｎ／鑓、５００ｎｇ／　ｍＬ　、１１００ｎ／
　ｍ区、５０ｎｇ　／　ｍｉｚ　１０　ｎ　ｇ　／　ｍ
ｉ　％の溶液を調製した。これらの溶液を０．１ｍＬｍ
ｌ正確化ビニル製マイクロプレートの各ウェルに滴下し
４°Ｃで一夜放置した。抗原溶液を除去した後１０χウ
シ胎児血清を０　、５　ｍｌ各ウェルに加え、１時間ブ
ロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、実施
例２で作成したＫＪ１９９−ａを０．１鑓各ウエルに滴
下し１時間反応させな。リン酸緩衝液でよく洗浄した後
よ（水を切り、０　、１　ｍｌのリン酸緩衝液を加えた
。フルオロスキャン（フロララボラトリーズ社製）で４
０５ｎｍの吸光度を測定したところ、ＫＪ１９９−ａば
少なくとも５ｎｇ／ｍＬのヒト■型コラーゲンを認識す
ることがわかった。吸光度を図２に示す。

［実施例５］ ＫＪ１９９を用いた直接酵素抗体法用の癌診断薬を以下
に述べる。

ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏ
ｘｄａｓｅ　ＴｙｐｅＩＩシグマ社製）５ｍｇを０．３
Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液ｐＨ８，１，１，０ｍ１ｌ
に溶解しこれに１００％エタノールに溶解した１ｚのフ
ルオロニトロベンゼン液０．１ｄを加え室温でゆっくり
混和させた。ざらに０．０５ＭのＨａＩ０４溶液１．０
鑓を加え室温で３０分反応させた。クエンチングのため
０．２Ｍのエチレングライコール溶液を１．Ｏｄ加え室
温で１時間放置した。反応液は充分量の０．ＯＩＭ　ｐ
Ｈ９，５の炭酸ナトリウム緩衝液で４°Ｃのもとで透析
しペルオキシダーゼ−アルデヒド溶液とした。次に実施
例１で得られた抗ヒトＶＩ型コラーゲンモノクローナル
抗体Ｋ　Ｊ　１９９．５ｍｇを１鑓の炭酸ナトリウム緩
衝液に溶解させ３ｍｇ−のペルオキシダーゼ−アルデヒ
ド溶液３１ｎｔに加え室温で３時間混和した。ざらにこ
の溶液に５ｍｇのＮａＢＨ＋を加え４°Ｃで一晩放置し
た。反応生成物はリン酸水で透析しセファデックスＧ−
２０００カラムで精製した。

目的とする両分は蛋白質を２８０ｎｍ、ペルオキシダー
ゼを４０３ｎｍの紫外吸収で追跡し両者が一致する両分
を分取することにより得られた。この画分はＫＪ１９９
を４．８ｍｇを含むリン酸緩衝液６鑓であった。このＫ
Ｊ　１９９溶液リン酸緩衝液で１００倍に希釈して癌診
断薬ＫＪ　１９９−ｂとした。

［実施例６］ 酵素標識したＫＪ１９９−ｂのヒトＩＶ型コラーゲンに
対する反応性を測定した。実施例４と同様に実施例１で
調製したヒトＩＶ型コラーゲンを用いて５．０ｍｇ／ｍ
ｉ、２．５ｍｇ／ｍｅ、１．０ｍｇ／ｍ区のリン酸緩衝
液溶液を調製した。この抗原溶液をリン酸緩衝液で希釈
してゆき、５０００ｎｇ／　ｍｌ　１２５００ｎｇ／　
ｍ（Ｌ　、　１１０００ｎ／　ｍＱ、　、５００ｎｇ／
　ｍｉ　Ｎ　１００　ｎ　ｇ　／　ｍｉ　、５０　ｎ　
ｇ　／　ｍＱ−，１０ｎ　ｇ　／　ｍｌ　、の溶液を調
製した。これらの溶液を０　、１　ｍｌ正確に塩化ビニ
ル製マイクロプレートの各ウェルに滴下し４°Ｃで一夜
放置した。抗原溶液を除去した後１０％ウシ胎児血清を
０゜５ｍｌ各ウェルに加え、１時間ブロッキングした。

ブロッキング溶液を除去した後、実施例５で作成したＫ
Ｊ　１９９−ｂ＠０．１鑓各ウエルに滴下し１時間反応
させた。リン酸緩衝液でよく洗浄した後０．００１％過
酸化水素を含む基質溶液を０　、１　ｍＬ各ウェルに加
えた。基質溶液は０−フェニレンジアミンを使用直前に
０．１Ｍクエン酸−０，２Ｍリン酸緩衝液（ｐ１１４．
８）に溶解し０．４ｍｇ／ｍｔとしたものを用いた。１
０分後、各ウェルに２０μｍの８Ｍ硫酸溶液を加え反応
を停止させ、マイクロプレート光度計で４９２ｎｍの吸
光度を測定した。その結果少なくとも５ｎｇ／ｍｔのヒ
トＩＶ型コラーゲンを認識することがわかった。吸光度
を図３に示す。

［実施例７コ ＫＪ　１９９−ｂのヒトＩＶ型コラーゲン分解物に対す
る反応性を測定した。実施例１で調製したヒト■型コラ
ーゲン分解物を用いて５　、０ｍｇ／鑓、２．５ｍｇ／
ｒＲｔ、１．０ｍｇ／ｍｌのリン酸緩（！７液溶液を調
製した。この抗原溶液をリン酸緩衝液で希釈してゆき、
５０００ｎｇ／ｍｔ、２５００ｎｇ／ｍｉ、１１０００
ｎ／ｍ区、５００ｎｇ／　ｍＯ−、１１００ｎ／　ｍＬ
　、　５０ｎｇ／　ｍＬ　、　１０ｎｇ／　ｍＬ　、の
溶液を調製した。これらの溶液を０．１ｒｎｌ正確に塩
化ビニル製マイクロプレートの各ウェルに滴下し４°Ｃ
で一夜放置した。抗原溶液を除去した後１０χウシ胎児
血清を０　、５　ｍｌ各ウェルに加え、１時間ブロッキ
ングした。ブロッキング溶液を除去した後、実施例５で
作成したＫＪ　１９９−ｂを０　、１　ｍＬ各ウェルに
滴下し１時間反応させた。

リン酸緩衝液でよく洗浄した後０．００１％過酸化水素
を含む基質溶液を０．１ｍｌｍｌ上ルに加えた。基質溶
液は○−フェニレンジアミンを使用直前に０．１Ｍクエ
ン酸−０，２１４リン酸緩（すｊ液（ｐＨ４，８）に溶
解し０．４ｍｇ／ｍｌとしたものを用いた。１０分後、
各ウェルに２０μｌの８Ｍ硫酸溶液を加え反応を停止さ
せ、マイクロプレート光度計で４９２ｎｍの吸光度を測
定した。その結果少なくとも５ｎｇ／ｍｌのヒト■型コ
ラーゲン分解物を認識することがわかった。吸光度を図
４にしめす。

［試験例１］ 癌診断薬ＫＪ　１９９−ｂが胃癌の診断に有効かどうか
試験した。試験に用いる検体は健常人より採取した血清
５０検体および胃癌患者より採取した血清５０検体であ
る。血清の調製は以下の方法によった。採取した血液を
４℃、３０００ｒｐｍＸ１０分で遠心分離し血清ををえ
た。血清をリン酸緩衝液で１０００００倍に希釈し、１
検体１ウェルとなるように塩化ビニル製マイクロプレー
トに０　、１　ｍＬずつ分注した。ＫＪＩ９９−ｂを使
って血清中のヒト■型コラーゲン分解物の量を測定した
４９２ｎｍの吸光度から血清中のヒト■型コラーゲン分
解物の濃度を算出すると、３．６６±０．３２ｍｇ／ｍ
Ｌの範囲に入る群５０検体と、４．８９±０゜４４ｍｇ
／ｍｌｊの範囲に入る群５０検体に２別された。症例と
の対応を見ると前者５０検体は健常人の血清であり、後
者５０検体は胃癌患者の血清であった。この結果から、
血清中のヒト■型コラーゲン分解物の濃度をＫＪ１９９
−ｂを使って測定することにより明確に健常人と胃癌患
者を区別することができた。

［試験例２コ 癌診断薬ＫＪ１９９−ｂがヒト子宮頚部癌の診断に有効
かどうか試験した。試験に用いる検体は健常人より採取
した血清５０検体および子宮頚部癌患者より採取した血
清５０検体である。試験例１と同様の方法で調製した血
清をリン酸緩衝液で１０００００倍に希釈し、１検体１
ウェルとなるように塩化ビニル製マイクロプレートに０
．１ｍｒずつ分注した。ＫＪ　１９９−ｂを使って血清
中のヒトＩＶ型コラーゲン分解物の量を測定した４９２
ｎｍの吸光度から血清中のヒトＩＶ型コラーゲン分解物
の濃度を算出すると、３．８２±０．２９ｍｇ／ｍＬの
範囲に入る群５０検体と、４．００±０．３８ｍｇ／ｍ
Ｌの範囲に入る群５０検体に２別された。症例との対応
を見ると前者５０検体は健常人の血清であり、後者５０
検体は子宮頚部癌患者の血清であった。この結果から、
血清中のヒトＩＶ型コラーゲン分解物の濃度をＫＪ　１
９９−ｂを使って測定することにより明確に健常人と子
宮頚部癌患者を区別することができた。

［実施例８］ ラジオアイソトープでＫＪ　１９９を標識した癌診断薬
を以下に示す。Ｎａ１２５Ｉの０．５ｍＣ１−０，４Ｍ
リン酸緩（對ｔｌ　’を容ンｐｉｌｏμｌにＫＪ　１９
９を１０ｍｇ／ｍｌリン酸緩Ｉｆｊ液１０μｍ加え、ざ
らに１ｍｇ／ｍｌのクロラミンＴリン酸緩衝液溶液を１
０μｌ加え６０秒間室温で振盪した。１ｍｇ／ｍｌのメ
タ重亜硫酸ナトリウムリン酸緩衝液溶液を１０μ！加え
反応を停止させな。

１分後１０ｍｇ／ｍｌのヨウ化カルウムリン酸緩（封液
）容；夜を１０μｌおよび０．２％ウシ血清アルブミン
を５００μｌ加えゲル濾過により精製し、３０ｍｃｉ／
ｍｌのＫＪ１９９リン酸緩衝液溶液をえた。これを以て
癌診断薬ＫＪ１９９−ｃとした。

［実施例９１ ＫＪ１９９を用いた間接蛍光抗体法用の癌診断薬を以下
に示す。ＫＪ１９９の１０μｇ／ｍｌリン酸緩衝液溶液
を一次抗体とし、ローダミン標識抗マウスＩｇＧ抗体（
タボ社製）を二次標識抗体として癌診断薬Ｋ　Ｊ　１．
９９−　ｄとした。

［実施例１０］ 間接蛍光抗体法用の癌診断薬を以下に述べる。標識され
る二次抗体は非標識抗マウスＩｇＧ抗体（タボ社製）で
ある。酵二の標識法と精製法は実施例５に準じた。ＫＪ
１９９の０．１％リン酸緩衝液溶液とここで作製したペ
ルオキシダーゼＰ　ｉ抗マウスＩｇＧ抗体をもって癌診
断薬ＫＪ１９９−ｅとした。

［実施例１１］ ＫＪ１９９用いた間接ラジオイムノアッセイ用癌診断薬
を以下に示す。ＫＪ　１９９の０．１％０．１Ｍ　ｐＨ
６，８リン酸緩（チｊ液溶液を一次抗体とし　１２５丁
標識抗マウスＩｇＧ抗体（タボ社製）を二次抗体として
癌診断薬ＫＪ１９９−ｆとした。

［試験例３］ 実施例９の癌診断薬ＫＪ　１９９−ｄがヒト子宮頚部癌
の組織診断に有用であるかどうか試験した。

子宮頚癌患者（５０才、女性）の子宮頚部組織から採取
されたヒト子宮頚癌組織、ヒト子宮頚部正常組織の凍結
切片（厚き７μｍ）をスライドグラスにのせる。これら
組織はすでに専門医師が上記２つの状態に判定したもの
である。それぞれの標本に０．２ｍｔのＫＪ１９９溶液
を滴下し室温で３０分放置したのも０．１Ｍ　ｐＨ７，
０の４°Ｃリン酸緩（町１夜で３回、計１５分洗ｉＤ　
Ｌな。これにフルオレッセイン［７ｌｊ抗マウスＩｇＧ
抗体（タボ社製）を０　、２　ｍＬ滴下し室温で３０分
放置したのちリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。

よく水を切ったのも５０％グリセリンを滴下しカバーグ
ラスをかぶせた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学社
製）で観察した。その結果ＫＪ　１９９−ｄはヒト子宮
頚部正常組織では基底膜に沿ってＩＶ型コラーゲンに反
応し帯状に蛍光を発していたがヒト子宮頚癌組■ｔでは
組織−面弥漫性の蛍光発色を認め、明らかに正常組織と
癌組織を識別することが可能であった。同様に３３才か
ら５９才までのヒト子宮頚癌患者２０名の組織を観察し
た結果全ての検体について正常組織と癌組織を識別する
ことができた。従って、間接蛍光抗体法用の癌診断薬Ｋ
ＪＩ９９−ｄがヒト子宮頚癌の組織診断に有効であるこ
とがわかった。

［実施例１２１ 実施例１で調製したヒトＩＶ型コラーゲンの溶（々を０
．２ｍＭ、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内注射した。同様
の免疫を２回繰返したのち肋膜を取り出しマウスミエロ
ーマ細胞と融合させた。細胞融合およびクローニングの
操作は実施例１に従った。目的の抗体を生産する細胞の
コロニーは５ｍ１ｌのＦＣＳを含むＲＰ）４Ｉ−１６４
０培養液で継代培養した。すなわち、ｌＸ１０６！を５
ｍＱ−のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培養液に懸濁させ５χＣ
Ｏ２３７°Ｃ１００％相対湿度の条件で培養する。６０
時間後５ｘｌＯＩ３個に増殖しこの操作で１代の培養と
なる。この細胞を遠心分離で培Ｍｔａと分離し新しい培
養液を加えて希釈する。１×１０６個ｌｔｒ＆に希釈さ
れた細胞１賢濁液１ｍｆｔに４ｍＮの培養液を加えると
いう操作で継代培養される。１０代継代培養された５０
ｒｒＬの培養液から遠心分離により５×１０７個の細胞
を得、５Ｉ！、の培養液に懸濁させた。これを回転培養
ビン１０本に分注し５％Ｃ０２３７°Ｃ１００％相対湿
度１ｒｐｍの条件で５日間培養した。５×１０６個／ｍ
ｒに達した培養液から遠心分離で細胞を除き吸引濾過し
、ａ液に硫酸アンモニウムを加え４５χとして沈殿物を
えた。

沈殿物はざらにプロティンＡにより精製した。計１５Ｌ
の培養液から９２ｍｇの抗ヒトＶｒ型コラーゲンモノク
ローナル抗体を粉末としてえた。この抗ヒトＶｌ型コラ
ーゲンモノクローナル抗体は５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動て単一のバンドでありＫＪ　１３２と名
付けた。

［実施例１３］ Ｋ　、Ｊ　１３２の性質を調べた。

ａ）ＫＪ　１３２の反応特異性 実施例２の方法に従いＫＪ　１３２の各種抗原に対する
反応特異性を調べた。その結果を表２に示す。

（以Ｔ−余白） （表２） 抗ヒトＶＩ型コラーゲンモノクローナル抗体Ｋ　、Ｊ１
３２の各種抗原に対する認識特異性 ＊数値は使用したリン酸緩衝液の４９２ｎｍの吸光度を
０．００とした場　合の各サンプルの吸光度 ＊Ｓ　Ｐ　２　／○は対照としてミエローマ細胞の培養
液をサンプルとしたもの 表２から明らかなようにＫＪ１３２はヒト由来の他の型
のコラーゲン、すなわちヒト■型コラーゲン、ヒトＩＩ
Ｔ型コラーゲン、ヒト■型コラーゲンや、牛ＩＶ型コラ
ーゲンは認識せず、ヒトフィブロネクチン、ヒトラミニ
ン、マウスラミニンも認識しなかった。

ｂ）組織切片に対する反応特異性 ５１才女性から採取されたヒト子宮頚部正常組織および
ヒト子宮頚癌組織、の凍結切片に対し実施例２と同じ間
接蛍光法により反応特異性を調べたところＫＪ　１３２
はヒト子宮頚部正常組織では基底膜に沿ってＩＶ型コラ
ーゲンに反応し帯状に蛍光を発していたが、ヒト子宮頚
癌組織には反応しなかった。

次に、ヒトＩＶ型コラーゲン分解物に対する反応特異性
を調べた。

ヒトｌｖ型コラーゲン分解物の調製およびヒト■型コラ
ーゲン分解物に対する反応特異性の測定は実施例２の方
法に従った。その結果ＫＪ　１３２はヒｈ　ＩＶ型コラ
ーゲン分解物のうち分子量７００００未満の断片は認識
しなかった。結果を図５に示す。

ｃ）ＫＪ　１３２の分子量 ＫＪ　１３２の分子量は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動から１４００００〜１６００００であった。

ｄ）ＫＪ１３２の免疫グロブリン・クラスＫＪ　１３２
の免疫グロブリン・クラスの同定はオクタコロニー二重
免疫拡散法により行ない、、　ＩｇＧ２ａであると判明
した。

［実施例１４コ モツクローナル抗体ＫＪ１３２を用いた直接蛍光抗体法
用の癌診断薬を以下に述べる。

実施例１２で得たＫ　Ｊ　１３２．２０ｍｇを用い実施
例３の方法に従い蛍光標識されたＫＪ１３２を０．０５
ＸのＮａＣＱ、を含む０．ＯＩＭリンリン酸緩衝液？Ｎ
　１８　ｍＬのとして得た。この溶液は２８０ｎｍの紫
外吸収からＫＪ１９９を１１ｍｇ含むことがわかった。

これをリン酸緩衝液で１００倍に希釈して癌診断薬ＫＪ
１３２−ａとした。

［実施例１５１ ＫＪ１３２−ａのヒトＩＶ型コラーゲンに対する反応性
を実施例３の方法に従って測定した。ヒト■型コラーゲ
ンの各希釈溶液に対する発光度を測定したところ、少な
くとも５ｎｇ／ｍｉのヒトＩＶ型コラーゲンを認識する
ことがわかった。吸光度を図６に示す。

［試験例４］ 実施例１４の癌診断薬ＫＪ１３２−ａがヒト子宮頚癌の
組織診断に有効かどうか試験した。子宮頚癌患者（４５
才、女性）の子宮頚部組織から採取されたヒト子宮頚癌
組織、ヒト子宮頚部正常組織の凍結切片（厚き７μｍ）
をスライドグラスにのせる。これら組織はすでに専門医
師が上記２つの状態に判定したものである。それぞれの
標本に０　、２　ｒｒＬのＫＪ１３２−ａを滴下し室温
で３０分放置したのも０．１ＭｐＨ７，０の４°Ｃリリ
ン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。よく水を切った
のも５０％グリセリンを滴下しカバーグラスをかぶせた
。これを蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）で観察した
。ヒト子宮頚部正常組織では基底膜に沿って■型コラー
ゲンに反応して帯状の蛍光が観測されたが、ヒト子宮頚
癌組織では蛍光の発光はｉｊｔ！測されなかった。上記
方法で３６オから５６オまでの子宮頚癌患者２０名の子
宮頚部正常組織および子宮頚部癌組織について癌診断薬
ＫＪ１３２−ａの特異性を試験した。その結果ヒトＩｖ
型コラーゲンに対する蛍光発光が観察されたものは全て
子宮頚部正常組織であり、蛍光発光が観察されないもの
はすべてヒト子宮頚癌組織であった。これで、直接蛍光
抗体法用の癌診断薬ＫＪ１３２−ａはヒト子宮頚部癌の
組織検査に有効であることがわかった。

［実施例１６］ ＫＪ　１３２を用いた直接酵素抗体法用の癌診断薬を実
施例４の方法に従い作成した。実施例１２で得られたＫ
Ｊ１３２．５ｍｇよりペルオキシダーゼで標識きれたＫ
Ｊ　１３２を４．０ｍｇを含むリン酸緩７１１（々７ｍ
Ｍ得た。このペルオキシダーゼで標識されたＫＪ１３２
溶液をリン酸緩ｉ±１液で１００倍に希釈して癌診断薬
ＫＪ　１３２−ｂとした。

［実施例１７］ ＫＪ　１３２−ｂのヒトＩＶ型コラーゲンに対する反応
性を実施例６の方法に従って測定した。マイクロプレー
ト光度計で各ヒトＩＶ型コラーゲンの希釈溶液に対応す
るウェルの４９２ｎｍの吸光度を」１１定した結果、少
なくとも５ｎｇ／ｍｉのヒト■型コラーゲンを認識する
ことがわかった。吸光度を図７にしめす。［試験例５］ ＫＪ１３２−ｂで子宮頚部癌を診断できるか否かを試験
した。子宮頚癌患者（５９才、女性）の子宮頚部組織か
ら採取されたヒト子宮頚癌組織、ヒト子宮頚部正常組織
の凍結切片（厚き７μｍ）をスライドグラスにのせる。

これら組織はすでに専門医師が上記２つの状態に判定し
たものである。それぞれの（７本にＫＪ　１３２−ｂを
０．２鑓滴下し室温で３０分間放置し、０．ＩＭ　　ｐ
ｔ（６，８の４°Ｃリン酸緩ｉチ１液で３回、計１５分
洗浄した。これを基質溶液中に３０分浸漬した。基質溶
液はジアミノベンチジン２５ｍｇを０．００５χの過酸
化水素を含む０．０５Ｍ　ｐＨ７，６のトリス緩（４ｊ
液１００ｍｔに溶解させ調製した。染色が完了した後リ
ン酸緩衝液で３回、計１０分間洗浄を行ない５０％グリ
セリンを滴下してカバーグラスでおおった。

顕微鏡下、茶褐色に染色された標本を観察した。

その結果ヒト子宮頚部正常組織では基底膜に沿って帯状
にヒト■型コラーゲンに対する呈色が観察されたがヒト
子宮頚癌組織では呈色が観察されなかった。上記方法で
４１才から５９才までの子宮頚癌患者２０名の子宮頚部
正常組織および子宮頚部癌組織について癌診断薬ＫＪ　
１３２−ｂの特異性を試験した。その結果ヒト■型コラ
ーゲンに対する呈色が観察されたものは全て子宮頚部正
常組織であり、呈色が観察されないものはすべてヒト子
宮頚癌組織であった。これで、間接酵素抗体法用の癌診
断薬ＫＪ　１３２−ｂはヒト子宮頚部癌の組織検査に有
効であることがわかった。

［実施例１８］ 実施例８と同じ方法でラジオアイソトープでＫＪ１３２
を標識した癌診断薬ＫＪ１３２−ｃを作成した。

［実施例１９］ ＫＪ　１３２を用いた間接蛍光抗体法用の癌診断薬を以
下に示す。ＫＪ１３２の１０μｇ／ｍｌリン酸緩衝液溶
液を一次抗体とし、ローダミン標識抗マウスＩｇＧ抗体
（タボ社ＩＡ）を二次標識抗体として癌診断薬ＫＪ　１
３２−ｄとした。

［試験例６］ ＫＪ　１３２−ｄがヒト子宮頚部癌の組織診断に有用で
あるかどうか試験した。子宮頚癌患者（４４才、女性）
の子宮頚部組織から採取されたヒト子宮頚癌組織、ヒト
子宮頚部正常組織の凍結切片（厚き７μｍ）をスライド
グラスにのせる。これら組織はすでに専門医師が上記２
つの状態に判定したものである。それぞれの標本に０　
、２　ｒｒＬのＫＪ　１３２溶液を滴下し室温で３０分
放置したのも０．１Ｍ　ｐＨ７，０の４゜Ｃリン酸緩衝
液で３回、計１５分洗浄した。これにフルオレッセイン
標識抗マウスＩｇＧ抗体（タボ社製）を０　、２　ｒｎ
Ｑ−滴下し室温で３０分放置したのちリン酸緩衝液で３
回、計１５分洗浄した。よく水を切ったのち５０χグリ
セリンを滴下しカバーグラスをかぶせた。これを蛍光顕
微鏡（オリンパス光学社製）で観察した。その結果ＫＪ
　１３２−ｄはヒト子宮頚部正常組織では基底膜に沿っ
てヒトｔＶ型コラーゲンに反応し帯状に蛍光を発してい
たがヒト子宮頚癌組織では組織−面弥漫性の蛍光発色を
認め明らかに正常組織と癌組織を識別することが可能で
あった。

同様に３６オから５７オまでのヒト子宮頚癌患者２０名
の組織を観察した結果全ての検体について正常組織と癌
組織を識別することができた。従って、間接蛍光抗体法
用の癌診断薬ＫＪ　１３２−ｄがヒト子宮頚癌の組織診
断に有効であることがわかった。

［実施例２０］ 間接酵素抗体法用の癌診断薬を以下に示す。ＫＪ１３２
の０．ＩＸリン酸緩衝液溶液を一次抗体とし、アルカリ
フォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（タボ社製）
を二次標識抗体として癌診断薬ＫＪ１３２−ｅとした。

［実施例２１］ ＫＪ　１３２用いた間接ラジオイムノアッセイ用癌診断
薬を以下に示す。ＫＪ１３２の０．１％０．１Ｍ　ｐＨ
６，８リン酸緩衝液溶液を一次抗体とし、１２５工標識
抗マウスＩｇＧ抗体（タボ社製）を二次抗体として癌診
断薬ＫＪ１３２−ｆとした。

［発明の効果コ 本発明のモノクローナル抗体ＫＪ１９９を用いて作成さ
れた癌診断薬は血中の■型コラーゲン分解物の濃度を測
定し、各種癌の診断に有用である他、癌の組織診断にお
いても正常組織と癌組織の識別を行うのに有用である。

またＫＪ　１３２を用いて作成きれた癌診断薬は癌の組
織診断においても正常組織と癌組織の識別を行うのに有
用であ

【図面の簡単な説明】

第１図はＫＪ１９９のヒトＩＶ型コラーゲン分解物に対
するイムノブロッチングの結果を示す。 第２図はＫＪ１９９−ａが各濃度のヒト■型コラーゲン
に反応したときの４０５ｎｍの吸光度を示す。 第３図はＫＪ　１９９−ｂが各濃度のヒトＶＩ型コラー
ゲンに反応したときの４９２ｎｍの吸光度を示す。 第４図はＫＪ１９９−ｂが各濃度のヒト■型コラーゲン
分解物に反応したときの４９２ｎｍの吸光度を示す。 第５図はＫＪ１３２のヒト■型コラーゲン分解物に対す
るイムノブロッチングの結果を示す。 第６図はＫＪ１３２−ａが各濃度のヒトＶｌ型コラーゲ
ンに反応したときの４０５ｎｍの吸光度を示す。 第７図はＫＪ　１３２−ｂが各濃度のヒトＶｉ型コラー
ゲンに反応したときの４９２ｎｍの吸光度を示す。 特許出願人　　　　　　株式会社資生堂図面Ｃ・〕〕買
−肩−、ｒ′：二なしン第ｉ口 第２　匹 第３図 ヒト■型コラーゲ゛＞ｅｈ　　１度 】４−図 ヒトＮをコラー七ケ角￥物つ儂ＡＬ ）’Ｃｆｆ１３Ｚｌこよ５ヒト■型コライン６Ｍ４物の
式名代 第６　図 ヒ１−Ｉｖ型コラーデ′ンのジ震度 第７図 ヒトＩＶタコラーデソの、ｌバし 手続補正書（方式） 】、事件の表示 事件との関係　特許出願人 昭和６１年１１月５日（発送日；同月２５日）５、補正
の対宋 願書の特許出願人の欄および図面全図 ６、補正の内容 （１）願書 別紙の通り（記名の後に捺印したもの）（２）図面 願書に添付した図面の浄書（内容に変更なし）手続補正
書（自発） 昭和６２年１月８日 曝

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記性質を有するＪＫ１９９、およびＪＫ１３２
   からなる群より選ばれる抗ヒトIV型コラーゲンモノクロ
   ーナル抗体からなる癌診断薬 （Ａ）ＪＫ１９９の性質 １）本質的にすべてのヒトIV型コラーゲンと特異的に反
   応する ２）分子量が５０００以上のヒトIV型コラーゲン分解物
   を特異的に認識する ３）分子量が１４００００〜１６００００（ＳＤＳ−ポ
   リアクリルアミド電気泳動法）である ４）免疫グロブリンクラスがＩｇＧ２ａである （Ｂ）ＪＫ１３２の性質 １）本質的にすべてのヒトIV型コラーゲンと特異的に反
   応する ２）２−メルカプトエタノールで還元された分子量が７
   ００００未満のヒトIV型コラーゲン分解物を認識しない ３）分子量が１４００００〜１６００００（ＳＤＳ−ポ
   リアクリルアミド電気泳動法）である ４）免疫グロブリンクラスがＩｇＧ２ａである