JPS6287100A - モノクロ−ナル抗体及び該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト子宮頚癌用診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒト子宮頚部の正常組織は認識しないがヒト子
宮頚癌組織ないしはヒト子宮頚癌前癌組織を認識するモ
ノクローナル抗体、およびこれらの抗体を用いたヒト子
宮頚癌の早期診断用の診断試薬またはキットに関する。

［従来の技術］ 従来よりヒト子宮頚癌の早期発見のためにモノクローナ
ル抗体を用いようとする研究がなされてきた。例えば抗
体は１９８２年、Ａｓｈａ　ｌ　Ｉ等は喉頭癌を抗原と
してヒト子宮頚癌を認識するモノクローナル抗体は得た
と報告している（−Ａｓｈａｌｌ　　ｅｔ、　ａｌ、。

Ｌａｎｃｅｔ、　（８２８８）　：　１−６．１９８２
）。ざらに１９８４年にＡｓｈａ　ｌ　１等の抗体を用
いてヒト子宮頚部生検の癌診断が試みられた（Ｆｒａｙ
　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、０ｂｓｔｅｊ。

Ｇｙｎｅｃｏｌ、　０１　（１０）：１０３７−４１．
１９８４）がこの抗体は癌組織のみならず良性の異常増
殖組織も認識するので子宮頚癌特異的抗体とはいえなか
った。そのためＡｓｈａ　Ｉ　１等はその臨床的応用に
限度があるとの結論に達している。Ｍｏｒｒｉｓ等は１
９８３年に抗ケラチン、抗トランスフェリン受容体、抗
１１ＬＡ−ＤＲ，抗ヒトミルク脂肋膜の諸モノクローナ
ル抗体、それに　ＣＥＡ（Ｃａｒｃ　ｉｎｏｅｍｂｒｙ
ｏｎ　ｉｃΔｎｔｉｇｅｎ）を用いて子宮頚部生検試料
の免疫染色を試みた　（Ｍｏｒｒｉｓ　ｅむ、　ａｌ、
＋Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　　Ｇｙｎｅｃｏ
ｌ、　９０　（１１）　：１０６９−８１゜１９８３）
が悪性腫瘍、良性増殖組織共に陽性となった。かれらも
Ａｓｈａｌｌ等と同様に診断的価値に限度があるとして
いる。Ｊｈａ等も１９８４年にヒトミルク脂肪膜とＣａ
１（喉頭癌）に対する諸抗体、抗膀胱癌抗体（いずれも
モノクローナル抗体）を用いて同様の実験を試みたがや
はり満足すべき結果は得られていない。ヒト子宮頚癌お
よび前立腺癌に対する二種の抗体が萩原により１９８３
年に得られている（特開昭５９−１３７４９７）。これ
らの抗体はヒト子宮頚８患者のＢ−Ｃｅｌｌとヒトリン
パ芽球細胞株のサブクローンとの（即ちヒト／ヒト）融
合細胞株により生産されるヒト免疫グロブリンである。

これら二種の抗体は、癌由来の株化細胞を認識したが、
実際にはＢ−Ｃｅ　ｌ　ｌ供与者以外の生検組織中の癌
細胞を認識するがどうかは確認されていない。

［発明が解決しようとする問題点］ 以上のようにヒト子宮頚癌以外を免疫原としたモノクロ
ーナル抗体はヒト子宮頚癌組織を認識するが良性の異常
増殖組織をも認識してしまうという欠点を有するため診
断薬に用いるには不適当であった。また特開昭５９−１
３７４９７で示されるモノクローナル抗体はＢ−Ｃｅ　
ｌ　１供与者以外の生検組織中の癌細胞を認識するがど
うかは不明であり、またヒト由来のＢ−Ｃｅ　ｌ　ｌと
ヒト由来の癌細胞の融合細胞であるヒト／ヒトハイブリ
ドーマか生産する乙のであるため、継代培養を続けると
細胞が変化して生産収量、品質ともに一定のモノクロー
ナル抗体が得られないという可能性が有り、診断用とし
て不向きであるという欠点を有していた。

［問題点を解決しようとする手段］ 本発明者らは、以前よりヒト子宮頚癌組織に特異的に結
合するモノクローナル抗体を得るべく研究を行ってきた
が、株化されたヒト子宮頚癌細胞もしくはヒト子宮頚癌
組織でマウスを免疫して得られる抗体生産細胞とミエロ
ーマ細胞との融合細胞か生産するモノクローナル抗体か
生検組織中のヒト子宮頚癌組織、あるいはヒト子宮頚癌
前癌組織を特異的に認識し正常子宮頚部組織は認識しな
いということを見出し本発明を完成するに至ったのであ
る。

すなわち、本発明は株化されたヒト子宮頚癌細胞もしく
はヒト子宮頚癌組織でマウスを免疫して得られる抗体生
産細胞とミエローマ細胞との融合細胞が生産するモノク
ローナル抗体、およびそれらを用いたヒト子宮頚癌早期
発見用診断キットを提供する乙のである。

以下、本発明の構成について詳述する。

本発明でいう株化されたヒト子宮頚癌細胞とは、ｔ（ｅ
ｌａ細胞にみられるように半永久的に継代しうる様に増
殖能を獲得したヒト子宮頚癌細胞を指す。

又、本発明で用いられるヒト子宮頚癌組織は完全に癌化
したものでもよいし前癌状態のものでもかまわない。免
疫される動物は豚、牛、兎、マウス、ラット等、人以外
の動物ならなんでもよいが抗体生産細胞の相手となるミ
エローマ細胞がマウス由来のものであるため特にマウス
がよい。上記ヒト子宮頚癌組織または株化されたヒト子
宮頚癌細胞をそのままあるいはホモジナイズしてマウス
に皮下注射し免疫する。注射方法はこれに限らず静脈注
射や腹腔内注射でもよい。マウスは必要に応じて追加免
疫される。

最終免疫後３日目にこれらマウスより抗体を生産するリ
ンパ球を含む脾臓を摘出する。摘出する組織はリンパ節
など末梢リンパ系組織ならどこでもよい。得られた組織
から例えば免疫実験操作法Ｂ（１９７４年日本免疫学会
発行１２５３ページ）に記載されている方法によりリン
パ球が単細胞として分離される。次にこのリンパ球が半
永久的に継代しうるように増殖能を与える。方法として
はＥ、Ｂ、−ｖｉｒｕｓやＡｂｅ　１ｓｏｎ−ｖ　１ｒ
ｕｓなどのウィルスにリンパ球を感染させ形質転換させ
る方法、仙台ウィルスや、ポリエチレングライコール存
在下ある種の癌細胞と細胞融合させる方法等がある。安
定した抗体を続けて産生きせるために同じマウスでも同
種のマウス由来の癌細胞たとえばマウスミエローマ細胞
がリンパ球の相手として用いられる。実際の細胞融合の
手法は一般的にＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ
、　３９，２８５−３’０８　（１’１８０　）に記載
された方法に準する。すなわち上記二種の細胞の融合は
ポリエチレングリコール存在下で行ないバイプリドーマ
のみ生育可能なＨＡ１゛培地（ここではヒボキサンチン
、アミノプテリン、デミジン添加培地）で生育きせる。

バイプリドーマのコロニーが確認できるようになったら
そ゛　の培養液中の抗体をスクリーニングする。スクリ
ーニングの方法としてはヒト子宮頚癌組織の凍結切片を
作り、スライドに塗布、このうえにハイプリドーマ培養
液を滴下し、洗浄後、蛍光法あるいは酵素法により二次
抗体で染色する。前癌組織を認識する抗体は同様に、予
め確認された前癌組織の組織のスライドを作り、前癌組
織の特異的染色により選択した。スクリーニングにより
活性を認めたハイプリドーマ株は制限希釈法によりクロ
ーンを確立する。クローンの作るモノクローナル抗体は
細胞培養液から分離精製することができるが一般的に抗
体価が高いので目的によっては上清そのままでも使用で
きる。またプリスタン前処理のマウス腹腔にクローンを
注入して生ずる腹水、および血清中に存在する非常に血
清価の高いモノクローナル抗体を用いることも可能であ
る。これら抗体はざらに塩析、イオン交換、ゲル濾過、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化
学的一般手法を適宜組合せて精製することができる。な
お本発明で使用されるモノクローナル抗体とは上記のよ
うに精製したもののばか培養液上清や血清、腹水の状態
で得られる標品も含める。

つぎにヒト子宮頚癌診断様キットについて述べる。

本発明に係る診断用キットは（１）蛍光標識をつけたモ
ノクローナル抗体からなる直接蛍光抗体法用のキット、
（２）モノクローナル抗体と該モノクローナル抗体と結
合し得る蛍光標識を担持する二次抗体からなる間接蛍光
抗体法用のキット、（３）酵素標識をつけたモノクロー
ナル抗体からなる直接酵素抗体法用のキット、および（
４）モノクローナル抗体と該モノクローナル抗体と結合
し得る酵素標識を担持する二次抗体からなる間接酵素抗
体法用のキットである。

モノクローナル抗体に酵素標識をつける方法は蛋白質核
酸酵素、計、　（１，１）　、　１００７〜１０１３．
　Ｈ）７５に記載の方法に準じて行えばよい。又、モノ
クローナル抗体に蛍光標識をつけるには基礎生化学実験
法６生化学的測定、１６７ページに記載の方法に準じて
行えばよい。ここで使用される二次抗体はモノクローナ
ル抗体と結合力を持つ抗体であればなんでもよい。例え
ば、キットに使用する一次抗体としてのモノクローナル
抗体で、ウサギ、ヤギ、マウス、など人以外の動物を免
疫して血清や腹水から得ることもできるし、各アイソタ
イプごとに前記のモノクローナル抗体に特異的に結合す
る抗体を購入して利用することも可能である。また、酵
素標識あるいは蛍光標識のついた二次抗体は上記方法で
作製してもよいし市販のものを購入して乙よい。

酵素基質液は抗体に担持された酵素の種類によって適宜
選択される。酵素がホースラディツシュペルオキシダー
ゼであれば、３，３°−ジアミノベンジヂン（８（改、
９−アミノ−９−エチルカルバゾールｉ容（１になど、
アルカリフォスファターゼ゛てあれば　５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルフォスフェート　ｐ−トルイ
ジン塩ｉ３　’（ＩＩなどである。

発色剤も酵素によって適宜選択され酵素がホースラディ
ツシュ　ペルオキシダーゼであれば、５−アミノサリシ
リックアシッド、Ｏ−フェニレンジアミンなど、アルカ
リフォスファターゼであればρ−二トロフェニルフォス
フエートなどである。

直接法はモノクローナル抗体自体に蛍光標識あるいは酵
素標識するもので、二次抗体を用いる間接法に比べ染色
のステップが少なくてすむが、逆にこの染色ステップが
少ないことかバックグラウンドを高めるという欠点とも
なる。またバパニコロー氏スメヤー検査機関が蛍光顕微
鏡を所持していれば蛍光抗体法による検査の方がステッ
プが少なくて頭単である。

し実施例］ 以下に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明する。

［実施例１］ 株化Ｆｉ　ＫＩＭ胞１１ｅｌａ（１０Ｘ］、０６ｃｅ１
１）をＲＰ１４Ｉ−１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）ＬＪ養
液で洗浄後、０　、２　ｍ（Ｌの同波に浮遊させ、ＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスに１腹腔内注射を行った。１週間後に同
様の処置で２回目の免疫を行った。１回目と２回目の免
疫時に’３ＡＣＴＯ−Δｄｊｕｂａｎｔ　（ＤＩＦＣＯ
社装）を０．１ｍ１ｊづつ同時に腹腔的注射した。ざら
に１週間後１０６個のｌ１ｅｌａ細胞で追加免疫を行っ
た。最終追加免疫後７２時間目にこのマウスより脾臓を
無菌的に摘出し　ハＩナミで切片としてさらにメツシュ
を通してリンパ球の懸濁液を得た。赤血球の混在を除く
ために溶血用バッファーに浮遊後１５００ｒｐｍで５分
間遠沈さＬ）　ＲＰ旧−１６４０培養液で更に２回洗浄
した。一方融合細胞としてのマウスミエローマ細胞（Ｓ
Ｐ２１０）は、融合の前々日より１０χ牛脂児血清（Ｆ
ＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１０４０培養液中で　１０χＣ
Ｏ２，３７°Ｃの条件で増１ｍさせた。牌細胞　１００
ＸＩＯ”個と、ミニローマ細胞１００ＸＩＯ”個を含む
培養ＩＩＩを混合し、１５００ｒｐｍで３０分遠心後、
上清を捨て、５０％ポリエチレングリコール４０００　
（メルク社製）１ｍ９を１１商づつ滴下しなからゆっく
りと細胞をほぐした。１分後、ＦＣ３含有ＲＰＭＩ−１
６４０培養液を１　ｍＬ　＋少つくりと滴下しなから細
胞を混合させ、同を美の操作を１分間繰返した。ざらに
ＦＣＳを含むＲ１）Ｍｌ−１（５４０培養液７ｍＬを３
分間かけてゆっくりと遠心管を回転させなから加えた。

この時点で１８養液をさらに加え２００Ｘ１０６！の細
胞が５０ｍＬの培養？ｌ夕に含まれるように調製しこの
細胞懸濁液０．１ｍＬづつを９６穴マイクロプレートに
分注し、１０％Ｃ０２下で３７°Ｃ（１０，０χ相対湿
度）で培養した。なおマイクロブ゛レートには予めマウ
スの貧食細胞を１０４個／ｗｅｌｌの割合で加えておき
、またＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液には分注
時に既にＩＩＡＴ（ＩＩヒポキリ゛ンチン　Ａニアミノ
プテリン　Ｔ：チミジン）を含むものを用いた。この改
良法によると少なくとも５日目まで培養液を換える必要
がなく、バクテリアの混在のチャンスも少なくすること
が出来、５日前後までにはハイフ゛リト−マのコロニー
が認められた。１０〜２５日後にこのＪＢ養液上清を０
　、１　ｍＱ−取り目的抗体のスクリーニングに用いた
。まず正常子宮頚部組織を含むヒト子宮頚癌組織の凍結
切片を７ミクロンの厚さ゛にスライスしスライド上に固
定した。検定する上ｒａｔ　０　、２　ｍＬを切片上に
滴下、１時間後洗浄し、二じ抗体としてＦＩＴＣ（フル
オレッセイン　イソチオＳアネー）・）でラベルした抗
マウスＩＨＧ　（Ｆ　＋Ａｏ）２フラグメト）で３７°
Ｃ３０分染色した後検鏡した。上記検体上（−の中から
正常細胞を染色しないが、癌組織または前癌組織を染色
した上清を選び、これに対応ずイハイブリドーマを３種
得、これらハイブリドースを制限希釈法によりクローニ
ングした。まずハイブリドーマがＬｙｅｌｌあたり０．
３個、１，０個、３個とちる様に培養液で希釈した。こ
のとき、１ｗｅｌｌあたり１００万個の胸腺細胞を加え
て正確に希釈できるＪうにした。マイクロプレートは３
７°Ｃで１０χＣＯ２１０（１１Ｕ対湿度の条件で培養
した。５日目に検鏡しＩｗｅｌ中に１個のコロニーを含
むものをチェックしてとき、２週間で生脅したところで
同様の制限希釈を繰返した。この操作を３回繰返して最
終的に２Ｈ類のコロニーが得られ、コロニーを通常の培
養嵜にうつしかえ、夫々５ｍＬの培養液で５×１０６個
７ｍＱ−になるよ・で培養した。２種のうち一方のコロ
ニー仄培養液を遠心管に移し１５００ｒｐｍで５分間遠
沈させ、ζ　　上清と細胞を分離し、細胞にはＲＰＭＩ
−１６４０培養液をあらたに０．５ｍ区加えゆっくり懸
（Ｗｊさせた。除いたし　　培養液は１５０００ｒｐｍ
で５分間遠心し抗体として上清ｉ　　　３　、　ＯｍＱ
−をえた。こうして得た目的の抗体を生産するクローン
１旨濁ｉ／！２を０．２ｍｉ、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹
ｊ控内ｉ主射を行ない、２〜３週間後に腹水８　、０　
ｍＱ−を採取し、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心後の
上清７　、　ＯｍＬを得た。

モノクローナル抗体を含む腹水を、０．１ＨｐＨ６，８
４パＣリン酸緩衝液で２５００倍に希釈したちの０．２
ｒｒｄｌと上記の培養液の上清０　、２　ｍＬをもちい
て組織の染色実験を繰返した結果、同様の陽性率を得た
。この≦　　モノクローナル抗体のアイソザイムは寒天
ゲル沈１　　降反応の結果ＩｇＭであることが判明し、
このモノクローナル抗体をＳＣＩと名付けた。もう一方
のコロニーを起源とし同じ操作を行ったが培養液の上清
、腹水ともに同じ陽性率を得た。このモノクローナル抗
体のアイソザイムは寒天ゲル沈降反応の結果ＩｇＧであ
ることが判明し、このモノクローナル抗体をＳＣ２と名
付けた。

［実施例２］ ０．５ｇのヒト子宮頚癌組織を０．２５Ｍショ糖を含む
生理的食塩水１ｍＮとともに２〜３分間ガラスガラスホ
モジブ“イ÷グーに力・け、このｉ冒濁？皮を０　、２
　ｍＬ　、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔的注射した。同様
の免疫を２回縁ｊＳシたのち脾臓を取り出しマウスミエ
ローマ細胞と融合させた。細胞融合およびクローニング
の操作は実施例１に従った。目的の抗体を生産する細胞
のコロニーは５ｍ区のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０
培養液で継代培養した。すなわら、ｌＸｌ０６藺を５ｍ
（ＬのＦＣＳを含むＲＰＭＩ培養液に懸濁させ５′ＸＣ
Ｏ２３７°Ｃ１００χ相対湿度の条件で培養する。６０
時間後５ｘｌＯ６個に増殖しこの操作で１代の培養とな
る。この細胞を遠心分ａ１１で培養液と分離し新しい培
養液を加えて希釈する。１ｘｌＯ”ｇ／ｍεに希釈され
た細胞懸濁液１ｄに４ｍ（ｌの培養液を加えるという操
作で継代培養される。１０代継代培養された５０ｍＭの
培養液から遠心分離により５Ｘ１０’個の細胞を得、５
１２．の培養液に懸濁させた。これを回転培養ビン１０
本に分注し５％ＣＯ２３７°Ｃ１００χ相対１２度１　
ｒ　ｐ　ｍの条件で５日間ｈ？　ｉした。

５　Ｘ　１０’個／ｒｒＬに達した培養液から遠心分離
で細胞を除き吸引濾過し、ｄ岳故に硫酸アンモニウムを
加え４５χとして沈殿物をえた。このモノクローナル抗
体は寒天ゲル沈降反応よりアイソザイムがＩｇＧである
と判明しＳＣ３と名付けた。沈殿物はさらにプロティン
八により精製した。計１５９．の培養液から７３、ｍｇ
のモノクローナル抗体を粉末としてえた。以後全３回に
わたる融合実験でヒト子宮頚癌組織または前癌組織を特
異的に認識するモノクローナル抗体２種をそれぞれ１０
３ｍｇ、８１＋ｎｇ得た。寒天ゲル沈降反応よりアイソ
ザイムはそれぞれＩｇＧ、　ＩｇＭであると判明しＳＣ
４、ＳＣ５と名付けた。

［試験例１１ モノクローナル抗体ＳＣ１、ＳＣ２、ＳＣ３、ＳＣ４、
ＳＣ５を産生ずるそれぞれのマウス／マウスハイブリ）
（−マは人工的に継代ＪΔ傅される。ここでは長期の継
代培ｔ＆後も安定した品質のモノクローナル抗体が得ら
れるかを試験した。それぞれのマウス／マウスハイシリ
ドーマは実施例２の方法に準じて継代培養を行った。１
０代、２５代、５０代、１００代の継代培養後やはり実
施例２に準して回転培養で大量に抗体を生産させ精製分
；箭した。収量は表１に示す。これより、いずれの抗体
も１００代までの継代培養であれば、収量に変化かない
ことがわかった。

［実施例３］ 直接蛍光抗体法用ヒト子宮頚癌診断試薬キットを以下に
述べる。

実施例２で得られたＳＣ５を２０ｍｇ秤旦し２ＯｍＱの
０．０５ＭＮａ２Ｃ０３−ＮａｌｌＣＤ−３４１（ｆｊ
（Ｆｉ、にｉ６解させた。２ｍｇ（７）フルオレッセイ
ンイソシアネ−１・（以下ＦＩＴＣ、シグマ社製）を２
０ｍ（Ｌの０．０５Ｍ　Ｎａ２Ｃ０３−ＮａｌｌＣＯ３
緩衝液に溶解させＳＣ５溶液と混合し、４９Ｃで撹拌し
ながら一晩反応きせた。反応生成物を０．ＯＩＭリン酸
級衝液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５にかけ
同じ０．０１材リン酸緩衝液で溶出し一〇未反応のＩｇ
ＧとＦＩＴＣの結合したＩｇＧを溶出させた。次に、０
．０１１４リン酸桜術ｉ１Ｚで平衡化したＤＥ八へセル
ロースカラムに１客用画分をかけ０．０１材リン酸緩（
封液で未反応のＩｇＧだけを溶出させた。カラムに残っ
たＦＩＴＣ結合１ｇＧは、０．０５ＨのＮａＣｌを含む
０．０１材リン酸緩（９ｊ液で）６出して２０ｍ区の１
容液として得られた。２８０ｎｍ（Ｄ紫外吸収からＳＣ
５を１８ｍｇ含むことかわかった。このＳＣ５溶液をも
ってヒト子宮頚癌診断試薬キットとした。

［実施例４］ 間接蛍光抗体法用ヒト子宮頚癌診断試薬キットを以下に
示す。モノクローナル抗体ＳＣ２を一次抗体とし、ロー
グミン標識抗マウスＩｇＧ抗体（タボ社製）を二次標識
抗体としてヒト子宮頚癌診断試薬キットとした。

［実施例５］ 直接酵素抗体法用ヒト子宮頚癌診断試薬キットを以下に
述べる。

ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏ
ｘｄａｓｅ　ＴｙｐｅＩＩシグマ社製）５ｍｇを０．３
Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液ｐ１１８．１．１．０ｍｇ
に溶解しこれに１００％エタノール、に１容解した１χ
のフルオロニトロノーンビン’（Ｖ　０　、１　ｍｌを
加え室温でゆっくり混和きせな。さらに０．０５ＭのＮ
ａＩＯ４溶液１　、０　ｍＱ、を加え室温て３０分反応
させた。クエンチングのため０．２Ｍのエチレングライ
コールｉ容’＋ｔｌを１　、０　ｍｔｌ加え室温で１時
間放置した。反応（１）ｊ、は充分呈の０．０１ＭｐＨ
９，５の炭酸ナトリウム援（封液で４°Ｃの乙とて透析
しベルオギシダーゼーアルデヒド溶’＋ｔＶとした。次
に実施例２で得られたモノクローナル抗体ＳＣ３，５ｍ
ｇを１ｍＱ−の炭酸ナトリウム緩衝液に１６解させ３ｍ
ｇのペルオキシダーゼ−アルデヒド溶（１り３　ｍＱ−
に加え室１昌で３時間混和した。さらにこの溶液に５１
のＮ　、　Ｂ　Ｉ＋　、、を加え４°Ｃで一晩放置した
。反応生成物はリン酸水て透析しセファデックスＧ−２
０００カラムで精製した。目的とする画分Ｃよ蛍白質を
２８０１１ｍ、ペルオキシダーゼを４０３ｎｍの紫外吸
収で追跡し雨音か一致する両分を分取することにより得
られた。この両分はＳＣ３を４．８ｍｇを含むリン酸緩
衝液ＧｍＱ。

であった。このＳＣ３ｉｆｆ液を乙ってヒト子宮頚癌診
断試某ギットとした。

［実施例６］ 間接酵素抗体法用ヒト子宮頚癌診断試薬キットを以下に
述べる。標識される二次抗体は非標識抗７１クスＩＥＧ
抗体（タボ社製）である。酵素の標識法と精製法は実施
例４に準じた。モノクローナル抗体ＳＣ４の０．１χリ
ン酸緩衝液溶液とここで作製したベルオキシグーゼ漂識
抗マウスＩｇＧ抗体をちってヒト子宮頚癌診断試薬キッ
トどした。

［実施例７］ 間接酵素抗体法用ヒト子宮頚癌診断試薬キットを以下に
示す。モノクローナル抗体ＳＣＩの０．１χリン酸緩南
液溶液を一次抗体とし、アルカリフォスファターゼ標識
抗マウスＩｇＭ抗体（タボ社製）を二次標識抗体として
ヒト子宮頚癌診断試薬キットとした。

［実施例８１ ＳＣ３とＳＣ４を用いた間接蛍光抗体法用ヒト子宮頚癌
診断試薬キットを以下に示す。モノクローナル抗体ＳＣ
３オヨヒ５ｃ４）０．１　’）５０．１Ｍ　ｐＨ６，８
’）　ン）Ｊｆｌｉ＋ｒ液）容液１ｍ区ずつを混合した
ものを一次抗体とし、フルオレッピイン標２Ｂ１抗マウ
スＩｇＧ抗体（タボ社製）を二次抗体としてヒト子宮頚
癌診断試薬キットとした。

［試験例２］ 実施例６のキットかヒト子宮頚癌診断試桑として有効か
どうか試験した。子宮頴癌患台（４８寸、女性）の子宮
頚部組熾から採取されたヒト子宮頚癌組織、ヒト子宮頚
癌面癌組ハ、子宮頚部正常組織の凍結切片（厚さ７ｇｍ
）をスライドグラスにのせる。これら組織はすてに専門
医師か上記３つの状態に判定したものである。それぞれ
の標本にＳＣ４ｉ容（ｆｋを０．２ｍの滴下し室温で３
０分間放置した。０．ＩＭ　ｐＨ６，８の４°Ｃリン酸
緩衝液で３回、計１５分洗浄した後ベルオギシダーゼ漂
識抗マウスＩｇＧ抗体を標本上に０．２耐滴下、室温で
３０分間放置し、Ｏ，ＬＭｐｌｌｏ、８の４°Ｃリン酸
緩衝液で３回、計１５分洗浄した。これを基質溶液中に
３０分浸漬した。基質溶液はジアミノノ＼ンチジン２５
ｍｇを０．００５％の過酸化水累を含む０．０５Ｍ　ｐ
Ｈ７，６のトリスＭＷ仲０１！１００ｍＱ、にｉ容解さ
せ調製した。染色が完了した後リン酸緩衝液で３回、計
１０分間洗ｊｐを行ない５０χグリセリンを滴下してカ
バーグラスでおおった。顕微鏡下、茶？８色に染色され
たｔす本を観察した。その結果ヒト子宮頚癌組織および
ヒト子宮頚癌前癌組織では呈色が観察されたか、子宮頚
部正常組織では呈色か観察されなかった。上記方法で３
６オから５６才士での子宮頚癌患者２０名の組織につい
てＳＣ４の特異性を試験した。ヒト子宮頚癌組熾および
ヒｉ・子宮ＩＭ４癌而癌面職ばずへて陽性であったか、
子宮頚部正常組織はすべて陰性であった。これで、実施
例６の間接酵素抗体法用キットはヒト子宮頚癌診ＩＪＪ
　３ｊ：薬として有効であることがわかった。

［試験例３］ 実施例４のキットがヒト子宮頚癌診断試薬として有効か
どうか試験した。試験に用いる組織は試験例２と同様の
ものである。それぞれの標本に０　、２　ｍＱ−のＳＣ
２溶液を滴下し室温で３０分放置したの／３０．１Ｍｐ
１１７．０の４°Ｃリリン酸緩衝液で３回、計１５分洗
浄した。これにフルオレッセイン標識抗マウスＩｇＧ抗
体（タボ社製）を０　、２　ｍｔ滴下し室温で３０分放
置したのちリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した。よ
く水を切ったのち５０χグリピリンを滴下しカバーグラ
スをかぶせた。これを蛍光頭ｆｆｉ鏡（オリンパス光学
社製）で観察した。その結果ＳＣ２はヒト子宮′Ａ癌組
織およびヒト子宮頚癌前癌組織は認識したか子宮頚部正
常細胞は認識しなかった。この方法により３６オから５
６オまでの子宮頚癌組織２０名のｉｎ　ｉｔについてＳ
Ｃ２の特異性を試験したかヒト子宮頚癌組織およびヒト
子宮頚癌前癌組織はすべて陽性であったが、子宮頚部正
常組織はずべて陰性てあった。これで、実施例４の間接
蛍光抗体法用キットがヒト子宮頚癌診断試薬として有効
であることかわかった。

Ｌ試験料４７ 実施例３のキットかヒト子宮頚癌診断試薬として有効か
どうか試験した。試験に用い・る組織は試験例２と同様
の乙のである。それぞれの標本に実施例３て調整したフ
ルオレッセイン標識ＳＣ５ｉ合液を０　、２　ｍｉ滴下
し、室温で３０分放置したの７３０．１Ｍ　＋）１１７
゜０の４パＣリン酸援街イ１夕で３回、計１５分洗）ｐ
した。よく水を切ったのも５０χグリセリンを滴下しカ
バーグラスをかぶせた。これを蛍光顕微鏡（オリンパス
光学社製）で観察した。その結果ＳＣ５はヒト子宮ガｊ
癌組織およびヒト子宮頚癌前癌組織は認識したが子宮頚
部正常細胞は認識しなかった。この方法により３６オか
ら５６オまでの子宮頚癌組織２０名の組織についてＳＣ
６の特異性を試験したがヒト子宮頚癌組織およびヒト子
宮頚癌前癌組織はすべて陽性であったが、子宮頚部正常
組織はすべて陰性であった。これで、実施例３の直接酵
詣抗体法用キットかヒト子宮頚癌診断試薬として有効で
あることがわかった。

［試験例６］ 実施例５のキットがヒト子宮頚癌診断試薬として有効か
どうか試験した。被検組織は試験例２にと同（ｋのちの
である。それぞれの標本にペルオギシダーじて行；識し
たＳＣ３溶液を０．２ｍＮｉ１々下し、室温で３０分間
放置した後、０．ＩＭ　ｐｆｉ（５，８の４６Ｃリン酸
桜衝ｉ１＊で３回、計１５分洗；子した。試験例２と同
じＩＳ質１ｕ液に３０分＆　’ｔ／ｊシ、染色か完了し
たのを確認してリン酸緩（封液で３回、計１０分間洗浄
を行った。５０％グリセリンを滴下してカバーグラスで
おおい、顕微鏡下、茶褐色に染色された標本を観察した
。その結果、ヒト子宮頚癌組織では呈色か観察されたが
、ヒト子宮頚癌前癌組熾および子宮頚部正常組織−Ｃは
呈色が観察されなかった。この方法により３６オから５
６才士での子宮頚癌思ａ　２０名の組織についてＳＣ３
の認識特異性を試験したがヒト子宮頚癌組織はすべて陽
性であったが、ヒト子宮頚癌前癌組織および子宮頚部正
常に■熾はすべて陰性てあ−Ｊた。これて、実施例５の
直接酵士抗体法用キットがヒト子宮頚癌診ＩＦＩｉ試薬
として有効であることかわかった。

「試験例７１ ここでは七ツクローナル抗体を生産する培養液の上清か
ヒト子宮頚癌診断試桑として有効がどうが試験した。被
検組織は試験例２と同じものである。実施例１で得たＳ
ＣＩを含む細胞培養液の上清０　、２　ｍＱ−をそれぞ
れの標本に滴下し室温で３０分間放置しノ°：ｏ０．Ｉ
Ｍ　ｐ１１６．８の４°Ｃリン酸緩（封液で３回、計１
５分洗浄した後ペルオキシダーゼ（ｉ１９　ｍ抗マＩク
スＩｇＭ抗体（タボ社製）を０　、２　ｍＭ標本上に滴
下し室温で３０分間放置した。０．１Ｍ　ｐＨ６，８の
４°Ｃリン酸緩（）１液で３回、計１５分洗浄した後、
試験例２と同じ基質ｉｄ液に３０分浸漬し、染色が完了
したのを確認してリン酸接衝液で３回、計１０分間洗浄
を行った。５０％グリセリンを滴下してカバーグラスで
おおい、顕微鏡下、茶褐色に染色された標本を観察した
。その結果、ヒト子宮頚癌組織およびヒト子宮頚癌前癌
組織では呈色が観察されたが、子宮頚部正常組織では呈
色が観察されなかった。３６オから５６オまでの子宮頚
癌患者２０名の組織についてＳＣＩを含む細胞培養液上
清の認識特異性を試験したがヒト子宮頚癌組織およびヒ
ト子宮頚癌前癌組織はすべて陽性であり、子宮頚部正常
組織はすべて陰性であった。これで、ＳＣ１を含むモノ
クローナル抗体を生産する培養液の上清かヒト子宮頚癌
診断試薬として有効であることがわかった。

［試験例８］ ここではモノクローナル抗体を生産するクローン懸濁液
をＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹ｊ停内注射して得た）Ｉ９水
がヒト子宮頚癌於断試薬として有効かどうか試験した。

被検組織は試験例２に従い採取した。実施例１で得たＳ
Ｃ２を含む腹水の希釈ｔ（１０、２ｍＱ−をそれぞれの
標本に滴下し室温で３０分間放置した。０．１Ｍρ１１
６．８の４°Ｃリン酸緩衝液で３回、計１５分洗浄した
後ベルオギシダーゼ標識抗で１クスＩｇＧ抗体（タボ社
製）を標本上に０　、２　ｍＱ−滴下し室温で３０分間
放置した。０．１１４ρ１１６．８の・１°Ｃリン酸緩
衝（々で３回、計１５分洗浄した後、試験例２ど同じ基
質溶液に３０分浸漬し、染色が完了したのを確認してリ
ン酸層ｉ町（？夕で３回、計１０分間洗ｃｐを行った。

５０χグリセリンを滴下してカバーグラスでおおい、顕
微鏡下、茶褐色に染色された標本を観察した。その結果
ヒト子宮頚癌組織およびヒト子宮頚癌前癌組織では呈色
が観察されたが、子宮頚部正常組織では呈色が観察され
なかった。

３６オから５６オまでの子宮頚癌患者２０名の組織につ
いてＳＣ２を含む腹水の特異性を試験したがヒト子宮頚
癌組織およびヒト子宮頚癌前癌組織はすべて陽性であり
、子宮頚部正常組織はずぺて陰性であ−）た。これで、
モノクローナル抗体ＳＣ２を生産するクローン懸濁ｔｔ
ｌをＢＡＬＢ／ＣマウスにＩＩ！腔内注射して得た腹水
がヒト子宮頚癌診断試薬として有効であることかわかっ
た。

［試験例９］ 実施例８で作製した、−次抗体にＳＣ３とＳＣ４の混合
物を用いたキットかヒト子宮頚癌診断試薬とじて有効か
どうか試験した。被検組織は試験例２と同じものである
。ＳＣ３とＳＣ４を含む一次抗体溶液をそれぞれの標本
に滴下し室温で３０分間放置した。以下の操作法は試験
例４に準した。蛍光顕微鏡（オリンパス光学社製）で観
察した結果、実施例８で作製した一次抗体ばはヒト子宮
頭痛組織およびヒト子宮頚癌前癌組織は認識したが子宮
頚部正常細胞は認識しなかった。この方法により３６オ
から５６才士での子宮頚癌思考２０名の組織に一ついて
この一次抗体の特異性を試験したがヒト子宮頚癌組織お
よびヒト子宮頚癌前癌組織はすべて陽性であったか、子
宮頚部正常組織はすべて陰性であった。これで、実施例
８で作製した、−次抗体にＳＣ３とＳＣ４の混合物を用
いたキットはヒト子宮頚癌診断試薬として有効であるこ
とがわかった。

［試験例１０１ 試験例１で分離精製した１ｏ代、２５代、５０代、１０
０代、継代培養後のモノクローナル抗体　ＳＣ１、ＳＣ
２、ＳＣ３、ＳＣ４、ＳＣ５について長期の継代培養後
も安定した品質のモノクローナル抗体が１７られている
こと確認するために組織への結合特異性に変化か有るか
を試験した。試験例２と同様既に専門医師により判別さ
れたヒト子宮頚癌組織、ヒト子宮頚癌前癌組織、正常子
宮頚部組織について間接酵素抗体法で認識特異性を確認
した。１次抗体がＳＣ１、ＳＣ５の場合はペルオキシダ
ーゼ標識抗マウスＩｇＭを２次抗体として用い、１次抗
体がＳＣ２、ＳＣ３、ＳＣ４、の場合はペルオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇＧを２次抗体として用いた。試験例
１て精製した２５代継代培養後のＳＣＩを１０ｍｇを１
０＋ｒＩｉの０．ＩＭ　ｐＨ６，８，４°Ｃのリン酸接
衝液に溶かし１次抗体ｉｆｆ液とした。以下試験例２と
同様の操作により認識特異性を確認した。

ＳＣＩはヒト子宮頚癌組織およびヒト子宮頚癌前癌ｉｆ
ｆ織は認識したが正常子宮頚部組織は認識しなかった。

この結果、１０代継代培養後に分離精製したＳＣＩの認
識特異性と一致した。５０代、１００代継継代養後の認
識特異性も試験したが、すべて１０代のものと変りはな
かった。同様にＳＣ２、ＳＣ３、ＳＣ４、ＳＣ５の各継
代ＪΔ養後のＪ？、！　５Ｊ特異性について試験したが
、とれｔＪ１０代継代継代後の認識特異性に一致した。

これで、それぞれのモノクローナル抗体は１００代３１
七代■Δ養されたのちに分離された乙のでも品質は安定
し−Ｃいることがわかった。

［試験例１１］ 本特許のヒト子宮頚癌診断試薬用キットか、現在ヒト子
宮頚癌の診断に一般に利用され−Ｃいるパパニコロー氏
法に代わりうるちのかどうかを試験した。被検ｎＩ増と
しては、２４０人の別々の個体から得られ、専門医師が
正常である、良性の異常増殖組織である、ヒト子宮頚癌
前癌組織である、ヒト子宮頚癌組織であると４つの段階
に区別したものをそれぞれ、１００枚、１００枚、２０
枚、２０枚、計２４０枚用意した。この２４０枚を任意
の順番に実施例３のキットで判別した。操作方法は、試
験例５に準じた。Ｊ、ｉ−た、この被検組織提供者２４
０人はパパニコロー氏法による診断６行った。方法は、
次のとおりである。被験者の子宮頚部組織を綿棒でこす
り取りスライドグラスに塗布した後、アルコールに浸漬
して固定した。これを検査所に送り判定してもら−〕た
。以下同様に、実施例４、実施例５、実施例６、実施例
７のギッｉ・についてム同じ組織の検査を行った。結果
は表２に示す。

この結果からパパニコロー氏法では良性の異常増殖組織
を若干認識ツーるが、本発明によるキットはほとんど認
識しないという点て、診断試薬として勝っていた。しか
乙、ヒト子宮頚癌組織、あるいはヒト子宮頚癌前癌、ｔ
ｆｌ織を認識するという点ではパパニコロー氏法に充分
化わりうるちのであった。

［発明の効果コ 本発明に係るモノクローナル抗体およびそれを用いたと
１・子宮＋Ｍ癌診断試薬キットはヒト子宮頚癌組織また
はヒト子宮頚癌的癌組織を特異的に認識し子宮頚部正常
組織および良性の異常増殖組織はほとんど認識しない。

また本発明で作製したマウス／マウスハイブリドーマは
長期にわたる継代培養後も安定した量のモノクローナル
抗体を産生じ、得られたモノクローナル抗体も認識特異
性に変化はないものである。

（以下余白） Ｌ：正常ＸＩ′Ｉ熾であると判定 ＩＩ：非定形的な細胞を含むがヘルペスによるような良
性の異常増殖組織であると判定 ＩＩＩ：５０χの確率で、悪性変化した乙のと判定ＩＶ
：Ｓ］！’ｉχの確率で癌であると判定Ｖ：１００χの
確率で癌であると判定 Ａ、了宮頚部正常組織 Ｂ：良性の異常増殖組織 Ｃ：　ヒＩ・子宮Ｔｎ　Ｉ’、’；　ｉ’＋ｆｆ痛組織
Ｄ＝ヒトり宮頚癌組織 パパニコロー氏法ではＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄの各組織か■〜■
の各段階に判定されたかのが何％かを表しモノクローナ
ル抗体法では各組織がキットによって何％＋ｉＥ　ａ！
されたかを表している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）株化されたヒト子宮頚癌細胞でマウスを免疫して
   得られる抗体生産細胞とミエローマ細胞との融合細胞が
   生産するモノクローナル抗体 （２）ヒト子宮頚癌組織でマウスを免疫して得られる抗
   体生産細胞とミエローマ細胞との融合細胞が生産するモ
   ノクローナル抗体 （３）抗体生産細胞がマウス脾臓由来のＢ−Ｃｅｌｌで
   ある特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体 （４）抗体生産細胞がマウス脾臓由来のＢ−Ｃｅｌｌで
   ある特許請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体 （５）株化されたヒト子宮頚癌細胞がＨｅｌａ細胞であ
   り、ヒト子宮頚癌組織およびヒト子宮頚癌前癌組織は認
   識するが正常子宮頚部組織は認識しないアイソタイプが
   ＩｇＭである特許請求の範囲第１項または第３項記載の
   モノクローナル抗体（ＳＣ１）（６）株化されたヒト子
   宮頚癌細胞がＨｅｌａ細胞であり、ヒト子宮頚癌組織お
   よびヒト子宮頚癌前癌組織は認識するが正常子宮頚部組
   織は認識しないアイソタイプがＩｇＧである特許請求の
   範囲第１項または第３項記載のモノクローナル抗体（Ｓ
   Ｃ２）（７）ヒト子宮頚癌組織は認識するがヒト子宮頚
   癌前癌組織および正常子宮頚部組織は認識しないアイソ
   タイプがＩｇＧである特許請求の範囲第２項または第４
   項記載のモノクローナル抗体（ＳＣ３）（８）ヒト子宮
   頚癌組織およびヒト子宮頚癌前癌組織は認識するが正常
   子宮頚部組織は認識しないアイソタイプがＩｇＧである
   特許請求の範囲第２項または第４項記載のモノクローナ
   ル抗体（ＳＣ４）（９）ヒト子宮頚癌組熾およびヒト子
   宮頚癌前癌組織は認識するが正常子宮頚部組織は認識し
   ないアイソタイプがＩｇＭである特許請求の範囲第２項
   または第４項記載のモノクローナル抗体（ＳＣ５）（１
   ０）蛍光標識または酵素標識した特許請求の範囲第５項
   記載のモノクローナル抗体ＳＣ１（１１）蛍光標識また
   は酵素標識した特許請求の範囲第６項記載のモノクロー
   ナル抗体ＳＣ２（１２）蛍光標識または酵素標識した特
   許請求の範囲第７項記載のモノクローナル抗体ＳＣ３（
   １３）蛍光標識または酵素標識した特許請求の範囲第８
   項記載のモノクローナル抗体ＳＣ４（１４）蛍光標識ま
   たは酵素標識した特許請求の範囲第９項記載のモノクロ
   ーナル抗体ＳＣ５（１６）蛍光標識または酵素標識した
   モノクローナル抗体ＳＣ１、ＳＣ２、ＳＣ３、ＳＣ４、
   ＳＣ５からなる群から選ばれる１種または２種以上を含
   有するヒト子宮頚癌診断試薬キット （１７）蛍光標識または酵素標識したモノクローナル抗
   体ＳＣ１、ＳＣ２、ＳＣ３、ＳＣ４、ＳＣ５からなる群
   から選ばれる１種または２種以上と、該抗体と結合しう
   る、蛍光標識または酵素標識された化合物からなるヒト
   子宮頚癌診断試薬キット