JPS61160060A - ヒト偏平上皮肺癌腫細胞に特異的なモノクロ−ナル抗体およびその製造ならびに使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に、免疫学的原理に基づく診断用助剤に
関し、さらに詳しくは、偏平上皮細胞肺癌腫（ＳＬＣ）
により産生される特有の抗原に対するモノクローナル抗
体、および該抗体の製造方法ならびにＳＬＣの診断にお
けるそれらの使用に関する。

〔発明の背景〕

癌細胞は例外的に非常に特異性の高いタン／４り質と糖
脂質を合成することが時々ある。これらが初期癌発見の
九めの、モして九ぶん形質転換過程の理解を助けるため
の目印を提供することができるので、この高い腫瘍特異
性を有する細胞化合物を同定するための鋭敏な方法が必
要である。

この方面からの研究は多くのヒト癌に必要であるが、と
りわけ、西ヨーコッノぐと化アメリカの多くの国々で今
では癌死の第一の原因となった肺癌に必要である。悪性
肺腫瘍はさらに様々な種類の組織構造に分けることがで
きるが、このうちＳＬＣの発生率は男性において約５０
〜６０憾である。

偏平上皮肺癌の治療可能性は非常に限定されたｔまであ
る。主な障害の１つは、診断時に病気が局所化したまま
の患者はわずかにすぎないということであるようだ。そ
れゆえ、現在の形態学を用いた治療効果はより一層早い
診断により向上することができるであろう。

免疫学的方法、特にモノクローナル抗体の使用に基づく
方法は、悪性腫瘍の初期同定の道具を約束する。ヒト肺
癌細胞に反応性を有する／　ＩＪクローナル抗体および
モノクローナル抗体の両方とも当業界で公知である。こ
れら抗体の多くは、異なった組織構造型の肺癌により共
有されそして正常な血清、および／ｌたは他の腫瘍型に
おいていくつかの正常に分化された細胞により表現され
る抗原と反応する。いくつかの抗体が豆類型の肺癌たと
えば小細胞および大細胞肺癌に特異的であると報告され
ている〔再調査のために、ジョイ。エル。

ムールシンら（Ｊ、　Ｌ、＋　Ｍｕ１１ｓｈｌｎ＊　５
ｔ−ａｌ、　）　ｅ１９８５を参照〕。しかしながらこ
れらの場合には特異性の分析は限られ念数の癌細胞系ま
たはいくつかの腫瘍標本に限定され、そしてまた抗原の
生化学的特徴も完全に制限される。

これまでのところ、血流に放出されるために血清学的検
査に適するＳＬＣの抗原に対し特異的なモノクローナル
抗体については何ら報告されていない。様々な種類の非
−肺癌細胞と関連する抗原性糖タンパク質および糖脂質
が知られており、このような糖タンノ々り質および糖脂
質の炭水化物エピトープが記載されている（たとえばハ
コモリらＨａｋｏｍｏｒｌ　＠ｔ”Ｎａ＊　１９８５参
照〕。しかしながら、肺癌細胞により放出されるこのよ
うな糖タン／４り質または糖脂質の炭水化物エピトープ
は何ら特徴が明らかではない。モノクローナル抗体によ
り検出される癌−関連炭水化物抗原の検討については、
ジンスパークら［（Ｇｌｎｓｂｕｒｇ　５ｔ−ａｌ、　
）１９８４］を参照せよ。

〔本発明の概略〕

本発明の目的は、これまで知られている診断方法のいず
れにもその鋭敏さの点で優れたヒト　ＳＬＣ検出方法を
提供するものである。

本発明はヒトＳＬＣ細胞系により作シ出された抗原が特
異的炭水化物部分を有し、このような抗原が偏平上皮肺
癌患者からの体液および腫瘍含有組織抽出物中に存在す
るという観察゛に基づく。

したがって、本発明の一面によれば、本発明は、この後
に定義されるハイブリドーマ細胞系４３−４３−９Ｆ（
ＩｇＭ）により産生される抗体により識別されるエピト
ープ含有５ＬＣ−関連抗原を提供するものである。エピ
トープは、ＳＬＣ細胞系ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１により作
られる特異的炭水化物部分として同定される（念とえは
第１図参照）か、またはノ・イブリドーマ細胞系４３−
４３−９Ｆ（ＩｇＭ）により作られる抗体または免疫学
的に等価なモノクローナル抗体により識別される抗イデ
ィオタイプ抗体の一部として同定されるのが好ましい。

さらに本発明の別の面は、ヒト偏平上皮肺癌に特有のエ
ピトープ炭水化物部分であって細胞系ＲＩ（−ＳＬＣ−
Ｌ１１にょシ産生される部分に結合するモノクローナル
抗体を提供するものである。本発明の好ましい一実施態
様として、モノクローナル抗体は蓄歯目、好ましくはネ
ズミ科動物の臓器のものである。さらに好ましい実施態
様として、モノクローナル抗値はヒト臓器のものである
。

本発明はまたモノクローナル抗体の調製方法を提供する
ものであり、この方法は、増殖培地中で、ヒト偏平上皮
肺癌１ｃ特有でありヒト　ＳＬＣ細胞系ＲＨ−ＳＬＣ−
Ｌ１１により産生されるエピトープ炭水化物部分と結合
する抗体を産生しうるハイブリドーマ細胞系を培養し、
続いてこの増殖培地からモノクローナル抗体を回収する
ことを特徴とするものである。本発明のモノクローナル
抗体調装において、ハイブリドーマ細胞系、好ましくは
細胞系４３−４３−９Ｆ（Ｉは組織培地またはネズミ腹
水培地で増殖する。

さらに、本発明は、体におけるヒト　ＳＬＣ検出用診断
器具一式を提供するものであり、この器具一式は特許請
求の範囲第５項記載のモノクローナル抗体を含む。好ま
しい実施態様において、診断器具一式は小点分析（ｄａ
ｔ−ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｌｍ　）、酵素結合イムノ
プルペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ　）または放射線免疫
検定法（ＲＩＡ　）に適する。

〔詳細な説明〕

肺癌細胞に対するモノクローナル抗体発生の一般的方法
およびこのような抗体の特異性を確立する方法は当業界
で公知である〔オールノンら（σＬｓｓｏｎ　ｅｔ　ａ
ｌｍ　）１９８４　）。この方法によりハイブリドーマ
の実質的数（３４８）が作られ、ＳＬＣ細胞に対する所
望の特異性が試験される。このうち３つだけが潜在的興
味のある特異性を有する免疫グロブリンを分泌すること
が見出された。

これら３つに希釈を制限することによりクローンを発生
させ、次いでＲｆ（−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞系のサブクロ
ーン１１との結合について試Ｍｆる。３つのモノクロー
ナル抗体のいずれもが１１のＳＬＣサブクローンの１つ
と結合しないことが観察され、一方、これらが小細胞が
ん腫（ＳＣＣ）細胞系ＲＨ−８ＣＣ−Ｌ１０　の多くの
サブクローンと反応することが見出された。これらハイ
ブリドーマ以外にこの一連の実験に含まれない１つのハ
イブリドーマが、ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞のサブクロ
ーン１１個とすべて結合し、ＲＨ−８ＣＣ−ＬＩＯサブ
クローンと反応を示さないモノクローナル抗体を作るこ
とが見出された。この抗体を４３−４３−９Ｆ（Ｉとす
る。

上述し念ようなＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞に対し同様な
特異性を有するモノクローナル抗体を産生ずる別のハイ
ブリドーマ細胞系が、同じ方法を用いて生じつる。特に
、免疫化およびスクリーニングのために可溶性４３−９
Ｆ抗原型剤が用いられる。

さらにスクリーニングおよび同定のために、市販の４３
−９Ｆ抗体を用いた競合的遮断分析を用いることができ
る。他の窩歯目種を使用することができる；他の骨髄腫
〔たとえば、タラが一ト、アール・テ４’ら（Ｔａｇｇ
ａｒｔ、　Ｒ，Ｔ、　ａｔ　ａｌ、　）（１９８３）：
］もまた使用できうる。

４３−４３−９Ｆ（Ｉハイブリドーマ細胞系を、次に示
した日付で、特許手続のために、ナシッナルコレクンョ
ンオブアニマルセルカルチャーズ（ＮＣＡＣＣ）サリス
ペリー、ウィルドジャー。

イングランドに寄託する。

寄託　日　　　　寄託者参考　　ＮＣＡＣＣ名称１９８
５年６月１４日　　ハイブリドーマ細胞系　８５０６１
４０２３−９Ｆ 後述する実施例にしたがって行なわれた小点分析または
１８ＬＩＳＡを用いて、４３−９Ｆ抗体により識別され
る抗原を分析する。第１図はいくつかの異なった種類の
細胞から調製される抽出物の分析結果を示す。４３−９
Ｆ抗原は異なった偏平上皮肺癌腫のうち２つのクローン
化細胞系の抽出物でただちに検出されたが、一方、正常
なヒト細胞型または他の癌細胞系からの抽出物中では特
異的結合が検出できなかった。４３−９Ｆ抗原−陰性細
胞型には、その他のヒト肺癌細胞、正常肺細胞ならびに
他の組織の悪性腫瘍および他のいくつかの正常組織から
導びかれる細胞系が含まれる。偏平上皮肺癌腫以外の種
類の細胞の希釈していない抽出物で弱い陽性反応が見ら
れることもあったが、これらの反応は４３−９Ｆ抗体の
弱い非特異的結合のためではないかと考えられる。これ
らの反応は、特異的反応と異なシ過剰の４３−９Ｆ抗体
で競合されなかったからである。

様々な種類のヒト腫瘍からの腫瘍生検を抗原の存在につ
いてｇＬＩｓＡにより分析し、第１表にまとめる。４３
−９Ｆ抗体が偏平上皮肺癌に対し強く特異的であること
がわかる。場合により他の腫瘍から単離された標本が４
３−９Ｆ抗体と弱い反応性を示すこともあるが、強い陽
性であるのは偏平上皮肺癌腫のみであった。

以下余白 第１表：様々はヒト悪性腫瘍の細胞抽出物の４３−９Ｆ
抗体を用い九ＥＬＩＳＡ分析肺： 偏平上皮癌　　　　４７　　４２９　９　　４２／４７
小型細胞肺癌　　　３５　　０　０　０　　　０／３５
腺癌　　　３９　２００　２／３９ その他　　　　　　１７　　２　０　０　　　２／１７
他の癌： 胃　　　　　　　　　　　　１９　　　０　　０　　０
　　　　　０／１９犬腸　　　２８　０００　０／２８ 乳房　　　２３　１００　１／２３ 卵巣　　　１４　１００　１／１４ 膀胱　　　１９　１００　１／１９ 肉腫： 線維肉腫　　　　　１２　　０　０　０　　　０／１２
横紋筋肉腫　　　　　１００００／１ 白血病： 急性リンノηｑモ１噴（阿　　　１１　　　　０　　　
０　　０　　　　　　０／１１急性骨髄性白血病　２３
　　１　０　０　　　１／２３ａ）　　ＫＬＩＳＡグレ
ートを自動ティチルチクスキャナー（ＴｉＴ＠ｒｔ＠ｋ
　ａｅａｎｎｅｒ　）で読む０ノ々、クグラウンドＯ，
Ｄ、値はすべて０．２００であり九。弱い反応（＋）は
Ｏ，Ｄ、値０．２０〜０．４１強い反応（←）と非常に
強い反応（＋）は、それぞれ０．４〜０．８と０．８以
であり九。

ハイブリドーマ４３−９Ｆからの抗体くよシ識別される
４３−９Ｆ抗原 第１図の希釈／４ターンにより、ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１
とＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１２細胞系により産生される抗原の
量は同じではないことがわかる。２つの抽出物のタン／
母り質濃度に関して、ノ・イブリドーマ４３−９Ｆから
の抗体により識別される抗原〔以後、１抗原４３−９Ｆ
”という〕の濃度は、ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞にお―
て１０〜３０倍大きいようである。螢光活性化細胞分別
（ＦＡＣ８）分析、透過した細胞における免疫螢光顕微
鏡法および電子顕微鏡法のすべてにより、４３−９Ｆ抗
原が主として細胞表面成分であることが立証される。

ＳＬＣ細胞系ＲＨ−８ｌ、Ｃ−Ｌ１１を、ナショナルコ
レクション　オプアニマルセルカルチャーズＣＮＣＡＣ
Ｃ）　、サリスペリー、ウィルドジャー、イングランド
に１次に示した日付にて特許手続のために寄託する。

１９８５年６月１４日　　ＲＩ（−ＳＬＣ−Ｌ１１　　
８５０６１４０３４３−９Ｆ’抗原は試験管内で細胞か
ら遊離するつＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ　１１細胞は試験管内で
たとえばＲＰＭＩ　−１６４０培地で、血清の供給なし
に増殖し、それゆえ４３−９Ｆ抗体と結合する遊離した
マクロ分子は培地からただちに調製される。

４３−９Ｆ抗体により識別された抗原は天然に産生する
糖タン／Ｊ？り質または糖脂質のいずれかを含む。この
ことは、タン／４’り質および脂質特性を有する実質的
に精製した分離フラクシ、／を単離し、そ、の各々が４
３−９Ｆ抗体で識別されることにより明らかである。

ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞と小細抱締がん腫（ＳＣＣ）
からの細胞（ＲＨ−８ＣＣ−ＬＩＯ）を、プラスチック
皿に入れたＲＰＭＩ　−１６４０培地とウシ胎児血清（
Ｆｅ２　）中で培養する（７Ｘ１０’個細胞／培地１ｄ
）。５Ｈ−グルコサミン（２，２Ｃｉ／ミリモル、５．
０μＣＩＡｎｌ）を０時に加え、その後、指示した時間
にサンプル３００μｌを取り出し、これを１０分間３０
．０００　ｒ＊ｐ、ｍで遠心分離して不溶物を除き、上
清中のＴＣＡ不溶性３Ｈ−糖タン・ぐり質を測定する。

第２図にＳＬＣ細胞（上側線）とＳＣＣ細胞（下側曲線
）からの　Ｈ−糖タンノタク質の放出を示す。小点分析
によれば、４３−９ＦエピトープがＲＨ−ＳＬＣ細胞か
ら放出される分子の少なくとも一部に存在するが、残り
の細胞系から放出されるものの中には存在しないことが
明らかであった。抗原の放出速度と全３Ｈ−糖タンパク
質の放出速度は、細胞がＦｅ２なしで増殖したときは同
じであった。

ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞からのトリトンで溶解された
４３−９Ｆ抗原の総量と、また培地へ自然に放出された
ものとは、電気泳動移動度の広い分布を示す。明らかに
別々の構造による個々のバンドが両方の分布に見られる
が、明確に分解した・々ンドはなく、隣りの免疫点にお
ける主要バンドの位置は相当しない。同様なダルのクー
マミーブルー染色によれば、主に染色された放出タンｔ
４り質はほとんど流動ダルに入らず、２００　ｋＤ標識
物より著しく大きい分子量を有する。この位置で一部が
分解した・々ンドも相当する免疫点でみられるが、しか
しほとんど連続した電気泳動移動度を有するより小さい
径の他の種類の多くもまた明らかである。要約すると、
イムノプロット分析は、４３−９Ｆ抗体により識別され
る分子が玉として大きな糖タン・やり質の様々な組合わ
せを含んでいることを示す。

さらに、糖タンパク質抗原は４３−９Ｆ抗体を用いて免
疫的に精製される。得られた生成物は、４３−９Ｆ抗体
により識別されるエピトープを含有しない糖夕／・臂り
質をｔｌとんど含まない。この生成物は様々な分子量の
タン・母り質からなシ、これら全ては４３−９Ｆエビ）
−７’（後述で定義する）を含む。この生成物は本発明
の一部である。

４３−９Ｆエピトープ 本発明で使用される“エピトープという語は。

抗体分子との特異的相互作用によるいかなる決定基を４
含むことを意味する。エピトープ性決定基は通常、たと
えば糖側鎖のような分子の表面基からなり、特異的３次
元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。４３−９
Ｆ糖タンｄり質および糖脂質抗原は４３−９Ｆ’エビ）
−ｆを含むであろう。しかしながら、４３−９Ｆエピト
ープはそれ自体で存在するか、またはこれが実際に関連
するタン・やり質または脂質複合体以外の他のものと結
合して存在してもよい。たとえば、４３−９Ｆエピトー
プは、通常これが実際に結合している以外のタン・ぐり
質、ラテ、クス粒子等と関連するかまたは結合してもよ
い。

４３−９ＦエピトープがＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１から放出
される糖タンノタク質の異なった基に存在することがア
フィニティークロマトグラフィにより示される。小麦胚
レクチンカラムは小点分析法により検出可能な４３−９
Ｆ抗原のほとんど全てな保持するし、この抗原はＱ、Ｉ
ＭＮ−アセチルグルコサミンにより溶出されうる。すな
わち、４３−９Ｆ抗体で識別された分子は粘接合体であ
ることが明らかである。この使用された抗原の一部はま
たコンカナ・々リンＡカラムでも保持され、メチル−α
−グルコぎラノシドで溶出されうる。これハ抗原が粘接
合体であるという判定を支持する。

Ｒ）（−ＳＬＣ−Ｌ１１により分泌される糖タンＡ／り
質をプロティナーゼにとともにインキュベートする。電
気泳動とそれに続くウェスタンプロット分析によりイム
ノプロット分析における反応成分のすべてが失なわれた
ことがわかる。プロテイナーぜを用いずにインキ−ベー
トした対照物は影響されない。すなわち、４３−９Ｆ抗
体で識別された部分はタンプ９り質と結合していること
が明らかである。

ＲＩ（−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞により放出される糖タンノ
リ質のセファクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　）■Ｓ−２
００におけるクロマトグラフィにより、紫外線吸収成分
の大半ならびに３Ｈ−グルコサミン標識化成分のほとん
どすべてが排除されたことがわかり、このことは２００
　ｋＤより高いＭｒであることを示す。

糖タン・９り質をＳＤＢ　溶液中で変性させ次いで！ロ
ティナーゼにで完全に加水分解すると、オーアルブミン
標識物のもの（４５ｋＤ　）より低い分子量範囲で３Ｈ
−標識化炭水化物類が遊離する。しかしながら、標識化
炭水化物類の一部は無効量（マｏｌｄマｏｌｕｒｎ・）
でまたは無効量付近で非常に大きな径を溶出し続ける。

分泌された糖タン・９り質はまたエンドグリコシダーゼ
Ｆ（エンドＦ）とともにインキュベートされ、グリコシ
ダーゼは糖タン／９り質におけるアス・ダラギン接続部
位付近で複合体と高マンドース型グリカンの両方を開裂
する〔エルダーとアレキサ／グー（Ｅｌｄｅｒ　ａｎｄ
　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　）　、　１９８２　）。

炭水化物鎖は！ロティナーゼＫによる糖タン／４り質加
水分解後のものと同じ大きさを有するよう作られるが、
しかしながら無効量で溶出する大きな炭水化物もまた維
持される。小点分析において４３−９Ｆ抗原の抗原性で
のエンドＦの明白な効果はなく、これは無効量で溶出す
る大きな粘接合体がエンドＦによる加水分解に抵抗性が
あり、４３−９Ｆ抗体により識別されるエピトープの多
くを含むことを示している。

４３−９Ｆ抗体が特異的エピトープ性炭水化物部分ｌ識
別 放射線免疫検定法は、異なった競合物の存在下に４３−
９Ｆ抗原への１２５Ｉ−標識化４３−９Ｆ抗体の結合を
調べるのに確立された。４３−９Ｆ抗原自体が競合物と
して使用されるし、ま九実施例４で後述するように、会
合したタンプ々り質のタン・ぐり質加水分解後に特異的
糖タン・譬り質から精製される炭水化物鎖もまた使用さ
れる。すべての競合物は３Ｈ−グルコサミン標識化糖タ
ン・ぐり質と同じ調製により誘導されるので、添加され
る競合物の相対量を３Ｈ−標識物から正確に比較するこ
とができる。第４図に示すように、プロティナーゼにで
完全に分解した後にセファクリル５２００の無効１で溶
出する３Ｈ−炭水化物は、分解されない糖タン・母り質
よりもさらに強く競合し、このことは４３−９Ｆ抗体で
識別されるエピトープがこれら炭水化物鎖中に含まれる
ことを示唆する。長鎖の炭水化物により高められ念競合
は繰り返し見られ。

このことにより、４３−９Ｆ抗体がプロティナーゼＫに
感受性のあるアミノ酸列を識別する可能性が除かれる。

糖タン・９り質の加水分解後に遊離するより短かい鎖の
炭水化物も４３−９Ｆ抗体の結合と競合するが、しかし
ながら分解されない糖タンノ々り質よりもさらに弱い。

競合データを比較すると、４３−９Ｆニートープの濃度
は短鎖炭水化物における　Ｈ−グルコサミン残基当り無
効量で溶出するものにおけるよりも２．５〜６倍低いこ
とがわかる。これらの結果により、４３−９Ｆ抗体によ
り識別されるエビドーグは、ＲＨ−ＳＬＣ−ＬＩＬ細胞
により特異的に作り出された炭水化物列であることが示
される。

４３−９１エビドーグは、１イラミニダーゼ処理前およ
び処理後の両方においてヒト赤血球のノ９ネルに見い出
されることはなく、これは直接および間接凝集による試
験および可溶化膜標品（ホワイトゴースト）における小
点分析により様々な血液型抗原を表わす（ＡＩＢ、Ｏ，
Ｍ、Ｎ、Ｓ、ＩＩＰ　１　ｇ　Ｃｅ　Ｃ”　ＨＤ　ｇ　
Ｅ　＃　ｅ　ｇ　＠　ｇ　Ｌｕ２　Ｌｕｂｇ　Ｋ　ｇｋ
、Ｋｐ　、Ｋｐ　、　　Ｌａ’ｔ　　Ｌｅ　、　　Ｆｙ
’、　　Ｆｙｂ＊ＪＫ’ｔ　ＪＫｂｖ　Ｘｇ’、　Ｖｅ
ｌ、　Ｗｒ”、　Ｃｏ’、　Ｃｏｂ、　Ｂｕ’＋Ｉ　＊
　Ｂｇ’　）。

糖脂質を精製して均質にする。これは薄層クロマトグラ
フィにおいてスポットが１つとなることにより証明され
る。このスポットは４３−９Ｆ抗体と結合する。このス
ポットを分離する。当業界で公知の方法による構造分析
を行ない、糖脂質の糖質部分を定義する。単離し精製し
た炭水化物部分、すなわち単離し精製したエビドーグも
また、それゆえ、本発明の一部である。

４３−９Ｆ抗体に対する抗イデオタイプモノクローナル
抗体 Ｂａ１ｂ／ａマウスを、４３−９Ｆ抗体で、たとえば３
週間かけて３回注射することにより免疫化する。最後に
免疫化した後単核牌細胞を単離し、ネズミ非免疫プログ
リンー産生性ネズミミエローマ細胞系Ｘ６３−Ａｇ３．
６．５．３で溶解する。４３−９Ｆ抗体と結合する能力
、さらに放射線免疫検定法において４３−９Ｆ抗原と競
合する能力を示すハイブリドーマ上清を選択し、Ｂａ１
ｂ／ｃマウスの免疫化に用いる。このようなマウスの血
清を、精製しｆｃ４３−９Ｆ抗原およびＳＬ、Ｃ−Ｌ１
１細胞との結合について試験する。４３−９Ｆエピトー
プを含まない糖タン・ダク質を実質的に排除した精製４
３−９Ｆ抗原が、アフィニティクロマトグラフィにより
、すなわちセファロス（５ｅｐｈａｒ…）■と結合した
４３−９Ｆ’抗体のカラム中で得られる。

血清中の４３−９Ｆ抗原の検出 ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１培養物の上清中へ大量の４３−９
Ｆ抗原が放出することは、同様な過程が生体内でも生じ
うろことおよび従って４３−９Ｆ抗体と反応する抗原が
ＳＬＣ患者の血清中に存在しうろことを示唆する。肺癌
患者１０９名の血清標本を診断時に手に入れ、４３−９
Ｆ抗体との反応性を分析する。さらに他の種類の癌患者
１４４名からの血清標本ならびに明らかに健康な個体１
９１０名からの血清を分析する。第２表に示すように、
偏平上皮肺癌の患者のうち約８０係が診断時に陽性であ
り、一方、他の種類の癌において陽性の割合は約６憾、
健康な対照グループでは約１鴫であったＯ ｗＪ２表：肺癌患者の血清および健巖人の血清における
４３−９Ｆ抗原の分析 患者分類標本（患者）　陽性Ａａ　）　　総陽性墓／総
黒＆　　　　　４Ｊ−１−←→ 肺がん： 偏平上皮　７６　３４９　８　　６０／７６小細胞　　
２０　０　０　０　　０／２０腺　　癌　　　　９１０
０１／９ その他　　　４００００／４ 他の癌： 消化ａ　　　５４　２　０　０　　２１５４乳　　　　
　　４１　　２　１　　０　　　　３／４１膀胱　３５
１００　１／３５ 卵　　巣　　　３２　　１　　２　　０　　　　３／３
２肉　　膝　　　　１９　　１　　０　　０　　　　　
１／１９白血病　　１７　１　０　０　　１／１７健康
個体：１９１０１８　１　０　　１９／１９１０＆）後
述する実施例９に記載のようにＥＬＩＳＡを行なつ念。

〔本発明の検討〕

これらのデータにより、偏平上皮肺癌患者の大部分がそ
の血清中にこの特別の型の癌に特異性の高い抗原決定基
を有することが示された。偏平上皮肺癌腫のクローン化
細胞系により放出され同一のモノクローナル抗体と反応
する抗原決定基の分析により、さらに、エピトープが糖
タンパク質の炭水化物部分に位置しこれらの多くは２０
０　ｋＤ以上の分子量とムチン様およびプロテオグリカ
ン様特性を有することがわかる。糖タン・平り質はまた
他の種類の細胞によっても合成され放出されると思われ
る。ＳＬＣ細胞に特有の主な違いはこれら大きな糖タン
ノ４り質における炭水化物銀の変性である。

４３−９Ｆ抗原に関する驚くべき特徴は偏平上皮肺癌に
対するその特異性である。他の種類の癌において臓瘍関
連抗原の炭水化物エピトープが、いくつかの異なった種
類の癌細胞およびある種の正常細胞により合成されてい
るようだが、一方。

ＳＬＣ細胞以外の他の腫瘍または細胞が４３−９Ｆ抗原
を産生ずることは見出されていない。癌患者２５０名の
血清標本、血清対照品１９００および異なりた癌患者は
ぼ３００名からの腫瘍標本を含む分析は、腫瘍関連抗原
の最も初期の研究より一層大規模である。非−ＳＬＣ腫
瘍がＥＬＩＳＡ分析で陽性を記載するいくつかの場合は
、主にＳＬＣと比較して弱い反応だけであシ、小点分析
において弱い反応を示すいくつかの種類の細胞は、特異
的ＳＬＣ抗原のように過剰の抗体により競合されること
はない。すなわち、この抗原はこれまで報告されたもの
よりもヒト偏平上皮肺癌に対し著しく高い特異性を有す
るばかりでなく、一般に最も特異的な腫瘍関連抗原の１
つであるようにも思われる。

４３−９Ｆ抗体で識別される炭水化物列は、様様な組合
せの糖タンパク質と関係する。ＳＬＣ細胞の抽出物にお
けるこれらは、主に分子量５０〜２００ｋＤの範囲であ
るが、少ない方の成分では分子量２０００　ｋＤ以上を
有するものもある。４３−９Ｆ’抗体で識別されるエビ
ドーグは他の公知の腫瘍関連炭水化物抗原と異なる〔ブ
イ、ノンスパーグら（Ｖ＊　Ｇｉｎｓｂｕｒｇ　ａｔ　
ａＬ、　１９８４　）　］。

第４図には、ＳＬＣ細胞から放出される複合糖質から精
製され之炭水化物鎖が、その複合糖質母体より４３−９
Ｆ抗体との結合に対し一層強く競合することが示される
。

４３−９Ｆ完全抗原またはその特徴的エピトープの存在
を検出することは、九とえば血清、血液、唾液、尿、組
織、生検、気管支洗浄等のような発生源または標本中で
行なわれることができる。

検出は免疫検定法たとえば競合型またはイムノメトリッ
ク型（サンドイッチ型）により行なうことができる。競
合検定法においては、精製した４３−９Ｆ抗原、または
その特徴的エピトープからなる分子を検出可能な標識物
でラベルする。

４３−９Ｆ抗体またはエピトープを含有すると予測され
る標本を４３−９Ｆ抗体および標識化４３−９Ｆ抗原と
一緒にインキュベートし、免疫複合体形成、分離および
検出後に４３−９Ｆ抗原のレベルをただちに測定する。

別の種類の競合型検定は固定化４３−９Ｆ抗原またはエ
ピトープと標識化４３−９Ｆ抗体とを含む。供給源ま念
は標・本における４３−９Ｆ’抗原の存在により抗体の
固定化抗原またはエピトープへの結合が阻止され、これ
により抗原存在の反比例値を提供する。

競合型分析において、抗体はまた、免疫複合体の形成前
または形成後のいずれかに固相に固定化されてもよい。

たとえば、第二の抗−マウスＩｇＧ。

固相に固定化された抗体を混合物へ加えることもでき、
これは６二重抗体”法として知られている。

イムノメトリ、り（サンドイッチ）法において、４３−
９Ｆ抗体の１つの標本は検出可能に標識化される。別の
抗体標本を固相上で不溶化する。標本を標識化され不溶
化された抗体とともにインキユベーションするとサンド
イッチ型となり、ここでは非結合抗体の分離後、標識物
の量が抗原量に比例する。イムノメトリ、り法は、不溶
化および／または標識化抗体の添加順序に応じて、先行
、逆行、または同時方法で行なうことができる。

サンドイツチ法において感度を増すために、記載し念力
法を変形させ、アぎジン−イルオキシダーゼ複合体と反
応するビオチニル化４３−９Ｆ抗体を用いることもでき
る。

４３−９Ｆ抗原または特徴的エピトープの代わりに、検
定において、抗−イデオタイプ抗体またはモノクローナ
ル抗体４３−９Ｆの結合部位に対し抗体を活性化するこ
とにより産生されるその免疫学的に活性なフラグメント
な用いることもできる。

本発明の検定に用いる材料は、器具一式の調製に十分適
する。このような器具一式は１区画され厳重に密閉され
た１個以上の容器手段たとえばバイアル、試験管等を収
容する運搬体手段からなり、前記容器手段の各々は所望
のいずれの方法にも使用されるように別々の構成物の１
つからなる。

たとえばイムノメトリック法に有用な前記容器手段の１
つは、支持体と結合したモノクローナル抗体４３−９Ｆ
を包含してもよい。第二の容器手段は、可溶性で検出可
能に標識化されたモノクローナル抗体４３−９Ｆの凍結
乾燥状または液状形のものを包含してもよい。

競合型検定に使用される器具一式は、検出可能に標識化
された４３−９Ｆ抗原を含む第一の容器と遊離型または
支持体結合型の４３−９Ｆ抗体を含む第二の容器とから
なる。

さらに、運搬体手段は複数の容器を含んでいてよく、こ
れらの各々は異なった予め測定した量の４３−９Ｆ抗原
を含んでいる。これらの容器を使用して、標準曲線を作
成しこの標準曲線へ未知量な有する標本から得られる結
果を挿入することができる。

以下余白 本発明の実際を次の特別の実施例によりさらに説明する
が、しかしながらこれにより本発明の範囲を限定するも
のと解釈してはならない。

〔実施例〕

実施例１：腫瘍標本および細胞培養 様々な悪性疾病を有する患者から腫瘍標本を新しい生検
材料として得る。標本を提供する機関は次のようである
、：ステートエニパーシティホスビタＡ／（８ｔａｔ＠
Ｕｎｌｖ＋５ｒｓｉｔｙ　Ｈｏ５ｐｌｔａｌ　）、コペ
ンハーｒン；アールＩルグシイダフス（Ａａｌｂｏｒｇ
Ｓｙｇ＠ｈｕｓ）、アール？ルグ、デンマーク：デ／４
−トメントオプクリニカルケミストリイ （Ｄ＠ｐａｒｔｍ＠ｎｔ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、オス口、ノルウェー；インスティ
チュートオ７”−？ヤンサロロジイアンドイムノジェネ
ティックス（Ｉｎ５ｔｌｔｕｔ＠ｏｆ　Ｃａｎｅ＠ｒｏ
ｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｇ＠ｎ＠ｔｌｅｍ）、ノ
中す、フランス：スタン７オードエニパシテイスクール
オプメデイシン（Ｅｌｔａｎｆｅｒｄ　Ｕｕｌｖ＠ｒｓ
ｉｔｙ　８ｅｈｏｏｌ　ｏｆＭ＠ｄ　１　ｃ　ｉ　ｎ・
）、スタンフォード、カリホルニア；シティオプホーグ
メディカルセンター（Ｃ１ｔ７ｏｆ　ＨＯｐ＠　Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ＠ｒ　）、デュアルト、カリホルニ
ア。示した診断書は提供機関のものである。材料の多く
は、通常大部分の膿瘍細胞が含まれる腫瘍の皮質部分を
単離後、ホモジナイズレ、３０　％　Ｆｅ２と１０　＊
　ＤＭ８０含有ＲＰＭＩ　−１６４０中で凍結し、液体
窒素中で保存する。白血病標本は新しい骨髄吸引物から
得られる。癌患者の血清標本は、列記したばか）の研究
機関で診断時に採取した。健康人の血清標本は次の血液
銀行における血液提供者から採取し九：ステートユニパ
シティホスピタ／Ｉ／（８ｔａｔ＠Ｕｎｉｖｖｒｓｉｔ
ｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌχコ４ンハーダン、デンマーク：
デノ臂−トメｙトオツクリニカルケミストリ４　（Ｄ＠
ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＣｌｉｎｌｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　）、オス口、ノルクエイ；およびオビタルポ
ールブルス（Ｈｏｐｌｔａｌ　ＰａｕｌＢｒｏｕｓｓａ
）、パリ、フランス。ヒトＳＬＣ細胞系朋−ＳＬＣ−Ｌ
　１１およびＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ　１２を、１５％ウシ胎
児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ／ＴＣ
８）中で予め記載したように培養する〔オルノンら（０
１ｓａｏｎ　ａｔ　ａｌ、）、１９８４］ａ細施は通常
のように増殖しプラスチック容器に付着する。これらは
′を九血清を含有しないＲＰＭＩ−１６４０培地中で７
日間増殖させるが、増殖速度は血清含有培地のものより
若干遅いだけでありた。

ヒト小細胞肺癌、腫系ＲＨ−８ＣＣ−ＬＩＯを記載した
と同じように保持する（同出典）。ａｔ図に示したヒト
癌細胞をＲＰＭＩ／′ＩＰＣ８中で増殖させ、ならびに
前骨髄球ＨＬ−６０白血球〔ギャラガーら（Ｇａ１１ａ
ｇｈ＠ｒ　ａｔ　ｍｌ、χ１９７９：）、組織リッツ４
球〔サンドストレームとニルリン（８ｕｎｄａｔｒｏｍ
ａｎｄ　Ｎ１１ｍ５ｏｎ　）、１９７６）、ＲＨ−Ｌ４
Ｂ−リンパ球〔オルノンら（０１ｍ５ｏｎ　ａｔ　ａｔ
、）、１９８°３〕および包皮線維芽細胞も同様に増殖
する。正常表ヒト単核白血球および赤血球を上述したよ
うに単離する（同出典）。悪性疾病以外の理由で肺葉切
除の手術を受けた患者から正常ヒト肺細胞集団を得る。

分析用生検は気管支の一切を含む。

以下余白 実施例２　：　ＳＬＣ細胞により放出される糖タンパク
質の精製 冊−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞を、１５０ｉまたは３００ｉプ
ラスチツク血中、３７℃にて、５％ＣＯｚ雰囲気下、Ｆ
ｅ２を除いたＲＰＭＩ　−１６４０培地中、細胞濃度少
なくとも２　Ｘ　１０４個細胸／ゴで増殖する。

増殖後４〜５日目に、培地を回収し、４℃まで冷却し、
３０．０００１９で２０分間遠心分離し細胞片または他
の不溶性物質を除く。硫酸アンモニウム飽和液（シグマ
グレード■）を連続的攪拌しながらゆっくり加え最終濃
度７５チφとし、４℃で一晩攪拌する。１回で処理する
培地の量は１００ｔｎｌ〜１．５１に変える。３０，０
ＯＯＩで３０分間遠心分離することにより沈でん物を集
め、タンパク質濃度約２〜５勢礪で０．１Ｍ硫駿す）　
ＩＪウム（ｐ）ｌ＝７．０）少量に再懸濁する。１゜Ｑ
ｑＡｔの溶液が０．Ｄ、　２８０＝　１．０であること
を仮定して紫外線吸収からタンノ膏り質濃度を評価する
。次いでその試料またはアリコートを、ＰＢ８またはｐ
Ｈ８＋０．１チトウイーンで平衡化されたセファクリル
（８＠ｐｈａｅｒｙｌ）　８２００　、８３００または
８４００カラム（７アルｉシア）（２５画Ｘ　０．８３
２）に入れ、この力２ムを同じ溶液で流速２９ｄ／ｈｒ
にて溶出する。第３図に示すようＫ、環タン・々り質お
よび４３−９Ｆ’に原の大部分が無効量で溶出する。

溶液中にトクイーンが含まれた場合には糖タンパク質の
回収はほとんど１００チ近くであったがトウイーンがな
いと通常は使用材料の３０チ以下であった。プロティナ
ーぜＫで分解後、トクイーンを用いてまたは用いずに炭
水化物を定量的に回収する。

実施例３：５Ｈ−標識化糖タンノク質 ５Ｈ−標識化糖タンパク質を調製するために１３Ｈ−グ
ルコサミン〔アメルシャム（Ａｍ＊ｒｓｈａｍ）〕３〜
１０μＣＩ／”ｓ　ａ、　５　ａｔ／　４９モルの存在
下に血清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地中で最後の２日間
ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞を増殖する。培地を集め、標
識化糖タンノクク質を全く記載したとおりに精製する。

以下余白 実施例４：環タンΔり質からの炭水化物の精製Ｒ）Ｉ−
ＳＬＣ−Ｌ１１細胞から放出され、全く記載したとおシ
に精製された環タンΔり質を、０．１０Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，０）と０．１０％ＳＤＳを含む溶液中で
２分間沸とうさせ、次いで冷却する。

溶液を同じリン酸緩衝液で４倍に希釈してタンノ々り質
濃度２００〜３００μｔｔ／ｒｄとし、室温で２時間自
動熟成したプロテイナーゼＫ（ベーリンカーマンハイム
）を加え最終濃度３７５μｌｉ／ｄとする。

３７℃で１６〜１８時間これを培養し、プロテイナーゼ
Ｋを追加して最終濃度７５０μｌ／−とし、２〜３時間
培養を続ける。溶液を１０分間沸とうし、冷却し、セフ
ァクリル８２００カラムへ入れると無効量でまたはほぼ
無効量で溶出するものから短鎖の炭水化物が分離する。

実施例５：抗体４３−４３−９Ｆ（Ｉ 寄託したマウスハイブリドーマ細胞系により抗体が分泌
される。無効量からフラク゛ジョンを集める。最も高度
に精製された抗体を、４３−９Ｆノ’イブリドーマが増
殖している血清不含ＨＢ　１０２培地（ハナバイオロジ
カル、カリフォルニア）から得られる上清から調製する
。５０％ψ硫酸アンモニウムを有する培地からＩｇＭが
沈でんし、これをＰＢＳで平衡化したセファクリル８３
００カラムへ用いる。無効量からのフラクシ璽ンはＩｇ
Ｍを含み、これはｉｏ＊ポリアクリルアミドｒルダル電
気泳動後にクーマシー青染色で検出可能な他の２つのタ
ンノクク質のわずかな量（０，５％以下）でのみ汚染さ
れるだけである。

実施例６　：　１２５ｘを用いた標識化糖タン・母り質
および抗体を、ビーズと結合したラクトベルオキシダー
ゼ（バイオラド）を介してまたはヨードダン（Ｉｏｄｏ
Ｇ＠ｎ）　（ピアース）試薬を用いるかのいずれかによ
り標識化する。遠心分離管中に備えた小型８２５セフア
デツクスカラムを通して遠心分離することにより標識化
タンノ４り質を遊離ヨウ素から分離し、標識化タンノや
り質を含む流出液を捕集する。ここで使用される抗体の
特異的活性は一般に０．５〜２　Ｘ　１０６　ｅｐｍ／
μｇの範囲とし多重標識化分子を避ける。抗原を識別し
うる標識化抗体の量は、ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞のト
リトン溶解物中における全部のタンパク質が複合化して
いるアフィニティカラム（アフィダルーノ々イ第２ド）
へ抗体を入れることによυ評価される。

実施例７：小点分析法 細胞抽出物または精製タンノＪ？り質を、小点分析法ニ
てニトロセルロースシート（、＋イオン）’）Ｉｃ付着
した抗原を用いて抗体の結合について分析する。培養し
た癌細胞または正常細胞を遠心分離によりそれらの増殖
培地から集め、ＰＨ８中で洗い、次いで、０．０２Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ７，５）、００２Ｍ　ＮａＣＬ　、　
０．２　ｍＭＰＭｓＦ、　０．１０　Ｍシ、糖を含む溶
液で洗いそして該溶液中にｌＸ１０７〜Ｉ　Ｘ　１０８
個細胞／ｒＩＬｄ　（細胞の容量による）で再懸濁する
。

ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞を２Ｘ１０７個細胞／ｄで懸
濁する。これらの細胞をデムペラを用いてプラスチック
皿から落とし散開させる。ポッターーエルグアーヒエム
（Ｐｏｔｔ＠ｒ　−Ｅ１ｖｅｒｈｊ＠ｍ　）ホモジナイ
デー中で１．０％）リドンＸ−１００の存在下に細胞を
破壊し、可溶性タンパク質を核および細胞片から分離す
る。これらはすべて記載されている〔リーデルセンと（
ティジョン（Ｌｙｄ＠ｒｓ＠ｎａｎｄ　Ｐ＠ｔｔｉＪｏ
ｈｎ　）、１９８０：ｌ。細胞を含まない抽出物中のタ
ンパク質濃度は、記載されているように〔ゼマックとグ
ロスベルブ（８＠ｄｍａｋ　ａｎｄＧｒｏｓｓｂ＊ｒｇ
）、１９７７）、酸性クーマシーブリリアントブルー溶
液中で測定される。粗抽出ｔＩＬまたは部分的精製タン
パク質を、ミクロピペットで直接２〜５μノの測定標本
を吸い込み、この標本を風乾させることによジニトロセ
ルロースへ加える。

このシートを、０．０５％）ウィーン含有ＰＢＳ溶液を
２回取替見て攪拌したトレー中で洗う。使用したタンパ
ク質のいくつかはこの時点で洗い流されることが一般的
である。保持された３Ｈ−放射活性を測定すると、記載
されているように約５００μｂ礪以下の濃度で用いた場
合、培地から精製された３Ｈ−糖タン／々り質は２０〜
２５チの範囲で不可逆的に結合する。次いでこのシート
を、密閉したプラスチック袋中で３０　Ｓ　Ｆｅ２と０
．０５１）ウィーンを含有するｐＢ８溶液中の１２５！
−標識化抗体（１〜２　Ｘ　１０’　ｃｐｍ／ニトロセ
ルロース１００ｃｙ＋ｓ２）とともにインキュベートす
る。振とり基中で室温にて２時間インキュベージ、ン後
、ニトロセルロースを取シ出し、６〜１２時間の間に４
〜５回ＰＢ８−トクイーン溶液中でこれを洗う：次いで
シートを乾燥し、プラスチック封筒中（３Ｈ放射活性が
フィルムを感光する可能性を除くため）にて−６０℃で
コダックＸ線フィルムへ適用し、小点のオートラジオグ
ラフを得る。小点において結合した１２５！−標識化抗
体の相対量を評価するために、ツァイス（Ｚ＠ｔａｓ）
記録微小濃度計を用いてオートラジオグラフを走査し、
ブロックアンドマイケルセン（Ｂｒｏｅｋ　ａｎｄ　Ｍ
ｉａｈ＠１ａＩｎ）デジタルプロセッサーを用いて積分
する。公知量の１２５ニ一モノクローナル抗体のオート
ラジオグラフを走査することにより較正を行なう。これ
らにより、積分した面積と結合モノクローナル抗体の間
の直線状の関係がある限定された範囲にわたって存在す
ることがわかる。

以下余白 実施例８：固相放射線免疫検定法 放射線免疫検定のために１実施例２で精製した糖タンノ
母り質放出ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１をプラスチック微量滴
定板の凹所に吸着させる。非特異的吸着部位を遮断した
後、各々の凹所をｌ　％　ＦＣ８含有ＰＲ８５０μ！中
で１２５に一標識化４３−９Ｆ抗体とともに４時間イン
キュベートする。精製したＡＨ−グルコサミン標識化Ｒ
Ｈ−ＳＬＣ−Ｌｌ　１放出糖タンノやり質または同じも
ので標識化された糖タンノ臂り質から精製した炭水化物
の可変量を標識化抗体との競合物として加える。インキ
−ベージ、ンし、洗浄後、各々の凹所中の結合１２５■
−標識化抗体をガンマ計測器で計測する。結果を第４図
に示す。

各データ点は同一の分析３回の平均である。上側曲線：
競合物は完全な５Ｈ−糖タンパク質である；下側曲線：
競合物は実施例４で記載したようなセファクリルカラム
で精製した炭水化物鎖である。

実施例９：酵素−結合イムノリルペントマッセイ（ＥＬ
Ｉ８Ａ　） ＥＬＩＳＡ法により４３−９Ｆ抗体と腫瘍細胞との反応
性を試験するために、腫瘍からトリトンＸ−１００抽出
物を調製し、９６個の凹所を有する板の凹所に約１０５
〜１０’個細胞に相当する抽出物を塗布する（これらは
全て上記記載）。モノクローナル４３−９Ｆ抗体をペル
オキシダーゼ複合体とし、このためＥＬＩＢｋ分析を一
段階法として行なう。

板を特異的抗体（約１００１９／凹所）とともに１時間
２０℃および１時間３７℃でインキュベートし、　　Ｐ
Ｂ８／）ウィーンで洗い、ケネット（（Ｋ＠ｍｎ５ｔｔ
）、１９８０１が記載したように基質とともにインキ−
ベートし、１５分と４５分後に自動ティチルチク（Ｔ１
ｔｅｒｔ＠ｋ　）スキャナーで読む。４５分における値
を用いる。パラフグ２クンド値に対する光学密度（０，
０，）は０．２００以下であシ、弱い（＋）反応は０．
Ｄ、０．２〜０．４、強い（＋＋）および非常に強い（
→＋）反応は、それぞれ０．４〜０．８と０．８以上と
である。抗体を捕獲し検出する両方のものとして４３−
９　Ｆモノクローナル抗体を用いて分析を何回か平行し
て行なった。

しかしながら後述した種類のＥＩＪＳムは、上述の一段
階法よシも優れているわけではなかった。これと対照的
に、このサンドイッチ型ＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析は、血清中
の抗原の分析に用すられる。一段階法はこの場合、血清
タン／４’り質が特異的抗原のプラスチックに対する付
着を競合するために１使用できなかりた。それゆえ検定
は、サンドイッチ型検定として行なわれ、ここでプレー
トを非標識化４３−９Ｆ抗体（１μＩＡＩ、　　１００
　ｑ／凹所）で塗布し、ＰＢＸ／）クイーンで洗い、Ｐ
Ｂ８／１チＢＳムでブロックし、ＰＨ５中でに１に希釈
された血清とともに室温で１時間と３７℃で１時間イン
キュベートし、洗−１そして−Ｒ／Ｌ／オキシダーゼ複
合化４３−９Ｆとともに室温で２時間インキュベートす
る。

試験の判読は上述したように行なわれる。

ＩＬＩａＡ法における感度向上のために、記載した方法
ヲ、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体と反応するビオ
チニル化４３−９Ｆ抗体を用いて変形することもできる
。

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よびケイ、ムンク（Ｋ。

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Ｋ＠ｎｎｅｔｔａ　）、ジェイ、マクセーン（Ｊ。

Ｍｃｋ＠ａｒｎ）およびクー。ピー、ペクトール（Ｋ、
Ｂ。

Ｂ＠ｃｈｔｏｌ）版、（プレナムプレス、ニューヨーク
）３７６〜３７７゜ リーデルセン、グー。ビー、　（Ｌｙｄｅｒｓａｎ、　
Ｋ、　Ｂ、　）およびペティジョン、デ４　（Ｐ＠ｔｔ
ｌｊｏｈｎ、Ｄ、）（１９８０）。分裂装置の極性部位
と関連するヒトー特異的核タンパク質：ヒト／ノ・ムス
ターノ島イブリッド細胞における分布。セル（Ｃ＠１１
　）　２２゜４８９〜４９９゜ ムールシャイン、ジョイ。エル、ら（Ｍｕ１１ａｈｌｎ
・。

Ｊ、Ｌ、・ｔ　ａｌ）癌におけるモノクローナル抗体ｐ
、２２９−２４６１：セル、ニス、　（ｇ＠１１、Ｓ、
）おヨヒライスフェルド、アール、ニー。

（Ｒｅ１ｓｔｅｌｄ、Ｒ，Ａ、　）版〕ヒューマナフレ
ス、ニュージャーシイ、アメリカ合衆国（１９８５）。

オールンン、エル、　（０１ｍ５ｏｎ、Ｌ、）、クロン
ストレーム、エイチ、　（Ｋｒｏｎｓｔｒｌｍ、Ｈ，）
カンがンーデーモウゾン、ニー、　（Ｃａｍｂｏｎ−ｄ
＠−Ｍｏｕｚｏｎ　。

Ａ、）、ホンシキ、シイ、ジェイ、　（Ｈｏｎ５ｌｋ　
。

Ｃ，Ｊ、）、ブローディン、テ４　、　（Ｂｒｏｄｌｆ
ｌ、Ｔ、）およびセコプセン、ビイ、　（Ｊａｅｏｂｓ
＊ｎ、Ｂ、）（１９８３）。抗体−産生ヒトーヒトハイ
ブリドーマ。！、テクニカルマスペクト、ジャーナルオ
ツハムノロジセルメリッド（Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　
。

Ｍｅｔｈｏｄｓ）　６１　、１７〜３２゜オールノン、
エル、　（０１ｉｉｏｎ、Ｌ、λセレンセン、エイチ、
アーＡ／　、　（Ｓｌｖ＊ｎｓｓ＠ｎ、Ｈ，Ｒ，）およ
びペンタ、オー、　（Ｂ＠ｈｎｋｓ、Ｏ，）　（１９８
４）。

クローン化ヒト肺臓瘍細胞系の内部腫瘍表現型の多様性
およびモノクローナル抗体を用いた分析の結果。キー？
７サー（Ｃａｎｃ＠ｒ　）５４　、　Ｌ７５７〜１７６
５゜ ゼマック、ジェイ、ジェイ、　（Ｓ＠ｄｍａｋ、Ｊ、Ｊ
、）およびグロスペルグ、ニス、イー、　（Ｇｒｏｓｓ
ｂｅｒｇ。

８、Ｅ−）Ｃ１９７７）。クーマシーブリリアントプル
ー０２５０を用いるタンノぐり質の急速、高感皇女多面
性分析。アナリティセルパイオケミストリイ（Ａｎａｌ
、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　）７９．５４４〜５５２゜サンド
ストレーム、シ４　、　（Ｓｕｎｄａｔｒｏｍ、Ｃ，）
およびニルノン、ケー、　（Ｎｉ１ｓｓｏｎ、に、）。

ヒト組織球すンパ細胞系（Ｕ−９３７）の衝圧および特
徴。インターナショナルジャーナルオプキャンサ−（Ｉ
ｎｔ、Ｊ、Ｃａｎａｓｒ）　　１　７　　、　５　６　
５〜５　７　７　　。

１９７６゜ タラガート、アール、ティ、ら（Ｔａｇｇａｒｔ、Ｒ，
Ｔ。

ｓ　ｔ　ａ　ｌ　、　）ｏサイエンス（８ｅｉ＠ｎｃｅ
）　２１９　。

１２２８（１９８３）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、異なった種類の細胞抽出物分析において４３
−９Ｆモノクロ一ナル抗体を用いた小点分析を示す。 ｌＸ２図は、ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞による糖タンノ
々り質の放出を示す。 第３図は、皿−ＳＬＣ−Ｌ１１細胞により放出された糖
タン・り質のセファクリル（ＳｅｐｈａａｒｙｌＰＳ２
００カラムにおける一連の排除クロマトグラフィを示す
。 第４図は４３−９Ｆ抗原（後に定義される）の競合的放
射線免疫分析を示す。この分析は、固定した抗原と滓渣
中の抗原間での標識化４３−９Ｆ抗体に対する競合に基
づく。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ハイブリドーマ細胞系４３−９Ｆ（ＩｇＭ）により
   産生される抗体または免疫学的に等価なモノクローナル
   抗体により識別されるエピトープを有する抗原。 ２、エピトープが偏平上皮肺癌腫細胞系ＲＨ−ＳＬＣ−
   Ｌ１１により産生される特定の炭水化物部分である特許
   請求の範囲第１項記載の抗原。 ３、エピトープが抗イディオタイプ抗体部分または免疫
   学的等価物である特許請求の範囲第１項記載の抗原。 ４、ハイブリドーマ４３−９Ｆにより産生される抗体に
   特異的に結合しうる実質的に精製された炭水化物部分。 ５、ヒト偏平上皮肺癌腫に特有のエピトープ炭水化物部
   分であって、細胞系ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１により産生さ
   れる部分を結合することを特徴とする、肺癌検出診断用
   モノクローナル抗体。 ６、齧歯目動物またはヒト臓器のものである特許請求の
   範囲第５項記載のモノクローナル抗体。 ７、ハイブリドーマ細胞系４３−９Ｆ（ＩｇＭ）または
   そのクローンもしくはサブクローンから得られうる特許
   請求の範囲第５項記載のモノクローナル抗体。 ８、ヒト偏平上皮肺癌腫に特有なエピトープ炭水化物部
   分であって、細胞系ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１により産生さ
   れる部分と結合する抗体を分泌するハイブリドーマ。 ９、ヒト偏平上皮肺癌腫に特有なエピトープ炭水化物部
   分であって、細胞系ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１により産生さ
   れる部分と結合する抗体を生じうるハイブリドーマ細胞
   系を増殖培地で培養することからなる肺癌検出用診断助
   剤として使用するモノクローナル抗体の調製方法。 １０、ハイブリドーマ細胞系が細胞系４３−９Ｆ（Ｉｇ
   Ｍ）である特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、ヒトＳＬＣ特有の抗原を含有するか含有する可能
   性のある発生源を特許請求の範囲第５項、第６項または
   第７項記載のモノクローナル抗体と接触させ、前記抗体
   が前記抗原と結合するかどうかを検出することからなる
   ヒト偏平上皮肺癌腫（ＳＬＣ）を検出する方法。 １２、特許請求の範囲第５項記載のモノクローナル抗体
   からなることを特徴とする血清、ヒトＳＬＣの組織また
   は組織抽出物における検出用診断器具。 １３、小点分析法、イムノメトリックサンドイッチ法ま
   たは競合法に適する特許請求の範囲第１２項記載の診断
   器具。 １４、ヒト偏平上皮肺癌腫細胞の免疫組織化学的局所化
   に適する特許請求の範囲第１２項記載の診断器具。 １５、その内部が区画され、第一の容器がハイブリドー
   マ４３−９Ｆにより産生される抗体により識別されるエ
   ピトープ含有抗原を含み、 第二の容器が、ＳＬＣ特有のエピトープ炭水化物部分で
   あって細胞系ＲＨ−ＳＬＣ−Ｌ１１により産生される部
   分と結合する、検出可能に標識化されたモノクローナル
   抗体を含む、２つ以上の容器を厳重に密閉してなる運搬
   体を有する診断器具。 １６、第二の容器中の抗体がハイブリドーマ細胞系４３
   −９Ｆにより産生される特許請求の範囲第１５項記載の
   器具。