JPS63301899A - ヒト膵臓癌に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、−触的には新規なハイブリドーマ細胞系に関
する。より詳細には、ヒト膵臓癌細胞との反応性を有す
るモノクローナル抗体を産生ずるモノクローナル細胞系
に関する。

（従来の技術） アメリカ合衆国において、癌腫は最も一般的な死亡原因
の第２位に位置している。膵臓の癌腫は８番目に多い形
態の癌であり、アメリカ合衆国では癌腫による死亡原因
中第４位である。膵臓癌の発生率は、はとんどの工業国
で過去２０年間着実に増加し続けており、疫学上の問題
が増大する特徴を示している。

膵臓癌の予後は、現時点では非常に悪く、全ての癌の中
で最も低い５年生存率を示す。このような予後は、主と
して診断の遅れから生じるものであり、一部は初期症状
が他のより一般的な腹部の病気と同じであるという事実
による。膵臓癌の診断は、しばしば病気がかなり進行し
た後に必然的に実施される試験的な外科手術に依存する
。

膵臓癌の初期診断に有効な手段の開発に実質的な努力が
向けられている。それにもかかわらず。

最終的な診断は、しばしば試験的な外科手術に依存して
おり、この手術は早期処置が効果的であり得る時点を過
ぎて病気が進行した後に必然的に実施される。様々な形
態の癌腫を早期診断するのに有望なある方法は、癌腫細
胞の表面に存在する抗原と呼ばれる特異的な生化学的成
分の同定である。

癌腫細胞表面に存在する抗原を特異的に認識し。

該抗原に結合する抗体は、特に悪性癌腫の診断および処
置のための強力な手段を提供する可能性がある。腫瘍特
異的細胞表面抗原は、いくつかのメラノーマ、結腸およ
び生殖腺の悪性リンパ腫について同定されている。

このように、膵臓の腫瘍細胞表面に存在する細胞表面マ
ーカーと、このような細胞表面マーカーを特異的に認識
する抗体とに対する情実な要求が久しく存在する。この
ようなマーカーおよび対応する抗体は、膵臓癌腫の早期
発見だけでなく、膵明はこれらの要求を満足させ、関連
する利点をも提供するものである。

（発明の要旨） 本発明は、抗体がヒト膵臓癌Ｉｌｌ　（ＨＰＣ）細胞に
対して特異的に反応することを特徴とするモノクローナ
ル抗体を提供する。　ＨＰＣ細胞上の細胞表面マーカー
を認識し、該マーカーに結合するこれらのモノクローナ
ル抗体は、　ｌｌＰｃの診断および処置に有利に用いら
れ得る。

本発明によれば、　ＨＰＣ細胞表面上の抗原性マーカー
と特異的に反応するモノクローナル抗体が提供される。

本発明のモノクローナル抗体調製物は、ヒト膵臓癌（Ｈ
ＰＣ）細胞の表面マーカーとは特異的に反応するが、リ
ンパ腫細胞、肝臓細胞および腎臓細胞とは反応しない。

本発明のさらに別の局面によれば、　ＨＰＣ細胞表面マ
ーカーに対して特異的な反応性を有するモノクローナル
抗体を産往するハイプリドーマ細胞系が提供される。好
適なハイブリドーマ細胞系は。

ＡＴＣＣ受託番号がそれぞれ１ｌＢ９３１８およびＨＢ
９３１９で同定されるＳ３−４１およびＳ３−５３と命
名されたバイブ・リドーマ細胞系であり、これらの細胞
系によりモノクローナル抗体が産生される。

１１Ｐｃとの反応性を有する本発明のＭａｂの製造方法
は、永久増殖性細胞系と、予めＩＩＰＣ細胞または誘導
細胞で免疫した動物由来の牌細胞と、を融合することに
より調製され、該Ｍａｂを分泌し得るハイプリドーマを
培養する工程、およびその培養物から該Ｍａｂを回収す
る工程を包含する。

１１Ｐｃに特異的である本発明のＭａｂの製造方法は。

上記のハイブリドーマをマウスに注射する工程。

および該マウスの血清由来の悪性腹水から該Ｍａｂを回
収する工程を包含する。

本発明は、以下に述べるように、　ＨＰＣ腫瘍細胞に対
する抗体についての新規なマーカーを提供する。本発明
のある局面においては、　ＨＰＣを検出するためにモノ
クローナル抗体がインビトロでのイムノアッセイに用い
られる。

本発明の別の局面においては、ある検出可能な標識と結
合させたモノクローナル抗体は、インビボにおいてＨ１
’Ｃを検出するためのイメージング試薬として有効であ
る。

哺乳類動物の身体内のＨＰＣを検出するまたはその所在
を確認する本発明の方法は、（ａ）該哺乳類動物に上記
のモノクローナル抗体を投与する工程；および（ハ）こ
の投与されたＭａｂを検出するまたはその所在を確認す
る工程を包含する。

さらに、ある毒性物質と結合させると、このようなモノ
クローナル抗体はＨＰＣの治療的処置に対して有効であ
る。

１１Ｐｃを有する患者に対して治療的処置を行う本発明
の方法は、毒性物質と結合させた上記のモノクローナル
抗体を、治療上有効な量で該患者に投与することを包含
する。

本発明の別の局面は１本発明の抗体と反応する細胞表面
マーカーに関する。これらのマーカーは。

該マーカーを有する細胞の特徴付け、および該マーカー
の機能に対する作用物質および拮抗物質の設計に有用で
ある。Ｓ３−４１抗体に対して反応性を有する抗原は、
インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）上位群のメンバーで
ある。

１１Ｐｃ細胞上で発現される本発明のある細胞表面マー
カーは、　５Ｏ５−ＰＡＧＥにおいて、還元条件下では
約２０５　ｋｄおよび約１２５ｋｄの見かけの分子量を
、そして非還元条件下では約１８５　ｋｄおよび１５０
ｋｄの見かけの分子量を有する２成分であり；そしてＭ
ａｂＳ３−４１　との反応性を有する。

１１Ｐｃ細胞上で発現される本発明の別の細胞表面マー
カーは、　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、還元条件下では
約１４０　ｋｄの見かけの分子量を、そして非還元条件
下では約１２５　ｋｄの見かけの分子量を有する単一成
分で構成され；そしてＭａｂ　Ｓ３−５３との反応性を
有する。

本発明におけるペプチドは、ポリシアリル化ペプチド、
およびその脱シアリル化型および部分的脱シアリル化型
のペプチドであって、該ポリシアリル化ペプチドはモノ
クローナル抗体Ｓ３−４１　との反応性を有し、かつ以
下の特徴を有する：下では約２０５ｋｄであり、そして
非還元条件下では約１９０ｋｄである； ｅｎｄｏＰによる処理に対して感受性を有し、該処理に
よって１９５ｋｄの糖タンパクを生じる；ｅｎｄｏｔｌ
に対する感受性を欠いている；ＮＡによる処理に対して
感受性を有し、該処理によって９５ｋｄのペプチドを生
じる； ｅｎｄｏＮによる処理に対して感受性を有し、該処理に
よって９５ｋｄのペプチドを生じる；そしてＮ−末端が
ブロック化されている。

モノクローナル抗体３３−４１との反応性を有する本発
明の糖タンパクは以下の特徴を有する：分子量を５ＤＳ
−ＰＡＧＩＩ’により測定すると、還元条件下では約１
２５ｋｄであり、そして非還元条件下では約１９０ｋｄ
である； ｅｎｄｏＦによる処理に対して感受性を有し、該処理に
よって約１０５ｋｄの糖タンパクを生じる；ｅｎｄｏＨ
による処理に対して感受性を有し、該処理によって約１
１５ｋｄの糖タンパクを生じる；ＮＡによる処理に対し
て感受性を有し、該処理によって１２０　ｋｄのペプチ
ドを生じる；そしてアミノ末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−
Ｘ−［！−Ｄ−Ｎ−Ｖ−Ｔ−Ｄ−に−Ｙ−Ｇ−Ｄである
。

本発明のヘテロダイマー複合体は、　５０Ｓ−ＰＡＧＥ
による分子量が４００であり、ゲル濾過による分子量が
５００ｋｄであり、　５３−４１と免疫反応を行なうヘ
テロダイマー複合体であって、以下の特徴を有する：α
鎖およびポリシアリル化β鎖；またはα鎖。

および脱シアリル化または部分的に脱シアリル化された
形のβ鎖を含む； 該α鎖（７）Ｎ−末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−
Ｄ−Ｎ−Ｖ−１−ローに−Ｙ−Ｇ−Ｄである； 該β鎮のＮ−末端がブロック化されている。

（発明の構成） 本発明の他の特徴および利点は、実施例により本発明の
詳細な説明する以下の詳細な記述から明らかとなる。

１、ｌｉ “ＨＰＣと反応性を有するモノクローナル抗体（Ｍａｂ
）　”は、ヒト膵臓癌腫（ＨＰＣ）細胞上で発現される
抗原と免疫反応し得る免疫グロブリンの均一な集団を意
味する。いずれの細胞表面にも存在する多数の抗原があ
り得ること、そして換言すれば、　ｌｌＰｃ細胞に存在
するあるレセプターが他の悪性または正常な細胞型上に
も生じ得るということが知られている。さらに、このよ
うな抗原は、実際に多くの抗原決定基を有する。本発明
の抗体はこれら決定基の１つまたはそれ以上に対するも
のであり得る。

ＨＰＣに関連するいかなる特徴的な抗原も、必須である
抗原決定基を提供し得る。

免疫グロブリンは（全てのタンパクのように）。

そのアミノ酸組成および環境に依存して、酸性。

塩基性、または中性の形で存在し得る。そして。

糖または脂質のような他の分子と結合して見出され得る
０本発明の免疫グロブリンは、　ＨＰＣ関連抗原と選択
的に反応する能力が残っている限りは。

この点に関しての状態にかかわらず、定義の範囲内にあ
る。

“細胞”または“細胞系”は、明らかにその子孫である
ことが示される細胞を意味する。細胞の増殖および成長
の間に、細胞または細胞系はそれらの遺伝的構成におい
て一定の状態を完全には維持できないかもしれない。実
際、これらの子孫は親細胞からある方法で区別し得る。

ここで述べる細胞が、上で定義したように、　　ＩＩＰ
Ｃと反応性を有するＭａｂについての分泌能力の特徴を
維持する限り。

それらは定義内に包含されると考えられる。

°“永久増殖性細胞系゛は、細胞培養において実際的な
目的において（つまり、決められていない回数の移植行
った場合において）、永久に維持され得る細胞系を意味
する。それはまた１通常の非形質転換細胞系に融合させ
ると、その融合産物にそれ自身の永久増殖的な特徴を与
えうるに違いない、この通常の非形質転換細胞系は１通
常単一細胞培養としては数日または数週間を越えては生
育できない。

Ａ、二般煎皿述 以下の実施例には、　　ＨＰＣ細胞抗原と反応性を有す
るモノクローナル抗体を産生ずる特異的なハイブリドー
マ細胞系の調製を述べる。しかし、　）ＩＰｃ細胞抗原
と反応性を有する特異的Ｍａｂｓの別の実施態様を得る
ために別の方法が用いられ得るということが理解され得
る。

ハイブリドーマの調製法は、当該技術分野で一般的によ
く知られている。一般的に言うと、このようなハイブリ
ドーマ細胞系は、永久増殖性細胞系と、所望の抗体を産
生ずるために適当に免疫化した８９７８球細胞系との、
適当な条件下での融合を包含する工程により調製される
。このように用いられる永久増殖性細胞系はしばしばネ
ズミ起源のものであるが、ラット、ウシ、イヌ、ヒト起
源などを包含するいずれの他の哺乳類種起源でも代わり
に採用し得る。永久増殖性細胞系は非常にしばしば腫瘍
起源、特にミエローマ細胞起源であるが１例えば、ニブ
スティン　パール　ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒ
ｒ　Ｖｉｒｕｓ）で形質転換した正常細胞も包含され得
る。ここでは、どの永久増殖性細胞も２本発明のハイブ
リドーマの調製に用いられ得る。

抗体を分泌し得る細胞（例えば、肺臓細胞または末梢血
リンパ球）が、融合パートナ−として用いられた。細胞
を誘導しようとする動物を、ヒト膵臓癌腫細胞の全懸濁
液で１間隔をあけて免疫化した。あるいは、細胞抽出物
または精製抗原が免疫化に用いられ得る。

永久増殖性細胞およびリンパ系細胞を、融合剤としてポ
リエチレングリコールを用いる標準的でよく知られた技
術に従って融合させ、ハイブリドーマを形成させた。あ
るいは、融合はエレクトロフュージョンにより実施し得
る。ハイブリドーマは、上清またはタンパク（所望の細
胞または抗原と反応性を有する腹水より精製した）を分
析することにより、適当なモノクローナル抗体分泌につ
いて選択される。このような分析技術には、特に。

ＥＬＩＳ＾、　ＲＩＡウェスタンブロッティング、また
は免疫沈降法が包含される。

本発明においては、最初にＨＰＣ細胞に対して反応性を
有する抗体の産生についてハイブリドーマを選択した。

代わりに、　ＨＰＣ細胞抽出物または精製抗原を選択に
用いることもできた。モノクローナル抗体をさらに特徴
づけるために１種々のｌｌＰｃ細胞系、他の腫瘍細胞系
および他の種々の正常。

悪性および非悪性のヒト病組襟との反応性を、　ＸＬＩ
ＳＡ。

ＲＩＡ、　　免疫沈降９組織学的染色法（間接的イムノ
ペルオキシダーゼまたは間接的免疫螢光染色を包含する
）のような標準的な分析方法を用いて調べた０本発明の
ハイブリドーマは、全てのヒト膵臓細胞系と一般的に高
い反応性を有するモノクローナル抗体を生産することが
見出された。これらのハイブリドーマはまた。他の腫瘍
に由来する細胞と高い反応性を示し、特に胃腸および尿
生殖器の管起源の腫瘍に由来する細胞と著しく高い反応
性を示した。さらに、これらのハイブリドーマは。

いくつかの正常組織とある程度の反応性を示したが、　
Ｍａｂは肝臓および腎臓のような主要臓器とは無視でき
るほどの反応性しか示さなかった。明らかに、抗体が標
的としている抗原は＋、　ＨＰＣ細胞上では高く発現さ
れているが、他の細胞型では中程度かまたはそれ以下で
しか発現していない。

抗原に由来する）ＩＰＣ細胞との選択的反応性のために
、モノクローナル抗体はｌｌＰｃおよび他の癌腫の診断
および治療の両方に有効である。さらに。

これらモノクローナル抗体は、特に、肝臓および腎臓に
対して非反応性であるため、治療に用いられても、これ
らの重要な臓器を標的にする危険性が比較的少ない。

本発明の抗体は、細胞膜の調製に免疫沈降および／また
はアフィニティクロマトグラフィーを用いる該抗体に反
応する細胞表面マーカーの調製にも有用である。以下に
記載するＳ３−４１抗体と反応するマーカーは、インテ
グリンの上位群のメンバーであり、細胞外マトリックス
への結合−を媒介する機能を有する。従って、このマー
カーは悪性細胞に含有され、転移および定着する。

Ｂ、１施■ 以下の実施例は、望ましいモノクローナル抗体用の起源
として役立つハイブリドーマ、およびこのように生産さ
れた抗体の調製方法を例示する。

記述されている方法は、有利に使用され得る典型的な方
法であるが、当業者に公知の別の方法も代わりに用いら
れ得る。このように、これら実施例は本発明を説明する
事を意図するものであり１本発明を限定することを意図
するものではない。

１１ＰＣ細胞系と反応性を有するネズミのＭａｂは、　
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ
　２５６：４９５（１９７５）の標準的な方法に実質的
に従って生産した。簡単に述べると、　Ｃ０ＬＯ３５７
およびそのサブクローンのような標準的なＨＰＣ細胞系
を用いて抗原調製物を得た。好ましくは、　ＦＧと呼ば
れる細胞系の細胞が用いられた（Ｋａｊｉｊｉ、Ｓ、Ｍ
、、ヒト膵臓癌における内部腫瘍形性の多様性、博士論
文、　Ｂｒｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（１９８４
））　＊抗原を発現している他の膵臓細胞系（例えば、
　ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ漱ＣＲＬ１６８７　）が用い
られ得る。細胞を単層培養で増殖させ、　ＥＤＴＡ処理
により集めた。簡単に述べると、集密的な単層を３７℃
で２０分間、　１０ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡおよび０．０２％
ＫＣＩを含有するＰＢＳでインキュベートした。遊離し
た細胞を集め、１１００Ｏｘで１０分間遠心し、そして
冷ＰＢＳで２回洗浄した。あるいは。

Ｂａ１ｂ／ｃ無胸腺ヌードマウス内で増殖したＰＧ異種
移植片から細胞懸濁液を得た。

２〜４ヶ月齢の正常Ｂａ１ｂ八マウスを、約５Ｘ１０”
〜５Ｘ１０＠細胞／注射液量／マウス、を含有する０、
５ｄの注射を腹腔内に一週間間隔、で６回注射して免疫
した。最終の注射の３日後、マウスを殺して膵臓を摘出
した。この膵臓を別々のペトリ皿中の無血清ダルベツコ
の最小必須培地（ＤＭＩ！Ｍ）に移して洗　。

浄した。膵臓細胞をゴムのポリスマンを用いて繊維状膵
臓性夾膜を右だやかに掻き砕いた。この細胞懸濁液を１
５ｄの遠沈管に入れ、１１０００Ｘで１０分間遠心分離
した０次いで、このペレットを無血清ＤＭＨＭで２回洗
浄した。

−洗浄した膵臓細胞およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８ミエローマ
細胞をＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（前出）
の方法に従って融合させた。用いた永久増殖性細胞系の
融合パートナ−は、ネズミのミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６
３Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号Ｎ１１ＴＩＢ９）であった
、これらミエローマ細胞を５Ｘ１０’細胞／ｄの密度に
まで増殖させ、１１０００Ｘで１０分間遠心分離するこ
とにより集めた。この細胞ベレットを無血清ＤＭＥＭで
２回洗浄した。最後に、膵臓細胞およびＰ３Ｘ６３Ａｇ
８ミエローマ細胞を、５０ｍの遠沈管中で７：　１の割
合で混合し、遠心分離（１０００ｇで１０分間）により
ベレットとした。このベレットを穏やかにほぐし、　　
１ＩＩｄｌの３５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
溶液を細胞上で穏やかに泡立てた。１分後、１０％ウシ
胎児血清（ＦＧ５）　（ギブコ、グランドアイランド、
　ＮＹ）を含有するＤＭＥＭ　１　ｄを細胞懸濁液に添
加し、穏やかに混合した。

その後、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭｌｏｄを添加
してＰｔ！Ｇを希釈し、細胞を再びペレットにした。ノ
１イブリドーマ融合産物を含むこの細胞ペレットを３０
１１ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＩＩ
ＡＴ）培地（アミノプテリンはシグマケミカルＣＯ１゜
セントルイス、　ＭＯ，ヒポキサンチンおよびチミジン
はＣａ１ｂｉｏｃｈｅ鴎、ラジョラ、　ＣＡから入手）
に再懸濁した。

次いで、この細胞懸濁液を、ｌｄ当り２Ｘ１０”個の胸
腺細胞（フィーダー細胞）を含有するＩＩＡＴ培地４０
０ｄと合わせた。この内容物を、滅菌した９６ウエルプ
レート（コスタ−、ケンブリッジ、　ＭＡ）に分注し、
直ちに３７°Ｃの恒温器に入れた。消費された培地は、
１週間後に、　　ＨＡＴ培地を含有する新鮮な胸腺細胞
で置き換えた。この型のプロトコルを用いると１成功裏
にハイブリドーマ培養物が得られ、　１０％ＦＣ３を含
有する新鮮なりＭＥＭを定期的に添加することにより維
持され得る。

＋１ＰＣ細胞と反応性を有するモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマを選択した。培養物がマイクロタ
イターのウェル表面の７５〜１００％を覆うほどの細胞
密度に達した後、ハイブリドーマからの培地を、標準的
なＥＬＩＳＡのプロトコルを用いて、抗肝Ｃ抗体の存在
について選択した（Ｓｃｈｕｌｔｚ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４４：５９１４（１９８４））
　、　簡単に述べると。

９６ウエルのミニプレート（ダイナチックマイクロタイ
タープレート、アメリカンサイエンティフィックプロダ
クツ、マゴーパーク、　ＩＬ）の底で乾燥させたＩ！Ｉ
ｍ細胞を標的として用いた。使用する抗原で覆った９６
ウエルのプレートのウェルをｐＨ８，０の緩衝液晶（１
５０＋＋＋Ｍ　ＮａＣ！、　０．２％Ｔｗｅｅｎ２０お
よび０．０１％チメロサールを含有する２０１トリス）
ですすいだ、緩衝液Ｂ（０，１％ウシ血清アルブミンを
含有する緩衝液Ａ）で１：２に希釈したハイブリドーマ
上清をウェルに添加し、特異的な抗体と結合するように
室温で１時間インキュベートした。特異的に結合した抗
体を、緩衝液Ａで洗浄することによって過剰のハイブリ
ドーマ上清が無くなるまですすいだ穴に、西洋ワサビの
ペルオキシダーゼ結合ラビット抗マウス免疫グロブリン
（バイオランド。

リッチモンド、　ＣＡ）を添加することにより検出した
。室温で１時間インキュベートした後に２次抗体をデカ
ンテーションし、ウェルを緩衝液晶で洗浄し、５０μｌ
／ウエルの基質溶液（４■０−フェニレンジアミン（シ
グマＣｈｅｗ、Ｃｏ、、セントルイス。

ＭＯ）および４μｌの３０％過酸化水素を含有する１０
ｄの８０＋ｗＭクエン酸−リン酸緩衝液）を添加した。

このプレートを室温で３０分間暗所にてインキュベート
し、各ウェルに２５μｌの４Ｍ硫酸を加えることにより
呈色反応を停止させた。特異的に結合した抗体を、３０
分以内にＥＬＩＳＡスキャナーＣモデルＥＬ３１０（バ
イオテクインスツルメンツ、ウイヌースキー。

ＶＴ）で００４９０における吸光度を測定することによ
り検出した。反応性は以下のように分類した：Ａ４９゜
≦０．１５．−；　Ａ４９゜＝０．１５〜０．３．１＋
；＾４．。・０．３〜０．６．２÷；Ａ４．。＝０．６
〜１．２．３＋；Ａ４．。≧１．２．４＋　、免疫した
ＦＧ細胞との反応性は有するが、リンパ芽球細胞？２１
−Ｐ細胞との反応性は有さないハイプリドーマを、以下
の実施例Ｈの方法に従いＩＩＰＣの凍結切片との反応性
についてさらに選択した。ＩＩＰＣの凍結切片との反応
性は有するが、正常なヒト肝臓。

腎臓および肺とは反応性を有さないハイブリドーマのみ
を選択した。以後の研究のために１選択した２つのハイ
ブリドーマ細胞系をそれぞれＳ３−４１およびＳ３−５
３と名付けた。

（以下余白） モノクローナル抗体の反応性を、以下のような間接的な
イムノペルオキシダーゼ染色により調べた。クリオトー
ムで切断した凍結組織片の２〜４μ鴎切片を、ゼラチン
で覆ったスライドグラス上にマウントし、風乾し、そし
てＴａｙｌｏｒ＋　Ａｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ。

Ｌａｂ、Ｍｅｄ、１０２：１１３（１９７０）の方法を
用いてただちに間接的イムノペルオキシダーゼ分析で検
査した。

簡単に述べると、ハンクス平衡塩溶液（ギプコ。

グランドアイランド、　Ｎ、Ｙ、）およびリン酸緩衝生
理食塩水（Ｐｕｓ；１０ｍＭリン酸ナトリウム、　０．
１５Ｍ　ＮａＣ１゜ｐＨ７、ｏ）中で１回洗浄した後、
切片を室温で順次以下の溶液でインキュベートした：希
釈緩衝液（５％正常ヤギ血清および１％ウシ血清アルブ
ミンを含有するＰＢＳ　）で１５分間；ハイブリドーマ
上清または適当なアイソタイプが一敗した対照この１：
２希釈物で１時間；　５％正常ヒト血清を含有する。

１：５０に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤ
ギ抗マウスｒｇ抗血清（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍ
ｏｎｄ、ＣＡ）で１時間；そして最後に基質緩衝液（０
，６■／−の３．３−ジアミノベンジジン、　０．０１
５％１ｌｚ（ｈを含有する１抛Ｈトリス、　ｐＨ７，４
）で１５分間インキュベートした。インキュベーション
の間にＨＢ　Ｓ　ＳおよびＰＢＳでの洗浄を行った。切
片を１％メチレンブルーで対比染色し、エタノールで段
階的に脱水し。

１１ｉｓｔｏ−Ｃ１ｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａ
ｇｎｏｔｉｃｓ＋Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ＋ＮＪ）中で洗
浄し、　Ｐｒｏ−Ｔｅｘｘ（Ｌｅｒｎｅｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗｌｌａｖｅｎ、　ＣＴ）にマウ
ントし、光学顕微鏡で調べた。

表１に、ハイブリドーマ細胞系Ｓ３−４１およびＳ３−
５３により生産されたモノクローナル抗体と６５種類の
異なる腫瘍との反応性についてまとめる０表１に示され
るように、　　Ｓ３−４１は一般的に膵臓の胃腸への管
、泌尿生殖器管、および頭部と頚部の腫瘍の癌腫にのみ
反応性を有していた。さらに、実質的に全ての例におい
て、　Ｓ３−４１　Ｍａｂによる染色は、腫瘍の病巣付
近の基底膜と明らかに関連しており、上皮基質界面にお
ける細胞の基底表面が片側だけ特徴的に染色される。染
色された肺癌腫。

メラノーマおよび乳癌組織のいくつかの場合においても
１反応性は基底膜に限られていた。

Ｍａｂ　Ｓ３−５３は、腺房細胞型の膵臓癌腫を包含す
る検査した７種の膵臓の悪性腺癌のそれぞれと反応した
。　Ｍａｂ　５３−５３は試験した腫瘍組織に広範囲の
反応性を示した。さらに１組織内の大部分の腫瘍細胞に
対するＳ３−５３の反応性は一般的に強かった。腫瘍細
胞基底膜もいくつかの場合において染色された。

（以下余白） 表１ イムノペルオキシダーゼ染色によるモノクローナル抗体
と新鮮な凍結ヒト腫ｇｉＩ＆Ｉｌ織切片との反応性１Ｓ
３−４１　　５３−５３ Ｓ３−４１　　　　５３−５３ （以下余白） Ｓ３−４１　　　　　Ｓ３−５３ 培養におけるパネル中の細胞系に対するＭａｂの反応性
を５ｃｈｕｌｔｚ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４４：５９
１４（１９８４）の方法に従い、実施例１で詳細に述べ
たようにＥＬＩＳＡ反応により調べた。

９６ウエルのマイクロプレートの底で乾燥させた細胞を
ＥＬＴＳＡの標的として用いた。西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗血清（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＋
　Ｒｉｃｈａ＋ｏｎｄ、　ＣＡ）を二次抗原として用い
た。

Ｍａｂ　Ｓ　３−４１およびＳ３−５３の反応性を表２
に示す。

両方のＭａｂは、試験した１０種類のＨＰＣ細胞系の大
半と反応性を有していた。さらに１両者は肺癌。

皮膚癌および胃腸と尿生殖器管腫瘍に由来する細胞系と
特に強い反応性を示した。Ｓ３−５３は、メラノーマ、
ダリア芽細胞腫および神経芽細胞腫を包含する神経芽細
胞腫起源の腫瘍細胞系について。

中程度から強い陽性を示した。両抗原は、血液型ＡＢ＋
、＾÷、　Ｂ＋、　０＋およびローのヒト赤血球細胞１
正常な２倍体繊維芽細胞および白血球またはリンパ球細
胞系とは、一般的に反応性がなかった。

（以下余白） 表２ モノクローナル抗体と培養ヒト細胞とのＥＬＩＳＡ反応
性細胞系（ＡＴＣＣＮｏ、）　　　　　　　Ｓ３−４１
　　　Ｓ３−５３ＧＭ５３−５３Ｇ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｚ＋細胞系は以下か
ら入手した： ａ、　Ｐ、Ｍｅｔｔｎｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ
ｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｏｒｗｎｌｌｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｂ、　ＬＪａｌｋｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　
１ｍｌＩｌｕｎｏｌｏｇｙ、５ｃｒｉｐｐｓＣ１ｉｎｉ
ｃ　　ａｎｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｆｏｕｎｄａｔ
ｉｏｎｃ、　Ｒ，Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ、Ｄｅｐａｒｔａ＋
ｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｙ、５ｃｒｉｐｐ
ｓＣ１ｉｎｉｃ　　ａｎｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎｄ、　　Ｔ、Ｅｄｇｉｎｔｏｎ、Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉ＋ａｍｕｎｏｌｏｇｙ＋
５ｃｒｉｐｐｓＣ１ｉｎｉｃ　　ａｎｄ　　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｅ、　Ｆ、Ｂａｃｈ、
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　１
ｌＣ１でないヒト　　　との　心 炎症性膵臓、良性腫瘍および増殖性上皮細胞とのＭａｂ
の反応性を、上記のＡ項の方法に従い、凍結組織切片の
間接的なイムノペルオキシダーゼ染色により調べた。Ｍ
ａｂ　Ｓ３−４１およびＭａｂ　Ｓ３−５３の両者は、
慢性膵炎組織の骨細胞とある程度の反応性を示した。　
Ｍａｂ　Ｓ３−５３は、常に別々の領域において染色を
行うが、試験した悪性ではないいずれの病組織をも染色
するという点で、広い反応性を有していた０表３はこの
組織のパネルで調べた結果を示す。

表３ イムノペルオキシダーゼ染色によるモノクローナル抗体
と新鮮な凍結した非悪性のヒト病組織切片との反応性３
３−４１　　　Ｓ３−５３ 巷Ｊ氏ｊ１父　　　　　　　　　　　　　　　　　４＋
Ｄ、　　　　　ｔ　　　　・　　　ム１日　　　　　の
　　心１１健常な成人および胎児の新鮮な凍結ａｍとＭ
ａｂとの反応性は、上記Ａ項の方法に従って１間接的な
イムノペルオキシダーゼ染色により調べた。抗体は調べ
た正常組織のほとんど大部分と反応しなかった。しかし
、　Ｍａｂ　Ｓ３−４１は食道、子宮頚部。

および大腸の基底上皮層または基底膜９足底表皮。

乳房組織および回腸上皮とある程度の反応性を示した。

正常な重層上皮の増殖している細胞層によるＳ３−４１
抗原の制限された発現、および上皮細胞基質界面におけ
るＳ３−４１抗原の局在は、この分子が引き続いて起こ
る悪性への転換で再発現する上皮細胞の初期分化抗原（
おそらく、細胞の接着に関与している）であり得ること
を示唆する。さらに、　Ｓ３−４１抗原は、皮膚に関連
した他の疾病（例えば、軸層および基底細胞癌）の診断
および治療に用いるのに有効であり得る。そして、該Ｓ
３−４１抗原は表皮細胞生物学を研究するための有益な
細胞表面マーカーであることが証明され得る。

Ｍａｂ　５３−５３は、成人および胎児の膵臓の線屑。

胎児膵臓の管、および検査した１／３の肝臓の実質およ
び胆汁管の細胞と反応した。該Ｍａｂ　Ｓ３−５３は。

食道、胃および小腸、子宮頚部、子宮、乳房、胎児およ
び成人の肺実質細胞、胎児の腎臓、脳皮質と中程度に反
応し、そして成人小脳内の分子層およびプルキニエ細胞
とも反応した。基底膜を含む足底表皮の全層も強く染色
された。

表４に、試験したこのパネルの結果をまとめる。

（以下余白） 表４ イムノペルオキシダーゼ染色による新鮮な凍結正常ヒト
組織とのモノクローナル抗体の反応性Ｓ３−４１　　５
３−５３ Ｓ３−４１　　　　　　５３−５３ Ｉ１品台ＩＩ側官　　　　　　　　　　　　　ｊ＋Ｓ３
−４１　　　　　　Ｓ３−５３ コロイト Ｓ３−４１　　　　　３３−５３ （以下余白） Ｅ、　　　　　との　、・ Ｍａｂにより認識される抗原が反応性のある組織の細胞
表面上で発現していたかどうかを決定するために、生存
しているｌｌＰｃ細胞を２次のような間接的免疫螢光分
析により、　Ｍａｂを用いて調べた。

カバーガラス上で集塊にまで増殖させた細胞を冷ＨＢＳ
Ｓで一度洗浄し、　　０．１ａｄ！の１：２ハイプリド
ーマ上清を４°Ｃにて１時間重層し、冷ＨＢＳＳで洗浄
し、そして、１：５０フルオレセインイソチオシアネ一
ト結合ヤギ抗マウスＩｇ抗血清（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌ
ｉｎ−ｇａｌｌｅ＋　ＣＡ）を４°Ｃにて１時間重層し
た。洗浄し。

３％パラホルムアルデヒド中で固定した後、細胞を８０
％グリセロール、１■／ｘｄｌｐ−フェニレンジアミン
、　　２００＋ｍＭ　ｌ−リス、　ｐＨ８，５，に重層
し、　Ｚｅｉｓｓ螢光顕微鏡で調べて撮影した。

Ｍａｂ　Ｓ３−４１およびＳ３−５３を用いると、いず
れの場合にも原形質膜が明瞭に染色される。このことは
、ｓｉ胞裏表面構造認識されることを示している。

両者は、細胞集団全体を染色し、連続的な線状の膜パタ
ーンを示した。

実１１１１ Ｍａｂにより認識される抗原の化学的性質を評価するた
めに、　　ＩＩＰＣ細胞を、　　Ｌ　−（３Ｈ）−ロイ
シンまたは〔３Ｈ〕−グルコサミンとインキュベートす
ることにより、そのいずれかで放射標識し、界面活性剤
で可溶化し、そして次のようにＭａｂ免疫吸着剤による
免疫沈降に供した。

プロティン−Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋
１Ｊｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）の１０％懸濁液１
Ｏｕｌを、０．３ｄのＰＯＲＴＯＲ法（１０ｓＭ　）リ
ス、　ｐｆ１８．５．０．１５ＭＮａＣ１゜０．５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０．０．１％Ｒｅｎｅｘ３０＋　２．５ｓＭ
アジ化ナトリウム、０．１％オボアルプミン）中で、５
μ！のウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｗｅｓｔｂｕｒｙ＋　ＮＹ）を用いて、４°Ｃにて１時
間インキュベートした。　ＰＯＲＴＯＲ法で２度洗浄し
、ｌｄのハイブリドーマ上清とともに４℃にて１時間イ
ンキュベートし、そしてＦＯＲＴＯＲ法で２度洗浄した
後に、ビーズを、放射標識した細胞抽出液（１〜２　Ｘ
１０’ｃｐｓ）とともに、４°Ｃにて一夜インキュベー
トシた。この免疫吸着剤を、　ＰＯＲＴＩＩ衝液（１０
＋ｍＭトリス、　ｐＨ８，５，０，１５ＭＮａＣｌ、　
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．１％Ｒｅｎｅｘ３０．２
．５ｍＭアジ化ナトリウム）で８度洗浄し、結合した抗
原をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８
０（１９７０））中に溶出した。この試料を５Ｏ５−Ｐ
ＡＧＥスラブゲル上で分析し、フルオログラフィーで視
覚化した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の最初の結果は、　Ｍａｂ　Ｓ３
−４１が。

２０５ｋｄおよび１３５ｋｄの２鎖のタンパク抗原をそ
れぞれ認識することを示した。両バンドは、　　（”Ｉ
＋）−グルコサミンを取り込んでいたので、グリコジル
化されていることがわかった。ある場合には。

１５０ｋｄおよび１８５ｋｄのさらに２つのバンドが認
められた。しかし、　　Ｓ３−４１バンドにより共沈降
した１１６ｋｄのバンドは非特異的であった。なぜなら
それは、対照の免疫吸着剤で前吸収させることによって
除去できたためである。　Ｍａｂ　Ｓ３−５３は、高度
にグリコジル化された１４０ｋｄのタンパクを認識した
。

代謝的に標識したｌｌＰｃの免疫沈降により、各モツク
ローナル抗体により認識される抗原決定基はタンパク分
子が保持していることが示された。これらのタンパクも
またグリコジル化されており。

従って、認識されるエピトープが、これらの分子のタン
パク部分または糖部分のいずれかにより表現されている
かどうかを決定することが残されている。

Ｓ３−４１で免疫沈降する抗原の確認により、それは、
２鎖のヘテロダイマー（細胞付着レセプターのインチプ
シンに属するもののうちの１つである）であることが証
明される。それは、非共有的に結合した２つの糖ペプチ
ドを含み、ここでは、それらはｇｐ２０５およびｇｐ１
２５と命名されている。このｇｐ１２５は、他のインチ
プシンのα鎖のアナログであり、　ｇｐ２０５ペプチド
は他のインチプシンのβ鎖のアナログであり、ポリシア
リル化されていることが示された。この２Ｍの抗原は、
上皮細胞の基底側部の表面にのみ発現することが示され
ており。

明らかに付着性を有する。

インチプシンは一般に、そのα鎖が高い相同性を持つヘ
テロダイマーであり、β鎖における相違により種々のイ
ンチプシンが亜科として存在する。

インチプシンの特徴についての総説は、　１Ｉｙｎｅｓ
＋Ｒ。

０、により、釦旦（１９８７）旦：４５９〜５５４に、
そしてＲｕｏｓｌａｈｔｉ＋　Ｂ、　　らにより、　５
ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）　２３８：４９１〜４９７
において発表されている。

細胞表面付着レセプターのインチプシンのクラスは、　
ＣＡＭを命名されたもう１つのタイプとは異なる。この
ＣＡＭはモノマーであり、コントロール要素として、ポ
リシアリル化に用いられる。Ｓ３−４１が結合するイン
チプシンは、そのポリシアリル化により、他の既知のイ
ンチプシンと区別される。

インチプシンという名は、この抗原に対して提唱された
ものである。

Ａ、　　の　　　およびαおよび　言゛の　　−５３−
４１を用いたヒト表皮断面の免疫学的な組織の解析によ
り、染色が基底膜の近くに集中しており、上部細胞層は
、除々に反応性がなくなっていることかわかる。従って
、その発現は細胞表面のこの特定の部分に制限される。

ＦＧ−ｓｅｔ２膵臓癌腫細胞が試験基質として用いられ
た。肺癌腫系列および正常のヒトのカラチノサイト（ｃ
ａｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）短期培養物においては、同一
の結果が得られた。

ＦＧ−ｍｅｔ　２膵臓癌腫細胞の培養物を、標準法に基
づき　＋ｚｓ■−ヨウ素化ナトリウムを使い、放射性ヨ
ウ素により表面標識化した。これらの標識化された細胞
の界面活性剤を用いた溶解物をＳ３−４１を用いて免疫
沈降させ、その免疫沈降物を、還元条件下において、そ
して非還元条件下においてポリアクリルアミドゲルにか
けた０、還元条件下において、　　２０５ｋｄのバンド
が検出され、非還元条件下においては、　　１９０ｋｄ
のところに単一のバンドが現れた。これは、ここでｇｐ
２０５と命名されるインチプシンのβ鎖を示している。

非還元条件下では１５０ｋｄのバンドに、そして還元条
件下においては１２５ｋｄのバンドに移動したα鎖は、
細胞を〔３ＳＳ〕−メチオニンまたはトリチウムで標識
したグルコサミンで代謝的に標識したときにのみ検出可
能であった０表面標識した細胞から１２ｓｋｄ／ｌｓｏ
　ｋｄのバンドが欠落しているのは。

ヨウ素化の手法によると思われる。

ｇｐ２０５およびｇｐ１２５の成分が細胞表面でお互い
に非共有結合で結合していることは９次のことにより立
証される。つまり、　ＦＣ−ｓｅｔ　２細胞（ヒト膵臓
癌腫系列）を膜下透過性架橋剤、　　ＤＴＳＳＰ、で処
理し、そして、界面活性剤で細胞を溶解することにより
立証される。このことにより、　５Ｏ５−ＰＡＧＥに４
００　ｋｄのバンドが生じる。この４００ｋｄのバンド
は。

調製物を還元することにより消失し、　　２０５ｋｄと
１２５ｋｄとに置き換わる。なぜなら１ＤＴＳＳＰが可
逆的に架橋するためである。このｇｐ２０５およびｇｐ
１２５の非共有結合複合体は、さらに、　ＦＧ−ｍｅｔ
２　（あらかじめ（３３Ｓ）−メチオニンで標識されて
いる）からの免疫沈降したタンパクにより認められた。

この免疫沈降物は、ゲル濾過分析により１分子量約５０
０ｋｄを示した。（見かけの分子量の不一致は。

測定に使用した方法による。） Ｂ、２０５および　１２５の　−＋１ 表面タンパクは、肺アデノ癌腫細胞系のＵＣＬＡ−Ｐ３
およびＰＧ−ｎｅｔの両者から単離された。

上記細胞は、５０ｇ湿重量および２０ｇ湿重量を得るの
に充分な量にまでそれぞれ増殖させた。洗浄後、これら
の細胞を２％Ｒｅｎｅｘ３０を含むＴＢＳ等容量テ溶菌
し、４°Ｃニテ１０，０ＯＯＸ　ｇ　テ３０分間遠心分
離し、−７０°Ｃで保存した。

その溶菌液を連続的にセファロースカラムに通し、そし
てｌまたは２個の連続的な５３−４１免疫吸１カラムに
５〜１０ｉＩｄｌ／ｈｒの割合で通した。０．１％Ｒｅ
ｎｅｘ３０を含むＴＢＳ、ｐｌ＋８．５で洗浄後、　　
Ｓ３−４１カラムを、逆向きにし、３倍容１ノＴＢｓ（
ｐ）＋８．５；１．０％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピ
ラノシドを含む）で洗浄し、そして、結合した物質を５
０ａ＋Ｍジエチルアミン（ｐ１＋１１．５；１５０ｗＭ
　ＮａＣｌ、　１．０％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピ
ラノシドを含む）で溶出させた。

溶出した物質は１．５ｄのエッペンドルフ管に集めた。

この工７ペンドルフ管には、　９Ｈを急激に約８．５に
まで下げるため、０．１Ｍ）リスＨＣＩ　ｐＨ６，８，
１５０＋＋＋ＭＮａＣＩ、および１％ｎ−オクチルβ−
Ｄ−グルコピラノシドを含む。溶出物は５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ銀染色またはクマシープルーによる染ｍｌを行
って検出し。

ピークに相当しタンパクを含む溶出部分をプールし、濃
縮した。

Ｃ１精ＪＩＭ；ｌ贋毘改 上記のように精製されたｇｐ２０５およびｇｐ１２５に
対応する抗原は、標準的な方法を用いて、Ｎ末端からア
ミノ酸配列決定が行われた。ａｐ１２５断片は。

次のＮ末端配列を有していた： Ｆ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−Ｖ−１−Ｄ−に
−Ｙ−Ｇ−Ｄこの配列は、他のインテグリンにおけるα
鎮のＮ末端配列上広範囲にわたり相同性を有することを
示す、これは第３図から明らかである。、第３図はｇｐ
２０５．　ｇｐ１２５．および他のインテグリンに由来
するα鎮のＮ末端配列を比較したものである。

この図の左側の欄には、これらのＮ末端配列がアミノ酸
の１文字コードによって表されている。ダッシュ記号は
最上段の配列と同じ残基であることを示し、空白は配列
の情報が欠けていることを示す。図の右側の欄に示され
た各インテグリンの略語は以下のとおりである：　ＦＮ
Ｒ〜フィブロネクチンレセプター（Ａｒｇｒａｖｅｒ　
ら、　１９８７）　　１ＶＬＡ−１〜−４（Ｔａｋａｄ
ａら、　１９８７　ａ　）　；　Ｍａｃ−１（Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒら、　１９８５）　　１ｐ１５０．９５（Ｍｉ
ｌｌｅｒ　ら、　１９８７）；ＬＦＡ−１（Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒら。

１９８５）　　；血小板■ｂ　−［［［ａ　（Ｐｏｎｃ
ｚら、　１９８７）　　；ＶＮＲ−ビトロネクチンレセ
プター（Ｓｕｚｕｋｉ　ら、　１９８６）　　１ｐｓ−
ミバエの位置特異的抗原（Ｌｅｐｔｉｎら、　１９８７
）　。

ＰＳ以外のすべての配列はヒト由来のものである。

このｇｐ２０５のβ鎖は、明らかにＮ末端のところでブ
ロックされている。

ツニカマイシン（Ｎ結合グリコシレージョンの阻害剤）
の存在下での固有的に（３Ｓｓ　］−メチオニンで標識
された細胞の界面活性剤を用いた熔解物のＭａｂ　Ｓ３
−４１による間接的な免疫沈降およびそれに続く還元条
件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ！による分析により、２つの
主要なバンド１９０ｋｄおよび１００ｋｄの存在が明ら
かになった。

ＰＧ細胞の半集密的培養物に１Ｍｇ／ｘｔｌのツニカマ
イシンを加え、３７℃にて１０〜１２時間インキュベー
トを行った。この細胞を次に、３％ＦＣ５と１Ｍｇ／ｄ
ツニカマイシンとを含みメチオニンを含まないＲＰＭＩ
培地中で１ｍＣ１の（３％３　）−メチオニンにより、
さらに１２時間パルス標識した。ツニカマイシンの不存
在下で（！５５）−メチオニンで同様に標識したコント
ロールのフラスコを調製した。代謝的に標識された細胞
を前述の方法で回収し、　ＲＩＰＡ溶解用緩衝液を使用
して溶解させた。細胞溶解物を４°Ｃにて１００，００
０　Ｘ　ｇで４５分間遠心分離して清澄化させ、−７０
℃で保存した。

Ｅ、二久豆ｙ土公扼 免疫沈降は、細胞の溶解物と免疫吸着剤（Ｍａｂをセフ
ァ０−ス４Ｂ−ＣＬビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕ
ｐｐｓａｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）に活性化ＣＮＢｒで結合させて調製した
）とを−夜インキエベートすることにより行われた。

室温にて、８Ｍ尿素中で溶・出した後、サンプルを二次
元電気泳動にかけた。この二次元電気泳動では、非平衡
ｐｎ電気泳動（ＮＥＰＨＧＥ）がチューブで−次元的に
行われ５　それに続いて７．５％アクリルアミドスラブ
ゲルでの５Ｏ５−ＰＡＧＥが行われる。ゲルに２．５−
ジフェニルオキサゾールを浸み込ませ、乾燥し、−７０
°ＣでＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５Ｘ線フィルムに指示され
た時間だけ感光させた。その結果得られた移動パターン
を第１図に示す。

Ｉ！鎖を切断する種々の酵素で、　　ｇｐ２０５および
ｇｐ１２５を単独でまたは両者を一緒にして処理した。

Ｅｎｄｏ　ＦおよびＥｎｄｏ　Ｈは、Ｎに結合した複合
オリゴ糖を切断する。その結果は、　ｇｐ２０５にはこ
のようなオリゴ糖が１個または２個、そして、　　ｇｐ
１２５には３個または４個含まれるという事柄に一致す
る。

ＥｎｄｏＦ　：２０５ｋｄ＝１９５ｋｄ　　ＥｎｄｏＨ
：　　２０５ｋｄ→２０５ｋｄ１２５ｋｄ→１０５ｋｄ
　　　　　　　１２５ｋｄ→１１５ｋｄノイラミニダー
ゼ（ＮＡ）は、複合Ｎ結合糖およびポリシアリル鎖を切
断する。ｅｎｄｏ−Ｎ−アセチルノイラミニダーゼ（Ｅ
ｎｄｏＮ）は、α−２，８結合直鎖シアル酸ホモポリマ
ーとしてのみポリシアリレートを切断する。その結果は
、　ｇρ２０５がポリシアリル化インテグリンのβ鎖で
あることと一致していた。

ＮＡ：　　２０５ｋｄ−＋９５ｋｄ　　ＥｎｄｏＮ　：
２０５ｋｄ→９５ｋｄ、　１５０ｋｄ１２５ｋｄ→１２
０ｋｄ これらの結果は、　ｇｐ２０５が、β結合によってシア
リル化が行われている高度にポリシアリル化されたβイ
ンテグリン鎖であることと一致する。（はとんどのイン
テグリンβ鎖は１分子Ｍ９５〜１２５ｋｄを有する。） Ｇ、上？ｆづタジ化１金 放射標識された細胞溶解物をレンチルレクチン−アガロ
ースビーズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ＋　Ｂｕｒｌｉｎ
ｇａｍｅ＋ＣＡ）を用いて前吸着させたとき、　　Ｓ３
−４１と反応性のある抗原が除去された。抗原が除去さ
れていることは、ビーズ上清の免疫沈澱およびそれに続
く５ＤＳ−ＰＡＧＩ！により示された。放射標識された
ライゼートを小麦胚アグルチニンーアガロースビーズ（
Ｅ、Ｙ、Ｌａｂｓ、、　Ｓａｎ　Ｍａｔｅｏ、　ＣＡ）
により同様に処理を行ってもＳ３−４１抗原は除去され
なかった。つまり。

Ｓ３−４１と反応性のあるこの抗原は、特異的にレンチ
ルレクチンに結合したが、小麦胚アグルチニンとは結合
しなかった。

（以下余白） Ｈ０抗源てυシ囚ｌ過 放射標識した細胞の界面活性剤による溶解物を小麦胚ア
グルチニンーセファロース力ラム（Ｅ、Ｙ。

Ｌａｂｓ、サンメテオ、Ｃ＾）に吸着させた０通過液を
レンチルレクチン−セファロースカラムに吸着させた。

洗浄後、吸着物は２％α−メチルマンノシド（シグマケ
ミカルＣｏ、、セントルイス）を加えることにより溶出
させた。溶出物は、セファロース６カラムを装着したｐ
ｐｔｃ装置（ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）
を用いて、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭＣａＣ１，
、１ｓＭ　Ｍｇｃｔ、　Ｈ６ＨｇＯ１０，０２％アジ化
ナトリウムおよび０．１％レネックス３０を含有する１
０１１Ｍトリス（ｐＨ８，０）の存在下で、ゲル濾過に
供した。分子量基準を平行させて流した。１ｍｉ画分を
採集しく約４０画分）、これら画分を３３−４１抗体に
よる免疫沈降に供した。免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析によると、以下の分子種が、示した両分においてＳ
３−４１と反応性があった： （以下余白） ＦＰＬＣ画分に対応する推定分子量は、右側の欄に示さ
れている。これらの推定分子量が５Ｏ５−ＰＡＧＥで測
定した分子量を越えているので、　　Ｓ３−４１抗原は
。

多量体として、おそら＜　２０５ｋｄ成分と１２５ｋｄ
成分との会合によって形成されたヘテロダイマーとして
存在しているはずである。遊離の１２５ｋｄ成分が過剰
に存在することも２両分３１〜３６に由来の免疫沈降物
によって示唆された。

■、パルスーチェイスによる　八　・な　六指数関数的
に増殖しているＰＧ細胞の単細胞懸濁液を、メチオニン
を含まない培地（アービン　サイエンティフィック、サ
ンタアナ、ＣＡ）中で３７℃にて１時間繁殖させ９次い
で（３５Ｓ）−メチオニン（１２９５Ｃｉ／ｍＭ　ＮＥ
Ｎリサーチプロダクツ、ボストン９ＭＡ）を１．０〜１
５ｍｃｉ／　３　Ｘ　１０’細胞／　ｍｌの濃度で用い
て、　１０分間パルス標識した。５Ｘ１０’個の細胞を
含む部分を採取（この時が時間の起点となる）した後、
残りの細胞は、　１０ｍＭ非標識Ｌ−メチオニン（シグ
マケミカルＣｏ、、セントルイス、　ＭＯ）を含む冷た
いトリス緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗浄した。

標識された細胞は、　１０ｍＭ非標識メチオニンを含む
完全培地に再懸濁し、３７°Ｃにて振盪器上でインキエ
ベートした。所定の異なる時点で一部を採取し。

細胞を遠心分離し、そしてＲＩＰＡ溶解緩衝液中で以前
記述したように抽出した。

（２８Ｓ）−メチオニンにより１０分間パルス標識した
後、　　１５０ｋｄの弱いバンドが追跡時間の起点にお
いて検出された。この１５０ｋｄ成分は、追跡の１５分
後に、明瞭に目視することができた。追跡の次の４５分
以内に、プロセッシングを受けているようであり、　　
１３５ｋｄ成分の出現が見られた。２０５ｋｄ分子およ
び１３５ｋｄ分子の両方が、追跡の４時間後から２０時
間後まで検出することができた。現在のところ、２つの
型の５３−４１抗原間に前駆体／生成物の関係が存在す
るかどうかは明白ではない、　１５０ｋｄ分子の翻訳後
プロセッシングにより１３５ｋｄサブユニツトが生じる
ようであるが、このような説明に束縛されることは望ま
ない、さらに、　　２０５ｋｄ成分は、　　１３５ｋｄ
成分がさらにプロセッシングされるか、あるいは１５０
ｋｄ前駆体が別のプロセッシングを受けることによって
生じ得る。あるいは、該成分が、　Ｍａｂ　Ｓ３−４１
によって認識されないそれ自身の前駆体分子を有するこ
とも有り得、このことはＳ３−４１抗原が非共存結合に
よって結合した２つの異なるサブユニットを含むヘテロ
ダイマーであることを示唆している。

（３５Ｓ）−メチオニンで標識したＰＧ−ｓｅｔ　２細
胞は、　　Ｓ３−５３を用いた免疫沈降に供し、非還元
条件下で５Ｏ９−ＰＡＧＥにより分析した。Ｓ３−５３
抗体は、これらの条件下において、　　１２５ｋｄの単
一バンドとして移動した。

Ｂ、Ｉ！Ｊによる　　１゛の　　瀞゛ ＦＧ−ｓｅｔ　２細胞培養物の表面を　＋１Ｓ（標識ヨ
ウ化ナトリウムを用いてヨウ素化し、該培養物の界面活
性剤による溶解物を、　　Ｓ３−５３を用いた免疫沈降
に供した。この沈澱した抗原は、還元条件下におけるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで１４０ｋｄの単一種として移動した。

標識された無機の硫酸塩またはリン酸塩で抗体を代謝的
に標識した場合にも、同様の結果が得られた。

Ｓ３−４１に代えて５３−５３を用いること以外は、実
施例４のＤ項における方法に従う。５３−５３は、還元
条件下における５Ｏ５−ＰＡＧＥで１００ｋｄの単一バ
ンドとして免疫沈降した。

Ｄ、二次元Ｙ土分扼 Ｓ３−４１に代えてＳ３−５３を用いること以外は、実
施例４のＥ項における方法に従う。得られた泳動パター
ンを第２図に示す。

Ｅ、″　、　　による几 Ｓ３−５３により認識される抗体は、放射標識した細胞
溶解物の免疫沈降によって単離する。免疫沈降物は種々
のエキソ型およびｅｎｄｏ型解糖系酵素で処理する。処
理後、沈降した抗原の見かけの移動度はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ系で測定する。解糖系酵素は、〇−結合またはＮ−結
合したグリカンの別々の部分を除去することにより、　
　５３−５３抗原の見かけの分子量を変化させることが
特徴である。得られた結果は以下のように要約すること
ができる：算−粟　　　九　′の　か番の　　− ｔ！ｎｄｏ　　Ｈ１４０ｋｄ ＮＡ　　　　　　　　　　　　　　１３５ｋｄＥｎｄｏ
　　Ｎ　　　　　　　　　　　１４０ｋｄＦ、Ｌ／えテ
詠？８１に金 ５３−４１に代えて３３−５３を用いること以外は実施
例４のＧ項の方法に従う。放射標識した溶解物をレンチ
ルレクチン−アガロースビーズに予め吸着させた際には
、　　Ｓ３−５３に対して反応性を有する抗原を除去し
た。該溶解物を小麦胚アグルチニンーアガロースビーズ
に予め吸着させた際には、抗原を除去しなかった。抗原
が除去されていることは。

ビーズの上清の免疫沈降、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り示した。従って、　　５３−５３と反応性を有する抗
原は。

小麦胚アグルチニンではなく、レンチルレクチンと特徴
的に結合する。

Ｇ、　　Ｓ３−５３　　Ｆ（７）　　六方法は実施例４
の１項に述べた通りである。パルス−チェイスにる生合
成実験は　（３ＳＳ　）−メチオニンで１０分間パルス
標識した後、　　１２０ｋｄ前駆体分子の存在を明らか
にした。追跡後１５分の時点では、少量の１４０ｋｄ　
Ｓ３−５３抗原も、目視することができた。これらの分
子は両方とも、追跡後６０分間まで存在を確認できたｔ
しかしながら、　　１４０ｋｄ分子だけが追跡後４時間
から追跡後２０時間まで検出することができた。従って
、　１２０ｋｄ成分は、Ｓ３−５３抗原の１４０ｋｄ成
分に対する前駆体として役立っている。

次ｍ影 肛見ｔｎ’　　　−１１ １１Ｐｃを保持することが判明した患者を、　　ＨＰＣ
細胞との反応性を有し、かつリシンのような毒性物質、
または細胞障害性薬剤と結合させたモノクローナル抗体
で治療する。このモノクローナル抗体複合体は、生理学
的に受容されるキャリア溶液（例えば、リン酸緩衝食塩
水）で、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与などを行
なう、投与量は患者の体重により決定され、好ましくは
約０．１■／一体重〜約４０■／ｋｇ体重の範囲内で、
そして通常は患者の体重１ｋｇ当たり約１■〜約１０■
の範囲内である。あるいは、投与量は標準的なＥＬＩＳ
Ａ　、ラジオイメージング、または他の方法によって定
量的に腫瘍の程度を評価することにより決定される。

感染から回復する患者の能力を高めるために必要とされ
る間隔で治療を繰り返す。

ＨＰＣ１ｉ胞との反応性を有するモノクローナル抗体は
、当該分野に公知の方法（例えば、　Ｌａｒｓｏｎら。

、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅ
ｓｔｉｇａｔｉｏｎ　７２：２１０１　　（１９８３）
　　；これは参照文献としてここに採用する）によりＩ
ＩＰＣの所在と程度とを決定するのに利用される。モノ
クローナル抗体は、好ましくは放射性ヨウ素化により、
または当該分野に公知の他の放射標識技術（例えば、ジ
エチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）のようなキレー
ト化剤を用いたキレート化）により放射標識するか；あ
るいは常磁性を有する試薬、化学発光を行なう基質、ま
たは酵素反応の成分で標識する。放射標識されたモノク
ローナル抗体は、精製され、そして成分で標識する。

標識モノクローナル抗体のキャリア（例えば、リン酸緩
衝食塩水）溶液が患者に静脈内注射される。

適当な投薬量は約１００μｇから５０■の範囲内である
。抗体との反応性を有する抗原決定基を持つ細胞が集中
している身体の領域へ該抗体が移動するには時間がかか
る。ある組織における放射性同位元素の濃度は、当該分
野に公知の全身イメージング技術（例えば、　Ｒａ１ｎ
ｓｂｕｒｙら、　Ｌａｎｃｅｔ、　１９８３年ＩＯ月２
２日、　　９３４（１９８３）を参照されたい；これは
参照文献としてここに採用する）によるか；あるいは生
検組織または抽出した体液をシンチレーションカウンタ
ーで評価することによって、決定するかまたは地図化す
ることができる。非放射性標識を用いた場合には他の適
当なモニタ一手段（例えば、核磁気共鳴検出器または分
光光度計）を用いる。放射能レベルが高い領域は９本発
明の細胞表面マーカーを有する細胞（例えば、　　ＩＩ
Ｐｃ）の存在を示している。

（発明の要約） ヒトの膵臓癌細胞と特異的に反応するモノクローナル抗
体を産生ずる新規なハイブリドーマ細胞系について述べ
られている。このハイブリドーマ細胞系を調製するため
に抗原調製物を生産する方法、および膵臓癌細胞を包含
するヒト細胞との反応性を有するモノクローナル抗体を
選別し、精製し、そして特徴付けする方法が開示されて
いる。

本発明の抗体が特異的に反応する抗原の特徴付けが行わ
れている。

４、　゛　　の　　　な量　■ 第１図はＳ３−４１をＦＧ細胞の放射標識抽出物と反応
させることにより得られた免疫沈降物の２次元ゲル分析
を示す図；第２図はＳ３−５３をＰＧ細胞の放射標識抽
出物と反応させることにより得られた免疫沈降物の２次
元ゲル分析を示す図；第３図は種々のインテグリンα鎮
のＮ−末端配列の比較を示す図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト膵臓癌（ＨＰＣ）細胞の表面マーカーとは特異
   的に反応するが、リンパ腫細胞、肝臓細胞および腎臓細
   胞とは反応しない、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）調製
   物。 ２、Ｓ３−４１およびＳ３−５３でなる群から選択され
   るハイブリドーマにより産生される特許請求の範囲第１
   項に記載のＭａｂ。 ３、特許請求の範囲第１項に記載の抗体を分泌し得るハ
   イブリドーマ細胞系。 ４、永久増殖性細胞系と、予めＨＰＣ細胞または誘導細
   胞で免疫した動物由来の脾細胞と、を融合することによ
   り調製される特許請求の範囲第３項に記載のハイブリド
   ーマ。 ５、Ｓ３−４１およびＳ３−５３でなる群から選択され
   る特許請求の範囲第４項に記載のハイブリドーマ。 ６、ＨＰＣとの反応性を有するＭａｂの製造方法であっ
   て、 特許請求の範囲第４項に記載のハイブリドーマを培養す
   る工程、およびその培養物から該Ｍａｂを回収する工程
   を包含する製造方法。 ７、ＨＰＣに特異的であるＭａｂの製造方法であって、 特許請求の範囲第４項に記載のハイブリドーマをマウス
   に注射する工程、および該マウスの血清由来の悪性腹水
   から該Ｍａｂを回収する工程を包含する製造方法。 ８、ＨＰＣ細胞上で発現される細胞表面マーカーであっ
   て、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、還元条件下では約２０５ｋ
   ｄおよび約１２５ｋｄの見かけの分子量を、そして非還
   元条件下では約１８５ｋｄおよび１５０ｋｄの見かけの
   分子量を有する２成分であり；そしてＭａｂＳ３−４１
   との反応性を有する細胞表面マーカー。 ９、ＨＰＣ細胞上で発現される細胞表面マーカーであっ
   て、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、還元条件下では約１４０ｋ
   ｄの見かけの分子量を、そして非還元条件下では約１２
   ５ｋｄの見かけの分子量を有する単一成分で構成され；
   そしてＭａｂＳ３−５３との反応性を有する細胞表面マ
   ーカー。 １０、哺乳類動物の身体内のＨＰＣを検出するまたはそ
   の所在を確認する方法であって、 該方法は以下の工程を包含する： （ａ）該哺乳類動物に特許請求の範囲第１項に記載のモ
   ノクローナル抗体を投与する工程；および（ｂ）この投
   与されたＭａｂを検出するまたはその所在を確認する工
   程。 １１、ＨＰＣを有する患者の治療的処置方法であって、 毒性物質と結合させた特許請求の範囲第１項に記載のモ
   ノクローナル抗体を、治療上有効な量で該患者に投与す
   ることを包含する治療的処置方法。 １２、ポリシアリル化ペプチド、およびその脱シアリル
   化型および部分的脱シアリル化型のペプチドであって、 該ポリシアリル化ペプチドはモノクローナル抗体Ｓ３−
   ４１との反応性を有し、かつ以下の特徴を有する： 分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定すると、還元条件
   下では約２０５ｋｄであり、そして非還元条件下では約
   １９０ｋｄである； ｅｎｄｏＦによる処理に対して感受性を有し、該処理に
   よって１９５ｋｄ（７）糖タンパクを生じる；ｅｎｄｏ
   Ｈに対する感受性を欠いている； ＮＡによる処理に対して感受性を有し、該処理によって
   ９５ｋｄのペプチドを生じる； ｅｎｄｏＮによる処理に対して感受性を有し、該処理に
   よって９５ｋｄのペプチドを生じる；そしてＮ−末端が
   ブロック化されている。 １３、モノクローナル抗体Ｓ３−４１との反応性を有す
   る糖タンパクであって、 該糖タンパクは以下の特徴を有する： 分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定すると、還元条件
   下では約１２５ｋｄであり、そして非還元条件下では約
   １９０ｋｄである； ｅｎｄｏＦによる処理に対して感受性を有し、該処理に
   よって約１０５ｋｄの糖タンパクを生じる；ｅｎｄｏＨ
   による処理に対して感受性を有し、該処理によって約１
   １５ｋｄの糖タンパクを生じる；ＮＡによる処理に対し
   て感受性を有し、該処理によって１２０ｋｄのペプチド
   を生じる；そしてアミノ末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ
   −Ｘ−Ｄ−Ｎ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄである。 １４、特許請求の範囲第１項および特許請求の範囲第２
   項に記載のペプチド性ヘテロダイマー複合体。 １５、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４００であり、
   ゲル濾過による分子量が５００ｋｄであり、Ｓ３−４１
   と免疫反応を行なうヘテロダイマー複合体であって、α
   鎖およびポリシアリル化β鎖；またはα鎖、および脱シ
   アリル化または部分的に脱シアリル化された形のβ鎖を
   含み、 該α鎖のＮ−末端がＦ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−
   Ｎ−Ｖ−Ｉ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−Ｄであり、 該β鎮のＮ−末端がブロック化されている、ヘテロダイ
   マー複合体。