JPH03188099A - 新規な腫瘍関連抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は抗原の特性化、特に腫瘍関連抗原の特性化に関
する。また、本発明は、そのような抗原、およびその抗
原決定基と特異的に反応する抗体に関する。また、本発
明は、そのような抗体の製造方法、並びに該抗体を診断
および治療に使用する方法に関する。

ごく最近の研究および考察は、モノクローナル抗体かが
ん治療において果し得る可能な役割に集中している。特
に、疾患の検出、疾患の経過を監視する（例えば、治療
期間中）ためのイムノアッセイへの適用に最大の興味が
集まっている。とりわけ、インビボでの腫瘍関連抗原と
の結合能力に基づいて、モノクローナル抗体の腫瘍の映
像作成および治療への適用の可能性に興味が寄せられて
いる。

モノクローナル抗体に関する技術の発展によりヒト腫瘍
の抗原の複雑さを調べることが可能となった。特に、モ
ノクローナル抗体の特異的な免疫反応性によりヒト腫瘍
によって発現された異なる抗原を同定し分別することが
可能となった。従って、これら別々の腫瘍関連抗原を特
性化することは、モノクローナル抗体の製造、およびモ
ノクローナル抗体を用いて行うがんの診断および治療を
促進するものである。

幾つかの抗原はヒト腫瘍細胞と正常細胞の両方で発現さ
れる。従って、これらの抗原は“腫瘍特異抗原”ではな
く、“腫瘍関連抗原”と呼称される。

そのような腫瘍関連抗原の診断および治療における価値
は、通常、正常細胞に関連性をもつ腫瘍細胞により、抗
原が過剰に発現されること、インビボにおいて、抗体が
、正常細胞におけるよりも腫瘍細胞で発現された抗原に
選択性を示すことにある。インビボに投与された抗体の
腫瘍部位への特異的な局在化の原因として以下が考えら
れている。

（１）悪性腫瘍の増殖による代謝の変化、および急速化
に起因する腫瘍細胞での抗原の発現の増大。

（２）腫瘍細胞密度の増大および周囲組織の正常細胞と
関連した腫瘍部位での構造異常の増大。

今日までに十分に特性化された腫瘍関連抗原の数は極め
て限られている。例えば、種々の肺がんに関連した抗原
と反応性を有する抗体がバーキらの“モノクローナル抗
体によって明らかにされたヒト肺腺がんに関連する抗原
”［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４４：６８１〜
６８７（１９８４）］に記載されている。バーキらによ
ると、モノクローナル抗体ＫＳ　１／４およびＫＳＩ／
１７は３タイプの肺がん（腺がん、上皮性がん、および
小細胞がん）のみならず大腸がん、乳がんおよび胃がん
とも反応性を有するが、ＫＳＩ／９はメラノーマおよび
肺、胃および大腸の腺がんのみと反応する。ＫＳ　１／
４およびＫＳ　ｌ／９によって認識される抗原は細胞質
膜にしっかりと結合していることが報告された。ブレン
ナーらの“免疫蛍光法および免疫沈降法により証明され
たヒト肺腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体”［Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　４２　：　３１Ｂ７
〜３１９２（１９８２）］には肺の鱗状細胞がんの膜上
に存在する抗原を認識する抗体が記載されている。小細
胞がんからの他のヒト肺腫瘍−関連抗原は、ブラーツら
（Ｂ　ｒａａｔｚ）の“ヒト肺腫瘍関連抗原の特性化お
よびラジオイムノアッセイの発達″［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、　　４２　：　８４９〜８５５（１９
８２）］に記載されている。

さらに、診断または予防マーカーとして有用なある種の
腫瘍関連抗原が、全患者に存在するとは限らず、疾患の
全段階および症状において存在するとは限らない。従っ
て、診断における識別性と治療における有効性は、同一
腫瘍組織から発現される腫瘍関連抗原を１つ以上、同定
し特性化することによって増強される。がんの診断およ
び治療の目的には、特定の型のヒト腫瘍に関連した１セ
ツトまたは１パネルの明確な抗原を用いることが望まし
い。従って、ユニークな腫瘍関連抗原がさらに同定およ
び特性化される必要がある。

本発明はヒト組織に存在する新規な抗原を発見し、特性
化した結果なされたものである。即ち、本発明は、分子
量が約５０，０００ダルトン（５０ｋｄ）から約ｓｏ、
ｏｏｏダルトン（８０ｋｄ）の範囲、等電点が約４．９
から約６．５の範囲である、実質上、純粋な形の腫瘍関
連抗原、およびそのような抗原に関連した実質上、純粋
なタンパク質エピトープを提供することを目的とするも
のである。

本発明はまた、明確にされた抗原に特異性を有する抗体
、およびそのような抗体の製造方法をも提供するもので
ある。さらに、本発明はそのような抗体をインビトロで
の免疫組織学的な、およびイムノアッセイ法によるがん
の検出、並びに診断に使用すること、およびヒト肺がん
のインビボ診断および治療に用いる方法を提供するもの
である。

また、本発明は薬学上許容し得る担体、希釈剤または賦
形剤と本発明の抗体とを含有する医薬組成物を提供する
ことを目的とするものである。

第１図はモノクローナル抗体ＬＡ２０２０７によって認
識される抗原の等電点電気泳動の像である。

第２図はゲルろ過高速液体クロマトグラフィーで得た抗
原画分の収集物とＬＡ２０２０７との反応性を示す図で
ある。

上記のごとく、本発明は分子量が約５０ｋｄから約８０
ｋｄの範囲でありかり等電点が約４．９から約６．５の
範囲である実質上、純粋な腫瘍関連抗原を提供するもの
である。本発明に従い、ハイブリドーマ細胞系（ｃｅｌ
ｌ　１ｉｎｅ）ＡＴＣＣＨＢ　１０２２４（１９８９年
９月１２日に寄託）により産生されるモノクローナル抗
体ＬＡ２０２０７を用いて、従来の文献に記載されてい
ない抗原を特性化した。

本発明抗原の物理化学的および免疫学的特性、特にモノ
クローナル抗体ＬＡ２０２０７との反応性により、該抗
原を特性化し、ヒト腫瘍組織を含むヒト組織に存在する
他の抗原から分別した。本明細書中、細胞系とは、例え
ば組織培養等のインビトロで、あるいはヌードマウスの
ような適当な動物宿主内で異種移植片として、増殖し得
る再生性細胞である。樹立細胞系から無制限に細胞が得
られるが、このことは、正常またはがん性組織からの細
胞の入手には制限があることと全く異なることである。

“組織標本”という語句は、固体標本、または同様の機
能を有する細胞集合を意味する“組織”という語句と相
互変換可能に用いる。そのような細胞は外科的、生検、
剖検、または直接動物またはヒトから抽出することによ
り得られる。

本発明により提供される抗原は、以下の特徴および性質
を有すると同定された。

（ａ）この抗原はヒト肺腺がん組織に存在する。

この抗原は肺腺がん細胞系を含む広範な様々な細胞系で
は発現されないようである。ＬＡ２０２０７とヒト肺腺
がん、および正常な肺および腎臓組織から得たサイトツ
ル（細胞質ゾル）との反応性を通常のＥＬＩＳＡ法で示
した。他方、抗体ＬＡ２０２０７は、試験した他の正常
組織、または乳がん、大腸がん、前立腺がん、およびメ
ラノーマを含む腫瘍組織とは反応しなかった。

（ｂ）標準的な免疫組織化学的方法で、正常な腎臓およ
び肺組織と同様、肺腺がんにもモノクローナル抗体ＬＡ
２０２０７によって強く染色される抗原が存在すること
を示した。比較として試験した乳がん、大腸がん、前立
腺がん、腎臓がん、メラノーマおよび他のがんはＬＡ２
０２０７との反応性を示さなかった。

（ｃ）ＨＰＬＣ分析の結果は、天然の抗原の分子量は約
５０ｋｄから約８０ｋｄの範囲であって、可能な分解産
物の分子量は約２Ｏ−３０ｋｄであることを示している
。

（ｄ）溶液中の抗原の等電点は約４．９から約６゜５の
範囲であって、ピークは約５．６である。

（ｅ）分解処理研究は、モノクローナル抗体ＬＡ２０２
０７が本発明によって特性化された抗原のタンパク質エ
ピトープと立体配座（コンホメーション）依存性の特異
的反応性を有することを示唆している。

以上、要約すると、本発明の１態様は、分子量が約５０
ｋｄから約８０ｋｄの範囲、等電点が約４゜９から約６
．５の範囲であって、ピークが約５．６である、実質上
、純粋な腫瘍関連抗原である。加えて、本発明の腫瘍関
連抗原は正常な肺および腎臓組織と同様、ヒト肺腺がん
によって発現される。

本発明の抗原と他の腫瘍関連抗原等の他の抗原との最も
重要な違いは、本発明によって特性化された抗原に対し
て、モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７が有する特異性
である。本発明を説明するに際し、“特異的”という語
句は“特異的な反応性”および“免疫反応性”という語
句と相互変換可能に用いる。

本発明によって特性化された抗原に対するＬＡ２０２０
７の特異性は、抗原を他の物質から単離、精製する、お
よび抗原決定基を特性化する場合の手段を与える。本明
細書で用いる“抗原決定基”という語句は“エピトープ
”という語句と相互変換可能に用いる。そのような純化
抗原およびその抗原決定基は診断および治療への適用の
ためのモノクローナルおよびポリクローナル抗体を当該
技術分野で周知の方法によって生産するのに有用である
。

例えば、純化抗原を用いて動物を免疫すると、抗原特異
的モノクローナル抗体を産生ずるネズミノ＼イブリドー
マが得られる。他の例として、抗原を用いてウサギ、ヤ
ギ、非ヒト霊長類、または他の動物の免疫応答を刺激し
、それらの血清からボーズら［Ｇｈｏｓｅ、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　９
３．３２６〜３２７（１９８３）］の記載に従ってポリ
クローナル抗体を得ることができる。さらに、抗原を用
いて、ヒト組織または体液中に存在するモノクローナル
抗体または抗体等の目的抗体を精製し、特性化すること
ができる。

本発明ではまた、本発明によって特性化された抗原に特
異的な抗体、およびその製造方法も提供する。そのよう
な抗体は、好ましくはモノクローナル抗体ＬＡ２０２０
７等、本発明の腫瘍関連抗原と免疫反応性を有し、好ま
しくはがん胎児性抗原とは反応性を持たないモノクロー
ナル抗体であることが好ましい。あるいは、この点に関
し、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体起源であって
もよい。本発明抗体には、本明細書中で特性化された腫
瘍関連抗原と特異的な反応性を有する、生物学的または
合成によるキメラ抗体、２機能性抗体およびヒト（ｈｕ
ｍａｎｉｚｅｄ）抗体も包含するであろう。また、混合
型抗体、例えば、キメ９２機能性またはヒト２機能性抗
体も本発明範囲に包含されるものと考える。

本発明の抗体はヒトのがん、とりわけ肺腺がんの検出、
診断および治療に有用であろう。そのような抗体は適当
な肺がん治療剤による検出、または結合のために、映像
用マーカーで標識しておくこともできる。画像診断のた
めには例えば、インジウム１１１．テクネチウム９９（
ヨウ素１２５、ガリウム６７、およびガリウム６８等の
ガンマ線放射体、陽電子放射体、およびＸ線放射体等の
放射性同位体によって抗体をラベルすることが好ましい
。ＬＡ２０２０７等の抗体をインジウム１１１等のガン
マ線放射体でラベルすることが好ましい。適当な治療剤
は放射性同位体、薬物、毒素、および生物学的タンパク
質を含む。放射性同位体には、映像に有用であると同時
に、アルファおよびベータ粒子の放射体である、イツト
リウム９０、スカンジウム４７およびヨウ素１３１が含
まれる。抗体、例えば好ましい抗体であるＬＡ２０２０
７をイツトリウム９０でラベルしたものが好ましい。薬
物には、通常、アルキル化剤、抗増殖剤、チュープリン
結合物質、細胞毒等を含み、ナイトロジエン・マスター
ド剤、ビンカ・アルカロイド、ダウノマイシンの仲間、
マイトマイシン類、プレオマイシン類、細胞毒性ヌクレ
オシド、薬物プテリジン類、および欧州特許公開Ｎｏ、
２２２．４７５（１９８７年５月２０日公開）記載のス
ルホニルウレア類が含まれる。好ましい薬物の内、特に
有用なものは、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシ
ン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン
、ジクロロメトトレキセート、ミドマイシンＣ１ポルフ
ィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプト
プリン、シトシン・アラビノシト、エトポシド、メルフ
アラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ラウロシジ
ン等である。治療剤として適当な毒素には、ボドフィオ
フィロトキシン類、リジン、トリクセセン類、コルチタ
ン類、およびシュードモナス・エンドトキシンが含まれ
る。治療的に価値ある生物学的タンパク質としてはホル
モン類、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガ
ンマ）、インターロイキン等がある。

そのような抗体はまた本発明の抗原の単離、精製、並び
に正確な決定基の特性化にも適用され得る。この点に関
し、本発明の他の態様は、本発明の新規な抗原上に認め
られ、本発明の抗体によって認識されるコンホメーショ
ン依存性の、実質上純粋なタンパク質エピトープに関す
るものである。

本発明はまた、このエピトープに対する抗体、好ましく
はモノクローナル抗体、より好ましくはモノクローナル
抗体ＬＡ２０２０７に関するものである。

上記のモノクローナル抗体はゲルハード［Ｇ　ｅｒｈａ
ｒｄ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
、　　３７０〜３７１゜Ｒ、Ｋ　ｅｎｎｅｔｔ編（Ｐ　
ｌｅｎｕｇ＋　Ｐ　ｒｅｓｓ　１９８０　）］の改良に
よるコーラ−およびミルシュタイン［Ｋｏｈｌｅｒａｎ
ｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　　Ｎａｔｕｒｅ　２５６．　
４９５〜４９７（１９７５）］の方法に従って製造する
ことができる。本発明においては、ネズミ等、当業者既
知の他の宿主を本発明の精製抗原または肺腺がんから得
たヒト腫瘍組織の可溶性画分で免疫する。感作後、免疫
マウスの肺細胞と適当なマウス骨髄腫細胞とを融合させ
てハイブリッド細胞系の混合物を得る。得られた細胞系
をハイブリッド細胞系用の選択培地で培養する。次いで
、本発明によって特性化された抗原に特異的なモノクロ
ーナル抗体、好ましくはＬＡ２０２０７を産生する生存
ハイブリッドをクローニングし、生産されたモノクロー
ナル抗体を回収する。

本発明はさらに、インビトロでのヒト腫瘍、とりわけ肺
腺がんの検出法に関する。既述のごとく、本発明でユニ
ークな腫瘍関連抗原が特性化されたので、患者の組織標
本中のそれらを検出することが可能となった。患者の組
織標本からインビトロで抗原を検出する方法は当該技術
分野で既知であり、それらには、例えば、テーラ−ら［
Ｔ　ａｙｌｏｒ。

Ａｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｌａｂ、Ｍｅｄ、　１０
２．　　ｌ　１３（１９７８）コの免疫組織学的方法が
ある。本発明との関連において簡単に述べると、がんの
疑いある患者の組織標本試料を本発明の腫瘍関連抗原に
特異性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、
より好ましくはモノクローナル抗体ＬＡ２０２０７で処
理する。次いで、標準的な組織学的手法で組織標本を選
択的に染色することにより、抗体が抗原と結合している
部位を決定する。そのような工程には、例えば、イムノ
パーオキシダーゼ（免疫過酸化酵素）染色、アビジン−
ビオチン法、およびイソシアン酸フルオレスセインを用
いる免疫蛍光染色法が含まれる。免疫組織学的方法また
はイムノアッセイ法による患者の組織標本中の腫瘍関連
抗原の定性測定または定量測定は、診断に有用でありか
つそれを示唆するか、あるいは、疾患の進行状態と関連
している。

同様に、イムノアッセイ法によるインビトロでの生物学
的液体試料中の抗原性物質の検出法も当該技術分野で周
知である。生物学的液体試料には血清、血漿、尿、唾液
、汗、腹水、胸膜液その他の体液が含まれる。本発明の
目的によれば、生物学的液体試料を、本発明の腫瘍関連
抗原抗体に特異的な少な（とも１個の抗体、好ましくは
モノクローナル抗体、より好ましくはモノクローナル抗
体ＬＡ２０２０７で処理する。次いで、本明細書で開示
した方法または当業者既知の方法で生物学的体液試料中
の抗原性の成分と後退との結合を測定する。例えば、本
発明で明らかにした抗原の定量的または定性的な測定は
、競合的または非競合的なイムノアッセイで行うことが
できる。本発明では、この場合にはモノクローナル抗体
、好ましくはＬＡ２０２０７を用いる。あるいは、本発
明で提供する抗原に特異的なポリクローナル抗体を用い
てもよい。イムノアッセイは、目標（ターゲット）抗原
の非−干渉性の決定基と結合するよう選択されたモノク
ローナル抗体類を用いる当業者周知の２−サイトイムノ
アッセイを用いることが好ましい。例えば、本願で引用
する米国特許第４゜３７６．１１０および４，４８６，
５３０（デビットら、それぞれ、１９８３年３月８日お
よび１９８４年１２月４日発行）に記載の２−サイトイ
ムノアッセイを用いることができる。

本発明の抗体がヒト患者の肺腺がんに有意に局在化する
ことは、本発明がインビボ適用に有用なことを示すもの
である。例えば、本発明はその１態様としてヒトがん、
特に肺がんのインビボ診断および治療を与える。本発明
方法に従って腫瘍の位置決定と検出を行うには、本発明
の腫瘍関連抗原と特異的な反応性を有する抗体の予め定
めた有効量を、がんの疑われる患者に投与した後、抗体
の局在する部位を検出する。局在部位は標準的な映像（
ｉｍａｇｉｎｇ）法、好ましくは平面映像（ｐｌａｎａ
ｒ　ｉｍａｇａｉｎｇ）または単光子放射型コンピュー
ター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、およびガンマカメラ全
身映像法によって測定することができる。ラベルした、
またはラベルしない、全抗体の予め定めた有効量は約２
〜約２００１９の範囲、好ましくは約５〜約８０Ｊ！９
の範囲、より好ましくは約２０〜約４０Ｒ９の範囲であ
る。抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好まし
くはＬＡ２０２０７を薬学的に許容し得る担体、希釈剤
、または賦形剤を含有する製剤として患者に投与する。

インビボでの検出を可能ならしめるマーカーで抗体をラ
ベルすることが好ましい。映像法のためには、上記マー
カーで抗体をラベルすることが好ましい。

映像法および治療に有用な、薬学的に許容し得る担体に
は、例えば、重炭酸塩バッファー、リン酸バッファー、
リンゲル溶液および所望により５％デキストロースまた
はヒト血清アルブミンを補充した生理学的食塩水等の水
溶液などが含まれ、これらは当業者周知である。本発明
はまた、本発明の幾つかの抗体によって、従来法では不
可能であった肺がん部位が検出され得ることが分かった
という利点をも有する。そのような場合、他の方法によ
っては、従来検出できなかった腫瘍部位の位置が決定さ
れると、治療方法が大きく変更される。

本発明のがん治療法では、本発明の腫瘍関連抗原に特異
的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好まし
くはモノクローナル抗体ＬＡ２０２０７の予め定めた有
効量を、がんと診断された患者に投与する。治療適用に
おける予め定めた抗体の有効量は約１〜約１００１９の
範囲、好ましくは約２〜約４０！９の範囲、より好まし
くは約２゜５〜約１０Ｍｇの範囲である。モノクローナ
ル抗体、好ましくはＬＡ２０２０７を上記の薬学的に許
容し得る製剤として投与する。

上記の、腫瘍部位に到達するよう選択された適当な治療
剤は、それをがん患者に投与する前にモノクローナル抗
体と結合させておいてもよく、あるいは患者へのモノク
ローナル抗体の投与後、別けて投与してもよい。この後
者の方法は、特に、２機能性抗体または金属キレート剤
と反応性の抗体の場合、とりわけ治療剤が放射性同位体
であるときに有用である。そのようながん治療用の治療
剤に抗体を結合させる方法は当該技術分野で周知である
。例えば、治療剤と抗体との結合はブレイア−ら［Ｂｌ
ａｉｒ、　　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
５９．　１２９（１９８３）］、ゴースら［Ｇｈｏｓｅ
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　９
３．　２８０（１９８３）］および米国特許第４，７４
１，９００（アルバレズ（Ａｌｖａｒｅｚ）ら、１９８
８年５月３日発行）に開示されている。本発明の治療組
成物を投与する方法も良く知られており、それらには静
脈内、腹腔内、リンパ節内、莢膜内、および動脈内への
注入および注射が含まれる。

さらにまた本発明は、本発明によって特性化された抗原
に対する特異的な反応性を有する抗体と、上記の当業者
周知の薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤と
を含有する医薬組成物を提供するものである。本発明の
医薬組成物に用いる抗体は、好ましくはモノクローナル
抗体、より好ましくはＬＡ２０２０７である。所望によ
り、上記のごとく抗体を画像診断用マーカーまたは適当
な治療剤に結合させてもよい。

さらに、当業者ならば、゛インビボのかん診断および治
療との関係において、本発明の腫瘍関連抗原に特異性を
有する抗体またはそのフラグメントの混合物を含有する
抗体製剤を、がんの検出、位置決定および治療の促進の
ために用いることもできるということを理解するであろ
う。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

実施例１　モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７の製造 ヒト肺腺がんから得た腫瘍細胞質ゾル（シトシール）を
ハイブリッド細胞系の製造における免疫源として用いた
。モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７を産生ずるハイブ
リッド細胞系はアメリカン・タイプ・カルチニア−・フ
レクシ日ンから、受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０２２４の下
で入手可能である。ヒト肺腺がん標本（ＡＯＯ２３９−
０１゜ベテランズφホスピタル・キャンサー・センター
ラ・ジョラ、カリフォルニア）を死後１０時間以内に解
剖によって採取し、−８０℃で保存した。

粗細脂質ゾルおよび膜を調製するために標本をＤｏｕｎ
ｃｅホモジナイザーを用い、４倍容量のＴｒｉｓ−ＨＣ
（２（ｐＨ７，５）、２ｓＭ塩化カルシウム、および２
ｍＭフェニルメチルスルホネート（ホモジナイゼーショ
ンバッファー）中、４°Ｃで均質化した。以後の工程は
すべて４℃で行った。ホモジネートをｌｏｏｏＸｇで５
分間遠心して核と全細胞を除去した。上清を除き、ペレ
ットを１００，０００Ｘｆで１時間遠心した。高速遠心
の後、細胞質ゾルを含有する上清を取り、−８０℃で保
存した。粗膜部分を含有するペレットを１容量のホモジ
ナイゼーションバッファーに再懸濁し、小分けし、−８
０℃で保存した。

雌性Ｂａ１ｂ／ｃマウス（チャールス・リバー・ブリー
ディング・ラボラトリイズ、ウイルミントン、マサチュ
ーセッツ）の各々をアルミナＣγ（シグマ、セントルイ
ス、モンタナ）に担持シたＡＯＯ２３９−０１肺腺がん
細胞質ゾル１００μ９で腹腔内免疫した。２０日後、マ
ウスをアルミナＣγに担持した細胞質ゾル１００μ９で
再度免疫し、第２免疫の８１日後、アルミナＣγに担持
した細胞質ゾル１００μ９で最終的に追加免疫した。

最後の免疫の３日後、マウスの牌臓をＡＰ−ＭＥＭ培地
（Ｆ　ｌｏｗラボラトリイズ、イングルウッド、カリフ
ォルニア）から無菌的に摘出した。注意深く牌臓を破壊
して牌細胞を培地に放出させ、細胞塊をピペットでほぐ
し、遠心管に移した。約５分間放置し、細胞懸濁から沈
澱物を分離し１，０００ｘｇで５分間遠心した。洗浄後
、１．ＯＯＯＸｇで５分間の第２回目の遠心の後、得ら
れた牌細胞ベレットをＡＰ−ＭＥＭ培地に再懸濁した。

細胞融合はゲルハードら［Ｇｅｒｈａｒｄ、　Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｔ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　　　Ｒ，Ｋ
ｅｎｎｅｔｔ編、　３７０〜３７１　（Ｐ　Ｉｅｎｕｍ
　Ｐｒｅｓｓ　１９８０）］の改良したコーラ−とミル
シュタインの方法［Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６，４９５〜４９７（１９
７５）］に従って行われた。簡単に述べると、Ｉ　Ｘ　
１０”個の牌細胞と２．５Ｘ１０’個のＰ３−Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）（マウス骨
髄腫細胞系）とをＡＰ−ＭＥＭ培地中の３５％ポリエチ
レングリコール（Ｐ　ＥＧ　ｌ　５００）１．０ｙｔ（
１中で融合させた。融合の後、細胞をＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）溶液を補充した培
地（１ｍ（ＩＨＡＴ／　１００ｍＱ培地）中、３７℃に
おいて、加湿した５％ｃｏ！インキュベーター内で培養
した。ＨＡＴ溶液の調製のために、５Ｍ　ＮａＯＨ２ｍ
Ｑと脱イオン水８ｓ＋（！とをヒポキサンチン４０８ｍ
ｇ、チミジン１１６．１１９、およびグリシン６゜７ｘ
ｇに加え、完全に溶解するまで旋回した。脱イオン水１
４０ｍ１２の添加に続いて、溶液を０．２μのＮａ１ｇ
ｏフィルターユニットで滅菌した。

得られたハイブリドーマによって産生される抗体を、Ａ
ＯＯ２３９−０１（免疫用肺腺がん組織標本）とヒト肝
組織から調製した粗膜製品上で、酵素結合免疫吸着結合
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でスクリーニングした。簡単に
述べると、まず、１μ９／ウエルのＡＯＯ２３９−０１
細胞質ゾルまたは肝臓膜を９６ウエルのマイクロタイタ
ープレート上に分けて置き、−夜乾燥させた。次いで、
ウェルをりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ　：　Ｏ，ＯＩＭ
りん酸ナトリウム＋０．４１Ｍ　ＮａＣｌ２）中０．３
％ゼラチン、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３回
洗浄した。最高約１００μ９／ｘＱを含有する培養上清
５０μｇを得、各ウェルに加え、次いで室温で１時間イ
ンキュベーションした。０．３％ゼラチン／ＰＢＳで５
回洗浄した後、ＰＢＳ＋　１０％ウマ血清で１／１００
０倍希釈したヤギ抗−マウスＩｇＧ−ビオチン（Ｚ　ｙ
ＩＩｌｅｄ）　５０　Ｉｔ　Ｑを第２抗体として加え、
１時間インキュベージコンした。

６回洗浄した後、試薬Ａ（アビジン）およびＢ（ビオチ
ン−西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含有する混合物５
０μＱを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベー
ションした。試薬Ａおよび試薬Ｂを１０％ウマ血清を補
充したＰＢＳ中で希釈（１：１０００）して混合物を調
製した。試薬Ａおよび試薬ＢはＶ　ｅｖｔｏｒから入手
可能である。各ウェルを６回洗浄して過剰量のアビジン
−ビオチン複合体を除去した。Ｏ，１Ｍチトレートホス
フエートバッファー中１１１９／ＩＱ　Ｏ−フェニレン
ジアミ７（ＯＰＤ）および０．０３％Ｈ，Ｏ−（以下、
ＯＰＤ展開溶液と称する）２００μＱを加えて発色させ
た。プレートを暗所で３０分間インキュベーションした
後、４Ｎ　Ｈ，ＳＯ，を５０μＱ／ウエルで加えて反応
を停止させた。光学密度（０，Ｄ、）を４９０ｎｍで測
定した。

正常な肝臓膜と比較して腫瘍細胞質ゾルとの反応性が５
倍またはそれ以上である抗体を選択した。

選択手段の結果からさらにモノクローナル抗体ＬＡ２０
２０７を特性化し、本発明によって提供する抗原の特性
化に用いるために選択した。これらの結果に基づき、Ｌ
Ａ２０２０７を用いて、本発明抗体のヒト肺がんの診断
と治療における有効性を決定するためのインビボ研究を
行った。

実施例２　モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７の特性化 Ａ、ラジオイムノアッセイ モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７を１団のヒト腫瘍に
対してスクリーニングし、抗体と反応性の抗原の存在を
調べた。ＬＡ２０２０７でスクリーニングした腫瘍を表
１に示す。

まず、固体腫瘍約ｔｇを組織プレスを通して砕き、ベト
リ皿上にのせ、腫瘍由来の細胞質ゾル溶解液を調製した
。砕いた腫瘍を次いで１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ、　２
ａ＋Ｍ塩化カルシウム、および２ＩＩＭフェニルメチル
スルホネートホモシネ−ジョンバッファー３ｘＱ中に再
懸濁し、冷却Ｄ　ｏｕｎｃｅホモジナーザーに移した。

約３ｙｔＱの０．５％ＮＰ−４０界面活性剤を加えた後
、懸濁した溶解液を、均質な溶液になるまでゆっくりと
ホモジナーゼーションした。次いで均質化溶液を５ｏｒ
ｖａｌｌ　ＧＬ（、−２Ｂデスクトップ遠心機中、１０
００Ｘ９で１５分間遠心した。粗細脂質ゾル溶解液を含
有する上清を一７０°Ｃで保存し、使用前に解凍した。

解凍した粗溶解液のタンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄＰ
ｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙにより業者の指示に従って測
定し、りん酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）を用いて２．５１１
？／ｘＱに調整した。クリーブランドプレートのウェル
内に配置したグラスファイバーディスクをＰＢＳで予備
洗浄し、真空にした後、粗すゼイトを５μ９／ウエルの
割合で加え、１５分間インキュベーションした。非結合
リゼイトを真空除去した後、ブロッキング剤（３％アル
ブミンまたは８％ウシ胎児血清）を５０μＱ／ウエルで
加え、５分間放置した後、ＰＢＳで２回洗浄した。

次いで、濃度１０　’ｃｐｓ／ディスクの１！Ｓ１標識
抗標識−緒に、ディスクを室温で１時間インキュベーシ
ョンした。１時間のインキュベーションの後、ディスク
を３回、ＰＢＳによる洗浄と真空処理で洗浄し、通常の
ガンマカウンターで全カウントを測定した。

モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７およびＫＳ１／４の
反応性を表１に示す。結果を相対結合に基づく主観的な
値（ｎｅｇ、　＋／ｎｅｇ、　＋　１．　＋２、＋３、
＋４）で示した。

人−↓　ＬＡ２０２０７のヒト腫瘍との反応性名　称　
　腫瘍型　　　　供給源　　　ＬＡ２０２０７ＬＳ１７
４Ｔ　　　結腸がん ５Ｗ４０３　　　結腸がん ５Ｗ６２０　　　結腸がん Ｔ１８３　　　　結腸がん Ｔ３８０　　　　結腸がん ＾００２３９　　　肺腺がん ＾５４９　　　　肺腺がん Ｃａ１ｕ３　　　肺腺がん Ｃ１＋２７ＬＣＩ　　肺腺がん Ｐ３／ＵＣＬＡ　　肺腺がん ３９２ 類表皮／ 腺がん １０３ 小細胞 肺がん ＮＣｌＮ４１７　　小細胞 肺がん ＡＴＣＣＣＬ１８８　　　　　ｎｅｇ ＡＴＣＣＣＣＬ２３０　　　　ｎｅｇ ＡＴＣＣＣＣＬ２２７　　　　　ｎｅｇＵＣ３Ｄ　　　
　　　　　　ｎｅｇ ＵＣ３Ｄ　　　　　　　　　ｎｅｇ Ｖ＾　　　　　　　　　　２＋ ＡＴＣＣＣＣＬ１８５　　　　　ｎｅｇＡＴＣＣＨＴＢ
−５５ｎｅｇ Ｕ、ｏｆ　ＷＡ　　　　　　　ｎｅｇ （ｌｌｅｌ　ｌｓｔｒｏｍ） Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　＆　Ｃｏ、　　ｎｅｇＵＣ５Ｄ （１（３ｐｌａｎ） ＶＡ（Ｄｅｆｔｏｓ）　　　　　ｎｅｇＣＩ （Ｍｕｌｓｈｉｎｅ） １０ｇ ＫＳＩ／４ ２＋ ｌ＋ ２＋ １０ｇ ２＋ ２９３ 小細胞 肺がん Ｃ３Ｄ Ｃ１ｏｕｓｅｒ　　乳がん　　　ＮＣＩ（Ｓｃｈｌｏｍ
）Ｆ１９２５　　　　乳がん　　　Ｕ、ｏｆｌｌ＾（Ｈ
ｅｌ　ＩｓＬｒｏｍ） ＭＣＦ７　　　　乳がん　　　ＡＴＣＣＨＴＢ　２２Ｍ
ＸＩ　　　　乳がん　　　Ｂ、　Ｌ、　Ｍｅｍｏｒｉａ
ｌＯａｋｌａｎｄ ＳＫＢＲ３乳がん　　　ＡＴＣＣ）ＨＴＢ　３０Ｔ３８
６　　　　乳がん　　　ＬＩＣ８ＤＴ４１７　　　　乳
がん　　　ｔｌｃｓＤ４−２１６９Ｔ２　　メラ／−マ
　Ｕ、ｏｆｌｌ＾（Ｈｅｌ　ｌｓｔｒｏｍ） Ｂｒｏｗｎ　　　メラノー７　　ＳＬ、ＪｏｓｅｐｈＨ
ｏｓｐ。

ＣＯＬＯ３ｇ　　　結腸がん　　Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｎ
ｇ）ＣＲＭＬ４　　　メラノーマ　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒ
ｉｖｅｒ（Ｓｈｅｋ） Ｍ２１　　　　　メラノー？　　Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｎ
ｇ）ＳＫＭＥＬ２ｇ　　メラノーマ　ＡＴＣＣ＃１ＩＴ
Ｂ−７２ＤＵ１４５　　　前立腺がん　ＵＣ３Ｄ／Ｖ＾
（Ｓｏｂｅｌ／Ｇｌａｓｓｅｙ） Ｐ３　　　　　前立腺がん　υＣ５Ｄ（Ｇｌａｓｓｅｙ
）１０ｇ １０ｇ １０ｇ ＡＴＣＣ＝アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレク
ション ＮＣｌ−ナショナル・キャンサー・インスチチュート ＵＣ３Ｄ＝カリフォルニア大学サンジエゴ校ＶＡ＝ベテ
ランズ・アソシエーション・ホスピタル、ラジョラ、カ
リフォルニア Ｂ、ＬＡ２０２０７の免疫組織学的測定ヒト組織の免疫
ペルオキシダーゼ染色により、正常および腫瘍組織中の
、ＬＡ２０２０７と反応性を有する抗原の存在を調べた
。

ティラー［Ｔ　ａｙｌｏｒ、　　Ａ　ｒｃｈ、　Ｐ　ａ
ｔｈｏｌ、　Ｌ　ａｂ、　Ｍｅｄ。

１０２．１１３（１９７８）］の記載した間接的な免疫
バーキシダーゼアッセイに原則的に従って切片を染色し
た。外科的に、および死後１０時間以内に解剖によって
得、−８０℃で凍結保存しておいた組織ブロックをミク
ロトーム／グリオスタット上で４−６ミクロンに切断し
接着剤を塗ったスライドグラスに置いた。当業者既知の
あらゆる接着剤が使用可能である。切片を簡単に風乾し
５分間ＰＢＳ中でインキコベーションして再度、水和さ
せた。次いで、ＰＢＳ中、１０％正常ヤギ血清で１５分
間前処理した。１μ９／ｘＱのＬＡ２０２０７抗体を含
有する上清を重層した後、切片を加湿チャンバー内で１
時間インキュベーションした。

次いで、切片をＰＢＳで洗浄して結合しなかった抗体を
除去した後、ＰＢＳ中に５分間浸した。切片にパーオキ
シダーゼと結合したヤギ抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ
抗体（Ｔ　ａｇｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、バーリンガム
、カルフォルニア）の５０倍希釈液を重層し、加湿チャ
ンバー内で３０分間インキコベーションした後、ＰＢＳ
で洗浄して結合しなかった第２抗体を除去した。０．０
３％Ｈ，Ｏ，中ｌｘｇ／ｘＱジアミノベンジジンで発色
させたのちへマドキシリン・エオシンでカウンター染色
した。

結果は下記衣２にまとめて示した。表２はモノクローナ
ル抗体ＬＡ２０２０７と、正常な腎臓および肺組織の反
応性をそれらの組織の染色の強さで示している。平均の
染色強度を相対結合に基づいて０から４＋までの尺度で
示した。比較として、ＬＡ２０２０７は試験した他の正
常組織とは反応性を示さなかった。

衣　２　　ＬＡ２０２０７の正常組織との免疫組織学的
反応性 組織 副腎 膀胱 脳 胸 子宮頚部 結腸 横隔膜 十二指腸 食道 心臓 回腸 空隔 腎臓 肝臓 肺 陽性の数／全試験数 ０／２ ０／２ ０／２ ０／８ ０／２ ０／８ ０／１ ０／１ ０／２ ０／２ ０／１ ０／１ ２／２（３＋） ０／２ ８／９（３＋） 卵巣 すい臓 末梢神経 胎盤 前立腺 唾液腺 皮膚 牌臓 を髄 翠丸 胸腺 甲状腺 扁桃 尿管 尿道 膣 ０／２ ０／２ ０／８ ０／２ ０／８ ０／１ ０／１ ０／２ ０／１ ０／２ ０／１ ０／２ ０／２ ０／１ ０／１ ０／１ 下記の表３に示すように、モノクローナル抗体ＬＡ２０
２０７は肺腺がんと強い反応性を有するが他の試験した
がんとは反応性を持たない。

表−３ＬＡ２０２ 職掌的反応性 組織 肺腺がん 乳がん 結腸がん 胃がん 肺気管支−肺胞腫瘍 肺類表皮がん 肺大細胞腫瘍 リンパ腫瘍 黒色腫 すい臓がん 前立腺がん 結腸がん 腎臓がん 肉腫 翠丸腫瘍 甲状腺腫 Ｏ７の腫瘍組織との免疫組 陽性の数／全試験数 ８／９（３＋） ０／８ ０／１１ ０／４ ０／２ ０／２ ０／２ ０／２ ０／４ ０／２ ０／８ ０／２ ０／４ ０／２ ０／４ ０／２ 正常な霊長類の肺および腎臓組織とヒト組織とのＬＡ２
０２０７に対する反応性を比較した。試験の結果、下記
表４に示すように、これらの間に何等の関連性は示され
なかった。結果は、平均の染色強度をＯ−４＋の尺度で
示したものである。

表−エ　ヒトおよび霊長類の正常組織における反応性の
比較 起　　源　　　　　腎臓　　　　肺 ヒト 霊長類： Ｃｙｎｏｔｎｏｌｇｏｕｓ アフリカミドリザル アカゲザル ヒヒ チンパンジー 略語：ｔ＝管上皮 ｂ＝気管支 ａ＝肺胞上皮 ｇ＝糸球体 ８＝支質 ３　＋　（Ｌ）　　　３　＋　（ｂａｓ）０　　　　　
２＋（ａ） ３＋（ｇ）　　　ｔ＋（ａ） １＋（ｇ）　　　０ ２＋軸）　　０ ０ Ｃ，ＬＡ２０２０７のアイソタイプの決定ヤギ抗−マウ
スＩ　ｇｃｙ　、、ＩｇＧい、ＩｇＧ＊ｅ＋　　１ｇＧ
５およびＩｇＭ（Ｔａｇｏ、　　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ
、　Ｃａ１ｉｒｏｒｎｉａ）をまず１０ｍＭりん酸ナト
リウムバッファー溶液（ｐＨ７，２）により、濃度１　
ｙｇ／　ｍＱの元のストックを１　：　３０００倍希釈
した。まず、９６ウエルのポリビニルマイクロタイター
プレートを希釈したヤギ抗マウスＩｇにより５０μａ／
ウエルで被覆し、３７°Ｃにおいて一夜インキユベート
した。次いで、プレートをＰＢＳ−０，１％Ｔ　ｗｅｅ
ｎによる洗浄の後、蒸留水で２回目の洗浄を行った。各
試験ウェルに遮蔽（ブロッキング）溶液２００μｇを加
え、カバーしたプレートを４°Ｃで保存した。ブロッキ
ング溶液は一定速度で撹拌されているＰＢＳ　２Ｉ２に
ＢＳＡ（シグマ＞２０９、Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ）　
２１１２％および１０％アジ化ナトリウム２０ｘＱをゆ
っくりと加えて調製した。

５日以内に、プレートをＰＢＳ−０，１％Ｔ　１ｅｅｎ
で洗浄した後、室温において蒸留水で２回目の洗浄を行
った。次いで、試験ウェルに濃度１０μｙ／＊ＱのＬＡ
２０２０７抗体上清４０μＱ％　ＩｇＧおよびＩｇＭ正
対照、並びにＨＡＴ（負対照として用いる）を加えてカ
バーをし、３７℃にて１時間インキュベーションした。

プレートをＰＢＳ−０゜１％Ｔ　５ｅｅｎで３回、蒸留
水で１回洗浄した後、各ウェルに調製したばかりのＯＰ
Ｄ展開溶液１００μＱを加えた。即座にプレートをホイ
ルでカバーし、室温で１５分間、振盪しながらインキュ
ベーションした。各ウェルに４Ｎ　Ｈ，Ｓｏ、５０μＱ
を加えて反応を止め、プレートをＥＬＩＳＡリーダーに
より４９０ｎｍで読み取った。

上記の工程に従い、モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７
のアイソタイプが、ネズミＩｇＧ、クラスに属すると決
定された。

Ｄ、フローサイトメトリー 本発明の抗原が血液成分を伴っているか否かを決定する
ために、ＬＡ２０２０７の血液成分（リンパ球、赤血球
、骨髄成分および血小板等）との反応性を評価した。フ
ローサイトメトリーの実施方法は当業者既知であり、シ
ャピ１口らの［実用フローサイトメトリーＪ［Ｈ，Ｍ、
５ｈａｐｉｒｏ、　　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｆ　　ｌ
ｏｗ　　ＣｙｔｏｍｅＬｒｙ（Ａｌａｎ　　Ｒ，Ｌｉ５
ｇ　　１　９　　Ｂ　　Ｂ）コに記載されている。

新鮮なヘパリン処理血液を１０００Ｘ９で２回、それぞ
れ５−８分間遠心した。これから直鎖を採取し１０００
Ｘ９で４回、４−６分間遠心して血小板をペレット化し
、適当量の直鎖に再懸濁した。

黄褐色の層も集めて１０００Ｘ９で２回、４−６回遠心
しリンパ細胞を収集した。黄褐色のペレットに約１Ｏ−
１２ｘＱの０．８３％塩化アンモニウム−０，１４％炭
酸水素カリウム−〇、０５ｍＭＥＤＴＡ溶液ｐＨ７，３
を加え、５分間インキュベーションした後、４−６分間
、１０００Ｘ９で再度、遠心した。ベレットを１回洗浄
し、濃度４０Ｘ１０６細胞／雇でＲＰＭＩ−１０％ウシ
胎児血清に再懸濁した。赤血球細胞も、濃度４０Ｘ１０
”細胞／ＲＱでＲＰＭＩ−１０％ウシ胎児血清に再懸濁
した。

ＬＡ２０２０７上清（５０μｅ）を９６ウエルのマイク
ロタイタープレートに分配し、細胞浮遊液２５μ１２（
１０”細胞）を加え、４℃で３０分間インキュベーショ
ンした。遠心により細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ヤギ抗
〜ヒトＩ　ｇＭ　　Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ抱合体（Ｔａｇｏ、
　　Ｂｕｒｌｉｎｇａ＠、　ＣＡ）５０μ（２と一緒に
４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を上記同
様、再度洗浄し、０．５−１．０ｘＱの１％ホルマリン
の入った試験管に移し、蛍光活性化セルソーターで分析
した。

表５に示すように、上記の分析によっては、ＬＡ２０２
０７がいずれかの血液成分と特異的に反応することは示
唆されなかった。従って、本発明の抗原は血液成分を伴
っていないと思われる。データは、平均蛍光強度（“Ｍ
ＩＦ”）に対する陽性％として示されている。

表　５　フローサイトメトリーデータ 面液二　　　　　　　　％陽性：ＭＩＦ赤血球　　　　
　　　＜１　：＜１０ リンパ球　　　　　　　４：３２ 単球　　　　　　　　　ｌ：５０ 顆粒球　　　　　　　　３：３６ 血小板　　　　　　　１１：２７ 骨髄： リンパ球／赤血球　　＜１：＜１０ 骨髄細胞　　　　　　＜１＋＜１０ 実施例５　モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７の精製 ｌＸｌ０’のＬＡ２０２０７ハイブリドーマ細胞（八Ｔ
ＣＣＨＢ１０２２４）を腹腔内注射した、ブリスタン感
作Ｂａ１ｂ／ｃマウスから採取した腹水２７８ｉ１２よ
りモノクローナル抗体ＬＡ２０２０７を精製した。腹水
製品および採取の方法はガルフレおよびミルスタインに
よって報告されている［Ｇａ１ｆｒｅ　ａｎｄ　Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗ＋ｏ
ｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、　７３　Ｂ、　　４３〜４５．　　Ｌａｎｇｏ
ｎｅ　＆　Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ編（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８１）］。

採取した腹水を４°Ｃにおいて２０分間、１１０００−
１８，０ＯＯＸ９で遠心した。室温で連続的にゆっくり
撹拌しながら２５％硫酸ナトリウム溶液６４４１１Ｑを
加えて上清から抗体を沈降させた。

得られた混合物を１．５時間、室温で放置し、次いで、
室温で約２０分間、１１，０００−１８，０００Ｘ９で
遠心した。上清画分を除去した後、１０％硫酸ナトリウ
ム１８０１（２を沈殿物に加えて均質溶液を調製し、室
温で２０分間、１１，０００−１８，０ＯＯＸ９で遠心
した。沈殿を５０ｍＭ　りん酸ナトリウム（ｐＨ８，２
）８４ｉ＋Ｑに溶解し、４°Ｃで５０＋ｉＭ　りん酸ナ
トリウムバッファー溶液（ｐＨ８、２）２１２に対しく
１６時間後に１回バッフ１−を交換）、４３時間透析し
た。透析した抗体溶液を次いで、滅菌水３８９肩Ｑで希
釈し１５．０ＯＯＸ９で２０分間、４℃において遠心し
た。ＬＡ２０２０７抗体を含有する上清画分を注意深く
分けて得、以後の精製のためにろ過した。

ろ過後、０．０１Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨ８，２、伝
導率１．８＠ＭＨＯ）で平衡化した１９０村ＤＥ　Ａ　
Ｅ　　Ｓ　ｅｐｈａｃｅｌ（ファルマシア）カラムを用
いてさらに精製した。抗体溶液を０．ＯＩＭ　りん酸ナ
トリウム（ｐＨ８，２、伝導率１．８ｍＭＨＯ）と−緒
にＤＥＡＥカラムに適用した後、ますカラムを０．０２
５Ｍ　りん酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ８，２、
伝導率３．６＋ｅＭＨＯ）で洗浄した後、０．０５Ｍり
ん酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ８，２、伝導率６
．４ｍＭ　ＨＯ）で溶離シタ。ＵＶモニターによる２Ｂ
０ｎｍの吸光度が１．０以上である画分を集めて採取し
、４°Ｃで保存した。

実施例６　ｌｌ１ｌｎ−標識り、Ａ２０２０７の調製Ｌ
　Ａ　２０２０７のインジウム−１１１による放射能標
識はキレート他剤ジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｄ
ＴＰＡ）を用いて行った。まず、１０＋ａＭ　ＤＴＰＡ
（ｐＨ９，５）３．Ｏ＊Ｑを６，４５Ｑ／ｘＱの精製Ｌ
Ａ２０２０７抗体２３．３１７２に加えた。

抗体−ＤＴＰＡ溶液のｐＨを１ＭＮａＣＯ３溶液（ｐＨ
１２）０．３１１２を用いて約９．５に調整した。次い
で、静かに撹拌しながら、室温で１５分間かけて９５ｍ
Ｍ　ＮａＣ０ａ　３．４ｘＱを加え、抗体濃度を５ｉ＋
ｇ／ｘＱに調整した。抗体溶液の撹拌の間に、０゜６ｍ
Ｍ　りん酸ナトリウム（ｐＨ８，２）０．４９ｘＱを３
７ｍＭ　”’　Ｉ　ｎ（Ｉ［［）インチオシアネート０
．４９１１Ｑに加えて”’　Ｉ　ｎ（ＩＩＩ）インチオ
シアネート溶液（“ＩＴｃ溶液”）を調製した。ＩＴＣ
溶液を調製した直後、溶液１．１６ｍ１２を抗体−ＤＴ
ＰＡ溶液に加え、続いて室温で２．５時間、連続撹拌し
た。

次いで、０℃に冷却して反応を止めた。

標識抗体結合混合物をＰ−６ＤＧセフアデツクスカラム
（ファルマシア）に負荷した後、カラムを０．１３ｍＭ
　クエン酸アンモニウム（ｐＨ６，０）により、流速７
０１１２／時間で溶離した。ＵＶモニターを用い、吸光
度（Ａｔ、。）が０．１以上である溶離液画分を収集し
、インジウム−１１１の取り込みに関して試験した。取
り込みが最高である画分を集めて抗体約１３２１ｇを含
有する３４．６ｚＱを得、これに２５％正常血清アルブ
ミン０．８ｍ１２を加えた。得られた抗体溶液を０．１
３ｍＭ　クエン酸アンモニウム（ｐＨ６，０）で終濃度
Ｌｘｔｉ／ｘＱに調節し、滅菌ろ過し、４°Ｃで保存し
た。

抗体の反応性に対する結合（フンジュゲーション）の影
響を決定するために、非結合および結合ＬＡ２０２０７
抗体の反応性の比較試験を行った。

実施例２記載の方法に従い、ＥＬＩＳＡによってＡＯＯ
２３９−０１肺腺がん組織標本から抽出した細胞質ゾル
１μｇ／ウェルに対し、精製した結合形ＬＡ２０２０７
抗体を試験した。結果は、ＬＡ２０２０７結合形（５９
％免疫反応性）は非結合形（６５％免疫反応性）と比較
して、なんら有意な反応性の喪失を示さなかった。その
上、この方法による結合により所望の２キレ一ト／抗体
が産生じ、インジウムの取り込みは９０％以上であった
。

実施例７　抗原の特性化二分子量の決定本発明の新規な
抗原の分子量を２個のゲルろ過カラム［９，４Ｘ２５０
１１ＣＦ−４５０Ｚｏｒｂａｋカラム（Ｄｕｐｏｎｔ）
に連結した９、４Ｘ２５０ｉｕＧＦ　−２５０Ｚｏｒｂ
ａｋカラム（Ｄｕｐｏｎｔ）］を用いるＨＰＬＣで測定
した。両ろ過カラムの前に１２゜５ｘ４ｘｘ　ＧＦ−２
５０Ｚｏｒｂａｋ　ｇｕａｒｄカラム（Ｄｕｐｏｎｔ）
を連結した。ＨＰＬＣ分析によって分子量を測定する方
法は当業者に周知であり、ジョンソンおよびステイーブ
ンソン（Ｅ、　Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ　＆　Ｒ。

Ｓ　ｔｅｖｅｎｓｏｎ）の「基礎液体クロマトグラフィ
ー」１４９−１６４（Ｖａｒｉｏｎ　Ａｓ５ｏｃ、　　
１９７８）に記載されている。簡単に述べると、０．２
Ｍりん酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶１ｆｆ
ｌ（ｐＨ７゜０）５０μＱ中の肺腺がんＡＯＯ２３９−
０１細胞質ゾル１−４５ｍｇをＨＰＬＣシステムに注入
した。

流速１　、　Ｏ蛙／分で各３００μＱの画分を採取し、
ＥＬＩＳΔ分析した。各画分の一部を５０μＱ／ウエル
でマイクロタイタープレートにピペットで載せ、３７℃
で一夜乾燥させた。翌日、乾燥した画分を実施例１記載
の一般的手法に従い、ＬＡ２０２０７との反応性に関し
て分析した。本発明の新規な抗原の分子量を測定するた
めに、ＨＰＬＣカラムから分画したゲルろ過標準（Ｂ　
１ｏｒａｄ）を用い、Ｏ，Ｄ、２８０でモニターして、
標準曲線を作成した。標準曲線を用いて測定した、ＬＡ
２０２０７で認識される抗原の固有の分子量は約５Ｏ−
８０ｋｄ、好ましくは約６７ｋｄであった。分子量領域
約２０−３０　ｋｄ、好ましくは約２８ｋｄのＬＡ２０
２０７と反応性の小さい成分も観察された。この成分は
天然の抗原の分解産物と考えられる。図１はＨＰＬＣに
よって得、集めた抗原画分のＬＡ２０２０７との反応性
を示す。

実施例８　等電点泳動による抗原の特性化Ｌ　Ａ　２０
２０７によって特性化した抗原の等電点を等電点泳動カ
ラムを用いて測定した。実施例１記載のごと（調製した
ＡＯＯ２３９−０１肺腺がん細胞質ゾル５屓９をウォー
タージャケットを付した１１ＯＮ＋２の等電点泳動カラ
ムを用い、ｐＨ域３．５−１０の両性電解質を含有する
０−４７％ショ糖グラデイエンド１１０ｉＱ中で等電点
泳動じた。４℃で１２時間、６００ボルトでカラムを予
備等電点泳動じた後、各試料をグラデイエンドの中間で
注入し、４℃でさらに３０時間フォーカスした。カラム
から１ｊＩＱ画分を集め、即座にｐＨを測定した。採取
した画分を一夜、１０ｍＭ　りん酸ナトリウム（ｐＨ７
，０）に対して透析した。その−部のＡＯＯ２３９−０
１肺腺がん標本の細胞質ゾル製品に抗するＬＡ２０２０
７との反応性を、ＥＬＩＳＡアッセイで調べた。

この方法による等電点泳動で、抗原の等電点は約４．９
〜約６．５、ピークは約５．６であった。

実施例９　抗原の特性化：エピトープの分析モノクロー
ナル抗体ＬＡ２０２０７によって認識されるエピトープ
の性質を決定するために、実施例１記載のごとくにして
調製したＡＯＯ２３９０１ヒト腫瘍細胞質ゾル２０μ９
を以下の分解処理に付し、ＥＬＩ　ＳＡによりＬＡ２０
２０７との反応性を試験した。

ａ）メタノール：９５％メタノール中、４℃で１時間イ
ンキュベーションした。

ｂ）ノイラミニダーゼ：　Ｃ，ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
ノイラミニダーゼ（シグマ、セント・ルイスＨＯ０ｕｎ
ｉｔ／ｍ（ｌトー緒に３７°Ｃで１時間インキュベーシ
ョンした。

Ｃ）過ヨウ素酸塩：ｌｎＭ過沃素酸ナトリウム中で室温
において３０分間インキコベーションし、１０ｍＭ水素
化ホウ素ナトリウムで還元した。

ｄ）熱：細胞質ゾルを１００°Ｃで２０分間熱処理した
。

ｅ）還元／アルキル化：６Ｍグアニジン−ＨＣｌ２゜１
０１ＭＤＴＴ中、４５℃で４時間インキュベ−ジョンし
た後、１０−Ｍヨード酢酸中、２３℃で３０分間インキ
ュベージワンした。

「）尿素：８Ｍ尿素中、４５℃で１８時間インキュベー
ションした。

分解処理の結果は以下の表６に記載されている。

肺腺がんＡＯＯ２３９細胞質ゾルを１μ９／ウエルでプ
レートアウトし、３７℃で一夜乾燥した。

炭水化物エピトープの同定を目指す処理（例えば過ヨウ
素酸塩やノイラミニダーゼ処理）は有意な影響を与えな
かった。立体配座的なタンパク質エピトープの同定に用
いる処理（熱、尿素およびグアニジン−ＨＣＱ）ではＬ
Ａ２０２０７と処理した抗原との反応性の有意な減少が
認められた。脂質エピトープを同定するために用いたメ
タノール処理の効果は未確定（結論に達していない）で
あるが、メタノール処理はタンパク質を変性することも
知られている。これらタンパク分解処理の全結果とメタ
ノール処理の結果が未確定であることを総合すると、Ｌ
Ａ２０２０７が立体配座依存性のタンパク質エピトープ
を認識することが示唆されていｆｉ６　　モノクローナ
ル抗体ＬΔ２０２０７ＡＯＯ２３９−０１細胞質ゾルの
分解処理対照 メタノール ノイラミニダーゼ ００ ６ ＞１００ （＋）０〜６％ （−）　６９〜１００％ （＋）０〜４％ （−）８８〜１００％ 過ヨウ素酸塩 熱 ９０　　　（＋）＜１０％ （−）＞７５％ １．７　　（＋）０〜６％ （−）＞５０％ ６Ｍグアニジン　　　＜１　　　（＋）＜１５％ＨＣＱ
　　　　　　　　　　　　（−）＞７５％８Ｍ尿素　　
　　　　＜１　　　　（＋）＜２０％（−）＞７５％ 未確定 非−炭化水素 エピトープ 非−炭化水素 エピトープ 立体配座的 エピトープ 立体配座的 エピトープ 立体配座的 エピトープ 実施例１０　　インビボ研究 Ａ、生物分布 ４８時間の生物分布研究において、６匹の正常なＳ　ｍ
１ｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ？ウス（Ｓ　１ａｏｎｓｅｎ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の各々に４６μｃｉのＩｌ
ｌ　ｌ　ｎ−標識ＬＡ２０２０７を用量５μ９／　ｌ　
ＯＯμＱで注射した。器官および排泄物を抽出または収
集し、重量を量り（もし適当なら）、当業者周知の方法
で放射能を測定した。生物分布研究の結果は下記の表７
に示されている。表７は、４８時間後の肝臓および血液
における線量測定値の計算値が卓越しており、他の器官
での放射線の取り込みは正常であることを示している。

表　７４８時間後のインビボでのＬＡ２０２０７の生物
分布 組　織　　　用ｆｆｉ／９（％）　　用量／器官（％）
血ｅＬ１５．２　　　　　２６．８ ±　４．９　　　　　±　２．８ 骨（大腿骨）　　　　　２．７　　　　　　６．８±　
０．８　　　　　±　１．５ 心臓　　　　　　４，７　　　　　　０．６±　２．５
　　　　　±　０．３ 腎臓　　　　　　５．３　　　　　　１．０±　６．１
　　　　　±　０．２ 肝臓　　　　　　６．１　　　　　　８．３±　１．６
　　　　　±　１．８ 肺　　　　　　　　　８．５　　　　　　　　１．７±
　３．ＯｆＱ、７ 筋肉　　　　　　１．１　　　　　１１．６±　０．２
　　　　　±　　１．４ 皮膚　　　　　　３．３　　　　　１２．３士　　０．
７　　　　　　　±　　１．７牌臓　　　　　　５．２
　　　　　　０．５±　２．６　　　　　±　０．１ 腸　　　　　　　　　１．０　　　　　　　　４．１±
　０，２　　　　　±　０．４ 尿　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．４糞便
　　　　　　　　　　　　　　５．５Ｂ、臨床研究 臨床における生物分布研究では、８人の患者にＬＡ２０
２０７を静脈内注射した。４人の患者の各々は目１イン
ジウムー標識抗体（５ｍＣｉ）２ｉ＋９と非標識“コー
ルド”抗体３１１ｇを与えられたが残る４人の患者はそ
れぞれ、標識ＬＡ２０２０７（５ｇ＋Ｃｉ）　２　ｙｔ
ｇとコールド抗体１８Ｍ９とを投与された。注射した抗
体の生物分布とクリアランスとを測定するために、全患
者を０，１．３および６日目にＰ。

Ｈ，ブラウンら（Ｐ、Ｈ，Ｂｒｏｗｎ）のガンマカメラ
全身映像法による画像形成に付した［ｒＷｈｉｌｅ　Ｂ
ｏｄｙＩ　ｗａｇｉｎｇによる簡略化されたＩＩＩ　ｌ
　、モノクローナル抗体の生物分布および線量測定法ｊ
、　ＣＩｉｎ。

Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、　１２　：　９５．　ｐｉ　１（１
９８７）］。尿および血液試料を７２時間後まで、定期
的に採取した。選択した器官での注入活性％、滞在時間
および吸収された量を表８に示す。尿路膀胱での注入活
性はＰ、　Ｈブラウンらの記載した方法に従って、尿デ
ータを用いて計算した［Ｐ、Ｈ，Ｂｒｏｖｎ、　ｒ患者
および健常者でのＴｃ−９９ｍ　ＨＩ　ＤＡの放射線量
測定Ｊ、　　Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、　　２２　：　１
７７〜８３（１９８１）］。尿および血液データは表９
に示されている。

（以下余白） ％　　８　　目’Ｉｎ−ＬＡ２０２０７のヒト患者にお
ける生物分布 全身　　１００　　９２．８ 心臓　　　７．１６　５．８９ 胸　　　　　７．４５　　８；　５７ 肺　　　　　９．７７　　７．４６ 脳　　　　　１．３２　　１．３５ 腎臓　　　１．３３　１．６７ 肺臓　　　１．０６　１．２２ 尿路膀胱 衣−旦　尿および血液中の ０７の注射量に対する％ ８６．１ ４．５４ ９．３０ ６．３３ １．２５ １．７４ １．３１ ７９．１　　　６７．７ ２．９０　　　４．５６ ９．１５　　　８．７９ ４．１８　　　６．０Ｇ １．０６　　　１．２１ １．３９　　　１．５５ ０．９５　　　１．１２ ０．２１ 目Ｉｎ標識り、Ａ２０２ ０．４９ １．４７ １．４１ １．２３ ０．３２ １．２１ １．３７ ０．４７ 全用量％ ｌ、８７ ０．７６ １．７６ ２．１５ １．９１ ２．３６ １０．８ 用量％ ８６．４ ８８．１ ８６．５ ８５．５ ８４．３ ８４．１ ４　　　　５　　　　２４　　　４８　　　７２　　　
１４４Ｂ２．０　７９．７　５９．６　４７．０　３６
．７　２０．７肺がんのインビボでの検出および治療に
おける本発明の抗体の潜在的な有効性を試験するために
、肺がん患者であることが分かつている１３人の患者に
モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７を投与した。４　５
ｍＣ１の１１１−インジウム標識ＬＡ２０２０７　（ｌ
　Ｒ９）を静脈注入し、患者が受は入れる全抗体量が、
５．２０または２０Ｒ９となるようにした。注入後３日
日にプラナ−イメージ（平面画像）をとり、注入後６日
または９日後にプラナ−イメージまたは５ＰＥＣＴイメ
ージを得た。原発生肝がんを７日または１０日後に外科
的に切除し抗体濃度を測定した。既知病巣の検出では７
０％がＬＡ２０２０７に対するものであると決定された
。

表１０に示した研究結果はモノクローナル抗体ＬＡ２０
２０７のインビボ適用における有用性を示している。

（以下余白） 表１０ ５．０　　　８　　　　１７　　　　　１２　　　　７
１２０．０　　　３　　　　　３　　　　　　２　　　
　６７２１．０　　　２　　　　　３　　　　　　２　
　　　６７合計１３　２３　１６　７０ 上記の記述は本発明を例示し説明するためのものである
。当業者ならば本発明の範囲内でこれらに変化または修
飾し得ることを理解するであろう。

本出願の特許請求の範囲はそのような変化および修飾を
包含するものと解釈されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗体ＬＡ２０２０７によって認
識される抗原の等電点電気泳動の像を示すグラフ、第２
図はゲルろ過高速液体クロマトグラフィーで得た抗原画
分の収集物とＬＡ２０２０７との反応性を示すグラフで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量が約５０ｋｄから約８０ｋｄの範囲、等電点
   が約４．９から約６．５の範囲である、実質上、純粋な
   形の腫瘍関連抗原。 ２、該等電点が約５．６である請求項１記載の抗原。 ３、該抗原がヒト肺腺がんによって発現されるものであ
   る請求項１または２記載の抗原。 ４、該抗原がモノクローナル抗体と反応性を有するもの
   である請求項３記載の抗原。 ５、該モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ＡＴ
   ＣＣＨＢ１０２２４によって産生されるＬＡ２０２０７
   である請求項４記載の抗原。 ６、分子量が約５０ｋｄから約８０ｋｄの範囲、等電点
   が約４．９から約６．５の範囲である腫瘍関連抗原と反
   応性を有する抗体。 ７、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、２機能
   性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、２機能性−キメラ抗体
   、または２機能性−ヒト抗体である請求項６記載の抗体
   。 ８、該抗体がモノクローナル抗体である請求項７記載の
   抗体。 ９、該抗体がＡＴＣＣＨＢ１０２２４によって産生され
   るモノクローナル抗体ＬＡ２０２０７である請求項６〜
   ８のいずれかに記載の抗体。 １０、モノクローナル抗体ＬＡ２０２０７。 １１、該抗体が適当な治療剤または映像マーカーと結合
   するか反応するものである請求項６〜１０のいずれかに
   記載の抗体。 １２、該適当な治療剤または映像マーカーが放射性同位
   体である請求項１１記載の抗体。 １３、分子量が約５０ｋｄから約８０ｋｄの範囲、等電
   点が約４．９から約６．５の範囲である腫瘍関連抗原に
   関連しており、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０
   ２２４によって産生されるモノクローナル抗体ＬＡ２０
   ２０７と反応性を有するタンパク質エピトープと反応性
   の抗体。 １４、分子量が約５０ｋｄから約８０ｋｄの範囲、等電
   点が約４．９から約６．５の範囲である腫瘍関連抗原に
   関連している、実質上、純粋な形のタンパク質エピトー
   プ。 １５、分子量が約５０ｋｄから約８０ｋｄの範囲、等電
   点が約４．９から約６．５の範囲である、ヒト肺腺がん
   上に存在する腫瘍関連抗原に対して特異性を有する抗体
   を産生するハイブリドーマ細胞系。 １６、該ハイブリドーマ細胞系がＡＴＣＣＨＢ１０２２
   ４である請求項１５記載のハイブリドーマ細胞系。 １７、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０２２４。 １８、請求項６〜１３項のいずれかに記載の抗体と、薬
   学的に許容し得る担体、希釈剤、または賦形剤とを含有
   する医薬組成物。 １９、請求項６〜１３項のいずれかに記載の抗体を温血
   動物に投与することからなる、該動物における疾患を治
   療または診断する方法。