JPH04502702A - ヒト癌に対する新規なモノクローナル抗体 - Google Patents

ヒト癌に対する新規なモノクローナル抗体

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト癌に対する新規なモノクローナル抗体本発明は、米国特許・商標局に１９８ ８年１２月２２日に提出された米国特許出願第２８９６３５号の一部継続出願で あり、その出願全体が参考文献としてここにとり込まれるものとする。
発明の技術分野 本発明は、ヒト癌細胞と反応する新規なモノクローナル抗体に関する。より詳細 には、本発明の抗体は結腸癌、乳癌、卵巣癌および肺癌のようなヒト癌の表面に 存在する糖脂質細胞膜抗原と反応するモノクローナル抗体である。この抗体は癌 細胞に対し高度に特異的であり、ある種の正常なヒト細胞とは低度の反応性を示 し、そしてリンパ腫、肉腫または黒色腫のような他の種類の腫瘍とは検出可能な 反応性を示さない。この抗体はさらに、それが結合する癌細胞の内部に取り込ま れる（インターナライズする）という利点をもっている。従って、本発明の抗体 は、例えばインターナリゼーションが望まれる抗体−薬物または抗体−毒素接合 体の抗体成分として、治療用途に特に有用である。
また、この抗体は悪性腫瘍の検出のような診断法にも適す。
発明の背景 癌関連抗原と反応するモノクローナル抗体は知られている［例えば、Ｌ、　Ｄ、 　Ｐａｐｓｉｄｅｒｏ、“モノクローナル抗体を使った癌の免疫学的監視におけ る最近の進歩”。
Ｓｅｍ１ｎ、Ｓｕｒｇ、０ｎｃｏ１．、　１　（Ｎ（Ｌ、４）、　Ｉ）、１７１ −８１　（１９８５）；　Ｊ。
Ｓｃｈｌｏｍら、“ヒト癌の管理におけるモノクローナル抗体の臨床的利用可能 性”、Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　Ａｄｖ、０ｎｃｏ１．、１９８５、　ｐ、１７０− １９２；　Ｗ、Ｈ，Ａｌｌｕｍら、、“悪性疾患の診断・治療におけるモノクロ ーナル抗体″、　Ｓｕｒｇ、Ａｎｎ、、　１８．　ｐ、４１−６４　Ｃ１９８６ ＞：およびＡ、　Ｎ、　Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、、　“モノクローナル抗体：癌治 療への応用可能性”、　Ｓｅｍ１ｎ、０ｎｃｏ１．。
１３（Ｎα、２）、　ｐ、１６５−１７９．　（１９８６）を参照されたい］。
これらの既知モノクローナル抗体は主に身体の特定器官に由来する特定の種類の ヒト癌（例えば、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、または他の胃腸癌）と反応しそ して、癌関連抗原（その本性は糖蛋白であるかまたは糖脂質である）と結合する ことができる［例えば、Ｌ、　Ｍ、　Ｆｉｎｋら、、“ヒト腫瘍抗原の同定およ び特性化のための診断試薬としてのモノクローナル抗体”、　Ｐｒｏｇ。
Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、、　９．　ｐ、１２１−１３３　（１９８４）を参照 されたい１゜例えば、特定の種類の癌に存在する糖蛋白抗原に結合するモノクロ ーナル抗体には、米国特許第４７３７５７９号（非小細胞肺癌に対するモノクロ ーナル抗体）、同第４７５３８９４号（ヒト乳癌に対するモノクローナル抗体） 、同′Ｍ４５７９８２７号（ヒト胃腸癌に対するモノクローナル抗体）、および 同第４７１３３５２号（ヒト腎臓癌に対するモノクローナル抗体）に記載される ものが包含される。しかしながら、モノクローナル抗体８７２．３は、数多くの 異なる癌において選択的に発現される分子量１０００ｋｄ以上の腫瘍関連癌胎児 性糖蛋白抗原を認識すると思われる。従って、８７２．３は８４％の乳癌、９４ ％の結腸癌、１００％の卵巣癌、および９６％の非小細胞肺癌と反応することが 示されている［Ｗ、　Ｗ、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、“モノクローナル抗体８７２． ３の研究により例示された臨床細胞学におけるモノクローナル抗体の応用”、Ａ ｃｔａ　Ｃｙｔｏｌ、。
１　（Ｎ（Ｌ５）、　ｐ、５３７−５５６　（１９８７）、およびＳｃｈｌｏｍ らに許可された米国特許第４６１２２８２号を参照されたいコ。
同様に、モノクローナル抗体ＫＣ−４は結腸癌、前立腺癌、肺癌および乳癌のよ うな多くの癌に発現される４００〜５００ｋｄはどの蛋白抗原を認識する［米国 特許第４７０８９３０号参照コ。Ｂ７２．３とＫＣ−４のどちらの抗体も、それ らが反応する癌細胞の内部に取り込まれないと思われる。
糖脂質抗原（ある種の腫瘍細胞と関連していると考えられる）と反応するモノク ローナル抗体も開示されている。例えば、Ｗ、　Ｗ、　Ｙｏｕｎｇら、“糖脂質 ガングリオ−Ｎ−）リオシルセラミドの２つの別個の立体部分（アシアロＧ　Ｍ 　ｚ　）に特異的なモノクローナル抗体の生産’、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　 １５０．１）、１００８−１０１９　（１９７９）には、Ｋｉｒｓｔｅｎマウス 肉腫ウィルスにより形質転換されたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞のマーカーとして確 立された細胞表面スフィンゴ糖脂質抗原である、アシアロＧＭ。
に特異的な２つのモノクローナル抗体の生産が開示されている。また、Ｂ、　Ｋ ｎｉｅｐら、“ホジキン病患者由来の細胞系に関するスフィンゴ糖脂質マーカー 、ガングリオトリオシルセラミド（アシアロＧＭり”、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、。
１３１（Ｎａ３）、　Ｉ）、１５９１−１５９４　（１９８３）および米国特許 第４５０７３９１号（ヒト黒色腫に対するモノクローナル抗体）を参照されたい 。
さらに、特定の種類の癌細胞に見出される糖脂質抗原と反応するモノクローナル 抗体には、Ｓ、　Ｔ、　Ｒｏｓｅｎら、　“ラット・モノクローナル抗体のパネ ルを使用したヒト小細胞肺癌分化抗原の分析”＊　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ。
４４、　ｐ、２０５２−２０６１　（１９８４）　（ヒト小細胞肺癌に対するモ ノクローナル抗体）、Ｎ、　Ｍ、　Ｖａｒｋｉら、“モノクローナル抗体により 特定されるヒト肺腺癌関連抗原”、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、　４４． 　ｐ、６８１−６８７　（１９８４）　（肺、胃および結腸のヒト腺癌、並びに 黒色腫に対するモノクローナル抗体）、および米国特許第５４７９８２７号（ヒ ト結腸腺癌に対するモノクローナル抗体）に記載されるものが包含される。また 、ヒト非小細胞肺癌、乳癌、および結腸癌の表面に発現される炭水化物抗原を認 識するＬ６モノクローナル抗体について記載している、Ｉ。
ＨｅｌｌＳｔｒＯｍら、“大部分のヒト癌と反応するＩｇＧ２ａ抗体、Ｌ６の抗 腫瘍作用”、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
８３、９．７０５９−７０６３　（１９８６）も参照されたい。Ｌ６抗体が反応 する抗原は癌細胞の内部に取り込まれないものである。
癌細胞に対する反応性を示す他のモノクローナル抗体が非常に必要とされている 。それは、診断や治療において、同一腫瘍塊に対して多数の異なるモノクローナ ル抗体の使用をしばしば必要とする多くの癌腫の抗原異質性に原因がある。さら に、広範な癌組織に対し高度の選択性を示すモノクローナル抗体は一般的でなく 、明らかにこの種の抗体はどれも有利であるだろう。
特にモノクローナル抗体の治療用途の分野において興味をそそるものとして、い わゆる“インターナライズ性”抗体、すなわち結合する腫瘍細胞の内部に取り込 まれ得る抗体が挙げられよう。この種の抗体は抗体−薬物または抗体−毒素接合 体が関わる腫瘍治療法に使用でき、その際抗腫瘍治療剤は抗体に連結されて腫瘍 部位に運搬され、そこで抗体がそれと反応する腫瘍関連抗原に結合して、そして 腫瘍部位へ抗腫瘍剤を“放出”する［例えば、Ｍ、　Ｊ、　Ｅｍｂｌｅｔｏｎら 、、“抗癌剤の抗体ターゲツティング”、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ　ｆｏｒＣａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐ ｙ、ｐ、３１７−３４４　（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　１９８５）を参照さ れたい］。腫瘍関連抗原に対する多くの抗体はそれらが結合する腫瘍細胞の内部 に取り込まれ得ないので、往々にして抗腫瘍剤は細胞内の作用部位に到達できな い。接合体の成分としてのインターナライズ性抗体の使用は、かかる接合体の抗 腫瘍活性を増強すると考えられる。
インターナライズ性抗体の例はり、　Ｌ、　Ｄｏｍｉｎｇｏら、。
“抗体−薬物接合体のターゲットとしてのトランスフェリンレセプター”、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１１２．　ｐ、２３８−２４７　（１９８５ ）に記載される抗−トランスフェリンレセプター抗体である。この抗体は腫瘍細 胞上に発現されるヒト・トランスフェリンレセプター糖蛋白と反応する。
しかしながら、トランスフェリンレセプター糖蛋白は正常組織にも発現されるの で、抗体−薬物または抗体−毒素接合体に抗−トランスフェリンレセプター抗体 を使用することは正常細胞に有意な毒性作用を及ぼしかねない。従って、腫瘍細 胞を選択的に死滅または抑制するためにこの抗体を用いることは疑問である。
従って、腫瘍細胞によって容易に取り込まれ、しかもある範囲の種類の癌細胞に 対し高度な選択性を示す、癌関連抗原反応性抗体が腫瘍治療において非常に有利 であろうことは明らかである。
発明の要約 本発明は、ある範囲のヒト癌に対し高度に選択的なインターナライズ性抗体を提 供する。より詳細には、（ＢＰＯ４により例示される）本発明の新規抗体はヒト 癌細胞の表面に存在する糖脂質細胞膜抗原に結合するモノクローナル抗体である 。この抗体は乳癌、肺癌、結腸癌、および卵巣癌に由来するような癌細胞に対し て高度に特異的であり、いくつかの正常ヒト細胞とは低度の反応性を示すにすぎ ず、リンパ腫、肉腫または黒色腫のような他の種類の腫瘍とは何ら検出可能な反 応性を示さない。さらに、本発明抗体はそれが結合する癌細胞の内部に取り込ま れ、それ故に、例えばインターナリゼーションが望まれる抗体−薬物および抗体 −毒素接合体の抗体成分として、特に治療用途に有用である。また、本発明抗体 は癌細胞の検出のためのインビトロまたはインビボ診断法において有用である。
図面の簡単な説明 第１図は、種々の濃度のＢＰＯ４−ＲＡ免疫毒素で処理したＨ２７０７肺癌細胞 のＤＮＡへのチミジン取り込みの阻害パーセントを示す。Ｌ　６−ＲＡは非イン ターナライズ性陰性対照である。この図面は免疫毒素のインターナリゼーション を例示するものである。
第２図は、種々の濃度のＢＲ６４−ＲＡ免疫毒素で処理したＨ３３９６乳癌細胞 のＤＮＡへのチミジン取り込みの阻害パーセントを示す。Ｐｌ、１７−ＲＡは非 インターナライズ性陰性対照である。この図面は免疫毒素のインターナリゼーシ ョンを例示するものである。
第３図は、種々の濃度のＢＰＯ４−ＲＡ免疫毒素で処理したＣ結腸癌細胞のＤＮ Ａへのチミジン取り込みの阻害パーセントを示す。Ｐｌ、１７−ＲＡは陰性対照 として使用した。この図面は免疫毒素のインターナリゼーションを例示するもの である。
第４図は、種々の濃度のＢＲ６４−ＲＡ免疫毒素で処理したＲＣＡ結腸癌細胞の ＤＮＡへのチミジン取り込みの阻害パーセントを示す。Ｐｌ、１７−ＲＡは陰性 対照として使用した。この図面は免疫毒素のインターナリゼーションを例示する ものである。
第５図は、種々の濃度のＢＲ６４−ＲＡ免疫毒素で処理したＪｉＪｏｙｅ細胞の ＤＮＡへのチミジン取り込みの阻害パーセントを示す。Ｌ　６−ＲＡは非インタ ーナライズ性陰性対照である。免疫毒素のインターナリゼーションは起こらなか った。
第６図は、種々の濃度のＢＲ６４−ＲＡ免疫毒素で処理した正常ヒト線維芽細胞 のＤＮＡへのチミジン取り込みの阻害パーセントを示す。Ｐｌ、１７−ＲＡは陰 性対照として使用した。免疫毒素のインターナリゼーションは起こらなかった。
第７図は、パルス−追跡実験後１時間以内の乳癌細胞による＋１″Ｉ−標識ＢＲ ６４抗体の取り込みを示す。
測定は細胞培養基中ニー圓−１細胞表面上ニー・−１および細胞内部（細胞内） ニーローの標識抗体について行った。
第８図は、パルス−追跡実験後６時間以内の乳癌細胞による＋ｔｓ　Ｉ−標識Ｂ Ｒ６４抗体の取り込みを示す。
測定は細胞培地基中ニー圓−１細胞表面上ニー・−１および細胞内部（細胞内） ニーローの標識抗体について行った。
第９図は、ＢＰＯ４−アドリアマイシン接合体で処理したＨ３３９６乳癌細胞の ＤＮＡへのチミジン取り込みの阻害パーセントを示す。有意な細胞毒性作用が示 された。
第１０図は、種々の培養癌細胞系への本発明のＢＲ６４抗体の結合を示す。末梢 血白血球（ＰＢＬ）は陰性対照として使用した。ＢＰＯ４で染色した細胞の明る さくＬＦＥ）　対対照抗体で染色した細胞の明るさの比はＦＡＣ３により測定し た。
第１１図は、既知の糖脂質抗原へのＢＲ６４抗体の結合を検出するためのＥＬＩ ＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。
発明の詳細な説明 ここに記載の本発明がよりよく理解されるよう、以下で詳しく説明することにす る。
本発明は、ヒト癌細胞に高度に特異的な新規モノクローナル抗体に関する。より 詳細には、この抗体は、乳癌、肺癌、卵巣癌および結腸癌のような、ある範囲の 癌と反応するが、いくつかの正常ヒト組織とは比較的低度の反応性を示すにすぎ ず、黒色腫、肉腫またはリンパ腫のような他の種類の腫瘍とは何ら検出可能な反 応性を示さない。
放射性標識ターゲット癌細胞とここに記載の抗体との免疫沈降実験、次で分離用 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で は、この抗体が結合する癌細胞上の細胞膜抗原は糖蛋白でないことが示された。
むしろ、既知の糖脂質抗原を用いたＥＬＩＳＡ結合実験では、この抗体はＬｅｗ ｉｓ　Ｙ　（ＬｅＹ）炭水化物抗原［例えば、Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ。
“癌関連炭水化物抗原”、　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、ｒｍｍｕｎｏｌ、、２．　ｐ。
１０３−１２６　（１９８４）および１．　Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら１．“ヒト肺 癌に対して生成されたモノクローナルマウス抗体”、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、 　４６．　ｐ、３９１７−３９２３　（１９８６）を参照］、およびＬｅＹ−関 連Ｈ２糖脂質抗原［例えば、Ｊ、ＬｌＭａｇｎａｎｉ、　”炭水化物に対するマ ウスおよびラット・モノクローナル抗体”。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１３８．　ｐ、４８４−４９１（１９８ ７）を参照］に結合することが示された。このデータは、以下で論する他の証拠 と共に、本発明抗体が新規な乳癌性糖脂質抗原の複合エピトープ（このエピトー プの一部はＬｅＹ炭水化物鎖から成る）を認識することを示している。
さらに、放射性標識抗体または抗腫瘍剤（例、薬物、毒素）を結合させた抗体を 用いた実験から、本発明抗体はそれが結合する癌細胞によって容易にかつ速やか に取り込まれることが判明した。
本発明のモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ　１ｓｔｅｉｎによっ て最初に紹介されて、十分に確立されたハイブリドーマ技術［Ｍ、　Ｋｏｈｌｅ ｒおよびＣ，Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ。
“予め定められた特異性を有する抗体を分泌する融合細胞の連続培養”、　Ｎａ ｔｕｒｅ、　２５６．　ｊ）、４９５−４９７　（１９７５）コを用いて生産で きる。また、Ｊ、　Ｐ、　Ｂｒｏｗｎら、“モノクローナル抗体によるヒト黒色 腫関連抗原ｐ９７の構造特性決定”、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２７（Ｎａ ２）、　ｐ、５３９−５４６　（１９８１）；　Ｊ、　Ｐ、　Ｂｒｏｗｎら、“ モノクローナル抗体との免疫沈降により同定された正常および悪性ヒト細胞の蛋 白抗原”。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５５．　ｐ、４９８０−４９８３　（１９８０） 　＋　Ｍ、Ｙｅｈ　ら。
“モノクローナル抗体により同定されたヒト黒色腫の細胞表面抗原”、　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７６　（Ｎα６）。
ｐ、２９２７−２９３１　（１９７９）　；およびＭ、　Ｙｅｈら、、　“ガン グリオシド画分に存在し、ヒト黒色腫により共有される細胞表面抗原”、　Ｉｎ ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　２９．　ｐ、２６９−２７５　（１９８２）を参照さ れたい。
これらの技術には、動物（例、マウス）内で所望の免疫応答（すなわち、抗体） を誘起するために、動物への免疫原（例えば、抗原を担持する細胞または細胞抽 出物、もしくは精製抗原）の注射が含まれる。十分な時間の経過後、その動物の 膵臓、リンパ節または末梢血のいずれかから抗体産生性リンパ球を採取する。
好ましくは、リンパ球は膵臓から得られる。次に、牌リンパ球を通常ポリエチレ ングリコール（ＰＥＧ）のような融合剤の存在下にミエローマ細胞系と融合させ る。多くのミエローマ細胞系の任意のものが標準技法によって融合相手として使 用できる；例えば、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６ ５３またはＳｐ２１０−Ａｇ１４　ミエローマ細胞系。これらのミエローマ系は メリーランド州ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシタン（ ＡＴＣＣ）から入手できる。
得られる所望のハイブリドーマを含めた細胞を次に（未融合親ミエローマまたは リンパ球細胞が終局的に死滅する）ＨＡＴ培地のような選択培地で増殖させる。
ハイブリドーマ細胞のみが生き残り、制限条件下で増殖させて単離クローンを得 ることができる。ハイブリドーマの上溝を所望の特異性を有する抗体の存在につ いて、例えば免疫化に用いた抗原を用いるイムノアッセイ技法によりスクリーニ ングする。次に、陽性クローンを限界希釈条件下でサブクローニングし、そして 生産されたモノクローナル抗体を単離することができる。これらの方法により作 製されたハイブリドーマは当分野で知られた技法を用いてインビトロまたはイン ビボ（腹水液中）で増殖させることができる［一般的には、Ｌ、　Ｍ、　Ｆｉｎ ｋら、、前出、ｐ、　１２３．第６−１図を参照されたい］。モノクローナル抗 体の一般的な精製方法には硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィ ー、およびアフィニティークロマトグラフィーが包含される［例えば、Ｈ，ＺＯ ｌａら、、“モノクローナルハイブリドーマ抗体の生産・特性決定技術“、　Ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。
Ｊ、Ｇ、Ｒ，Ｈｕｒｅｌｌ　（編）、　ｐ、５１−５２　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ　 １９８２）を参照されたい］。
好適な実施態様によれば、ＢＲ６４と呼ばれる本発明抗体は、免疫原として乳癌 細胞系３３９６を使って以下で述べるハイブリドーマ技法により生産された。
以下で述べるようにして作製されそしてＢＲ６４抗体を産生ずるＢＲ６４ハイプ リドーマは１９８８年１１月３日にメリーランド州ロックビル、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そこで次のように同定された： ＢＲ６４受託番号：ＨＢ　９８９５ ＢＲ６４抗体はＩｇＧ１サブクラスのマウス抗体である。この抗体は異なる種類 の器官の広範なヒト癌細胞、例えば、乳房、肺、結腸、胃、すい臓、および卵巣 の腫瘍並びに種々の肺癌、乳癌および結腸癌からの細胞系と強い反応性を示す。
さらに、ＢＲ６４抗体は他の種類の腫瘍細胞、例えばＴ細胞リンパ腫細胞系ＣＥ ＭおよびＭＯＬＴ−４、Ｂ細胞リンパ腫細胞系Ｐ３）ｒＲ−１、黒色腫細胞また は肉腫細胞に対しては何ら検出可能な結合を示さない。
その上本発明抗体は身体の大部分の主要器官例えば腎臓、膵臓、肝臓、皮膚、肺 、乳房、結腸、脳、甲状腺、リンパ節または卵巣からの大部分の正常ヒト組織例 えば線維芽細胞、内皮細胞または上皮細胞に対して免疫組織学的に検出しつる結 合を示さない。この抗体は末梢血白血球とも骨髄幹細胞とも反応しない。この抗 体は次のようなある種の正常組織とは反応する、すなわち胃および食道の上皮細 胞、すい臓の豚房細胞、扁桃および精巣の一時的細胞。また、ＮＩＨ（国立衛生 院）で行われた結合実験の一つにおいては、ＢＲ６４抗体は唾液腺からの細胞お よび十二指腸のバネト細胞と反応するように思われた。ＮＩＨで行われた別の免 疫組織学的実験では、この抗体は正常心臓の６つのサンプルのうち３つからの毛 細管を染色した。しかしながら、本発明者らの実験室で行った実験では３つの心 臓においてこのような染色は見られなかった。
ある種の正常組織とのこの低度の反応性を考慮しても、本発明抗体は正常細胞と 比べて腫瘍細胞に対するその高度な特異性のために大抵の他の既知抗腫瘍抗体よ りｔ優れている［例えば、Ｋ、　Ｅ、　Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“腫瘍治療への 免疫学的方法：モノクローナル抗体、腫瘍ワクチン、および抗イデイオタイプ、 　Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ敗史」μし迫■江匣」展」ユ田徂牡弦ユＬ膓山「１国ユ 回Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ｑｕａｓｈ／Ｒｏｄｗｅｌｌ　（編）、　ｐ、２４−２８ 　（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、ｅ印刷中）、およびに、Ｄ、Ｂａ ｇｓｈａｗｅ、“腫瘍マーカー：我々はここからどこへ行くか”、　Ｂｒ、Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ。
４８、　ｐ、１６７−１７５　（１９８３）を参照されたい］。
本発明は、上記のＢＲ６４抗体およびこの抗体の活性な抗原結合領域を含有する その任意の断片、例えばＦａｂ、Ｆ　（ａｂ　’）！、およびＦｖ断片を包含す るとのが理解されるべきである。かかる断片は当分野で確立された技法を用いて ＢＲ６４抗体から調製することができる［例えば、Ｊ、　Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら 、　“異なるラット夏ｇＧサブクラスのモノクローナルＩｇＧから加水分解断片 を調製するための最適条件”、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、。
１２１、　ｐ、６６３−６６９　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８６　 ）を参照されたいコ。
さらに、本発明は、ＢＲ６４抗体と同一の抗原決定基またはエピトープに結合で き、その部位での結合についてＢＲ６４抗体と競合しうる抗体をも包含する。
これらにはＢＲ６４抗体と同じ抗原特異性を存するが、種起源、アイソタイプ、 結合アフィニティ、または生物学的機能（例、細胞毒性）の点で相違する抗体が 包含される。例えば、ＢＲ６４抗体の抗原結合領域を有する本発明抗体のクラス 、アイソタイプおよび他の変異型は、当分野で知られた組換えクラススイッチお よび融合技術を用いて調整することができる［例えば、Ｐ、　Ｔｈａｍｍａｎａ ら、、“ハイプリドーマにおけるＩｇＭからＩｇＧへの免疫グロブリン重鎮クラ ススイッチ”。
Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３．　ｐ、６１４　（１９８３）；　Ｇ、５ ｐｉｒａら、。
“サブセレクションおよびＥＬＩＳＡアッセイによるモノクローナルクラススイ ッチ変異型の同定”、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、　７４．９．３０７−３１５　（１９８４）　； 　Ｍ、Ｓ、Ｎｅｕｂ−ｅｒｇｅｒら、“新規エフェクター機能を有する組換え抗 （１９８６）を参照されたい］。従って、ＢＲ６４抗体と同じ結合特異性を有す るキメラ抗体または他の組換え抗体（例えば、抗体がリンフ才力インのような第 二蛋白と結合した融合蛋白）は本発明抗体の定義の範囲内に含まれる。
また、ＢＲ６４抗体の抗原結合領域を有する本発明抗体の変異型は、Ｇ、５ｐｉ ｒａら、“同胞選択およびＥＬＩＳＡアッセイによるモノクローナルクラススイ ッチ変異型の同定”、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　７４．　ｐ、 ３０７−３１５（１９８４）に記載されるようにして、自然界で起こるクラスス イッチ突然変異体の選択によって得ることもできる。かかる変異型も本発明抗体 の定義の範囲内である。
これらの方法に従って、ＢＰＯ４のＩｇＧ２ａ変異型（以後ＢＲ６４，６０と呼 ぶ）が得られた。ＢＰＯ４，６０の可変部はもとのＢＰＯ４の可変部と同じであ り、従ってこれら２つの抗体は同一の特異性を有する。しかしながら、ＢＰＯ４ はときどき弱いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞障害）を示すが、このＩｇＧ２ ａ変異型は顛著なＡＤＣＣとＣＤＣ（細胞依存性細胞障害）を有する。ＢＰＯ４ のＩｇＧ２ａ変異型を産生ずるＢＰＯ４，６０ハイブリドーマは１９８９年１１ 月７日にＡＴＣＣに寄託され、そこで次のように同定された： ＢＰＯ４，６０受託番号：ＨＢ　１０２９２本発明抗本発明上れが結合する抗原 を単離および特性決定するのに使用できる。従って、ＢＰＯ４またはＢＰＯ４， ６０はこの抗体によって認識されるエピトープを同定および特性決定するための 、そしてさらにそれが反応する細胞膜抗原を特定するためのプローブとして使用 できる［例えば、Ｅ、　Ｎｕｄｅｌｍａｎら、。
“モノクローナル抗体４．２によって特定されるヒト黒色腫関連ガングリオシド 抗原の特性決定”、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、　２５７（Ｎ（Ｌ、１）、　Ｉ）、１２７５２−１２７５６　（１ ９８２）、およびＳ。
Ｈａｋｏｍｏｒｉ、“腫瘍関連炭水化物抗原”、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　。
２、　ｐ、１０３−１２６　（１９８４）を参照されたい］。
先に述べたように、ＢＲ６４抗体を用いた研究でその抗原が糖蛋白ではなく糖脂 質であることが示された。
そこで、ＢＲ６４抗体をＥＬＩＳＡアッセイで既知炭水化物構造を有する種々の 固定化糖脂質に対するその反応性について試験し、そしてＬ　ｅ　’　［Ｆｕｃ ａｌ−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃａｌ−３）Ｇ１ｃＮＡｃｌ抗原およびＨ２［Ｆ ｕｃａｌ−２Ｇａｌβｌ−４ＧｌｃＮＡｃ］糖脂質に結合することが分かった。
Ｌｅ’抗原と反応することが当業上知られているモノクローナル抗体はほかにも 存在することに注意されねばならない。しかし、それらの抗体のどれも本発明抗 体が示す腫瘍特異性およびインターナリゼーション能力を示すとは記載されてい ない。従って、本発明抗体はエピトープの一部がＬｅ’抗原から成る新規な乳癌 性抗原上の複合エピトープを認識すると思われる。ここに本発明抗体を開示する ことによって、本発明者らはこの新規抗原を得るための手段を提供する。それゆ え本発明は（ＢＰＯ４が反応するエピトープ以外のエピトープも含めた）、この 新規抗原上の任意の抗原決定基またはエピトープに結合する抗体を包含するもの である。
また、本発明のＢＲ６４抗体の抗イディオタイプ抗体も本発明の範囲内に包含さ れる。これらの抗イデイオタイプ抗体は免疫原としてＢＲ６４抗体を用いて生成 でき、腫瘍に対する体液性応答を検出する診断目的のために、および患者の抗腫 瘍応答を誘発する治療上の適用例えば、ワクチンにおいて有用である［例えば、 Ｇ、　Ｔ、　Ｎｅｐｏｍら、“抗イデイオタイプ抗体および特定の腫瘍免疫の誘 導”、　Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅ＋ｖｓ。
６、　ｐ、４８７−５０１　（１９８７）を参照されたいコ。
本発明のモノクローナル抗体はさらに、この抗体が特異的に結合する抗原を有す るヒト癌の検出に、インビトロおよびインビボの両方において診断用途に有用で ある。インビトロ診断法には腫瘍細胞（例えば、ヒト組織、細胞または切除した 腫瘍標本）の免疫組織学的検出、または腫瘍関連抗原（例えば、血液試料または 他の生物学的液体中の抗原）の血清学的検出が包含される。
免疫組織化学的手法には、組織標本のような生物学的標本を本発明抗体と接触さ せ、次に標本の抗原に複合体形成した抗体の存在の検出が包含される。かかる抗 体−抗原複合体の形成はその組織に癌細胞か存在することを示す。標本上の抗体 の検出は、免疫酵素法、例えばイムノペルオキシダーゼ染色法またはアビジン− ビオチン（ＡＢＣ）法、もしくは免疫蛍光法のような当分野で知られた技法を用 いて達成できる［例えば、Ｄ、　Ｒ，Ｃ１ｏｃｃａら、、“モノクローナル抗体 を使用する免疫組織化学的手法”、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１２１． 　ｐ、５６２−５７９（１９８６）　；　１．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“ヒト肺 癌に対して生成されたモノクローナルマウス抗体”、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ。
４６、　ｐ、３９１７−３９２３　（１９８６）　；およびＪ、Ｗ、Ｋｉｍｂａ ｌｌ　（編）。
Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（第２版）、　９． １１３−１１７（Ｍｌ１３−１１７（Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、　１９８６）を参照され たい］。例えば、イムノペルオキシダーゼ染色は、ＢＲ６４抗体と肺癌、乳癌、 結腸癌および卵巣癌との反応性、並びにこの抗体と正常ヒト組織標本との反応性 の相対的欠如を立証するために、以下の実施例２に記載するようにして使用され た。
血清学的診断法は、癌にかかっていると思われる患者の血清または他の生物学的 液体中に分泌または“放出′された腫瘍関連抗原の検出および定量化を含むもの である。かかる抗原は液体試料中の抗原の存在を検出するために、“放出”され た抗原と反応性の抗体が用いられるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素 結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような当分野で知られた技法を 用いて体液中で検出できる［例えば、Ｍ、Ｕｏｔｉｌａら、、“ヒトＡＦＰに対 するモノクローナル抗体を用いる２部位サンドイッチＥＬＩＳＡ”、　Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　４２．　ｐ、１１　（１９８１）およびＷ、Ｈ ，ＡｌＪｕｍら、、　前出、　９．４８−５１を参照されたい］。
従って、ここに開示されるＢＲ６４抗体を用いるこれらのアッセイは、ＢＲ６４ 抗体が反応する糖脂質抗原を生物学的液体において検出するために、従って患者 におけるヒト癌を検出するために用いることができる。
従って、前述のことから、本発明抗体は抗原−抗体反応を伴う多くのアッセイに 使用できることが明らかである。これらのアッセイには標準ＲＩＡ法（液相と固 相の両方）、ならびにＥＬ　ＩＳＡアッセイ法、免疫蛍光法、および他の免疫細 胞化学的アッセイが包含されるが、それらに限定されない［例えば、Ｋ、５ｉｋ ｏｒａら。
（編）、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ｐ、３２−５２　 （ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　１９ ８４）を参照されたいコ。
本発明はさらに上記アッセイを実施するための診断用キットをも包含する。１つ の実施態様においては、診断用キットはＢＰＯ４（またはＢＰＯ４，６０）モノ クローナル抗体、およびこの抗体の特異的結合相手と検出可能なシグナルを発す ることのできる標識とから成る接合体を含有する。試薬には緩衝剤および蛋白安 定剤（例、多糖類）のような補助剤も包含されつる。
診断用キットは、必要に応じて、バックグラウンド障害を減らすための試薬、対 照試薬、またはテストを実施するだめの器具もしくは容器を含めて、シグナル発 生系の他の成分をさらに含有することかできる。別の実施態様においては、診断 用キットは本発明のＢＰＯ４（またはＢＰＯ４，６０）モノクローナル抗体と検 出可能なシグナルを発することのできる標識とから成る接合体を含有する。先に 述べたような補助剤も存在しつる。
本発明の抗体はヒト癌を検出するためのインビボ診断用途にも有用である。かか る方法の一つには腫瘍画像形成法によるインビボ腫瘍検出が包含される。
この方法によれば、本発明抗体またはその断片、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’ ）ｚが検出可能なシグナルを発する適当な画像形成試薬で標識される。使用でき る画像形成試薬の例には、限定するものではないが、＋３１１、Ｉｌｌ　Ｉ　ｎ 　Ｓ＋ｚｓ　Ｉ　、　ＩＩｓ″Ｔｃ、３２ｐ、１２８Ｉ、３）（および１４Ｃの ような放射性標識、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、並びに ルシフエリア（ｌｕｃｉｆｅｒｉａ）のような化学発光物質が包含される。当分 野で知られた技法を用いて、抗体をかかる試薬で標識することができる。例えば 、抗体の放射性標識化に関する技法については、Ｗｅｎｓｅｌ　ａｎｄ　Ｍｅａ ｒｅｓ、　Ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ　ａｎｄ　Ｒａｄｉｏｉｍ ｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、　Ｅｓｅｖｉｅｒ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８３）を参照されたい［また、Ｄ、　Ｃｏ１ｃｈｅｒ ら、“無胸腺症マウスにおけるヒト癌異種移植片の位置確認のための放射性薬剤 としてのモノクローナル抗体の使用”、　Ｍｅｔｈ、ＥｎＺｙｍｏｌ、、　１２ １．　ｐ、８０２−８１６　（１９８６）を参照されたいコ。
放射性標識抗体の場合は、抗体を患者に投与し、抗体が反応する抗原を担持する 腫瘍にその抗体を局在化させて、例えばガンマカメラまたは放射形断層撮影法を 使って放射性核走査のような既知技法によりインビボで検出または“画像形成” を行う［例えば、Ａ、　Ｒ。
Ｂｒａｄｗｅｌｌら、、“抗体イメージングの進展”、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　 Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ｒ。
Ｗ、　Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、　ｐ、６５−８５　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ　１９８５）を参照されたい］。抗体は製剤的に許容しうる担体、例えば 水、食塩水、リンゲル液、ハンクス液、または非水性担体例えば固定油中で患者 に投与される。担体は緩衝剤または防腐剤のような抗体の等張性および化学安定 性を高める物質も含みつる。抗体製剤は例えば、腫瘍ターゲット部位の視覚化を 可能にするのに十分なガンマ放射を与えるに足る投与量で静脈内に投与される。
抗体を腫瘍ターゲットに局在化できるようにするためには、抗体の投与と画像シ グナルの検出の間には十分な時間を置くべきである。腫瘍画像形成の一般的論議 については、Ｗ、　Ｈ，Ａｌ　ｌｕｍ、　ｅｔ、　ａｌ、　、前出、　９．５１ −５５を参照されたい。
本発明のＢＲ６４Ｒ６４抗多くのインビボ治療用途をもっている。第一に、この 抗体はヒト癌を治療するための適当な治療剤と共に使用できる。例えば、抗体は 治療剤を癌部位にデリバリ−するために治療薬物または毒素に接合または連結さ せることかできる。このような治療剤を抗体に結合させる技法はよく知られてい る［例えば、Ｒ１Ａｒｎｏｎら、“癌治療における薬物のイムノターゲツティン グのためのモノクローナル抗体”。
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅ ｒａｐｙ、　Ｒ，Ａ。
１’１ｅｉｓｆｅｌｄら　（編）、ｐ、２４３−２５６　（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ ５ｓ、Ｉｎｃ。
１９８５）；　Ｋ、Ｅ、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら０．“薬物デリバリ−用抗体“。
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｒａｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、（第２版）、Ｊ、Ｒ，Ｒ ｏｂｉｎｓｏｎら、（編）、ｐ、６２３−６５３　（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅ ｒ、１９８７）；　Ｐ、Ｅ。
Ｔｈｏｒｐｅ、“癌治療における細胞毒剤の抗体運搬体：評論”、　Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂＯｄｉｅＳ　’　８４：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎ ｄＣｌｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら　（ 纒）、ｐ、４７５−５０６　（１９８５）；およびＰ、　Ｅ、　Ｔｈｏｒｐｅら 、“抗体−毒素接合体の調製および細胞毒特性”、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、 、　６２゜ｐ、１１９−１５８　（１９８２）を参照されたい］。本発明のＢＲ ６４Ｒ６４抗それが結合する癌細胞内に容易に取り込まれ、従って治療剤を細胞 内作用部位へデリバリ−できるので、治療用接合体として使用するのに特に適し ている。
また、本発明抗体は、腫瘍部位に局在した場合に、数細胞直径の死滅をもたらす 高エネルギー放射物、例えば＋３１１のようなラジオアイソトープに結合させる ことができる［例えば、Ｓ、　Ｅ、　０ｒｄｅｒ、“癌治療における放射性標識 抗体の分析、結果、および治療用途の将来の展望”、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃ−（Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８５）を参照されたいコ。別の実施態様によれば、ＢＲ６ ４はり、　Ｍ、　Ｓｅｇａｌの米国特許第４６７６９８０号に記載されるように 第二抗体に接合させて、腫瘍細胞治療用の抗体異種接合体を形成することもでき る。
本発明のＢＲ６４Ｒ６４抗らに別の治療用途には、プロドラッグを細胞毒性薬物 に転換しうる酵素への（例えば、組換えＤＮＡ技術による）その接合または連結 、およびプロドラッグを腫瘍部位で細胞毒性薬物に転換するための抗体−酵素接 合体とプロドラッグとの併用が包含される［例えば、Ｐ、　５ｅｎｔｅｒら、、 “抗体−アルカリホスファターゼ接合体とエトポシドホスフェートとの併用によ る抗腫瘍作用”、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５．　ｐ、４８４２−４８４６　（１９８８）を参照され たい］。
ＢＲ６４Ｒ６４抗らに他の治療用途には、癌患者の骨髄から腫瘍細胞を除くため の、補体の存在下でのまたは抗体−薬物もしくは抗体−毒素接合体の一部として の、その使用が包含される。この方法によれば、自己由来の骨髄が抗体処置によ り生体外に排出され、そして患者に骨髄が注入される［例えば、Ｎ、　Ｋ、　Ｃ ，Ｒａｍ５ａｙら。
“モノクローナル抗体を用いた骨髄排出”、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。
さらに、先に述べた本発明のキメラまたは他の組換えＢＲ６４Ｒ６４抗療に使用 できる。例えば、抗腫瘍活性を有する第二の蛋白例えばリンフ才力インまたはオ ンコスタチンの少なくとも機能的に活性な部分に結合されたＢＲ６４Ｒ６４抗な くとも抗原結合領域を含有する融合蛋白がヒト癌のインビボ治療に使用できる。
さらに、ＢＲ６４の抗原結合領域がヒトＦｃ領域、例えばＩ　ｇＧ　Ｌに結合し たキメラＢＲ６４抗体は抗体依存性細胞性細胞障害または補体媒介細胞障害を促 進するのに使用できる。さらに、当分野で知られた組換え技術を用いて、抗体の 結合特異性の１つがＢＲ６４のものである二特異的抗体を作製することができる ［例えば、米国特許第４４７４８９３号を参照されたいコ　。
さらに、クラス−スイッチ変異型のようなりＲ６４抗体の他の変異型も治療に使 用できる。例えば、ここに開示したＩｇＧ２ａ変異型である、ＢＲ６４，６０は その特定のサブクラスによってＡＤＣＣおよびＣＤＣを促進することができる。
最後に、ＢＲ６４Ｒ６４抗イデイオタイプ抗体は能動腫瘍免疫および腫瘍治療に おいて使用できる［例えば、Ｋ、　Ｅ、　Ｈｅｍ、　ｌｓｔｒｏｍら、“腫瘍治 療の免疫学的方法：モノクローナル抗体、腫瘍ワクチン、および抗イデイオタイ プ”、　Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、前 出、　ｐ、３５−４１を参照されたいコ。
従って、本発明はヒト癌を治療するための医薬組成物、混合物、および方法を包 含することが明らかである。例えば、本発明は、医薬的に有効な量のＢＲ６４抗 体および製剤上許容しうる担体を含有するヒト癌治療用の医薬的組成物を包含す る。この種の組成物は未修飾形態の、治療剤（例、薬物、毒素、酵素、または第 二抗体）に接合した形態の、組換え形態（キメラまたは二特異的ＢＲ６４）の、 もしくは変異型の、ＢＲ６４抗体を含有しつる。本組成物は癌を治療するための 他の抗体または接合体（例、抗体カクテル）をさらに含有しうる。
本発明の抗体組成物は通常の投与方法により投与でき、例えば、限定するもので はないが、静脈内、腹腔内、経口、リンパ内投与、または腫瘍への直接投与が含 まれる。静脈内投与が好適である。
本発明の抗体組成物は溶液剤、懸濁剤、錠剤、火剤、粉剤、坐剤、ポリマーマイ クロカプセル剤、微小胞剤、リポソーム、および注射または注入用の溶液剤を含 む多種の剤形であることができるがそれらに限定されない。好適な剤形は投与様 式および治療用途に応じて決まる。
また、抗体組成物は好ましくは当分野で知られた慣用の製剤上許容しうる担体お よび補助剤、例えば、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン 、緩衝物質（例８　リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、 および塩類または電解質（例、硫酸プロタミン）をも含有する。
本発明組成物の最も有効な投与様式および投薬療法は、病気の重症度および経過 、患者の健康状態および治療応答、並びに主治医の判断の如何による。従って、 本組成物の投与量は個々の患者に対し滴定されるべきである。それでも、本発明 の抗体組成物の有効投与量は約１〜約２０００ｍｇ／ｒｄの範囲でありうる。
ここに記載の本発明のより完全なる理解のために、以下の実施例を掲げる。これ らの実施例は例示するためのものであって、いかなる場合にも本発明の範囲を制 限するものと解釈されるべきでないことは理解されるべきである。
実施例１ ＢＲ６４モノクローナル抗体の調製 本発明のＢＲ６４モノクローナル抗体は、先に　Ｍ。
Ｙｅｈら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　（１９７９） 、前出、およびＭ、　Ｙｅｈら、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　（１９８２）、 前出、に記載されるハイブリドーマ融合技術を用いて生産された。簡単に述べる と、生後３力月のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ヒト乳癌由来の３３９６またはＨ３３ ９６と呼ばれる外植培養細胞を免疫原として用いて免疫した。マウスは４度注射 を受けた、すなわち、最初の３度の場合にはマウスは１回の腹腔内注射と１回の 皮下注射（マウス上の４つの個所で分けて注射した）を受けた。４度目の場合は マウスに１回の腹腔内注射のみを与えた。
それぞれの場合に注射した細胞の合計数は約１０”細胞であった。最終免疫の３ 日後、膵臓を取り出して牌細胞をＮ５−１培地に浮遊させた。次に牌細胞をポリ エチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下にＮ５−１マウスミエローマ細胞と融合 させ、この細胞浮遊液をＭ。
Ｙｅｈら、前出、に記載されるようにして選択ＨＡＴ培地を入れたマイクロタイ ターウェルで増殖させた［また、Ｇ、　ＫｏｈｌｅｒおよびＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．　ｐ。
４９５−４９７　（１９７５）およびＥｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６．　 ｐ、５１１−５１９（１９７６）を参照されたい］。この混合物を培地に接種し て単一の融合細胞またはクローンから生ずる低密度培養物を形成させた。
次に、これらのハイブリドーマ培養物からの上清を、乳癌細胞系３３９６および 線維芽細胞系に対する直接結合活性について、Ｊ、　Ｙ、　Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ ら、“酵素標識第二抗体を用いてモノクローナル抗体の生産をスクリーニングす るための酵素結合イムノソルベントアッセイ”。
アッセイと類似したＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングした。
このアッセイによれば、抗原（スクリーニングされる抗体がこの抗原と反応する ）をマイクロタイタープレートに固定し、そして次にハイブリドーマ上清とイン キュベートする。上清が所望の抗体を含有する場合には、その抗体は固定化され た抗原に結合して、抗−免疫グロブリン抗体−酵素接合体およびその酵素に対す る基質（光学濃度の測定可能な変化を招来）の添加により検出される。本実験に おいては、乳癌細胞または対照線維芽細胞を９６−ウェル組織培養プレート（Ｃ ｏｓｔａｒ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）に分配し、湿潤３７℃インキュベー ター（５％Ｃ○２）内で一晩インキユベートした。次に、細胞を新たに調製した １、０％グルタルアルデヒド１００μｍ　（最終ウェル濃度０．５％）で固定し 、室温で１５分間インキュベートし、次に１　×ＰＢＳで３回洗った。次に、細 胞をＰＢＳ中の５％ＢＳＡで３０分間ブロックし、再度ＰＢＳで３回洗った。
そこでハイブリドーマ培養物からの上清を１００μｍ／ウェルで加え、ウェルを 室温で１時間インキュベートし、そして細胞をＰＢＳで３回洗った。次に、０． １％ＢＳＡおよびＰＢＳ中に希釈したヤギ抗〜マウスセイヨウワサビペルオキシ ダーゼ（Ｚｙｍｅｄ、　ＣＡ）を１０’　０μｌ／ウエルの濃度まで加えた。こ の反応混合物を室温で１時間または３７°Ｃで３０分間インキュベートし、細胞 をＰＢＳで３回洗った。次に、０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を１００μｌ ／ウエルで加え、そしてプレートを暗中にて室温で５〜４５分間インキュベート Ｌ、た。細胞への抗体結合は、１０〜２０分以内に起こるウェル内の色の変化に より検出した。反応を１００μｌ／ウェルＨＩＳＯ，の添加により停止させ、吸 光度を４９０ｎｍでＤｙｎａｔｅｃｈ　（Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）Ｍｉ ｃｒｏｅｌｉｓａ自動読み取り話中で読み取った。
このアッセイは固定化抗原として完全細胞または精製した可溶性抗原もしくは細 胞抽出物を用いて実施できることに留意すべきである。可溶性抗原または細胞抽 出物を抗原として使用する場合は、初めにその抗原をＰＢＳ中５０μｍ／ウェル でプレートに加え、そしてプレートを室温で一晩インキユベートしたのちアッセ イを始める。完全細胞を抗原として使用する場合は、それらを新鮮な状態でまた は固定化した後に使用した。
どちらの場合にも、初めに培地中に１００μｍ／ウェルで１０４細胞をまき、３ ７℃インキュベーター（５−％Ｃｏ、）内で一晩インキユベートした。
このようにして、乳癌細胞系には結合するか１、線維芽細胞系には結合しない抗 体を産生ずるハイブリドーマを選択し、クローン化し、インビトロ増殖させそし て抗体特異性についてさらに調べた。ヒト乳癌反応性抗体を産生ずるこれらのハ イブリドーマを再クローン化し、増殖させ、ブリスタン感作Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ 　ｃマウス（生後３力月）に注射し、そこで腹水腫瘍として増殖させた。
この手順に従って、ハイブリドーマ細胞系ＢＲ６４が得られ、クローン化しそし て腹水腫瘍として増殖させるべくマウスに注射した。先に述べたように、ＢＲ６ ４ハイブリドーマはＡＴＣＣに寄託された。腹水中に分泌された抗体はプロティ ンＡ−セファロース［例えば、Ｐ、　Ｌ、　Ｅｙら、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、　１５．　ｐ、４２９−４３６（１９７８）を参照］またはセファク リルＳ−３００でのゲル濾過により精製した。精製ＢＲ６４抗体をさらに特性決 定に使用した。
実施例２ ＢＲ６４モノクローナル抗体の特性決定アイソタイプ決定 ＢＲ６４ハイブリドーマにより産生された免疫グロブリンのクラスを決定するた めに、次の技法を利用した： （ａ）オフテルロニー／免疫拡散 ハイブリドーマ細胞の上清の一部分を２５％寒天プレートの中央ウェルに入れた 。単一特異的ウサギ抗−マウスＩｇアイソタイプ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌ。
ｇｙ、　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　ＡＬ）を外側のウェルに入れ、このプレート を室温で２４〜４８時間インキュベートした。
次に、沈降線を読み取った。
（ｂ）ＥＬ　ＩＳＡアイソタイピング Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ　９６−ウェルプレートをＰＢＳ中５０ μｍ／ウェルで１μｇ／ｍｌ濃度のヤギ抗−マウスＩｇ抗体を被覆し、４°Ｃで 一夜カバーして放置した。プレートをＰ　Ｂ　Ｓ／Ｔｗｅｅｎ　２０　（０，０ ５％）で洗い、１００μｍ／ウェルの培地を用いて室温で１時間ブロックした。
プレートを洗浄した後、ＢＲ６４ハイブリドーマからの上滑を加え、室温で１時 間インキュベートした。２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで 洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ）に結合した単一特異的 ウサギ抗−マウスＩｇアイソタイプ抗体と３７°Ｃで３０分間インキュベートし た。さらに洗浄後、プレートを０．１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ４，５中の１ｍｇ ／ｍｌの０−フェニレンジアミンおよび０．０３％Ｈ２０□と共にインキュベー トした。６３０ｎｍでの光学濃度をＤｙｎａｔｅｃ　ＥＬＩＳＡプレート読み取 り器で測定した。　これらの操作に基づいて、ＢＲ６４モノクローナル抗体がＩ ｇＧ１アイソタイプであると判定された。
ＢＲ６４モノクローナル抗体の結合特性我々の実験では、ＢＲ６４抗体が広範な ヒト癌に対して高度の選択性を以って結合するが、ある種の正常細胞とは低度の 反応性しか示さないことが示された。
これらの実験には凍結組織切片に関する免疫組織学的研究および完全培養細胞を 用いる結合実験が含まれる。
免疫組織学的研究では、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　９．１０４−１６ ９　（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７９　） に記載され、Ｈ，Ｊ、　Ｇａｒｒｉｇｕｅｓら、“原発性ヒト黒色腫の組織学的 切片におけるヒト黒色腫関連抗原ｐ、９７の検出”。
Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　２９．　ｐ、５１１−５１５　（１９８２）によ り改変された、Ｌ、　Ａ、　ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒのＰＡＰ技法が用いられた 。これらの検査用のターゲット組織は外科手術により採取し、摘出後４時間以内 に液体窒素で予備冷却したイソペンタンを用いて凍結した。次に組織は使用する まで液体窒素中でまたは一７０°Ｃで保存した。凍結切片を調製し、風乾し、ア セトンで処理しそして再度乾燥した［Ｈ，Ｊ、　Ｇａｒｒｉｇｕｅｓら、前出を 参照コ。組織学的評価に用いる切片はヘマトキシリンで染色した。非特異的バッ クグラウンドを低減させるために、切片をＰＢＳ中で１１５に希釈した正常ヒト 血清とプレインキユベートシた［Ｈ，Ｊ、　Ｇａｒｒｉｇｕｅｓら、前出を参照 ］。マウス抗体、ウサギ抗−マウスＩｇＧおよびマウスＰＡＰを１０％正常ヒト 血清および３％ウサギ血清の溶液中に希釈した。ウサギ抗−マウスＩ　ｇ　Ｇ　 （Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−Ｍｅｙｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉ ｎｃ、、　Ｊａｒｅｔｔｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は１１５０の希釈度で使用した。
２ｍｇ／ｍｌの特異的精製ＰＡＰを含有するマウスペルオキシダーゼ−抗ペルオ キシダーゼ複合体（Ｐ　Ａ　Ｐ　、　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−ＭｅｙｅｒＩｍ ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、　）は１／８０の希釈度で使用し染色 方法は、連続した切片をいずれかの特異的抗体、すなわちＢＲ６４または対照抗 体、で２．５時間処理し、その切片を１１５０希釈ウサギ抗−マウスＩｇＧと室 温で３０分インキュベートし、次に切片をｌ／８０希釈マウスＰＡＰ複合体に室 温で３０分さらすことから成っていた。抗体での処理後、スライドをＰＢＳで２ 回洗った。
免疫組織化学的反応は０．０５Ｍ）リス緩衝液ｐＨ７，６中の新たに調製した０ 、５％３．３１−ジアミノベンジジン四塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ 、　ＭＯ）および０．０１％Ｈ２Ｏ２を８分間加えることにより発色させた［１ ．　Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２７．　ｐ、１５７ −１６０（１９８１）を参照］。蒸留水中の１％Ｏｓ　Ｏａ溶液に２０分間さら すと、染色が増強された。切片を水ですすぎ、アルコール中で脱水し、キシレン 中で澄明にし、スライドに載せた。平行切片はヘマトキシリンで染色した。
スライドはそれぞれ符号をつけて評価し、符号をつけた試料はそれぞれ独立した 試験者によってチェックした。代表的なスライドは微分干渉対比光学機械（Ｚｅ ｉｓｓ−Ｎｏｍａｒｓｋｉ）を用いることにより写真を撮った。抗体染色の度合 はＯ（反応性なし）、＋（少数の弱陽性細胞）、＋＋（少なくとも３分の１の細 胞が陽性）、＋＋＋（大部分の細胞が陽性）、および＋＋＋＋（はぼ全部の細胞 が強陽性）として評価した。十と０染色との差異は十と＋十染色との差異はど明 確ではないので、＋＋またはそれ以上と評価された染色を“陽性”とみなした。
腫瘍細胞と間質細胞の両方が腫瘍試料において観察された。間質細胞はまったく 染色されないか、または腫瘍細胞よりはるかに弱くしか染色されないので、記録 された染色は腫瘍細胞のものである。
以下の第１表は、ＢＲ６４モノクローナル抗体を用いた各種腫瘍および正常組織 標本の免疫組織学的染色を示す。この表から明らかなように、ＢＲ６４抗体は広 範なヒト癌標本と反応し、黒色腫および肉腫のような非癌性腫瘍とは反応せず、 また試験した大多数の正常ヒト組織とは何ら反応性を示さない。さらに、我々の 免疫組織学的研究では、これらの癌細胞がＢＲ６４抗体により強（染色されるこ とが証明された。この抗体は精巣および扁桃の一時的細胞に対し弱い結合を示し 、そして胃および食道の上皮細胞並びにすい臓の豚房細胞との反応性を示した。
この表はさらに、本発明者らの実験ではこの抗体と正常心臓組織との反応性を何 ら示さなかったが、ＮＩＨで別個に行った試験ではある種の正常ドナーの心臓の 毛細管と若干の反応性を示したことを示している。
（本頁以下余白） 第１表 ＢＲ６４モノクローナル抗体によるヒト腫瘍および正常組織標本のイムノペルオ キシダーゼ染色組織種類　陽性数／試験数 腫瘍 肺癌（非小細胞’）　７／１０ 乳癌　９／１３ 結腸癌　１２／１４ 卵巣癌　１／２ 子宮内膜癌　３／３ 胃癌　３／３ すい臓癌　２／２ 食道癌　３／３ 子宮頚癌　１／１ 黒色腫　０／８ 肉腫　０１５ 正常組織 肺　０／４ 牌臓　０／４ 乳房　０／４ 結腸　０／３ 腎臓　０１５ 肝臓　０／４ 脳　０／２ 心臓＊０／３ 皮膚　０／４ 甲状腺　０／１ 副腎　０／１ 卵巣　０／２ 網膜　０／１ 扁桃＊　＊　２／２ 精巣＊１２／２ すい臓ｇ　５１５ Ｗ＠＠　２／２ 食道６　＠　６　２／２ リンパ球ペレット　０／４ ＊　ＮＩＨて別個に行った試験は、６つの心臓試料のうち３つの毛細管がＢＲ６ ４で染色されることを示した。
＊＊　少数の細胞集団が陽性であった。
５　豚房細胞が陽性 ９目　上皮細胞が陽性 ９ｇ９表面上皮細胞は陽性；基底細胞は陰性衣に、我々は種々の培養細胞系に対 するＢＲ６４抗体の結合を調べた。完全培養細胞の細胞表面への抗体結合は、Ｊ 、　Ｐ、　Ｂｒｏｗｎら、“正常および腫瘍組織における黒色腫関連抗原ｐ、９ ７の定量分析”、　Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、　７８．　ｐ、５３９−５４３　（１９８１）に記載される 　″′Ｉ−標識抗体を用いる直接結合アッセイ法によるかあるいは蛍光活性化セ ルソーター（ＦＡＣ３）ＩＦを使用した直接免疫蛍光法により確認した。
放射性標識抗体を用いて行った結合アッセイでは、各種培養細胞系をトリプシン 処理して細胞浮遊液をつくり、ｌＸｌ０＠細胞を結合緩衝液（ＩＭＤＭ中１５％ ＦＣ３）１００μｌ中で１０’　ｃｐｍ（Ｄ　”’Ｉ−標識抗体と氷上で３０分 間インキュベートした。浮遊液を０．２ｍｌのジノニルフタレート：ジブチルフ タレート（１：　ｌｖ／ｖ）に重層しそして遠心した。ベレットと水相の１２８ １を計数した。非特異的結合を測定するために、競合体として非標識抗体を用い て同様のインキュベーションを行った。
ＦＡＣＳセルソーターを用いる結合分析では、１×１０６培養細胞をＩＭＤＭ培 地（Ｇｉｂｃｏ、　ＮＹ）中の１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に分注し、全容 量を５００μｍ／チューブとした。細胞をＳｅｒｏｆｕｇｅで１．５分間遠心し 、上溝を除いた。各チューブに１０μｇ／ｍｌのＢＲ６４モノクローナル抗体１ ００μｍを加え、チューブの内容物を混合して氷上で３０分間インキュベートシ た。この反応混合物はＳｅｒｏｆｕｇｅて１．５分遠心することにより１５％Ｆ ＢＳ／ＩＭＤＭ　５００μｍで３回洗った（３回目の洗浄後、チューブの水分を 吸い取った）。次に、１５％ＦＢＳ／ＩＭＤＭで１．２５に希釈した最適化ＦＩ ＴＣ接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　Ｃ Ａ）５０　μｍを各チューブに加え、この反応混合物を混合して３０分間インキ ュベートした。洗浄工程を繰り返し、チューブの水分を吸い取った後、それぞれ のペレットを２００〜５００μｍのＰＢＳに再度浮遊させた。各試料はＣｏｕｌ ｔｅｒＥｐｉｃｓ　ＣＦＡＣ３にかけ、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。Ｍ ＦＩから、直線状蛍光当量（ＬＦＥ）をめた。陰性対照のＬＦＥで割った各被検 試料のＬＦＥにより、特異的抗体と対照抗体により染色された細胞の明るさの比 率が得られた。結合データを以下の第■表に示す（第１Ｏ図も参照されたい）。
（本頁以下余白） 第■表 細胞系　比　率 乳癌３３９６　４９ 肺癌２７０７　１３ 結腸癌ＣＢ５　１０ 結腸癌ＲＣＡ　１３ 結腸癌Ｃ１１ Ｔ細胞リンパ腫ＣＥＭ　Ｉ Ｔ細胞リすパ腫ＭＯＬＴ−４１ Ｂ細胞リンパ腫Ｐ３ＨＲ−１？ 末梢血白血球　１ 第■表および第１Ｏ図から明らかなように、ＢＲ６４モノクローナル抗体はヒト 乳癌、肺癌、および結腸癌細胞系とは反応するが、ＴまたはＢリンパ腫系とも正 常末梢血白血球とも反応しなかった。また、ＢＲ６４は骨髄幹細胞とも反応しな かった（データは示さず）。
放射性標識抗体を用いたスキャッチャード分析では、ＢＲ６４抗体が約１０　’ Ｍ−’の会合定数（Ｋａ）を有しそして癌細胞系３３９６が細胞光たり０．　５ −１．　０×１０６の抗原部位を有することが示された。
実施例３ 癌細胞内へのＢＲ６４モノクローナル抗体のインターナリゼーション この実験は癌細胞内へのＢＲ６４モノクローナル抗体のインターナリゼーション を判定するために行った。
１つの方法によれば、ＢＲ６４をリシンＡ鎖毒素に接合させて免疫毒素ＢＲ６４ −ＲＡを形成させ、次に癌細胞によるそのインターナリゼーションを測定した。
毒素への抗体の接合は次のようにして実施した。
すなわち脱グリコジル化リシンＡ！Ｊｌ　（Ｉｎｌａｎｄ　ｌ、ａｂｓ。
Ａｕ５ｔｉｎ、　ＴＸ）　［Ｄ、Ｃ，Ｂｌａｋｅｙら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、、４７゜ｐ、９４７−９５２　（１９８７）を参照］をジチオトレイトール（ ５ｍＭ）で処理し、次に溶離剤としてＰＢＳ　（ｐＨ７゜２）を用いてＧ−２５ セフアデツクスでゲル濾過した。
これをＰＢＳ中の抗体に２：１のモル比で加えた。この抗体はＪ、　Ｍ、　Ｌａ ｍｂｅｒｔら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６０．　ｐ、１２０３５−１ ２０４１　（１９８５）の方法に従ってＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリ ジルジチオ）プロピオネ−）（ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ 、　ＩＬ）で予め修飾しておいた。この反応を室温で１２〜２４時間実施し、次 に溶液を１容量のＨ２０で希釈した。未接合抗体の除去はブルーセファロースＣ Ｌ　−６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ。
Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて達成した［Ｐ、ｐ、Ｋｎｏｗｌｅｓら、　Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６０．　ｐ、４４０−４４３　（１９８７）を参照］。
この接合体および過剰のりシンＡ鎖を高塩（ＩＯＸＰＢＳ）で溶離し、さらに溶 離剤としてＰＢＳを用いてセファクリル−３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製 した。得られた接合体は未結合モノクローナル抗体またはりシンＡ鎖を含まず、 主にｌ：１付加物から成っていた。
種々の癌細胞系によるＢＲ６４−ＲＡのインターナリゼーションはチミジン取込 み阻害アッセイを用いて測定した。このアッセイによれば、癌細胞のＤＮＡへの ３Ｈ−チミジン取込みの阻害（つまり、細胞増殖の阻害）が細胞に対するＢＲ６ ４−ＲＡの細胞毒性作用の尺度であり、ひいては細胞内への免疫毒素のインター ナリゼーションの尺度でもある。
癌細胞を９６−ウェルマイクロタイタープレート中ｌＯ％ウシ胎児血清（Ｆｅ２ ）含有ＩＭＤＭ培地１５０μｍにｌＸｌ０’細胞／ウエルでまいた。次に、ＢＲ ６４−ＲＡ免疫毒素（５０μｍ）をｌｏｇｉｏ連続希釈（１０μｇ／ｍｌから出 発して最終濃度０．０１μｇ／ｍｌまで希釈）で加えた。この反応混合物を５％ Ｃ０２インキユベ一ター内３７℃で６時間インキュベートした。この時点で、５ ０μｌの３Ｈ−チミジンをｌμＣｉ／μＣ用で加え、プレートを５％Ｃ○２イン キュベーター内３７℃で６時間インキュベートした。次にアッセイブレートを一 ７０°Ｃで少なくとも１時間凍結させ、ゲルドライヤーで１５分解凍した。細胞 をＰＨＤセルハーベスタを用いてプラスチック製シンチレーションバイアル中の ガラス繊維フィルター（ＦｉｌｔｅｒＳｔｒｉｐｓ、　Ｎｏ、２４０−１．　Ｃ ａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上に収穫した。このバイアルにシン チレーション計数用液体３ｍｌを入れ、そしてバイアルをＢｅｃｋｍａｎ　ＬＳ ３８９１ベータシンチレーションカウンターを使って１分／試料で計数した。
このアッセイの結果は未処理対照細胞により取込まれた８Ｈ−チミジンの百分率 として表した。試験した各細胞系の免疫毒素濃度に対するチミジン取込みの阻害 パーセントのグラフをプロットし、これを第１〜６図に示す。それぞれのアッセ イにおいて、インターナリゼーションを示さない免疫毒素対照としてＬ６−ＲＡ またはＰｌ、１７−ＲＡを使用した。Ｌ６は癌細胞と反応するがインターナリゼ ーションを示さない抗体である。Ｐｌ、１７はヒト細胞に結合しない非インター ナライズ性１ｇＧ２ａマウスミエローマ蛋白であり、ＡＴＣＣから入手できる。
第１図は、ＢＲ６４−ＲＡのインターナリゼーションにより惹起されるＨ２７０ ７肺癌細胞系由来の細胞によるチミジン取込みの阻害パーセントを示す。同様の 結果がＨ３３９６乳癌細胞系、Ｃ結腸癌細胞系、およびＲＣＡＣ結腸癌細胞系合 にも得られた（第２〜４図参照）。このように、ＢＲ６４抗体はこれらの癌細胞 によって取り込まれた。対照的に、ＢＲ６４−ＲＡはＪｉＪｏｙｅ細胞系、ヒト Ｂリンパ腫細胞系、または正常ヒト線維芽細胞によっては取り込まれなかった（ 第５および６図参照）。それゆえ、この実験ではＢＲ６４抗体のインターナリゼ ーションばかりでなく、インターナリゼーションの（すなわち、癌細胞に対する ）選択性も示された。
第二のインターナリゼーション実験では、放射性標識ＢＲ６４を使って、乳癌細 胞系３３９６によるＢＲ６４モノクローナル抗体の取込みを判定した。
抗体を次のようにして放射性標識した。すなわち２０〜４０μｇの抗体をＰＢ３ ４００〜５００μｍ中で１ｍＣ１のＮａ　”’Ｉ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および １０μｇのクロラミン−Ｔと約４°Ｃで２分間インキュベートした。
この反応を１０μｇのメタ重亜硫酸ナトリウムの添加により停止させ、標識抗体 を約１ｍｌの２％ＢＳＡで予備処理しＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２ ５（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）カラムでゲル濾過して精製した。
′２’Ｉ−ＢＲ６４の比活性は約５．４Ｘ１０＠ｃｐｍ／μｇであった。この抗 体をＰＢＳ中２％ＢＳＡの同量で希釈し、そして一部分を一７０°Ｃで凍結した ［例えば、Ｍ、　Ｙｅｈら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６（Ｎｏ、４）、 　ｐ、１３１２−１３１７　（１９８１）およびＪ、　Ｐ、　Ｂｒｏｗｎら、　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　（１９８１）、前出を参照されたい］。
次に、　”’）−ＢＲ６４を使用して次のように抗体のインターナリゼーション を測定した。すなわち乳癌系３３９６からの腫瘍細胞（２ｘ１０’　／３５ｍｍ 培養皿）を１５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）含有ＩＭＤＭ培地中で一夜培養した。
この細胞を冷（４°Ｃ）ＰＢＳで５分間予備冷却し、次に揺動台の上で＋２１） 　ＢＲ６４、（１０’ｃｐｍ）と４℃で３０分インキュベートした。未結合抗体 は４°Ｃにて培地で十分に洗浄する（７Ｘ６ｍｌ）ことにより除いた。細胞を３ ７℃インキュベーターに移し、指定された追跡時間培養した。
それぞれの追跡期間の終わりに、培地を集めてガンマカウンターで計数した。こ れは“培地”画分と呼ばれ、細胞によって放出されたモノクローナル抗体を表わ す。
次に、細胞単層をＰＢＳで２回（各５ｍ１）洗い、０．１Ｍ酢酸と４℃で２０分 （ｔ＝０時点のみ）、あるいはトリプシン（０，３５％）と３７℃で１０分イン キュベートした。酢酸により放出された物質を上記のように計数し、これは１＝ ０での細胞“表面”結合抗体に相当した。トリプシン処理細胞を集めて１ｍ）の Ｆｅ２に加えた。次に細胞を４００ｇ、４°Ｃで４分遠心し、上清を細胞“表面 ”抗体として集めた。ペレットを培地１０ｍ１に４°Ｃで浮遊させ、遠心により ２回洗浄した。最終ペレットをＳＤＳ含有緩衝液［ＲＩＰＡ＝１０ｍＭ）リス、 ｐＨ７，２，１５０ｍＭＮａＣＬ　１％デオキシコレート、１％トリトンＸ−１ ００，０，１％ＳＤＳ、１％アブロチニンコ中で可溶化し、そして前記と同様に して計数した。この画分は“細胞内”モノクローナル抗体を表わす。酢酸で処理 した細胞をかき集めて同じＳＤＳ緩衝液を用いて可溶化した。これは１＝０での “細胞内”抗体である。
この実験の結果は次の通りであった。すなわち乳癌３３９６細胞ははっきりした 島として増殖し、２×１０６細胞／培養皿でほぼ集密的であった。４°Ｃでのイ ンキュベーションは細胞形態または細胞付着に何の影響も及ぼさなかった。細胞 表面に結合した抗体を、ｔ＝０では冷５０ｍＭ酢酸（４°Ｃ）を用いて、または ｔ＝２分−６時間ではトリプシン（０，３５ｇ／１００μｍ）を用いて溶離した 。トリプシンでの溶離は３７℃、１０分のインキュベーションを必要とし、この 間に抗体が取り込まれることが分かった。その結果、ｔ＝０で、トリプシンを用 いて収穫した細胞は細胞内プールと関連した約５００００ｃｐｍを有しくデータ は示さず）、一方４℃での酢酸溶離細胞の同一プールは１２０００ｃｐｍＬか有 しなかった（第７図参照）。
第７および８図に示したグラフの作成において、追跡時間（ｔ＝２分−６時間） は実際には１０分のトリプシン処理期間を含み、すなわち２分の追跡時間は実際 には２分の追跡＋１０分のトリプシンインキュベーションに相当する。
細胞は４°Ｃでの１２５１−ＢＲ６４での３０分パルスの間に＞７００００ｃｐ ｍ／培養皿を取り込んだ。ｔ＝０で、モノクローナル抗体の８０％は５０ｍＭ酢 酸（４℃）により放出され、つまり細胞表面に存在していた。しかしながら、第 ７および８図に示すデータから、細胞を３７℃でインキュベートした場合、細胞 表面と関連したＢＲ６４モノクローナル抗体は速やかに減少し、反対に細胞内プ ールは増加することが明らかになった。
第７図に示されるように、２分の追跡までに、ＢＲ６４抗体の６０％は細胞内に 存在するが、２０％は培地に放出された。細胞表面抗体は細胞関連全放射能の約 １０％の定常状態に達した。第７および８図に示されるように、１時間の追跡で は、細胞内プールに見出される抗体量と培地に放出される抗体量とが大ざっばに みて等しく、すなわち４５％の放射性標識であった。
最後に、第８図に示されるように、１時間の追跡後、細胞内プールの標識抗体の 量は徐々に減少し、６時間までにこの画分には３２％の放射性標識が存在し、一 方培地は今や６０％を含有していた。
従って、このインターナリゼーション実験は、ＢＲ６４が癌細胞内に速やかに取 り込まれることを示す。
時間が経過すると、大部分の抗体は培地に放出される。
しかしながら、６時間後でさえも細胞内画分に関連して有意な割合が存在する。
先に論じたように、本発明ＢＲ６４抗体がそれと反応する癌細胞内に取り込まれ る能力を有するゆえに、この抗体はヒト癌を治療するための治療用途にとりわけ 有用である。
実施例４ 癌細胞に対するＢＲ６４−アドリアマイシン接合体のインビトロ細胞毒性作用 本実施例は、癌細胞を効果的に死滅させる抗体−薬物接合体の形のＢＲ６４抗体 の治療能力をさらに例示する。ここに述べる実験によれば、ＢＲ６４−アドリア マイシン接合体はインビトロで癌細胞に対して有意な細胞毒性作用を示した。
ＢＲ６４−アドリアマイシン（ＡＤＲ）接合体は次のようにして作製した。すな わちＡＤＲをダウノマイシンの誘導体化について以前に報告された方法を用いて ｃｉｓ−無水アコニット酸を用いて誘導体形成させた［Ｗ、　Ｃ，５ｈｅｎら、 Ｂｉｏｃｈｊｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１０２゜ｐ、１０ ４８−１０５４　（１９８１）を参照］。凍結乾燥した生成物をＰＢＳ　（２， ４ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、２当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプク ピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）　（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　Ｉ Ｌ）で活性化した。室温で１０分後、この薬物誘導体をＢＲ６４抗体（ＰＢＳ中 ５〜１０ｍｇ／ｍ１）ｉ；１５　：　１のモル比で加え、反応を２〜４時間進行 させた。Ｇ−２５セフアデツクスによるゲル濾過に続いて、ポリスチレンビーズ （Ｓトコビーズ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）での処理お よび滅菌濾過により未接合薬物を含まない接合体を得た。ＢＰＯ４：ＡＤＲ比は ３．　０〜５．　０（７）範囲であった。用いた化学は以前に報告された方法［ 例えば、Ｈ，Ｍ、　Ｙａｎｇら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、　８５゜ｐ、１１８９−１１９３　（１９８８”）を参照コと同様であっ た。
次に、ＢＰＯ４−ＡＤＲ接合体をＩＨ−チミジン取込みアッセイを用いてＨ３３ ９６癌細胞に対するその細胞毒性作用について調べた。このアッセイは１０％Ｆ ＢＳ含有ＩＭＤＭＩ　５０１ｔ　Ｉ中のｌＸｌ０’癌細胞の浮遊液を９６−ウェ ルマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、３７℃で一夜付着させた。ＩＭ ＤＭ＋１０％ＦＢＳ中の接合体の希釈液を加え、３７°Ｃで４時間インキュベー トした。ウェルを２回洗浄し、インキュベーションを２０時間続け、その際最後 の６時間に３Ｈ−チミジン（ｌμＣｉ／μＣ用）のパルスを与えた。プレートを 一２０″Ｃで凍結して細胞を分離させ、ガラス繊維ディスク上に細胞を回収した 。フィルターをＢｅｃｋｍａｎ　３７０１シンチレーシヨンカウンターで計数し た。
第９図に示されるように、ＢＰＯ４−ＡＤＲ接合体は、癌細胞に対してＡＤＲ単 独の場合に観察される作用に匹敵しつる有意な細胞毒性作用を示した。Ｌ６−Ａ ＤＲ接合体を陰性対照として使用した。さらに、ＢＲ６４−ＡＤＨ接合体は抗原 陰性ターゲット細胞に対しこのような死滅作用を示さなかった（データは示さず ）。
実施例５ ＢＲ６４抗原の特性決定 ＢＲ６４抗体をＥＬＩＳＡアッセイ（抗原と抗体を過剰に使用）を用いて、種々 の既知炭水化物構造を有する種々の固定化精製糖脂質との反応性について試験し た。糖脂質はマイクロタイターウェル中１１００ｎ／ウェルでメタノールから乾 燥した。精製抗体は１％ウシ血清アルブミンを含有する０、０１Ｍトリス−ＨＣ ｌ　（１）Ｈ７，４）中１０μｓ／ｍｌの濃度でアッセイした。吸光度は２通り のウェルの平均として算出した。
第１１図に示すように、ＢＲ６４抗体はプレートに固定したＬｅ’およびＨ２抗 原と特異的に結合した：Ｈ２はＬ　ｅ　’　（Ｆｕｃａｌ−２Ｇａｌβｌ−４（ Ｆｕｃａｌ−３）ＧｌｃＮＡｃ）と同じ構造を育するが、内部Ｆｕｃａｌ−３を 欠く。ＢＰＯ４を用いた初期の免疫沈降実験（ＢＲ６４抗原を可溶化して５ＤＳ −ＰＡＧＥにより分析）ではＢＲ６４抗原が糖蛋白でないことが示されている（ データは示さず）。従って、ＢＲ６４抗体は新規なインターナライズ性汎癌性糖 脂質抗原上の複合エピトープ（このエピトープの一部はＬｅ’炭水化物鎖から成 る）に結合すると思われる。
実施例６ ＢＰＯ４のサブクラス−スイッチ変異型の調製本実施例では、もとのＢＲ６４抗 体のサブクラスをＩｇＧ１からＩｇＧ２ａにスイッチした。
変更重鎮アイソタイプを産生ずるＢＲ６４細胞系の変異型（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９ ８９５）を同胞選択および軟質アガロースでのクローニングの組合わせにより生 成させた。マイクロタイタープレートに１０００細胞／ウエルの親ＢＲ６４細胞 をまき、そして自然に起こるサブクラス−スイッチ変異型をＧ、　５ｐｉｒａら 、前出に記載されるようにして選択した。
簡単に述べると、ウェル内のＢＲ６４細胞をＩ５％ＦＣ３および２Ｘグルタミン を補添したイスコープ培地（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ｃｏ、、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中でほぼ集密となるまで増殖 させた。培地をノンートリトン含有Ｍｉ１１ｅｘフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ ｅ　Ｃｏｒｐ、。
Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を通して濾過し、蛍光か入らないようにした。
ウェル内で７日間増殖後、細胞がほぼ集密的となり、そしてウェルからの上清を 取り出して、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ２ａ免疫グロブリンの存在についてアッセ イした（Ｓｐｉｒａら、前出、　９．３０９を参照）。陽性ウェルは自動ＥＬＩ ＳＡ読みとり器を用いて同定し、定量した。各陽性ウェルからの細胞をマイクロ タイタープレートの多重ウェルに再度まき、７日間増殖させた。
ＥＬＩＳＡアッセイを繰り返し、そして最も反応性の高いウェルからの細胞をプ ールした。
次に、これらのプールからの細胞をＩｇＧ２ａ特異的抗血清を含有する軟質アガ ロース中でクローン化した（Ｇ、５ｐｉｒａら、前出、　ｐ、３１０を参照）。
ＩｇＧ２ａ免疫グロブリンの分泌を示す免疫沈降物を形成したクローンを回収し て大量培養で増殖させた。培養上清を親ＩｇＧ１および他のすべてのマウスＩｇ Ｇアイソタイプの存在についてアッセイした。次に、抗体生産のためにＩｇＧ２ ａアイソタイプのみを産生ずるクローンを選択した。かかるクローンの一つかＡ ＴＣＣに寄託されたＢＰＯ４，６０である。
実施例７ ＢＰＯ４，６０抗体の細胞毒活性 ＢＰＯ４，６０モノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性の測定はｌ（ｅｌｌｓｔｒｏ ｍら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）。
８２、　ｐ、１４９９−１５０２　（１９８５）に記載されるようにして行われ た。簡単に説明すると、Ｃｅｒｒｏｔｉｎｉら、　Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。
１８、９．６７−１３２　（１９７４）に記載される、”Ｃｒの放出を測定する 短期間の”Ｃｒ−放出試験を腫瘍細胞溶解（すなわち、細胞毒性）の証拠として 用いた。健康なヒト被験体からの末梢血リンパ球をＬ　Ｓ　Ｍ　（Ｌｙｍｐｈｏ ｃｙｔｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　：リンパ球分離培地）（Ｏｒｇ ａｎｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｄｉｖ、、　Ｄｕｒｈａｍ、　ＮＣ）で分離して 、２つの異なるターゲット細胞系すなわち癌細胞系３６５５および３６３３に対 する５％ナチュラルキラー細胞反応性に等ゲット細胞を１００μＣｉ　（ＩＣｉ ＝３７ＧＢｑ）の”Ｃｒと３７°Ｃで２時間インキュベートすることにより標識 し、次にそれらを２回洗浄しそして１０％ＦＣ８含有ＩＭＤＭ培地に再浮遊させ た。標識細胞をマイクロタイター■−底プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）に６７μｍ中２Ｘ１０’細胞／ウエルでまいた 。次に精製ＢＲ６４，６０抗体（０，１μｇ／ｍ１〜１０μｇ／ｍ１）を加え、 続いて６７μｍ中の２Ｘ１０’　リンパ球／ウェルを加えた。この混合物を２〜 ４時間インキュベートし、次にプレートを４００Ｘｇで遠心した。上清を取り出 し、そして１００μｍ試料中の放射能をガンマ−カウンターで測定した。１群当 たり２回の反復実験を実施した。反復実験間の変動は１０％以下であった。
自然放出は抗体にもリンパ球にもさらされないターゲット細胞から培地に放出さ れたカウント数／分（Ｃｐｍ）として定義した。全放出はアッセイの終わりに浸 透圧溶解したターゲット細胞から放出されたカウント数として定義した。細胞毒 性パーセントは次のように算出した： 実験群の放出−自然放出　×１００ ｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｎ ｅｗ　５ｅｒｉｅｓ。
Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ　＆　５ｅｌｌ、　（編）、　Ｌｉ５ｓ、　ＮＹ、　２７．　 ｐ、１４９−１６４（１９８５）に記載される方法を用いて、Ｌｅｕ−１１ｂ表 面マーカーに対する抗血清およびモルモット補体とのインキュベーションに対す るそれらの感受性を評価することにより特性決定した。これはＬｅｕ−１１ｂマ ーカーの発現を測定するめに行われた。Ｌｅｕ−１１ｂマーカーはナチュラルキ ラー（ＮＫ）細胞の特徴であり、モノクローナル抗体ＢＲ６４，６０の存在下に ヒト癌細胞に対するＡＤＣＣを媒介するリンパ球により発現される。
表Ａに示した結果は、ＢＲ６４，６０が０．１〜１０μｇ／ｍｌの抗体濃度でＡ ＤＣＣ活性を媒介することを示している。このＡＤＣＣ活性は肺癌および卵巣癌 細胞系のような抗原陽性細胞系でＢＲ６４，６０を検査した場合に見られる。Ｎ Ｋエフェクター細胞単独は使用した個々の細胞系に応じて１１〜２２％の範囲の バックグラウンド細胞毒性を生じた。
表Ａ−細胞毒性％ ＢＲ６４，６０抗体濃度 μｇ／ｍｌ 肺癌３６５５　１１　５８　３７　１２卵巣癌３６３３　２２　６８　４４　３ ０補体源としてのヒト血清の存在下に腫瘍細胞を死滅させるモノクローナル抗体 ＢＲ６４，６０の能力、すなわちＣＤＣ活性を評価する試験は、上記のＡＤＣＣ 試験と同様に行ったが、エフェクター細胞浮遊液の代わりに補体源として１：３ 〜１：６に希釈した正常ヒト被験体からのヒト血清をマイクロテストウェル当た り６７μｍ加えた。
以下の表Ｂに示すように、ＢＲ６４，６０は約５〜１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で ヒト血清の存在下に細胞毒性作用を生じた。
（本頁以下余白） 表Ｂ−細胞毒性％ ＢＲ６４，６０抗体濃度 乳癌３６８０　１００　８４　１４　１ＭＣＦ７　９１　８０　１３　０ 卵巣癌３６３３　４０　１２．４　１ 肺癌３６５５３５１５２ 我々は本発明の特定の実施態様を上に示したが、本発明の範囲内で種々の変更お よび修飾が可能であることは明白である。従って、本発明の範囲は実施例で先に 示した特定の実施態様によって定められるのではなく、添付の請求の範囲により 定められることが理解されるであろう。
（本頁以下余白） 四−害ノぐ一巴ント ７口 阻苦ノぐ−をント 一口 ■ 阻害パーＶント 一口 Ｊ ｐＨ害１（−セント 一ロ ー臣 限冬へ〇−乞ント ーロ （η 咀菩）＼０−〔ント ｑ ■ 銹令”　Ｉ　−８Ｒｉｌｌ　ｃｐｐｎ −口 紡今ゝ２５１−βＲ碑ＣＰ自 一口 ■ 国際臘審麟失 暴ｌＩＩｅ１Ｍ１１１１ＩＩ−喝＾１６１１１１む”’０Ｐｆｆｉ／ＩＦ＋８Ｑ ７０５ＢＱ２

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. １．モノクローナル抗体の抗原結合領域がハイプリドーマＨＢ９８９５により産 生されたモノクローナル抗体ＢＲ６４のそのターゲット抗原への免疫特異的結合 を競合的に阻害するものである、モノクローナル抗体。
  2. ２．ａ）ヒト癌細胞と選択的に反応し；ｂ）反応する癌細胞の内部に取り込まれ ；そして。）ＡＴＣＣに寄託されたハイプリドーマＨＢ９８９５により産生され た抗体とも反応性であるヒト癌糖脂質抗原と反応する、モノクローナル抗体。
  3. ３．該抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求の範囲１または２記載のモ ノクローナル抗体。
  4. ４．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ９８９５の同定特性を有するハイプリドーマによ り産生されたモノクローナル抗体ＢＲ６４。
  5. ５．ＡＴＣＣに寄託されたＨＢ１０２９２の同定特性を有するハイブリドーマに より産生されたモノクローナル抗体ＢＲ６４．６０。
  6. ６．請求の範囲１、２、４または５記載のモノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆ（ａ ｂ′）２またはＦｖ断片。
  7. ７．該抗体が検出可能なシグナルを発することができる標識に接合されている、 請求の範囲１または４記載のモノクローナル抗体。
  8. ８．該標識が放射性標識、酵素、発色団または蛍光物質より成る群から選ばれる 、請求の範囲７記載のモノクローナル抗体。
  9. ９．抗体接合体を形成するために治療剤に連結された、請求の範囲１、４または ５記載のモノクローナル抗体。
  10. １０．該治療剤が抗腫瘍剤、毒素、放射性剤、第二抗体または酵素である、請求 の範囲９記載のモノクローナル抗体。
  11. １１．ＡＴＣＣに寄託されたハイプリドーマＨＢ９８９５。
  12. １２．ＡＴＣＣに寄託されたハイプリドーマＨＢ１０２９２。
  13. １３．請求の範囲１または４記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を含有す る組換え蛋白。
  14. １４．該蛋白がキメラ抗体である、請求の範囲１３記載の組換え蛋白。
  15. １５．該抗原結合領域が抗腫瘍活性を有する第二蛋白の少なくとも機能的に活性 な部分に結合されている、請求の範囲１３記載の組換え蛋白。
  16. １６．第二蛋白が酵素、リンフォカイン、オンコスタチンまたは毒素である、請 求の範囲１５記載の組換え蛋白。
  17. １７．２つの異なる抗原に対し結合特異性を有し、これらの抗原の１つが請求の 範囲１または４記載のモノクローナル抗体と反応するものである、二特異的抗体 。
  18. １８．請求の範囲４記載のモノクローナル抗体のクラスまたはサブクラススイッ チ変異型。
  19. １９．プロドラッグを細胞毒性薬物に転換し得る酵素および前記プロドラッグに 連結された請求の範囲１、４または５記載のモノクローナル抗体を包含する免疫 接合体の組合わせ。
  20. ２０．医薬上有効な量の請求の範囲１、４または５記載のモノクローナル抗体お よび製剤上許容しうる担体を含有する、ヒト癌の治療に有用な薬学的組成物。
  21. ２１．医薬上有効な量の請求の範囲９記載の少なくとも１積の抗体接合体および 製剤上許容しうる担体を含有する、ヒト癌の治療に有用な医薬組成物。
  22. ２２．医薬上有効な量の請求の範囲１３記載の少なくとも１積の組換え蛋白およ び製剤上許容しうる担体を含有する、ヒト癌の治療に有用な医薬組成物。
  23. ２３．医薬上有効な量の請求の範囲２０記載の組成物を患者に投与することから 成る、ヒト癌の治療方法。
  24. ２４．医薬上有効な量の請求の範囲２１記載の組成物を患者に投与することから 成る、ヒト癌の治療方法。
  25. ２５．医薬上有効な量の請求の範囲２２記載の組成物を患者に投与することから 成る、ヒト癌の治療方法。
  26. ２６．ヒト組織の標本を請求の範囲７記載の抗体と接触させ、そして該組織への 該抗体の結合を検出することから成る、ヒト組織における癌の存在の判定方法。
  27. ２７．有効量の請求の範囲７記載のモノクローナル抗体を静脈内に投与し、該抗 体を癌細胞の部位に局在化させ、そして該抗体を検出することから成る、ヒト癌 の画像形成法。
  28. ２８．請求の範囲１または４記載のモノクローナル抗体上のイディオタイプと反 応性のモノクローナル抗ーイディオタイプ抗体。
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