DE4237649C2

DE4237649C2 - Verfahren zur immunologischen Untersuchung von Zellen aus Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE4237649C2
Application number: DE19924237649
Authority: DE
Inventors: Klaus Decken; Thomas Ebert; Roger Gerke; Bernd Schmitz-Draeger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-11-07
Filing date: 1992-11-07
Publication date: 2003-02-20
Anticipated expiration: 2012-11-08
Also published as: DE4237649A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Untersuchung von Zellen aus Körperflüssigkeit, das sich insbesondere für die Diagnostik von Urotheltumoren aus Urin eignet.

In den letzten Jahren hat sich vor allem die Urinzytologie in der klinischen Routine bewährt und bildet neben der Blasen spiegelung die zweite Säule in der Diagnostik von Urotheltu moren.

Es hat sich gezeigt, daß Urin ein ideales Medium zum Nachweis dieser Tumoren ist. Dies beruht darauf, daß der Urin mit den ableitenden Harnwegen extensiv in Berührung kommt. Die Kon taktdauer zwischen Tumor und Urin kann dabei bis zu mehreren Stunden betragen. Außerdem kann die Gewinnung einer Probe auf nicht-invasivem Wege erfolgen. Schließlich steht Urin in praktisch unbegrenzter Menge zur Verfügung.

Die Erfahrungen der vergangenen Jahre haben jedoch gezeigt, daß die Sensitivität der Urinzytologie besonders beim Nach weis hochdifferenzierter Tumoren nicht befriedigend ist (Du bernard JM, Devonec M, Amiel J, Bouvier R, Fontaniere B, Faucon M (1982) Correlation between cytology and cystoscopy in the follow-up of patients with bladder tumours. Eur Urol 8: 5-8; Koss LG, Deitch D, Ramanathan R, Sherman AB, (1985) Diagnostic value of cytology of voided urine. Acta Cytol 29: 810-816; Zein T, Wajsman Z, Englander LS, Gamarra M, Lopez C, Huben RP, Pontes JE (1984) Evaluation of bladder washings and urine cytology in the diagnosis of bladder cancer and its correlation with selected biopsies of the bladder mucosa. J Urol 132: 670-671). Darüber hinaus sind die Ergebnisse in ei nem hohen Maße von der Erfahrung des Untersuchers abhängig.

Mit der Einführung der Hybridomatechnologie ergaben sich völ lig neue Möglichkeiten zur Identifizierung tumorassoziierter Parameter. Mit dieser Technik können monoklonale, determinan tenspezifische Antikörper im Antikörper (mAk) entwickelt wer den, mit denen molekulare Veränderungen der Tumorzelle be reits zu einem Zeitpunkt erfaßt werden können, an dem noch keine lichtmikroskopisch sichtbaren Zeichen einer Transforma tion vorliegen.

In den vergangenen Jahren hat sich eine Reihe von Wissen schaftlern darum bemüht, mit Hilfe der Hybridomatechnik Anti gene zu identifizieren, die für einen Nachweis von Urotheltu moren aus dem Urin geeignet erscheinen.

Beispielsweise haben Arndt und Mitarbeiter (Arndt R, Dürkopf H, Huland H, Donn F, Loening T, Kalthoff H (1987) Monoclonal antibodies for characterization of the heterogeneity of nor mal and malignant transitional cell. J. Urol 137: 758-763) über den monoklonalen Antikörper mAk 486 P 3/12 berichtet. Dieser Antikörper ist gegen ein Antigen gerichtet, das bei Urotheltumoren vermehrt exprimiert wird. Der Anteil Antigen- positiver Zellen variiert von Tumor zu Tumor, ohne daß eine Korrelation zum Malignitätsgrad ersichtlich ist. Das korrespondierende Antigen ist auch auf einigen Zellen der normalen Blasenschleimhaut vorhanden, ebenso wie auf anderen Normalgeweben Lymphatischen Ursprungs, Granulozyten, gastro intestinaler Schleimhaut und Endometrium. Auch Nierentumor zellen oder Turmoren des Gastronintestinaltraktes exprimieren das durch den Antikörper mAk 486 P erkannte Antigen. Bioche misch handelt es sich um ein Glykoprotein mit einem Moleku largewicht von 200 kD, das offensichtlich zur Familie der CEA-Proteine gehört.

In der Literatur (Decken R, Schmitz-Dräger BJ, Rohde D, Na kamura S, Ebert T, Ackermann R (1992) Monoclonal antibody Due ABC directed against Transitional cell carcinoma. I. Pro duction, specifity analysis and preliminary characterization of the antigen. J Urol 147: 235-41) ist ferner ein durch den mAk Due ABC 3 erkanntes Antigen beschrieben worden, das auf der Mehrzahl der Tumorzellen verschiedener Urotheltumoren vorhanden ist, aber ebenfalls gelegentlich auf normalen Uro thelzellen auftritt. Die Antigen-positiven Zellen sind in unterschiedlichem Maß in den verschiedenen untersuchten Tumo ren vorhanden. Im Unterschied zu dem durch den oben beschrie benen Antikörper mAk 486 P 3/12 erkannten Antigen scheint das durch den Antikörper mAk Due ABC 3 erkannte Antigen vermehrt bei gering differenzierten Tumoren exprimiert zu sein. Das Antigen ist auch auf verschiedenen Normalgeweben, z. B. Granulozyten, Dickdarmpithelien, proximalem Tubulusepithel und verschiedenen Tumorzellen nicht-urothelialer Herkunft wie Nierentumoren und Mammakarzinom vorhanden.

Von Walker und Mitarbeitern (Walker KZ, Russell PJ, Kingsley EA, Philips J, Raghavan D (1989) Detection of malignant cells in voided urine from patients with bladder cancer, a novel monoclonal assay. J. Urol 142: 1578-1583) wurde der mAk BLCA-8 beschrieben. Dieser Antikörper reagiert mit frisch kultivier ten urothelialen Tumorzellen und Zellinien urothelialer Her kunft, aber nicht mit veschiedenen Zellinien anderer Her kunft. Bei dem korrespondierenden Antigen handelt es sich nach den Angaben der Autoren um ein Glykolipid.

Obwohl in den vergangenen Jahren eine Reihe verschiedener monoklonaler Antikörper gegen Transitionalzellkarzinome (TCC) produziert wurden, gibt es nur wenige Berichte über den Ein satz solcher Antikörper zur Diagnostik von TCC (Chopin DR, de Kernion JP, Rosenthal DL, Fahey JL (1985) Monoclonal antobo dies against transitional cell carcinoma for detection of malignant urothelial cells in bladder washing. J. Urol 134: 260-265; Huland E, Huland H, Arndt R, Baisch H, Klöppel G (1988) Urindiagnostik oberflächlicher Harnblasentumoren durch Zytologie, Immunzytologie und Flowzytometrie. Ergebnisse einer prospektiven vergleichenden Studie an 104 Patienten. Akt. Urol 19: 13-17; Schmitz-Dräger BJ, Nakamura S, Decken K, Pfitzer P, Rottmann-Ickler C, Ebert T, Ackermann R (1992) Monoclonal antibody Due ABC 3 directed against transitional cell Carcinoma. II. Prospective trial on the diagnostic value of immunocytology using monoclonal antibody Due ABC 3. J. Urol 146: 1521-1524; Sheinfeld J, Reuter VE, Melamed MR, Fair WR, Morse M, Sogani PC, Herr HW, Whitmore WF, Cordon-Cardo C (1990) Enhanced bladder cancer detection with the lewis^x antigen as a marker of neoplastic transfor mation. J. Urol 143: 285-288; Walker KZ, Russel PJ, Kingsley EA, Philips J, Raghavan D (1989), Detection of malignant cells in voided urine from patients with bladder cancer, a novel monoclonal assay. J. Urol 142: 1578-1583). Alle diese Berichte betreffen den immunzytologischen Einsatz der mono klonalen Antikörper. Der Nachweis von tumorassoziierten Anti genen im Urin selbst stößt bislang auf Schwierigkeiten. Für die meisten der genannten Antikörper lassen die Kreuzreakti onen mit anderen im Urin vorkommenden Zellen wie Granulozyten oder Makrophagen einen direkten Nachweis im Urin nicht sinn voll erscheinen.

Wie oben bereits ausgeführt wurde, sind die Antikörper mAk 486 P und Due ABC 3 gegen Differenzierungsantigene gerichtet, die auch Antigene auf normalen Urothelzellen erkennen. Huland und Mitarbeiter (Huland H, Arndt R, Huland E, Loening TE, Steffens M (1987) Monoclonal antibody 486 P 3/12: a valuable bladder carcinoma marker for immunocytology. J. Urol 137: 654-659) schlugen deshalb eine quantitative Form der Auswer tung vor (Quantitative Immunocytology = Quic). Dabei wird ein gewisser Anteil Antigen-positiver Zellen (z. B. 20%) als nor mal betrachtet. Erst ein Überschreiten dieses Wertes gilt als pathologisch.

Chopin und Mitarbeiter (Zitat siehe oben) berichteten bereits 1985 über erste Erfahrungen mit monoklonalen Antikörpern in der Urinzytologie. Weitere Beobachtungen über den Einsatz von monoklonalen Antikörpern der Urinzytologie stammen von Huland und Mitarbeitern aus dem Jahr 1988 (Zitat siehe oben). Die Sensitivität dieser Methode wurde für die Immunzytologie und Durchflußzytometrie mit 91% und für die Zytologie mit 89% berechnet. Basierend auf diesen Untersuchungen wird inzwi schen auf dem Markt ein Test angeboten, der den Antikörper mAk 486 P 3/12 als Nachweisantikörper benutzt. Es hat sich jedoch gezeigt, daß dieser Rest im Augenblick wenig anwender freundlich ist.

Sheinfeld und Mitarbeiter (Zitat siehe oben) haben 1990 für die immunzytologische Untersuchung einen gegen das Lewis^x Antigen gerichteten Antikörper, mAk P-12, verwendet. Dieses Antigen ist ein auf der Membran verschiedener normaler Zellen und Tumorzellen vorkommendes Differenzierungsantigen, das entweder an ein Protein oder ein Lipid gekoppelt auftreten kann. Immunhistochemsche Untersuchungen haben gezeigt, daß das Lewis^x Antigen auf Transitionalkarzinomen, jedoch nicht auf normalen Urothelzellen vorkommt. Eine Ausnahme bilden lediglich die sogenannten Deckzellen des Urothelts, die ge legentlich das Lewis^x Antigen exprimieren. Bei Einsatz des genannten Antikörpers ermittelten Sheinfeld und Mitarbeiter eine Sensitivität von 85%.

Walker und Mitarbeiter (Zitat siehe oben) publizierten kürz lich einen Bericht über den Einsatz der Immunzytologie zur Untersuchung von Spontanurin. Das Testprinzip ist von den an deren Tests verschieden. Hier erfolgt eine Einbettung der Proben in eine Matrix (Agarose), was eine mikroskopische Untersuchung in verschiedenen Ebenen möglich macht. Das Pro blem einer Überlagerung von Urothelzellen durch nicht-uro theliale Zellen, was in anderen Tests bei Vorliegen einer Entzündung die Auswertung erschwert, kann hier umgangen wer den.

Hinsichtlich der Untersuchung anderer Tumoren ist der zytolo gische Nachweis von Tumorzellen aus Magenflüssigkeit be schrieben. Ebenso können bei einigen Tumoren des zentralen Nervensystems zytologisch im Punktat von Liquor cerebrospi nalis Tumorzellen nachgewiesen werden. Zur Diagnose von Lungentumoren werden zytologische Präparate aus Sputum, Pleu ra-Ergüssen oder auch bronchio-alveolären Lavagen herange zogen. Metastasen oder Primärtumoren in der Bauchhöhle können durch die Untersuchung von Aszites diagnostiziert werden. Die Entwicklung entsprechender kommerzieller Tests ist bisher nicht bekannt.

Umfangreiche immunzytologische Untersuchungen liegen zur Diagnostik und Klassifikation von Tumoren des hämatopoieti schen Systems vor. Dazu werden Antikörper angeboten. Kommer zielle Tests sind jedoch den Erfindern nicht bekannt gewor den. Gerade auf dem Gebiet der Diagnostik und Klassifikation von Tumoren des hämatopoietischen Systems dürfte jedoch ein erheblicher Bedarf für praktikable Tests bestehen.

Alle oben beschriebenen immunzytologischen Verfahren weisen jedoch erhebliche Nachteile auf. Hierzu zählen insbesondere die Vielzahl von Einzelschritten, welche die praktikable Anwendung erheblich erschweren. Hinzu kommt der erhebliche Zeitaufwand, welcher zwischen 2 1/2 und 5 Stunden liegt (vgl. Beispiele A-D).

Der Nachteil der geschilderten Verfahren liegt auch darin, daß für die Herstellung der zytologischen und immunzytologi schen Präparate regelmäßig sogenannte Zytozentrifugen einge setzt werden. Die Zentrifugation mit anschließender Luft trocknung der Präparate ist jedoch technisch und zeitlich sehr aufwendig. Für diesen Vorgang werden spezielle Zyto zentrifugen benötigt, deren Anschaffung mit erheblichen Kosten verbunden ist. Auch bei der Umrüstung konventioneller Zentrifugen zu Zytozentrifugen fallen erhebliche Kosten an. Selbst wenn aber eine geeignete konventionelle Zentrifuge (nicht alle Zentrifugen sind geeignet) vorhanden ist, müssen noch entsprechende Einsätze beschafft werden, was auch mit erheblichen Kosten verbunden ist. Darüber hinaus führt die Verarbeitung der Zellen in der Zytozentrifuge zu Zellver lusten, was vor allem bei Patienten ohne Tumor oder mit Tu moren im Frühstadium dazu führen kann, daß die Präparate nicht mehr auswertbar sind.

Die EP-A-375 562 betrifft monoklonale Antikörper für menschliche Karzinome, die über verschiedene in vitro Diagnosemethoden, beispielsweise die Immunperoxidase-Reaktion und andere immunozyklische chemische Verfahren nachgewiesen werden können, u. a. über eine Färbung mit Hämatoxylin. Im Rahmen des Absatzes "Bindungscharakteristiken der BR64 monoklonalen Antikörper" wird zwar im Rahmen eines Nachweisverfahrens auch darauf hingewiesen, daß Epithelzellen des Magens und Darms zugegen sind, man findet in dieser Druckschrift allerdings weder eine Offenbarung noch einen konkreten Hinweis darauf, sowohl eine Filtration einzusetzen, als auch durch die Filtration speziell Epithelzellen von Granulozyten zu trennen. Darüber hinaus wird auch kein Hinweis darauf gegeben, welche speziellen Membranmaterialien und welche Porengrößen speziell eingesetzt werden können. Dies ist auch nicht verwunderlich, denn Gegenstand dieses Standes der Technik ist allein die Zurverfügungstellung eines Antikörpers zur inneren Anwendung der hochselektiv für eine Reihe von menschlichen Karzinomen ist, nämlich des Antikörpers BR 64, wie Seite 2 letzter Absatz der der EP-A1 zu entnehmen ist. Dies ergibt sich in gleicher Weise aus den Patentansprüchen dieser Entgegenhaltung, die auf diesen Antikörper und auf die Hybridomazellen verweisen und bezüglich des Behandlungsverfahrens für menschliche Karzinomzellen nur auf die Verabreichung dieses Antikörpers abstellen. Hierdurch wird allerdings die im erfindungsgemäßen immunologischen Untersuchungsverfahren einzusetzende spezielle Filtrationsmembran weder vorbeschrieben noch nahegelegt.

Die DE 41 10 405 A1 betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Differenzierung und der Invasivität von Karzinomzellen, wobei man Gewebeschnitte und/oder Extrakte von Tumorzellen durch Bindung eines monoklonalen Antikörpers oder durch Einsatz einer Nukleinsonde in Form einer "in situ"-Hybridisierung analysiert. Der Gegenstand dieser Offenlegungsschrift führt aber vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung weg, denn Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist gerade kein Nachweis der Differenzierung und der Invasivität von Karzinomzellen, wobei man Gewebeschnitte und/oder Extrakte von Tumorzellen durch Bindung eines monoklonalen Antikörpers oder durch Einsatz einer Nukleinsonde analysiert. Dies steht im klaren Gegensatz zum erfindungsgemäßen Verfahren zur Untersuchung von Zellen aus Körperflüssigkeiten mit einer speziellen Schrittabfolge, welche zwingend die Verwendung einer Kapillarporenmembran zur Trennung von Epitelzellen von Granulozyten vorsieht, d. h. einem rein diagnostischen Verfahren. Dieser Filtrationsschritt in Zusammenhang mit den anderen erfindungsgemäßen Schritten ist in diesem Stand der Technik weder vorbeschrieben noch wird er nahegelegt.

Der MEDLINE Abstract aus der Zeitschrift "Clinical Hemorheolgy (1987) 7/5 (Seite 699-706) beschreibt allgemein den Effekt von beta adrenergischen Verbindungen auf die Granulozytendeformierbarkeit unter Verwendung einer Polycarbonat Membran bei einem Porendurchmesser von 5 µ. Derartige Verbindungen, wie Isoproterenol oder Propranolol sind dafür bekannt, daß sie die Zelleigenschaften von Granulozyten in der Weise beeinflussen, daß ursprünglich diese Zellen, die eine Porenmembran nicht passieren können, durch Modifikation der Oberfläche soweit deformiert werden können, daß sie dennoch die Poren passieren können. Gerade ein derartiges aufwendiges Verfahren unter Einsatz von so exotischen Verbindungen wie Isoproterenol oder Propranolol wird aber erfindungsgemäß gerade nicht eingesetzt, denn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist dieser zusätzliche Behandlungsschritt gerade nicht notwendig, vielmehr passieren durch eine Membran nicht-deformierte Granulozyten ins Filtrat und ausschließlich Epithelzellen werden zurückgehalten.

Hieraus ergibt sich schon, daß die Intention dieses Standes der Technik in eine ganz andere Richtung abzielt, als das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren, denn dort wird nur, wie auch schon der Titel aussagt, der Effekt von speziellen beta adrenergischen Verbindungen auf die Granulozytendeformierbarkeit getestet, ohne eine praktische Anwendung wiederzugeben.

Die vorliegende Erfindung hat sich nunmehr die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Untersuchung von Zellen aus Körperflüssigkeiten durch Nachweis von zell-assozierten Determinanten gemäß Oberbegriff von Anspruch 1 zur Verfügung zu stellen, welches die obengenannten Nachteile nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale von Anspruch 1 gelöst.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Untersuchung von Zellen aus Körperflüssigkeiten durch Nachweis von zell- assoziierten Determinanten, wobei

a) die Probe mittels Filtration auf einen für die mikroskopische Auswertung geeigneten Träger aufgebracht wird,
b) durch Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen das zell-assoziierte Antigen eine Antigen-Antikörper- Reaktion ausgelöst wird,
c) die nicht gebundenen Antikörper entfernt werden,
d) eine Farbreaktion durchgeführt wird und
e) anschließend durch Gegenfärbung antigen-positive und antigen-negative Zellen dargestellt werden, das

dadurch gekennzeichnet ist, daß die Filtration mittels einer Kapillarporenmembran erfolgt, die Epithelzellen anreichert, aber Granulozyten durchläßt.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbe sondere ein Verfahren der vorgernannten Art, bei dem der Nachweis zellulärer Antigene mittels einer durch Zugabe monoklonaler Antikörper ausgelösten Antigen-Antikörper- Reaktion, der Nachweis von Stoffwechselfunktionen durch die Bestimmung von Enzymaktivitäten oder Rezeptorbindung und der Nachweis genetischer Determinanten (DNA, RNA) mittels spezifischer Gensonden erfolgt.

Im einzelnen erfolgen der Nachweis zellulärer Antigene mit tels einer durch Zugabe monoklonaler Antikörper ausgelösten Antigen-Antikörper-Reaktion, der Nachweis von Stoffwechsel funktionen durch die Bestimmung von Enzymaktivitäten oder Rezeptorbindung und der Nachweis genetischer Determinanten (DNA, RNA) mittels spezifischer Gensonden.

Im letzten Falle erfolgt in Schritt b) durch Zugabe von Gen sonden für zell-assoziierte Nukleinsäuren eine in-situ-Hybri disierung, in Schritt c) werden die nicht gebundenen Genson den entfernt und in Schritt e) durch Gegenfärbung positive und negative Zellen dargestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für die Diagnostik von Urotheltumoren aus Urin. Als Ausgangsma terial für den Test kann sowohl Blasenspülflüssigkeit als auch Spontanurin verwendet werden.

Vor der Filtration kann eine Vorfixierung durch eine Flüssig keit durchgeführt werden, die sowohl eine Lysierung der Erythrozyten als auch eine Konservierung oder Fixierung der übrigen Urinbestandteile bewirkt.

Vorzugsweise wird erfindungsgemäß eine sogenannte Esposti- Lösung eingesetzt. Eine solche Lösung enthält als Wirkstoffe einerseits Eisessig und andererseits Methanol. Im einzelnen setzt sie sich aus 10 Teilen Eisessig sowie jeweils 45 Teilen Wasser und Methanol zusammen.

Durch den Eisessiganteil wird die Lysierung der Erythrozyten erreicht. Dies ist deshalb vorteilhaft, weil der weitere Testverlauf durch die Erythrozyten gestört wird.

Durch den Methanolanteil werden die übrigen Urinbestandteile so fixiert, daß die Antigene erhalten bleiben. Das Präparat ist somit mindestens 14 Tage haltbar. Eine sofortige Verar beitung des Präparates ist daher nicht erforderlich. Gege benenfalls kann es sogar an externe Labors verschickt werden.

Statt einer Zytozentrifugation der Zellen wird erfindungsge mäß der Urin filtriert. Erfindungswesentlich ist die Verwen dung spezieller Kapillarporenmembranen, deren Porengröße so gewählt ist, daß die interessierenden Epithelzellen auf dem Filter angereichert werden, während kontaminierende Granulo zyten größenteils im Filtrat verbleiben. Vorzugsweise kommen hier aus Polycarbonat oder Polyester bestehende Membranen zum Einsatz. Im vorliegenden Fall werden die Zellen über ein Va kuum auf diese Membran aufgebracht und sogleich wird die Flüssigkeit abgezogen. Die Filtration kann hierbei mittels einer Vakuumpumpe oder auch einer Wasserstrahlpumpe bewerk stelligt werden. Durch die Filtration der zu untersuchenden Probe wird auch die Entfernung der Leukozyten und Granulo zyten erreicht.

Die weiteren Schritte des Testverfahrens werden mit dem mit den Zellen beaufschlagten Membranfilter durchgeführt. Die mikroskopische Auswertung kann aufgrund der Transparenz der Polycarbonatfilter ohne besondere Eindeckung erfolgen.

Es ist erfindungsgemäß aber auch möglich, ein Eindeckmittel zur Beseitigung größerer - störend wirkender - Poren einzu setzen. Hierfür hat sich insbesondere 3,3-Diphenyl-1-Propanol bewährt. In Kombination mit einem Polarisationsfilter können so die Poren vollständig unsichtbar gemacht werden.

Die Verwendung von 3,3-Diphenyl-1-Propanol ist deshalb beson ders vorteilhaft, weil es einen mit Polycarbonat identischen Brechungsindex besitzt. Da Polycarbonat doppelbrechend ist, muß zusätzlich ein Polarisationsfilter eingesetzt werden, um den zweiten Brechungsindex auszuschalten. Als Filtermateria lien sind auch Kapillarporenmembranen aus Polyester oder Nylongaze denkbar.

Die Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgt direkt auf der Fil termembran durch Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen das zell-assoziierte Antigen. Als Antikörper kommen auch sol che zum Einsatz, die markiert sind. Sofern nicht markierte Antikörper verwendet werden, können zusätzlich markierte Nachweisantikörper der Probe zugesetzt werden.

Die Zugabe von Antikörpern und Nachweisantikörpern kann nacheinander erfolgen. Denkbar ist aber auch die gleichzei tige Zugabe von Antikörpern gegen das Tumorassoziierte Anti gen und Nachweisantikörper. Für erstere kann beispielsweise der bereits oben beschriebenen Antikörper Due ABC 3 zum Einsatz kommen.

Geeignete Nachweisantikörper sind Anti-Maus-Immunoglobul in Antiserum mit alkalischer Phosphatase markiert. Jedoch ist die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahren nicht an den insatz bestimmter Antikörper oder Markierungsformen gebun den. Die Phosphatase ist prinzipiell ersetzbar durch andere Enzyme (z. B. Peroxidase, Galactosidase).

Durch die gleichzeitige Zugabe von Antikörpern und Nachweis antikörpern wird erfindungsgemäß eine erhebliche Reduzierung der Inkubationszeiten erreicht. Statt der nach dem Stand der Technik üblichen 30-60 Minuten wird nämlich bei Raumtempe ratur nur noch 5 Minuten inkubiert. Eine Inkubation in der Wärme (beispielsweise 37°C) kann gewährleisten, daß die ver kürzte Inkubation noch sicherer reproduzierbar ist. Unter Umständen kann eine Bestrahlung der Probe mit Mikrowellen die erforderliche Inkubationsdauer noch weiter reduzieren, min destens jedoch den Effekt der Inkubation in der Wärme er setzen.

Die Farbreaktion, d. h. der Nachweis der Antikörperbindung, erfolgt nach dem Auswaschen von nicht gebundenen Antikörpern durch Zugabe geeigneter Substrate. Damit werden die Antigen- exprimierenden Zellen nachgewiesen. Anschließend werden Anti gen-positive und Antigen-negative Zellen durch Gegenfärbung dargestellt. Eine geeignete Färbesubstanz ist das Kernecht rot.

Die Auswertung erfolgt durch Auszählen Antigen-positiver und Antigen-negativer Urothelzellen unter dem Lichtmikroskop nach dem Verfahren von Huland (Huland H, Arndt R, Huland E, Loening TE, Steffens mm (1987) Monoclonal antibody 486 P 3/12: a valuable bladder carcinoma marker for immunocytology. J Urol 137: 654-659). Das Ergebnis wird als Anteil Antigen- positiver Zellen an der Gesamtzahl der Urothelzellen in Prozent angegeben.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens werden durch die folgenden Beispiele verdeutlicht. So sind in dem er findungsgemäßen, in 1E dargestellten Verfahren wesentlich weniger Schritte erforderlich als bei den Versuchen 1A-D.

Deutlich wird vor allem, daß die Immunfärbung erfindungs gemäß nur 15 Minuten beansprucht, während die Färbung im übrigen aber bei 120-175 Minuten liegt. Während die Inku bation erfindungsgemäß nur 5 Minuten beansprucht, werden nach den Beispielen 1B und 1C zwischen 40 und 60 Minuten benö tigt. Insgesamt liegt die Dauer des erfindungsgemäßen Test verfahrens bei ca. 30 Minuten. Hingegen werden für die Ver fahren nach den Beispielen 1B und 1C 2½ bis 5 Stunden gebraucht. Aber selbst bei dem Verfahren nach der konventio nellen Zytologie gemäß 1A liegt die Gesamtverfahrensdauer bei dem Doppelten des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bei allen Verfahren ist also der Zeitaufwand erheblich höher als der erfindungsgemäße, obwohl bei den Verfahren nach den Beispie len 1A-D im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung eine vor herige Konservierung der Präparate nicht stattfindet.

BEISPIELE 1. Methodenvergleich Bekannte Verfahren in der onkologischen Urinzytologie A Konventionelle Cytologie (Papanicolaou)

Verfahren nach G. N. Papanicolaou (Science 95, 1942, pp. 438 ff. bzw. Science 101, 1945, pp. 500-520). Standardme thode in der Onkologie. Verschiedene Variationen sind verbreitet, speziell die Herstellung und Fixierung der Präparate betreffend. Vorfixierungen sind beschrieben, aber nicht üblich. Die dargestellte Variante stellt den Standard in der Abteilung Cytopathologie des Pathologi schen Institutes der Heinrich-Heine-Universität dar. Der Vorteil des Verfahren liegt in seiner hohen Spezifität bei allerdings geringer Sensitivität.

B Quantitative Immun-Cytologie (Huland/Hamburg)

Verfahren nach E. Huland und Koautoren (Journal of Urology 144, 1990, pp. 637-640) und in P. Rathert. St. Roth, Urin zytologie, Springer-Verlag, Berlin, 1991, pp. 177-186).

C Agarose-Immun-Cytologie (Sydney)

Verfahren nach K. Walker und Koautoren (Journal of Urolo gy, Band 142, 1989, pp. 1578 ff.).

D Immun-Cytologie (Düsseldorf)

Verfahren beschrieben in P. Rathert, St. Roth, Urinzyto logie, Springer-Verlag, Berlin, 1991, pp. 165-176 und Journal of Urology 146, 1992, pp. 1521-1524.

E Filter-Immun-Cytologie (Düsseldorf)

Erfindungsgemäßes Anwendungsbeispiel für eine urologisch- onkologische Fragestellung.

A KONVENTIONELLE CYTOLOGIE (PAPANICOLAOU) 1. Konservierung der Proben

entfällt üblicherweise
verschiedene Vorschläge zur Konservierung sind publiziert

2. Herstellung der Präparate (6 Schritte)	ca. 20 min
a) Zentrifugation (2000 U/min)	10 min
AL=L<b) Überstand absaugen
AL=L CB=3<c) Sediment aufwirbeln@ AL=L CB=3<d) Herstellen der Cytozentrifugenpräparate@	e) Cyto-Zentrifugation	10 min
AL=L<f) Spray-Fixierung

3. Färbung (15 Schritte)	30 min
a) Alkohol-Bad	2 min
b) HARRIS-Hämatoxylin	2 min
c) spülen in Aqua dest.	2 min
d) Bläuen in 3 ml Ammoniak auf 97 ml 70% Alkohol	2 min
e) aufsteigende Alkoholreihe	6 × 2 min
f) 2% wässrige Orange-G-Lösung	2 min
g) Spülen in 96% Alkohol	2 × 2 min
h) EA 31, EA 50 oder EA 65	2 min
i) spülen in 96% Alkohol	2 min

4. Eindeckung (3 Schritte)	ca. 15 min
a) aufsteigende Alkoholreihe	4 × 2 min
b) Xylol	2 × 2 min
c) Eindecken in Depex	1 min

5. Gesamtdauer (22 Schritte)

ca. 1 Std.

6. Auswertung

- mikroskopische Auswertung durch erfahrenen Cytopathologen
- einzelne Zellen oft ausreichend
- hochdifferenzierte Tumoren und Normalurin oft ohne Befund

B QUANTITATIVE IMMUN-CYTOLOGIE (HULAND/HAMBURG) 1. Konservierung der Proben

entfällt
sofortige Verarbeitung erforderlich

2. Herstellung der Präparate (6 Schritte)	ca. 140 min
a) Zentrifugation (2000 U/min)	10 min
AL=L<b) Überstand absaugen
AL=L CB=3<c) Sediment in PBS aufwirbeln@ AL=L CB=3<d) Herstellen der Cytozentrifugenpräparate@	e) Cyto-Zentrifugation	10 min
f) Lufttrocknung	120 min
AL=L<(Lagerung: einfrieren, lyophilisieren und einschweißen)

3. Färbung (22 Schritte)	150 min
a) Aceton-Fixierung	5 min
b) Rehydrierung in Spülpuffer	10 min
c) Inkubation mit monoklonalem Antikörper	30 min
d) Waschen, mehrfacher Pufferwechsel	10 min
e) Inkubation mit 1. Nachweisantikörper	30 min
f) Waschen, mehrfacher Pufferwechsel	10 min
g) Inkubation mit 2. Nachweisantikörper	30 min
h) Waschen, mehrfacher Pufferwechsel	10 min
i) Farbreaktion (Vorbereitung i.-iii. während g bzw. h)	5 min
AL=L<i. Vorbereitete Substratlösung (Naphthol-AS-MX-Phosphat in TBS) auftauen
AL=L CB=3<ii. Cosubstrat (Fast Red TR) frisch einwiegen@ AL=L CB=3<iii. Cosubstrat in Substratlösung lösen@ AL=L CB=3<iv. Inkubation@	k) Waschen, mehrfacher Pufferwechsel	10 min
l) Gegenfärbung: Hämalaun	1 min

4. Eindeckung (2 Schritte)	15 min
a) Bläuen in Leitungswasser	10-15 min
b) Eindeckung in Kaiser's Glyceringelatine	1 min

5. Gesamtdauer (30 Schritte)

ca. 5 Std.

6. Auswertung

- mikroskopische Auswertung durch angelernte Kraft
- mindestens 100 Zellen auszählen
- über 30% der Urothelzellen positiv = positiver Befund
unter 20% der Urothelzellen positiv = negativer Befund
zwischen 20 und 30% positiv = kontrollbedürftig

C AGAROSE-IMMUN-CYTOLOGIE (SYDNEY) 1. Konservierung der Proben

entfällt
sofortige Verarbeitung erforderlich

2. Herstellung der Präparate (7 Schritte)	ca. 15 min
a) Zentrifugation (1000 U/min)	7 min
AL=L<b) Überstand absaugen
AL=L CB=3<c) Sediment aufwirbeln@	d) Zellzahlbestimmung	ca. 5 min
AL=L<e) Suspension von 2 × 10⁵
Zellen in 100 µl RPMI-1640-Medium mit 40% FCS

3. Färbung (4 Schritte)	120 min
AL=L<keine weitere Vorbehandlung
a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper bei 4°C	30 min
b) Waschen in PBS bei 4°C	30 min
c) Inkubation mit Fluoreszein-markiertem Nachweisantikörper bei 4°C	30 min
d) Waschen in PBS bei 4°C	30 min

4. Eindeckung (1 Schritt)	1 min
Eindeckung in 10% Glycerin-PBS	1 min

5. Gesamtdauer (12 Schritte)

ca. 2½ Std.

6. Auswertung

- mikroskopische Auswertung durch angelernte Kraft
- Fluoreszenz-Mikroskop erforderlich sowie Dunkelraum
- mindestens 50 Zellen auszählen
- über 5% der Urothelzellen positiv = positiver Befund
unter 5% der Urothelzellen positiv = negativer Befund

D IMMUN-CYTOLOGIE (DÜSSELDORF) 1. Konservierung der Proben

entfällt
sofortige Verarbeitung erforderlich

2. Herstellung der Präparate (7 Schritte)	ca. 20 min
a) Zentrifugation (2000 U/min)	10 min
AL=L<b) Überstand absaugen
AL=L CB=3<c) Sediment in PBS aufwirbeln@ AL=L CB=3<d) Herstellen der Cytozentrifugen-Präparate@	e) Cyto-Zentrifugation	5 min
f) Trockenzentrifugation	1 min
g) Lufttrocknung	5 min
AL=L<(Lagerung: einfrieren)

3. Färbung (23 Schritte)	175 min
AL=L<(nach Lagerung: 60 min Auftauen im Wärmeschrank, 37°C)
a) Formaldehyd/Aceton-Fixierung	2 min
b) Methanol/H₂O₂-Fixierung	30 min
c) Waschen in PBS	3 × 5 min
c) Inkubation mit 5% Kaninchenserum	10 min
d) Waschen in PBS	3 × 5 min
e) Inkubation mit monoklonalem Antikörper	30 min
f) Waschen in PBS	3 × 5 min
g) Inkubation mit Nachweisantikörper	30 min
h) Waschen in PBS	3 × 5 min
i) Farbreaktion Vorbereitung i.-iii. während g bzw. h	5 min
AL=L<i. Auftauen der vorgefertigten Substratlösung (DAB in PBS)
AL=L CB=3<(Diaminobenzidin in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung)@ AL=L CB=3<ii. Filtration@ AL=L CB=3<iii. Zugabe von Wasserstoffperoxid direkt vor der Inkubation@ AL=L CB=3<iv. Inkubation@	k) Waschen in Wasser	5 min
l) Gegenfärbung: Hämalaun	1 min

4. Eindeckung (9 Schritte)	ca. 30 min
a) Bläuen in Leitungswasser	10-15 min
b) aufsteigende Alkoholreihe	5 × 2 min
c) Xylol	2 × 2 min
d) Eindecken in Depex	1 min

5. Gesamtdauer (39 Schritte)

ca. 4 Std.

6. Auswertung

- mikroskopische Auswertung durch angelernte Kraft
- mindestens 50 Zellen auszählen
- über 20% der Urothelzellen positiv = positiver Befund
unter 20% der Urothelzellen positiv = negativer Befund

E FILTER-IMMUN-CYTOLOGIE (DÜSSELDORF)

1. Konservierung der Proben (1 Schritt)	1 min
Vorfixierung mit 10% Esposti-Fixativ	1 min
AL=L<Lagerfähigkeit mind. 14 Tage

2. Herstellung der Präparate (1 Schritt)	2 min
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)	2 min
AL=L<keine weitere Fixierung

3. Färbung (5 Schritte)	15 min
AL=L<keine weitere Vorbehandlung
a) Einschritt-Inkubation mit monoklonalem und Nachweisantikörper zusammen	5 min
b) Waschen	3 min
c) Farbreaktion (Vorbereitung i. während b)	5 min
AL=L<i. Auftauen der vollständigen Substratlösung (BCIP + NBT in TBS)
AL=L CB=3<(5-Brom-4-Chlor-3-Indolphosphat + Nitroblautetrazolium)@ AL=L CB=3<ii. Inkubation@	d) Gegenfärbung: Kernechtrot	1 min

4. Eindeckung (5 Schritte)	10 min
a) Alkoholreihe	3 × 2 min
b) Eindeckung in 3,3-Diphenyl-1-Propanol	1 min
c) Umrandung mit Klarlack	1 min

5. Gesamtdauer (12 Schritte)

ca. ½ Std.

6. Auswertung

2. FILTER-IMMUN-CYTOLOGIE BEISPIELE FÜR VERSCHIEDENE NACHWEISVERFAHREN A NACHWEISANTIKÖRPER-PHOSPHATASE

Wie unter Beispiel 1.E wird gebundener monoklonaler Antikörper durch markierten polyklonalen Antikörper gegen Maus-Immunglobulin nachgewiesen. Die Nachweisreaktion erfolgt dem allgemeinen Standard folgend in zwei Schritten.

B NACHWEIS MIT PHOSPHATASE-PROTEIN A

Analog zu polyklonalem Antikörper gegen Maus-Immunglobulin können die Fc-Rezeptoren Protein A bzw. Protein G zum Nachweis unmarkierter monoklonaler Antikörper eingesetzt werden.

C MONOKLONALER ANTIKÖRPER-BIOTIN + PHOSPHATASE-STREPTAVIDIN

Biotin-markierter monoklonaler Antikörper wird durch markiertes Avidin aus Hühnerei bzw. bakterielles Streptavidin nachgewiesen.

D NACHWEISANTIKÖRPER-BIOTIN + PHOSPHATASE-STREPTAVIDIN

Analog zu A wird der gebundene monoklonale Antikörper durch einen polyklonalen Antikörper gebunden, welcher - analog zu C - mit Biotin gekoppelt ist und durch markiertes Avidin bzw. Streptavidin nachgewiesen wird.

E NACHWEISANTIKÖRPER-PEROXIDASE

Alternativ zu Peroxidase kann auch Galactosidase oder Glucose-Oxidase als Marker-Enzym verwendet werden.

F NACHWEISANTIKÖRPER-FLUORESZEIN

Alternativ zu Fluoreszein kann auch Rhodamin (bzw. Tetramethylrhodamin) Texas Red, Phycoerythrin oder Phycocyanin als Fluoreszenzfarbstoff verwendet werden.

G NACHWEISANTIKÖRPER-KOLLOIDALES GOLD

Kolloidale Gold-Markierungen lassen sich bei Bedarf durch eine nachgeschaltete Silberverstärkung intensivieren. Kolloidales Gold läßt sich ersetzen durch kolloidales Eisen.

H MONOKLONALER ANTIKÖRPER-KOLLOIDALER FARBSTOFF

Kolloide von (z. B. mit Cibachron-Blau) gefärbten Latex-Partikeln, welche direkt an den monoklonalen Antikörper gekoppelt werden - oder wahlweise an einen polyklonalen Nachweisantikörper - ermöglichen eine Färbung ohne enzymatische Nachweisreaktion.

Bei den Nachweisverfahren nach A bis D kann statt Phosphatase als Markierung jedes Enzym nach E und jeder Farbstoff nach F und G eingesetzt werden. Alle Enzym- und Farbstoff- Markierungen können dabei sowohl als direkte Markierung (analog C bzw. H) am monoklonalen Antikörper erfolgen oder als indirekte Markierung nachgeschalteter Nachweisreagenzien (analog A, B, D, E, F, G).

A FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER UND NACHWEISANTIKÖRPER-PHOSPHATASE (11 Schritte)

a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper
b) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
c) Inkubation mit Nachweisantikörper
d) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
e) Farbreaktion (Vorbereitung i. während d)
- a) Auftauen der vollständigen Substratlösung (z. B. BCIP + NBT) (Bis-Chlor-Indolphosphat + Nitroblautetrazolium)
- b) Inkubation
f) Gegenfärbung: Kernechtrot

B FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER UND NACHWEIS MIT PHOSPHATASE-PROTEIN A (11 Schritte)

a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper
b) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
c) Inkubation mit Phosphatase-gekoppeltem Protein A
d) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
e) Farbreaktion (Vorbereitung i. während d)
- a) Auftauen der vollständigen Substratlösung (z. B. BCIP + NBT) (Bis-Chlor-Indolphosphat + Nitroblautetrazolium)
- b) Inkubation
f) Gegenfärbung: Kernechtrot

C FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER-BIOTIN UND PHOSPHATASE-STREPTAVIDIN (11 Schritte)

a) Inkubation mit Biotin-markiertem monoklonalem Antikörper
b) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
c) Inkubation mit Phosphatase-gekoppeltem Streptavidin
d) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
e) Farbreaktion (Vorbereitung i. während d)
- a) Auftauen der vollständigen Substratlösung (z. B. BCIP + NBT) (Bis-Chlor-Indolphosphat + Nitroblautetrazolium)
- b) Inkubation
f) Gegenfärbung: Kernechtrot

D FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER, NACHWEISANTIKÖRPER- BIOTIN UND PHOSPHATASE-STREPTAVIDIN (15 Schritte)

a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper
b) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
c) Inkubation mit Biotin-markiertem Nachweisantikörper
d) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
e) Inkubation mit Phosphatase-gekoppeltem Streptavidin
f) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
g) Farbreaktion (Vorbereitung i. während f)
- a) Auftauen der vollständigen Substratlösung (z. B. BCIP + NBT) (Bis-Chlor-Indolphosphat + Nitroblautetrazolium)
- b) Inkubation
h) Gegenfärbung: Kernechtrot

E FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER UND NACHWEISANTIKÖRPER-PEROXIDASE (11 Schritte)

a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper
b) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
c) Inkubation mit Peroxidase-markiertem Nachweisantikörper
d) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
e) Farbreaktion (Vorbereitung i, während d)
- a) Auftauen der Substratlösung (z. B. Diaminobenzidin)
- b) Inkubation
f) Gegenfärbung: Hämalaun

F FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER UND NACHWEISANTIKÖRPER-FLUORESZEIN (8 Schritte)

a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper
b) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
c) Inkubation mit Fluoreszein-markiertem Nachweisantikörper
d) Waschen, dreifacher Pufferwechsel

G FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER UND NACHWEISANTIKÖRPER-KOLLOIDALES GOLD (4 Schritte)

a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper
b) Waschen, dreifacher Pufferwechsel
c) Inkubation Nachweisantikörper, der mit kolloidalem Gold gekoppelt ist
d) Waschen, dreifacher Pufferwechsel

H FÄRBUNG MIT MONOKLONALEM ANTIKÖRPER GEKOPPELT AN GEFÄRBTE LATEXPARTIKEL (2 Schritte)

a) Inkubation mit monoklonalem Antikörper, der an (z. B. Cibachron-Blau) gefärbte Polystyrol-Latexpartikel gekoppelt ist
b) Waschen

3. FILTER-CYTOLOGIE ANWENDUNGSBEISPIELE A URINCYTOLOGIE/Onkologische Fragestellung

Als Urincytologien werden im folgenden cytologische Untersuchungen von Spontanurin, Katheterurin sowie Blasenspülflüssigkeit bezeichnet.

Bei Patienten mit Blasentumoren treten häufig in Verbindung mit dem Tumorleiden Entzündungen auf. Das massive Auftreten von Entzündungszellen behindert nicht nur die cytologische Analyse bei konventionellen Färbungen, sondern speziell in der Immuncytologie werden Kreuzreaktionen der verwendeten monoklonalen Antikörper mit den Entzündungszellen beobachtet, die eine Auswertung besonders erschweren. Bei dieser Fragestellung ist deshalb die Wahl eines Filters vorteilhaft, bei dem die Porenweite so gewählt ist, daß Entzündungszellen passieren können, während die interessierenden Epithelzellen auf dem Filterpräparat verbleiben (z. B. 10 µm). Eine Vorfixierung mit Esposti-Fixativ konserviert nicht nur die zu untersuchenden Proben, sondern beseitigt ebenfalls durch Lyse der Erythrocyten einen potentiellen Störfaktor.

B URINCYTOLOGIE/Nicht-Onkologische Fragestellung

Bei Urincytologien mit anderen Fragestellungen (z. B. Nierenfunktionsdiagnostik, Harnwegsentzündungen) sind oft die Blutzellen für die Untersuchung von Bedeutung für die Diagnosestellung. In diesem Falle muß die Porenweite so gewählt werden, daß alle Blutzellen auf dem Filterpräparat erhalten bleiben (z. B. 5 µm). Eine Konservierung der Proben (z. B. mit Thiomersal oder Natriumazid) ist möglich, jedoch darf in diesem Falle kein hämolysierendes Esposti-Fixativ verwendet werden.

C REZEPTORSTATUS AN FEINNADEL-PUNKTATEN (FNP)

Feinnadelpunktionen werden besonders bei Tumorverdacht durchgeführt, wobei aus dem tumorverdächtigen Areal Gewebe eingesaugt wird, das anschließend cytologisch untersucht wird (entsprechend A und B). Dabei können je nach untersuchtem Organ bzw. der Verdachtsdiagnose entsprechend unterschiedliche monoklonale Antikörper als Tumormarker eingesetzt werden (z. B. bei FNP Niere RC 38, bei FNP Lunge NSE etc.). Speziell bei bei FNP Prostata und FNP Mamma ist der Rezeptorstatus, d. h. die Bindung markierten Hormons (Androgenrezeptoren im Falle des Prostatakarzinoms, Oestrogen rezeptoren im Falle des Mammakarzinoms) von prognostischer Bedeutung für ein Ansprechen auf eine Antihormon-Therapie. Die Standardmethode für den Rezeptorstatus verwendet radioaktiv markiertes Hormon. Obwohl natürlich ein radioaktiver Nachweis auf Filtercytologien möglich ist, ist im Methodenbeispiel - dem heutigen Stand der Forschung entsprechend - ein nichtradioaktiver Nachweis mit biotiniertem Hormon beschrieben.

D NACHWEIS VON PAPILLOMVIRUS-DNA AN VAGINALABSTRICHEN

Das Humane Papillomvirus (HPV) bzw. bestimmte Stämme dieses Virus sind mutmaßlich an der Genese des Zervixkarzinoms beteiligt. Neben cytologischen und Immuncytologischen Untersuchungen der Abstriche gewinnt daher zunehmend auch der molekulargenetische Nachweis der onkogen wirksamen HPV-Stämme durch in-situ Hybridisierung an Bedeutung. Dabei wird am entsprechend fixierten Präparat mittels einer spezifischen Gensonde die virale Erbsubstanz (DNA) nachgewiesen.

E GENETISCHE UNTERSUCHUNG VON FRUCHTWASSERPUNKTATEN

Fruchtwasserpunktionen sind bei Risikoschwangerschaften ein probates Mittel zur Überprüfung des wachsendes Embryos auf genetische Aberrationen, welche auf spätere Mißbildungen schließen lassen. Zu den häufigsten beobachteten chromosomalen Aberrationen gehört die sog. Trisomie 21 - ein Vorliegen eines zusätzlichen Chromosomes Nr. 21 - die sich durch cytogenetische oder neuerdings auch molekulargenetische Untersuchungen nachweisen lassen. Nachteil einer cytogenetischen Untersuchung ist, daß erst Kulturen angelegt werden müssen, weil nur bei in Teilung befindlichen Zellen die Chromosomen überprüft werden können. Der molekulargenetische Nachweis des kritischen Chromosomes durch in-situ-Hybridisierung mit einer markierten Gensonde ermöglicht eine sofortige Analyse von teilungsinaktiven Zellen. Die Präparate werden durch Filtration des Punktates auf eine Filtermembran mit 8-10 µm Porenweite gewonnen.

F CYTOLOGIE DER ATEMWEGE

Für cytologische Untersuchungen aus Sputum, Trachealspülung, Bronchio-Alveolären Lavagen (BAL) oder Abstrichen von Schleimhäuten der Atemwege ist zur Filtration zuerst ein schleimlösendes Agens (z. B. Ammoniumchlorid, Säure oder Acetylcystein) zuzugeben. Das kleinzellige Lungenkarzinom stellt die häufigste Tumorerkrankung der Atemwege dar, deshalb findet die Filtration mit Filtern von 5 µm Porenweite statt. Die Färbung erfolgt bei der Verdachtsdiagnose Lungenkarzinom beispielsweise mit dem Tumormarker NSE nach 3.A bzw. 1.E oder nach konventioneller Papanicolaou-Färbung.

G CYTOLOGIE DES GASTROINTESTINAL-TRAKTES

Die Diagnose des Magenkarzinomes wird häufig durch cytologische Untersuchungen von Abstrichen der Magenschleimhaut bzw. Magensaft bestätigt. Als probater Tumormarker kommt hier das Carcino-Embryonale Antigen (CEA) zur Anwendung. In analoger Form wird zur Diagnostik des Lebertumors aus Feinnadelpunktion oder Gallensekret ein cytologisches Präparat hergestellt; der Tumormarker der Wahl ist hier das Alpha-Fetoprotein (AFP). In beiden Fällen sind Membranen mit 8 µm Porenweite zur Filtration geeignet.

H CYTOLOGIE VON GELENKPUNKTATEN

Bei Gelenkentzündungen werden häufig Gelenkpunktionen mit anschließender cytologischer Untersuchung des Punktates durchgeführt. Für bestimmte Diagnosen kann dabei die Frage der Entzündungsaktivität interessieren, in diesem Zusammenhang würden Helfer-T-Zellen und Suppressor-T-Zellen durch Doppelmarkierung gefärbt und differenziell quantifiziert.

Für die Genese von Rheumatoider Arthritis - einer der häufigsten chronischen Gelenksentzündungen - wird die Beteiligung von Parvoviren angenommen. Der Nachweis von Viren im entzündeten Gelenk erfolgt durch eine in-situ-Hybridisierung mit einer spezifischen Gensonde, welche mit Biotin (oder einem anderen geeigneten Hapten) markiert ist.

J HÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN (Tumorerkrankungen)

Die verschiedenen Formen von Blutkrebs (Leukämien) werden heute noch routinemäßig durch cytochemische Farbreaktionen endogener Enzyme nachgewiesen. Zur besseren Auswertung der Präparate empfiehlt sich eine Erythocytolyse, jedoch kann wegen einer Beeinträchtigung der Enzymaktivität dafür nicht mit Esposti-Fixativ gearbeitet werden (ersatzweise kann 0,17 mol/l Ammoniumchlorid verwendet werden). Die Filterpräparate können gut mit 10 µm-Filtern hergestellt werden. Die verschiedenen Nachweisreaktionen erfordern jeweils ein eigenes Filterpräparat. Der Vollständigkeit halber sei darauf hingewiesen, daß inzwischen für alle Diagnosen der Leukämie spezifische Monoklonale Antikörper vorliegen, die auch eine immuncytologische Differenzierung erlauben. Auch hier würde für jeden Marker ein eigenes Filterpräparat erforderlich sein.

K HÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN (Parasitenerkrankungen)

Zum Nachweis der Blutstadien von Humanparasiten ist die Filtercytologie eine geeignete Methode. Eine Blutprobe wird mit einer Fixier- und Färbelösung (nach Mehlhorn und Peters, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1983) verrührt und dann aufgefiltert. Zur Filtration empfiehlt sich eine Membran mit möglichst großer Porenweite (10 µm), um ein Verstopfen der Poren durch die Reste der lysierten Erythrocyten zu vermeiden. Um jedoch auch kleine Parasiten (Trypanosomen, Plasmodien) zu erfassen, muß mindestens bei einem Präparat eine Porenweite von 1-2 µm gewählt werden. Bei Malariaverdacht (Plasmodium) sollte sogar - eventuell in einem Parallelansatz - eine Cytologie ohne vorherige Erythrocytolyse vorgenommen werden.

L HÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN (Immunstatus)

Als allgemeiner Parameter akuter entzündlicher Prozesse - wie z. B. bei Transplantat abstoßung, Viruserkrankungen oder bakteriellen Infektionen- sowie auch als Aktivitäts marker chronischer Entzündungen - z. B. bei rheumatischen Erkrankungen - wird häufig ein Immunstatus erstellt. Wesentlich ist dabei das Verhältnis von stimulierenden Helfer-T- Lymphozyten zu inhibierenden Suppressor-T-Zellen, die durch eine Doppelmarkierung mit monoklonalen Antikörpern gegen die sie charakterisierenden CD 4- bzw. T₄- und CD 8- bzw. T₈-Antigenen quantifiziert werden. Zum Nachweis eignet sich besonders eine Fluoreszenz markierung mit unterschiedlichen Fluorochromen, alternativ ist aber auch eine Enzym markierung bei anschließender Färbung mit verschiedenfarbigen Substraten möglich.

A URINCYTOLOGIE/Onkologische Fragestellung

1. Konservierung der Proben
Vorfixierung mit 10% Esposti-Fixativ
Lagerfähigkeit mind. 14 Tage
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
Immuncytologie mit dem monoklonalen Antikörper Due ABC 3 nach (1.E)

B URINCYTOLOGIE/Nicht-Onkologische Fragestellung

1. Konservierung der Proben
Konservierung mit 0,1-0,5% Thiomersal oder Natriumazid möglich
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (5 µm Porenweite)
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
Färbung nach Papanicolaou (1.A)

C REZEPTORSTATUS AN FEINNADEL-PUNKTATEN (FNP)

1. Konservierung der Proben
Konservierung mit 0,1-0,5% Thiomersal oder Natriumazid möglich
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
- a) Inkubation mit biotiniertem Hormon
- b) Waschen
- c) Nachweis des gebundenen biotinierten Hormons mit Phosphatase-gekoppeltem Streptavidin wie unter 2.C

D NACHWEIS VON PAPILLOMVIRUS-DNA AN VAGINALABSTRICHEN

1. Konservierung der Proben
sofortige Verarbeitung erforderlich
2. Herstellung der Präparate
- a) Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
- b) Fixierung in 4% Paraformaldehyd
- c) Waschen in Ethanol
- d) Lufttrocknen
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
- a) Rehydrieren in 2 × SSC
  (Natriumcitrat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung, doppelt konzentriert)
- b) Acetylierung mit 0,25% Essigsäureanhydrid in 0,1 mol/l Triethanolamin
- c) Wachen in 2 × SSC
- d) Neutralisation mit 0,1 mol/l Glycin in 0,1 mol/l Tris/HCl (pH 7,0)
- e) Wachen in 2 × SSC
- f) Alkoholreihe (30%, 70%, 96%)
- g) trocknen bei 52°C
- h) Hybridisierung
  - a) Vorbereitung der Hybridisierungslösung aus biotinierter RNA-Sonde, EDTA, Trispuffer (pH 8,0), phys. Kochsalzlösung, Hefe t-RNA, DNA aus Lachsrogen, deionisiertem Formamid
  - b) Aufkochen der Hybridisierungslösung
  - c) Zentrifugation
  - d) Temperieren auf 55°C
  - e) Hybridisierung bei 55°C
- i) 2 × Waschen mit 50% Formamid in 2 × SSC
- j) Inkubation mit RNase A in 2 × SSC bei 37°C
- k) Waschen mit 50% Formamid in 2 × SSC
- l) 3 × Waschen mit 2 × SSC
- m) Nachweis der gebundenen biotinierten Gensonde mit Phosphatase-gekoppeltem Streptavidin wie unter 2.C

E GENETISCHE UNTERSUCHUNG VON FRUCHTWASSERPUNKTATEN

1. Konservierung der Proben
sofortige Verarbeitung erforderlich
2. Herstellung der Präparate
- a) Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
- b) Fixierung in 4% Paraformaldehyd
- c) Waschen in Ethanol
- d) Lufttrocknen
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
- a) Hybridisierung
  - a) Vorbereitung der Hybridisierungslösung aus 60% Formamid, 10% Dextransulfat, 2 × SSC, Heringsrogen-DNA und Biotin-DNA-Probe
  - b) Denaturierung der Probe und des Präparates bei 80°C
  - c) Hybridisierung bei 42°C
- b) 3 × Waschen mit 60% Formamid in 2 × SSC
- c) 3 × Waschen mit 2 × SSC
- d) Waschen mit 0,2% Tween 20 in TBS
- e) Inkubation mit 1% Magermilchpulver in TBS
- f) Waschen mit 0,2% Tween 20 in TBS
- g) Nachweis gebundener DNA-Sonde mit Phosphatase-gekoppeltem Streptavidin wie unter 2.C bzw. 3.D

F CYTOLOGIE DER ATEMWEGE

1. Konservierung der Proben
Vorfixierung mit 10% Esposti-Fixativ
Lagerfähigkeit mind. 14 Tage
Zusatz von 0,1% Ammoniumchlorid zur Schleimlösung
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
Immuncytologie mit monoklonalem Antikörper gegen Neuronspezifische Enolase (NSE) (nach 1.E)

G CYTOLOGIE DES GASTROINTESTINAL-TRAKTES

1. Konservierung der Proben
Vorfixierung mit 10% Esposti-Fixativ
Lagerfähigkeit mind. 14 Tage
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
Immuncytologie mit monoklonalem Antikörper gegen Carcinoembryonales Antigen (CEA) (nach 1.E)

H CYTOLOGIE VON GELENKPUNKTATEN

1. Konservierung der Proben
Konservierung mit 0,1-0,5% Thiomersal oder Natriumazid möglich
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
- a) In-situ-Hybridisierung mit Parvovirus-spezifischer Gensonde (nach 3.D)
- b) Doppelmarkierung mit anti-T₄/anti-T₈ (nach 3.L)

J HÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN (Tumorerkrankungen)

1. Konservierung der Proben
Konservierung mit 0,1-0,5% Thiomersal oder Natriumazid möglich
Erythrozytolyse durch Ammoniumchloridzusatz (0,17 M)
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
Lufttrocknung
(Lagerung bzw. Versand möglich, Verarbeitung nach spätestens drei Tagen)
3. Färbung
- a) Darstellung der alkalischen Leukozytenphosphatase
  - a) Fixierung in Methanol/Formaldehyd
  - b) Spülen in Leitungswasser und lufttrocknen
  - c) Färbung mit α-Naphthylphosphat und Variamin-Blausalz in Trispuffer
    (Färbelösung ist frisch zuzubereiten)
  - d) Spülen in Aqua dest. und lufttrocknen
  - e) Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun
- b) Darstellung der unspezifischen Esterase
  - a) Fixieren in Formaldehyddampf
  - b) Spülen in Leitungswasser und lufttrocknen
  - c) Färbung mit α-Naphthylphosphat und Diazoniumsalz in Phosphatpuffer
    (Färbelösung ist frisch zuzubereiten)
  - d) Spülen in Aqua dest.
  - e) Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun
- c) Darstellung der sauren Phosphatase
  - a) Fixieren in Formaldehyddampf
  - b) Spülen in Leitungswasser
  - c) Färbung mit Naphthol-AS-BI-Phosphat und Diazoniumsalz in Acetatpuffer
    (Färbelösung ist frisch zuzubereiten)
  - d) Spülen in Aqua dest.
  - e) Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun
- d) Darstellung der Peroxidase
  - a) Fixieren in Ethanol/Formaldehyd
  - b) Spülen in Leitungswasser
  - c) Färbung mit 4-Chlor-α-Naphthol und Wasserstoffperoxid in Trispuffer
    (Färbelösung ist frisch zuzubereiten)
  - d) Spülen in Aqua dest.
  - e) Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun
- e) PAS (= Periodic Acid-Schiff)-Reaktion
  - a) Fixieren in Ethanol/Formaldehyd
  - b) Spülen in Leitungswasser
  - c) Oxidation mit Periodsäure in Acetatpuffer
    (Lösung ist frisch zuzubereiten)
  - d) Spülen in Aqua dest.
  - e) Färben in SCHIFFs Reagenz
  - f) Spülen in Aqua dest.
  - g) Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun

K HÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN (Parasitenerkrankungen)

1. Konservierung der Proben
Fixierung und gleichzeitige Färbung durch Gentianaviolettreagenz
(2 ml gesättigte alkoholische Gentianaviolettlösung,
5 ml Eisessig
100 ml 5% Formalin)
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite) zur Darstellung von parasitären Würmern
Filtration auf Polycarbonat-Membran (2 µm Porenweite) zur Darstellung von parasitären Protozoen
3. Färbung
entfällt (Präparate sind vorgefärbt durch Schritt 1)

L HÄMATOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN (Immunstatus)

1. Konservierung der Proben
Vorfixierung mit 10% Esposti-Fixativ
Lagerfähigkeit mind. 14 Tage
2. Herstellung der Präparate
Filtration auf Polycarbonat-Membran (10 µm Porenweite)
(Lagerung bzw. Versand der Filterpräparate ist nach Trocknung möglich)
3. Färbung
Simultane Färbung mit
Fluoreszein (FITC)-markiertem monoklonalem anti-CD 4 (anti-T₄) und
Rhodamin (TRITC)-markiertem monoklonalem anti-CD 8 (anti-T₈)

Claims

1. Verfahren zur Untersuchung von Zellen aus Körperflüssigkeiten durch Nachweis von zell-assoziierten Determinanten, wobei

a) die Probe mittels Filtration auf einen für die mikroskopische Auswertung geeigneten Träger aufgebracht wird,
b) durch Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen das zell- assoziierte Antigen eine Antigen-Antikörper-Reaktion ausgelöst wird,
c) die nicht gebundenen Antikörper entfernt werden,
d) eine Farbreaktion durchgeführt wird und
e) anschließend durch Gegenfärbung antigen-positive und antigen-negative Zellen dargestellt werden,

dadurch gekennzeichnet, daß
die Filtration mittels einer Kapillarporenmembran erfolgt, die Epithelzellen anreichert, aber Granulozyten durchläßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe zwecks Vorfixierung mit einer Lösung versetzt wird, die eine Lysierung der Erythrozyten und zugleich eine Konservierung der nicht lysierten Zellen bewirkt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-Antikörper-Reaktion durch Zugabe markier ter Antikörper ausgelöst wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Zugabe von nicht markierten Antikörpern zusätz lich markierte Nachweisantikörper eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß nicht markierte Antikörper zusammen mit den markierten Nachweisantikörpern eingesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lysierung der Erythrozyten durch Zugabe einer Eis essig enthaltenden Lösung bewirkt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konservierung oder Fixierung der nicht lysierten Zellen durch Zusatz einer Methanol enthaltenden Lö sung bewirkt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vorfixierung eine aus 10 Teilen Eisessig, aus 45 Teilen Methanol und aus 45 Teilen Wasser bestehende Lösung eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß durch Filtration der zu untersuchenden Probe Leukozyten und Granulozyten entfernt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe über eine folienförmige Membran filtriert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine aus Polycarbonat bestehende Membran eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine aus Polyester bestehende Membran eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-22, dadurch gekennzeichnet, daß die filtrierte Probe mit einem Eindeckmittel versetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Eindeckmittel 3,3-Diphenyl-1-Propanol verwendet wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-Antikörper-Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-Antikörper-Reaktion für 5 Minuten durch geführt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-Antikörper-Reaktion unter Wärmezufuhr durch geführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur von 37°C die Antigen-Antikörper- Reaktion durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß während der Antigen-Antikörper-Reaktion eine Bestrahlung mit Mikrowellen erfolgt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtdauer des Verfahrens ca. 30 Minuten beträgt.

21. Verfahren nach Ansprüchen 1-20, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis zellulärer Antigene mittels einer durch Zugabe monoklonaler Antikörper ausgelösten Antigen-Antikörper- Reaktion, der Nachweis von Stoffwechselfunktionen durch die Bestimmung von Enzymaktivitäten oder Rezeptorbindung und der Nachweis genetischer Determinanten (DNA, RNA) mittels spezifischer Gensonden erfolgt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-20, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) durch Zugabe von Gensonden für zell-asso ziierte Nukleinsäuren eine in-situ-Hybridisierung erfolgt, in Schritt c) die nicht gebundenen Gensonden entfernt werden und in Schritt e) durch Gegenfärbung positive und negative Zellen dargestellt werden.