DE60300339T2

DE60300339T2 - Verfahren zum Nachweis von Karzinomen in solubilisierten zervikalen Körperproben

Info

Publication number: DE60300339T2
Application number: DE60300339T
Authority: DE
Inventors: Dr. Ruediger Ridder; Anja Dr. Reichert; Matthias Dr. Herkert; Magnus Dr. Von Knebel Doeberitz
Original assignee: Roche MTM Laboratories AG
Current assignee: Roche MTM Laboratories AG
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2003-08-25
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2023-08-26
Also published as: DE60300339D1; JP2012032412A; US7932047B2; CA2528490A1; AU2004317284B2; US20070190529A1; MXPA05013903A; RU2405158C2; JP5619336B2; EP1507148A1; BRPI0414030B1; WO2005088311A1; CN1836166A; CN1836166B; BRPI0414030B8; EP1664788A1; JP2007503208A; HK1092219A1; JP5677270B2; ATE461449T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur frühen Diagnose von Karzinomen sowie deren Vorstufen, hauptsächlich Karzinome des oberen Respirationstrakts oder des Anogenitaltrakts, in einer gelösten Körperprobe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Vorsorgeprogramme zur Erkennung verschiedenster Karzinome werden schon seit Mitte der 50-er Jahre angeboten. In Bezug auf zervikale Karzinome basieren sie hauptsächlich auf der morphologischen und zytologischen Untersuchung zytologischer Ausstriche des Gebärmutterhalses, dem sogenannten Pap-Test, welcher auf der Basis gynäkologischer Routineuntersuchungen in regelmäßigen Abständen bei Frauen ab dem 20. Lebensjahr durchgeführt wird. Anhand der Zellmorphologie werden die Ausstriche in mehrere Intensitätsgrade dysplastischer Zellveränderungen unterteilt. Gemäß Pap I–V, sind die Intensitätsgrade normales Zellbild, leichte Dysplasie, mittelschwere Dysplasie, ernsthafte Dysplasie und invasives Karzinoma zu unterscheiden. Wenn der Pap-Test zu einem auffälligen Ergebnis führt, wird eine kleine Biopsie genommen und einer histopathologischen Untersuchung unterzogen, bei der die Art und Intensität der Dysplasie bestimmt und als zervikale intraepitheliale Neoplasie (CINI–III) klassifiziert wird.
Trotz aller Vorsorgeprogramme, sind die jährlich 400.000 neuen Fälle von zervikalen Karzinomen, die bei Frauen am häufigsten vorkommenden Karzinome. Dies ist unter anderem auf die Tatsache zurückzuführen, dass bis zu 30% der Ergebnisse des Pap-Tests falsch negativ sind.
Beim konventionellen Screening für zervikale Karzinome, werden Abstriche zum Nachweis neoplastischer Läsionen des Gebärmutterhalses verwendet. Beim Screeningverfahren müssen mehrere Arten von Läsionen unterschieden werden. Ursachen für Läsionen können beispielsweise Entzündungen (aufgrund infektiöser Agenten oder physischer oder chemischer Beschädigungen) oder präneoplastische und neoplastische Veränderungen sein. In morphologischen Untersuchungen werden Läsionen verschiedener Eigenschaften unterschieden. So müssen Zytologen und Pathologen für die Untersuchung von Abstrichen besonders geschult sein, und sogar erfahrene Fachleute verzeichnen eine hohe Inter- und Intra-Untersuchungsabweichung bei einer Diagnosestellung, die auf zytologischen Proben beruht. Im Allgemeinen basieren die Ergebnisse der Untersuchung auf der subjektiven Interpretation von diagnostischen Kriterien des untersuchenden Pathologen/Zytologen. Demzufolge bleibt der Anteil von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen bei Screeningtests unbefriedigend hoch.
Jedoch kann die Reproduzierbarkeit der Untersuchungsergebnisse durch den Einsatz von unterstützenden molekularen Hilfsmitteln verbessert werden. Ein molekulares Hilfsmittel kann beispielsweise der zyklinabhängige Kinaseinhibitor p16^INK4a sein. Es hat sich gezeigt, dass dieser zyklinabhängige Kinaseinhibitor häufig in Verbindung mit Tumoren steht. Jedoch kann sich die Beteiligung von p16^INK4a verschiedenartig je nach Tumor äußern.
R. Klaes et al. (2001) Int. J. Cancer 92, 276–284 beschreibt beispielsweise den Nachweis einer Überexpression von p16^INK4a in zytologischen Untersuchungsverfahren zur Diagnosestellung einer zervikalen Dysplasie. Es wird eine Verbindung zwischen der Überexpression von p16^INK4a, die durch immunozytologische Färbeverfahren bestimmt wird, und dem dysplastischen Zustand der jeweiligen positiv gefärbten Zellen aufgezeigt. Dieses Phänomen der immunozytologisch und immunohistologisch nachweisbaren Überexpression des p16^INK4a Proteins in Zellen, wird mit bestimmten Tumorarten und besonders mit den HPV-assozierten Tumorarten in Verbindung gebracht. Unter diesen Tumorarten ist besonders der Gebärmutterhalskrebs zu finden. Der Einsatz von p16^INK4a bei zytologischen zellbasierten Diagnosen von Gebärmutterhalskrebs wird des weiteren zum Beispiel in der US-Patentanmeldung US2002/0106685A1 erläutert. In diesem Dokument wird der immunozytochemische Nachweis der Überexpression von p16^INK4a in Zellen zusammen mit dem immunochemischen Nachweis der Überexpression anderer geeigneter Marker offenbart. Besonders der Co-Nachweis von mehr als einem Markermolekül durch immunochemische Verfahren bei Präparationen von Körperproben, vorzugsweise in einer einzigen Zelle, soll sich zur Diagnoseverbesserung beim Gebärmutterhalskrebs-Screening eignen.
Im Gegensatz dazu wurde der p16^INK4a Genlokus schon zuvor im US Patent 6,090,578 mit Tumoren assoziiert. Jedoch offenbart dieses Dokument eine Assoziation von Mutationen im p16^INK4a Genlokus mit der Anwesenheit von Tumoren. Dieses Dokument offenbart somit den Nachweis von mutierten p16^INK4a Molekülen als geeignete Diagnosestellung. Diese Verwicklung des p16^INK4a Gens in Tumoren wird auch durch US 6,579,420 unterstützt, wo die Assoziation von Dearrangements und Deletionen in der chomosomalen Region 9p21 und besonders im p16^INK4a Gen beschrieben wird.
Jedoch kann das Problem mit der Konservierung und Präparation von Proben nicht nur durch den zusätzlichen Einsatz von molekularen Markern gelöst werden. Eine weitere Komplikation bei der Durchführung von zytologischen und histologischen Untersuchungen zu Screeningzwecken und besonders bei der Anwendung von Verfahren zum Nachweis von molekularen Markern, entsteht durch die strengen Vorsichtsmaßnahmen, die getroffen werden, damit die Proben keine Artefakte oder ungenaue Ergebnisse produzieren.
Dies ist zum Teil auf die Instabilität der zellbasierten morphologischen Information zurückzuführen und zum Teil auch auf die Instabilität der molekularen Marker, die während der Tests nachgewiesen werden sollen. Dies ist teilweise auf die Instabilität der zellbasierenden morphologischen Information und teilweise auf die Instabilität der molekularen Marker, die in den Tests eingesetzt werden sollen, zurückzuführen. Wenn die Proben nicht sachgemäß präpariert, transportiert und gelagert werden, kann die zellbasierende Information oder sogar die molekulare Information verloren gehen oder verändert werden. Also kann die Diagnose unmöglich sein oder zu Artefakten neigen. Zum Beispiel ist die Interpretation von Biopsien oder zytologischen Präparationen häufig durch (physikalisch oder biochemisch) zerstörte Zellen schwierig oder unmöglich. Außerdem scheint in Bezug auf Gewebeproben oder Biopsien die Konservierung von molekularen Probenbestandteilen, die durch hohe Umsatzraten gekennzeichnet sind, kompliziert aufgrund des Zeitraumes, der bis zur Durchdringung der gesamten Probe durch geeignete Konservierungssubstanzen verstreicht.
Die morphologisch unterstützten Diagnostikverfahren, die routinemäßig in der Technik durchgeführt werden, haben zwei große Nachteile. Erstens sind die Verfahren stark von der individuellen Wahrnehmung der Ausführenden abhängig. Zweitens ist die morphologische Information sehr anfällig für Zerfallsprozesse und so für die Generierung von Artefakten nach der Präparation der Proben. Beide Aspekte tragen zu einer nicht angemessenen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei.
Deswegen liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren durch das zervikale Karzinome früh und zuverlässig diagnostiziert werden können. Zusätzlich sollte eine Differenzierung in Bezug auf gutartige entzündliche oder metaplastische Veränderungen von dysplastischen Präneoplasien durch dieses Verfahren möglich sein. Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis von Karzinomen auf biochemischer Basis in gelösten Proben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Nachweis zervikaler Karzinome, zervikaler intraepithelialer Neoplasien oder zervikaler Karzinome In-Situ in einer gelösten menschlichen Probe eines Menschen. Das Verfahren beinhaltet folgende Schritte: a) Gewinnen einer zervikalen Körperprobe von einem Menschen, b) Auflösen der zervikalen Körperprobe in einem Lysepuffer, und c) Bestimmen der Überexpression des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in der gelösten zervikalen Probe durch Vergleich des Levels des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 innerhalb besagter gelöster zervikaler Probe mit dem Level in einer gelösten gesunden menschlichen zervikalen Probe.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auch an ein In-Vitro diagnostisches Produkt, welches Antikörper enthält, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet und an feste Träger fixiert sind, zum Messen von p16 in einer gelösten Probe.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich des Weiteren auf ein Testkit zur Bestimmung des Levels des zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16, welches Antikörper, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet sind sowie ein Lysepuffer zur Lösung einer Körperprobe enthält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die OD Werte des ELISA Tests, der den Level von p16 in gelösten zervikalen Proben ermittelt; für Details des Versuchs siehe Beispiel 1.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis des Anmelders, dass zellzyklusregulierende Proteine in vielen Karzinomen überexrpimiert werden, z. B. in Karzinomen des oberen Respirationstrakts oder in anogenitalen, besonders in zervikalen Karzinomen, sowie in den jeweiligen Vorstufen dieser Karzinome. Ein Beispiel für die zellzyklusregulierenden Proteine sind Zykline. Zyklinabhängige Kinasen, welche die Zykline regulieren, sind besonders hervorzuheben. Zyklinabhängige Kinaseinhibitoren, welche im Gegenzug die zyklinabhängigen Kinasen regulieren, sind noch stärker hervorzuheben. Beispiele für zyklinabhängige Kinaseinhibitoren sind die Proteine p14, p15, p19, p21 und p27. Der Anmelder hat herausgefunden, dass die Intensität der Überexpression der zellzyklusregulierenden Proteine mit dem Grad der Zelldysplasie zusammenhängt.
Gemäß der Erfindung, werden die Erkenntnisse des Anmelders für ein Verfahren zur frühen Diagnose von Karzinomen und deren Vorstufen eingesetzt, welches die Bestimmung der Überexpression von Zellzyklusproteinen in Körperproben beinhaltet.
Gemäß der Erfindung können zytologische oder histologische Untersuchungen durch den Einsatz von molekularen Markern ersetzt werden. Solche Marker werden oft in immuno-histochemischen Färbereaktionen verwendet oder im Verlauf von In-Situ Hybridisierungsreaktionen. Kombinationen von morphologischen Untersuchungen und immuno-histochemischen Färbereaktionen basierend auf Markermolekülen, die charakteristisch für Karzinome des Gebärmutterhalses sind, können zu verbesserten Ergebnissen führen. Die morphologische Untersuchung bleibt mühsam und zeitaufwendig und deswegen teuer, sogar wenn sie durch die molekularen Verfahren unterstützt wird, welche die Ergebnisse zuverlässiger machen. Außerdem ist die Diagnose auf einer morphologisch zellbasierenden Ebene, auch wenn sie durch molekulare Parameter unterstützt wird, abhängig von der individuellen Wahrnehmung der Morphologie einzelner Untersucher. Deswegen ist die Diagnose von der Person abhängig, welche die Untersuchung durchführt.
Die Erfinder konnten des Weiteren zeigen, dass in spezifischen Fällen molekulare Marker ohne zusätzliche Unterstützung durch zellbasierende morphologische Untersuchungen als diagnostische Hilfsmittel verwendet werden können. Verfahren zur Diagnose von Karzinomen auf ausschließlich molekularer Ebene, ohne die Unterstützung von zellbasierender Information, sind auf Fälle beschränkt, wo Marker oder Level von Marker eindeutig spezifisch für den zu charakterisierenden Zustand sind. Dies ist besonders der Fall, wenn die Marker keine menschlichen Substanzen sind. Zum Beispiel kann der Nachweis von Virusinfektionen in Probenlösungen durchgeführt werden, da die Marker, die charakteristisch für die Anwesenheit von Viren in Geweben sind, nicht in gesunden menschlichen Geweben vorkommen.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass der menschliche zyklinabhängige Kinaseinhibitor p16 als Marker für Karzinome in biochemischen Marker-basierten Nachweisverfahren dienlich sein kann, obwohl er ein zellzyklusregulierendes Protein ist, das in niedrigen Level in jeglicher normal proliferierenden menschlichen Zelle in bestimmten Stadien des Zellzyklus exprimiert wird.
"p16" oder "zyklinabhängiger Kinaseinhibitor p16" bezieht sich in der vorliegenden Erfindung auf den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16INK4a (auch als CDKN2 oder MTS1 bezeichnet), dessen Gen in der chromosomalen Region 9p21 angesiedelt ist. p16 wurde erstmals in Serrano, M., et al., Nature, 1993 Dec 16; 366(6456): 704–7 beschrieben. Die Bezeichnungen „p16" oder „zyklinabhängiger Kinaseinhibitor p16" in allen grammatikalischen Formen beziehen sich hier auf Nukleinsäuren sowie auf Polypeptidmoleküle. „p16" oder zyklinabhängiger Kinaseinhibitor p16" beinhaltet beispielsweise RNA (mRNA, hnRNA, etc.), DNA (cDNA, Genom-DNA, etc.), Proteine, Polypeptide, Proteoglykane, Glykoproteine und die jeweiligen Fragmente dieser Moleküle.
Der p16 Level bezieht sich auf einen semiquantitativen sowie auf einen quantitativen Wert hinsichtlich der Menge von p16 in einer Probe. Ein quantitativer Wert kann z. B. in Form der Konzentration ausgedrückt werden. Ein semiquantitativer Wert kann in Form einer Skala ausgedrückt werden, z. B. nicht nachweisbare Level, niedrige Level, mittlere Level, hohe Level usw. Der p16 Level kann auch in Form eines abhängigen Parameters, wie der Intensität eines Signals, das in einem Assayformat in Abhängigkeit von der Anwesenheit von p16 generiert wird, ausgedrückt werden. In gewissen Ausführungsformen kann sich der p16 Level auch auf eine qualitative Bestimmung der Anwesenheit von p16 beziehen.
Aufgrund der Expression des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in gewissen gutartigen Zelltypen, die in zervikalen Proben vorliegen, scheint die Diagnose von Dysplasien, basierend auf dem Level des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16, ohne zusätzliche Information über die zelluläre Morphologie schwierig oder unmöglich zu sein. Es ist in der Technik bekannt, dass bis zu 30% der metaplastischen Zellen, die in zervikalen Abstrichen vorhanden sind, für den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 auf einem mittleren bis hohen Level immunoreaktiv sind. Außerdem sind endometriale Zellen, die unter gewissen Umständen in zervikalen Abstrichen vorhanden sein können, für p16 positiv. In zytologischen oder histologischen Testverfahren beeinflusst diese Tatsache die Diagnose nicht, da die Zelltypen leicht von dysplastischen Zellen hinsichtlich ihrer zellulären Morphologie unterschieden werden können.
Überraschenderweise haben die Erfinder herausgefunden, dass es durch die Bestimmung eines Schwellenwerts des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 möglich ist, den Nachweis oder die Diagnose von Dysplasien sogar ohne die zelluläre Morphologie zu ermöglichen.
Die Bezeichnung "Karzinome und ihre Vorstufen" umfasst Karzinome jeglicher Art und Herkunft sowie deren jeweilige Vorstufen. Zum Beispiel können dies Karzinome des oberen Respirationstraktes oder anogenitale Karzinome, hauptsächlich aber die zervikalen Karzinome sein. In Verbindung mit letzteren müssen besonders deren Vorstufen, wie z. B. zervikale intraepitheliale Neoplasien (CINI–III), Karzinome In-Situ (CIS), etc. erwähnt werden. Vorstufen umfassen gemäß der vorliegenden Erfindung alle Vorläuferstadien und Vorläufer von Karzinomen oder andere Malignitäten. Im Hinblick auf zervikale Karzinome können sich gemäß der vorliegenden Erfindung Vorläuferstadien oder Vorstufen auf Stadien zervikaler intraepithelialer Neoplasien beziehen, die durch geeignete Klassifikationssysteme wie z. B. der CIN Klassifikation (CIN I–III), der Pap Klassifikation (PAP I–PAP V) oder der Bethesda Klassifikation (LSIL, HSIL) identifiziert werden.
Die Bezeichnung "zellzyklusregulierende Proteine" umfasst zellzyklusregulierende Proteine jeglicher Art und Herkunft. Zum Beispiel können die Proteine Zykline sein. Sie können auch zyklinabhängige Kinasen sein, welche die Zykline regulieren. Beispiele für zyklinabhängige Kinasen sind die Proteine cdk4 und cdk6. Insbesondere können sie auch zyklinabhängige Kinaseinhibitoren sein, welche im Gegenzug die zyklinabhängigen Kinasen regulieren. Beispiele für zyklinabhängige Kinaseinhibitoren sind die Proteine p14, p15, p16, p18, p19, p21 und p27, und hauptsächlich p16.
Die Bezeichnung "Körperprobe" umfasst beliebige Körperprobe, in welcher zellzyklusregulierende Proteine nachgewiesen werden können. Beispiele solcher Körperproben sind Sekrete, Abstriche, Lavagen, Körperflüssigkeiten, Sperma, Zell- und Gewebeproben, Blut, Ausstriche, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle, Magen-Darm-Sekretionen, Lymphe, Knochenmark, Aspirate und Biopsien von Organen wie Nadel- oder Punchbiopsie, und (Fein-)Nadelaspirate. Hauptsächlich handelt es sich um Ausstriche, Abstriche und Biopsien, wenn es um den Nachweis von anogentitalen Karzinomen, z. B. zervikalen Karzinomen geht. Biopsien gemäß der vorliegenden Erfindung können z. B. Resektionsproben von Tumoren, endoskopisch präparierte Gewebeproben oder Punch- bzw. Nadelbiopsien von Organen sein.
Körperproben gemäß der vorliegenden Erfindung können feste oder konservierte Zell- oder Gewebeproben umfassen. Zell- oder Gewebeproben können z. B. in einer gewöhnlichen in der Technik bekannten Probensammlung, Lager- oder Transportlösung konserviert werden, wie beispielsweise in handelsüblichen Konservierungslösungen (Formalinlösung, Cytcy „PreserveCyt", Digene „Universal Collection Medium", Tripath „Cytorich", etc.). Diese Lösungen können für die Konservierung von Zellbestandteilen ein oder mehrere Alkohole, Aldehyde, Ketone, Säuren, Metall-Ione oder Sublimate, Äther etc. enthalten. Alkohole beinhalten Methanol, Ethoanol, (N- oder I-)Propanol, (N-, I- oder T-)Butanol oder höher verzweigte oder unverzweigte Alkohole. Aldehyde beinhalten Formaldehyde, Acetaldehyde, Glutaraldehyde etc. Ketone, wie z. B. Acetone können auch verwendet werden. Säuren für Standardprobenlösungen umfassen organische Säuren (Essigsäure, Trichloro-Essigsäure, Salizylsäure, Picrinicsäure) oder anorganische Säuren wie Chromsäure. Standardprobenlösungen können Metalle, wie Silber, Kupfer, Chrom, Quecksilber, Osmium oder Uranium beinhalten. Salzhaltige Lösungen wie Uranyl-Azetate, Potassiumbichromate, Ammoniumsulfate, etc. können Bestandteile von Konservierungslösungen sein.
Zellen, die in geeigneten Lösungen (Alkohole etc.) oder feste Gewebeproben können gemäß der vorliegenden Erfindung als Rohproben eingesetzt werden. In einer Ausführungsform kann die Körperprobe zum Beispiel ein zervikaler Abstrich sein, der in eine alkoholhaltige Konservierungslösung transferiert wurde. Des weiteren können Körperproben, die sofort nach der Entnahme einer Zelllyse unterzogen wurden gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Anmelder hat eine Anzahl schneller und einfacher Möglichkeiten um molekulare Proben zu konservieren herausgefunden, wobei die morphologische Information der Proben verloren geht. Proben können zum Beispiel in einer reproduzierbaren und leicht zu lagernden und transportierbaren Form präpariert werden, indem man die Zellkomponenten der Rohprobe in einem geeigneten Lösungsmittel sofort nach oder sogar während der Probennahme auflöst. Körperflüssigkeiten können direkt vom menschlichen Körper in eine Lösung transferiert werden, die geeignete Detergenzien und Konservierungssubstanzen enthält. Außerdem können Gewebeproben sofort denaturierenden Lösungsbedingungen unterworfen (eventuell unterstützt durch physikalische Kräfte) und so konserviert werden. Wenn man geeignete Inhaltsstoffe im Lösungsmittel verwendet, können die molekularen Bestandteile der Ausgangsprobe konserviert werden und es kann kein Abbau stattfinden. Der Abbau durch enzymatische Aktivität kann zum Beispiel durch Enzyminhibitoren minimiert werden. Auf diese Weise kann eine Probenlösung einfach die molekularen Eigenschaften der Probe im Moment der Auflösung repräsentieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Rohproben in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst. Solche Lösungsmittel können zum Beispiel wässrige Lösungen von chaotropen Agenzien wie z. B. Harnstoff, GuaSCN, Formamid, von Detergenzien wie anionischen Detergenzien (z. B. SDS, N-Lauryl-Sarcosine, Natriumdeoxycholate, Alkyl-Aryl-Sulfonate, langkettige (Fettsäure-)Alkoholsulfate, Olefinsulfate und -sulfonate, Alfa-Olefinsulfate und -sulfonate, sulfathaltige Monoglyceride, sulfathaltige Äther, Sulphosuccinate, Alkansulfonate, Phosphat-Ether, Alkylisothionate, Saccharoseester), kationische Detergenzien (z. B. Zetyltrimethylammoniumchloride), nicht-ionische Detergenzien (z. B. Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100, NP-40, Igepal CA-630, N-Octyl-Glucosid) oder amphotere Detergenzien (z. B. CHAPS, 3-Dodecyl-Dimethylammonio-Propan-1-Sulfonate, Lauryldimethylaminoxide) und/oder von Alkalihydroxiden wie NaOH oder KOH sein. Im Allgemeinen kann gemäß der vorliegenden Erfindung jede geeignete Flüssigkeit als Lösungsmittel für den Lysepuffer verwendet werden. Die Flüssigkeit kann organisch oder anorganisch sein, kann eine reine Flüssigkeit sein, eine Mischung aus Flüssigkeiten oder eine Lösung aus Flüssigkeitssubstanzen. Die Flüssigkeit kann auch zusätzliche Substanzen zur Verbesserung der Lösungseigenschaften enthalten. In bestimmten Ausführungsformen, wo die Zelllyse ohne Detergenzien erreicht werden kann, können Hyper- oder hypotonische Lösungen oder Puffer oder einfach Wasser oder eine organische Flüssigkeit als Lösung verwendet werden. Jede Flüssigkeit, die sich dafür eignet die Zellbestandteile von Körperproben ganz oder zum Teil aufzulösen, kann gemäß der vorliegenden Erfindung als Lysepuffer verwendet werden. Somit müssen Lysepuffer gemäß der vorliegenden Erfindung keine Puffersubstanzen oder Pufferkapazitäten enthalten.
In einer Ausführungsform ist die Lösung so zusammengesetzt, dass Zellen, Zelltrümmer, Nukleinsäuren, Polypeptide, Lipide und andere Biomoleküle, die potenziell in der Probe vorliegen, aufgelöst werden. In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Lösung so zusammengesetzt sein, um die differenzielle Lyse von spezifischen Bestandteilen der Körperprobe sicherzustellen und andere Bestandteile unaufgelöst zu lassen.
Die Lösung, in der die Körperprobe gemäß der vorliegenden Erfindung aufgelöst wird, kann zudem ein Agens oder mehrere Agenzien, welche den Abbau der Bestandteile in der Rohprobe verhindern, enthalten. Solche Bestandteile können beispielsweise Enzyminhibitoren wie Proteinaseinhibitoren, RNAse-Inhibitoren, DNAse-Inhibitoren etc. umfassen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Probe direkt in der Form aufgelöst, wie sie von den einzelnen Test-Individuen gewonnen wurde. Proteinaseinhibitoren können z. B. Inhibitoren von Serinproteinasen, Inhibitoren von Cysteinproteinasen, Inhibitoren von Asparaginproteinasen, Inhibitoren von Metallproteinasen, Inhibitoren von Säureproteinasen, Inhibitoren von alkalischen Proteinasen oder Inhibitoren von neutralen Proteinasen umfassen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Probe weiter aufbereitet werden, bevor sie aufgelöst wird. Solche Aufbereitungsvorgänge können zum Beispiel das Wegspülen von Fremdkörpern wie Schleim oder Ähnlichem, die Auftrennung oder Konzentration von Zellbestandteilen, der Zellerhalt und Zelltransport umfassen. Auf diese Weise sind die Zellbestandteile der Rohproben in einer einzigen Probenlösung enthalten.
Die Präparation der Probe zur Anwendung in einem Verfahren, wie es hier offenbart wird, kann auch mehrere Schritte weiterer Präparationen der Probe umfassen, wie die Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen, Isolierung von Polypeptiden oder Nukleinsäuren, die Präparation von Festphasen-fixierten Peptiden oder Nukleinsäuren oder die Präparation von Beads, Membranen oder Objektträgern, an die die zu bestimmenden Moleküle kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt sind.
Die Bezeichnung "Bestimmen der Überexpression von zellzyklusregulierenden Proteinen" umfasst beliebige Verfahren, die sich dazu eignen, die Expression zellzyklusregulierender Proteine oder deren kodierender mRNAs sowie eine Amplifikation der entsprechenden Gene nachzuweisen. Um eine Überexpression zu bestimmen, wird die zu untersuchende Körperprobe mit einer entsprechenden Körperprobe einer gesunden Person verglichen. Eine solche Probe kann in einer standardisierten Form vorhanden sein.
Der Vergleich mit normalen, gesunden Körperproben kann anhand verschiedener Verfahren durchgeführt werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, kann der Vergleich direkt durch eine Kontrollreaktion mit gesunden Gewebe- oder Zellproben durchgeführt werden. Diese gesunden Gewebe- oder Zellproben können von einem gesunden Menschen stammen, oder von gesunden Regionen eines Menschen sowie von Zellkulturzellen, welche die Expression des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in gesunden Zellen aufweisen können. In einer weiteren Ausführungsform kann der Vergleich indirekt durch Vergleichen des Levels des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 innerhalb der zu untersuchenden Probe mit dem Level des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in normalen, gesunden Proben erfolgen. Die Informationen bezüglich des Levels in normalen, gesunden Gewebe- oder Zellproben kann durch eine repräsentative Anzahl von Tests beschafft werden oder durch wissenschaftlichen Publikationen, die Informationen über den Expressionslevel des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in normalen gesunden Zellen liefern. Der Vergleich kann durch die Verwendung eines Werts für die Konzentration des p16 Proteins oder der Nukleinsäuren durchgeführt werden, oder durch einen charakteristischen Wert abhängig von der Protein- oder Nukleinsäurenkonzentration, wie z. B. der optischen Dichte unter definierten Reaktionsbedingungen. Ansonsten kann der bekannte Wert durch eine Ersatzkontrolle eines Peptids oder rekombinanten Proteins repräsentiert werden. So kann der in normalen gesunden Proben vorliegende Level durch eine Kontrollprobe eines rekombinanten Proteins oder eines Peptids im Testverfahren repräsentiert werden.
Im Allgemeinen kann der Vergleich des Levels in der zu untersuchenden Probe mit Hinblick auf einen Wert durchgeführt werden, der in jedem einzelnen Testverfahren definiert, oder schon vordefiniert wird. Der vordefinierte Wert kann global für das Testverfahren festgelegt werden. Ansonsten ist der Wert nur für ein bestimmtes Lot von Testreagenzien gültig. Zum Beispiel kann der Referenzwert nur für einen definierten Kalibrierungszeitraum gültig sein und bei der Kalibrierung des Testprozesses definiert werden.
Der p16 Level in einer gesunden menschlichen zervikalen Probe kann in einer standardisierte Probenlösung bestimmt werden. Eine standardisierte Probenlösung kann eine Lösung eines gelösten Pools normaler Zellen oder normaler Gewebeproben umfassen. Der Probenpool kann beispielsweise ein Pool zytologischer Proben mit normaler Diagnose einer Screeningpopulation sein, oder ein Pool normaler Zellen von histologischen Proben. Des Weiteren kann ein Pool normaler Zellen aus einer Gewebekultur normaler zervikaler epithelialer Zellen entnommen werden. Die Probenlösung kann z. B. mit Hinblick auf den Zellgehalt pro ml der Probenlösung standardisiert werden. Es kann auch jeder andere Parameter zur Standardisierung verwendet werden. Die Probenlösung kann z. B. in einer standardisierten Form bereitgestellt werden, um die Stabilität und Reproduzierbarkeit der Testergebnisse zu gewährleisten. In bestimmten Ausführungsformen kann eine solche Lösung als Bestandteil des Kits zu Vergleichs- oder Kalibrierungszwecken bereitgestellt werden.
In bestimmten Ausführungsformen erfolgt der Vergleich des in einer Patientenprobe vorliegenden Levels des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 mit dem Level in einer normalen gesunden Körperprobe unter Verwendung eines Anhalte- oder Grenzwerts für die p16 Konzentration. Der Anhaltewert ist in diesem Zusammenhang ein Wert (z. B. für die Konzentration des p16 Proteins, angegeben in z. B. mg/ml oder für die optische Dichte, gemessen unter definierten Bedingungen in einem ELISA Test), der sich dazu eignet, normale gesunde Proben von kranken Proben zu trennen. Beispielsweise werden alle Proben, die Werte über dem Anhaltewert liefern, als dysplastisch betrachtet, wohingegen die Proben, mit Werfen unter dem Anhaltewert als gesund betrachtet werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann der Grenz- oder Anhaltewert so festgelegt werden, dass hochgradige Dysplasien von allen weniger schweren Dysplasien unterschieden werden. In weiteren Ausführungsformen, kann der Anhaltewert so definiert werden, dass gesunde Proben von Dysplasien, einschließlich Vorläuferstadien unterschieden werden. Es ist somit möglich, dass Testformat so zuzuschneiden, dass verschiedene Funktionen erfüllt werden können, wie die Früherkennung von Läsionen und sogar Vorläuferstadien der Läsionen oder auch die Erkennung von Läsionen, die einer sofortigen Therapie bedürfen.
Die (Über)expression von zellzyklusregulierenden Proteinen können auf der Nukleinsäuren- und Proteinebene nachgewiesen werden. Beim Nachweis auf der Proteinebene ist es beispielsweise möglich, Antikörper zu verwenden, die gegen zellzyklusregulierende Proteine gerichtet sind. Diese Antikörper können in den verschiedensten Verfahren eingesetzt werden, wie z. B. bei Western Blot, ELISA oder Immunopräzipitation. Es ist sinnvoll, die Antikörper auf festen Trägern, wie z. B. ELISA Platten, Reaktionsgefäße, Beads, Sphären, Membranen, kolloidalen Metalle (z. B. Gold), poröse Materialien, Kapillarenoberflächen (z. B. Flow-Through-Test), Teststreifen oder Latexpartikeln zu fixieren.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis der Markermoleküle aus einer Lösung gelöster Körperproben durchgeführt. Der Nachweis kann in der Lösung oder unter Einsatz von Festphasen-fixierter Reagenzien ausgeführt werden.
Eine Festphase gemäß der vorliegenden Erfindung kann verschiedene Ausführungsformen fester Substanzen umfassen wie z. B. flache Oberflächen, Partikel (einschließlich Mikro-, Nano-Partikel oder sogar kleinere Partikel). In bestimmten Ausführungsformen können die Partikel als Sphären, Beads, Kolloide, oder ähnliches bereitgestellt werden. Die Festphasenfixierung der Reagenzien in einem Testkit oder in einem In-Vitro Diagnostischen Produkt kann über die direkte Fixierung oder indirekte Fixierung durchgeführt werden. Die direkte Fixierung kann über die kovalente Bindung, nicht-kovalente Bindung, Assoziierung, oder die Oberflächenadsorption erfolgen. Die indirekte Fixierung kann durch die Antikörperbindung an Agenzien, die selbst direkt an Festphasen fixiert sind erfolgen. Bindeagenzien beinhalten z. B. Avidin, Streptavidin, Biotin, Digioxingenin, Antikörper oder ähnliches.
Der Nachweis eines oder mehrerer molekularer Marker kann in einem einzigen Reaktionsgemisch oder in zwei oder mehreren separaten Reaktionsgemischen erfolgen. Die Nachweisreaktionen für mehrere Markermoleküle können zum Beispiel gleichzeitig in Multiwell-Reaktionsgefäßen durchgeführt werden. Die Nachweisreaktion für Markermoleküle kann eine oder mehrere Reaktionen mit Nachweisagenzien umfassen, die entweder die ursprünglichen Markermoleküle erkennen, oder vorzugsweise die vorherigen Moleküle (z. B. Primär-Antikörper), die eingesetzt wurden, um die ursprünglichen Marker zu erkennen. Die Nachweisreaktion kann weiterhin eine Reporterreaktion umfassen, welche den Level der Marker anzeigt, die charakteristisch für proliferative Störungen oder für die Normalisierungsmarker sind.
Die Nachweisreaktion zum Nachweis des Levels des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in gelösten Proben kann in einer Lösung oder mit Festphasen-fixierten Reagenzien erfolgen. In bestimmten Ausführungsformen kann die Nachweisreaktion in einer Lösung durchgeführt werden, derartige Verfahren können beliebige Methoden umfassen, die sich für den Nachweis molekularer Interaktionen (Bindung eines Antikörpers oder Bindungsagens an ein Antigen) in einer Lösung eignen. Die Verfahren zur Bestimmung einer molekularen Interaktion (Veränderung der Leitfähigkeit, Massenveränderungen, Licht-, UV-, IR-Veränderungen, magnetisch, spektrometische Veränderungen, Plasmonresonanz etc.) sind dem Fachmann in der Technik bekannt. In bestimmten Ausführungsformen kann der Nachweis ein Verfahren beinhalten, bei dem ein Komplex von antigengebundenen Nachweisreagenzien für den Nachweis an eine Festphase adsorbiert wird. Damit kann die nicht-kovalente Bindung der Analyte an eine Festphase im Verlauf oder sogar zu Beginn der Nachweisreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Eine Sonde für den Nachweis der Markermoleküle kann jegliches Molekül sein, das spezifisch an besagtes Markermolekül bindet. Die Probe kann zum Beispiel ein Antigen-Bindeagens wie Antikörper (monoklonal oder polyklonal), Antikörperfragmente oder künstliche Moleküle, die Antigen-bindende Epitope enthalten, sowie DNA- oder RNA-Bindemoleküle wie Proteine oder Nukleinsäuren sein. Nukleinsäuren, die andere Nukleinsäuren binden, können zum Beispiel Oligonukleotide für Nachweiszwecke oder Primer sein. Ein Molekül erkennt ein anderes Molekül, wenn es mit diesem spezifisch interagiert. Spezifische Interaktion kann zum Beispiel spezifische Bindung des anderen Moleküls oder an das andere Molekül sein. Die Bezeichnung „Antikörper" in allen grammatikalischen Formen soll sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung generell auf antigenbindende Moleküle beziehen, einschließlich aber nicht ausschließlich monoklonaler und polyklonaler Antikörper, Antikörperfragmente, antigenbindende Epitope, Miniantikörper, Peptidomimetics mit antigenbindenden Eigenschaften, Anticaline und Diabodies.
Der Ausdruck „ein Molekül erkennt ein anders Molekül" soll bedeuten, dass das erste Molekül spezifisch mit dem anderen Molekül interagiert. Spezifische Interaktion kann zum Beispiel spezifische Bindung des anderen Moleküls oder an das andere Molekül sein.
Die Reporterreaktion kann jeder Vorgang sein, welcher ein Signal als Resonanz auf die Anwesenheit eines Markers oder auf die Bindung einer spezifischen Sonde an den Marker sein. Zum Beispiel kann eine Reaktion, die eine farbige Verbindung, eine fluoreszente Verbindung, eine lichtabgebende Verbindung, eine strahlungsabgebende Verbindung, oder die Konzentration einer oder mehrerer dieser Verbindungen als nachweisbare Konzentration in einem vordefinierten Bereich eines Testprodukts als Reporterreaktion dienen.
Geeignete Formate für die Nachweisreaktion im Sinne der vorliegenden Erfindung können Blot-Techniken, wie Western-Blot, Southern-Blot oder Northern-Blot sein. Die Blot-Techniken sind in der Technik dem Durchschnittsfachmann bekannt und können zum Beispiel als Elektro-Blot, Semdry-Blot, Vakuum-Blot oder Dot-Blot durchgeführt werden. Des weiteren können immunologische Verfahren zur Bestimmung von Molekülen eingesetzt werden, wie zum Beispiel Immunpräzipitation oder immunologische Assays wie EIA, ELISA, RIA, FIA (fluoreszente Immunoassys), Lateralflow-Assays (unter Einsatz von porösen Elementen oder Kapillare), immunchromatografische Strips, Flow-Through-Assays, Latexagglutination-Assays etc. In nukleinsäurebasierenden Annäherungen können Hybridisierungs- oder Amplifikationstechniken eingesetzt werden.
Immunoassays gemäß der vorliegenden Erfindung können sowohl kompetitive als auch nichtkompetitive Immunoassays wie z. B. Sandwich-Assays umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann immunochemisches oder auf Nukleinsäuren basierendes Testen unter Einsatz eines Testprodukts für klinische Laboratorien durchgeführt werden. Ein solches Testprodukt kann jedes Produkt umfassen, welches sich zu immunochemisch- oder nukleinsäurebasierenden Testen eignet, einschließlich beliebigem Format wie Point of Care sowie Bench-Top oder Laborprodukte. Die Produkte können beispielsweise als offene oder geschlossene Systeme bereitgestellt werden. Das System kann auf beliebiger Methodik basieren, wie Mikrotiterplatten, Multiwellplatten, Flow-Through oder Lateral-Flow Systeme, Mikrochip- oder Array-basierte Systeme, sowie Bead- oder Membran-basierte Systeme. Die Nachweisverfahren können beliebige dem Fachmann bekannte Verfahren umfassen, die sich für immunochemische oder auf Nukleinsäuren basierende Nachweisreaktionen eignen. Derartige Nachweissysteme können zum Beispiel Lumineszenz-Systeme (Elektrolumineszenz, Biolumineszenz, Photolumineszenz, Radiolumineszenz, Chemilumineszenz, Elektrolumineszenz), Fluoreszenz-basierte Systeme, auf Konduktivität basierende Nachweissysteme, Strahlung (Licht, UV, Röntgenstrahlen, Gamma- Strahlen etc.), Plasmonresonanz (z. B. Oberflächenplasmonresonanz SPR) oder jedes andere bekannte Verfahren sein.
Die Bezeichnung poröse Elemente soll gemäß der vorliegenden Erfindung jede dreidimensionale Anordnung poröser Substanzen betreffen. Solche porösen Elemente können beispielsweise Membrane, Beads o. ä. beinhalten.
Durch die vorliegende Erfindung ist es möglich, Karzinome frühzeitig, d. h. in deren Vorstufen, zu diagnostizieren.
Ein weiterer Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der Erfindung. Ein solches Kit umfasst zum Beispiel:

(a) ein Reagenz zum Nachweis der Expression eines zellzyklusregulierenden Proteins, z. B. ein gegen ein solches Protein gerichteter Antikörper oder eine für ein solches Protein kodierende Nukleinsäure und jeweils Teile davon
(b) ein Lysepuffer zur Auflösung der Körperprobe
(c) konventionelle Agenzien, wie Puffer, Träger, Marker, etc., und optional
(d) ein Agens für Kontrollreaktionen, z. B. ein zellzyklusregulierendes Protein, eine für ein solches Protein kodierende Nukleinsäure und jeweils Teile davon, oder eine Zellpräparation

Darüber hinaus können eine oder mehrere der einzelnen Komponenten vorhanden sein. Zum Beispiel kann das Nachweisreagenz sowie andere Festphasen-fixierte Reagenzien vorhanden sein.
Im Allgemeinen kann der Lysepuffer jedes dem Fachmann bekannte Lösungsmittel sein. Der Lysepuffer zum Einsatz im Kit kann zum Beispiel ein organisches oder wässriges Lösungsmittel von chaotropen Agenzien sein wie z. B. Harnstoff, GuaSCN, Formamid, von Detergenzien wie anionischen Detergenzien (z. B. SDS, N-Lauryl-Sarcosine, Natriumdeoxycholate, Alkyl-Aryl-Sulfonate, langkettige (Fettsäure-) Alkoholsulfate, Olefinsulfate und -sulfonate, Alfa-Olefinsulfate und -sulfonate, sulfathaltige Monoglyceride, sulfathaltige Äther, Sulphosuccinate, Alkansulfonate, Phosphat-Ether, Alkylisothionate, Saccharoseester), kationische Detergenzien (z. B. Zetyltrimethylammoniumchloride), nicht-ionische Detergenzien (z. B. Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100, NP-40, Igepal CA-630, N-Octyl-Glucosid) oder amphotere Detergenzien (z. B. CHAPS, 3-Dodecyl-Dimethylammonio-Propan-1-Sulfonate, Lauryldimethylaminoxide) und/oder von Alkalihydroxiden wie NaOH oder KOH. In bestimmten Ausführungsformen, wo die Lyse der Zellen ohne Detergenzien erreicht werden kann, können Hyper- oder hypotonischen Lösungen oder Puffer oder einfach Wasser oder eine organische Flüssigkeit als Lösungsmittel verwendet werden. Jede Flüssigkeit, die sich dafür eignet die zellulären Bestandteile von Körperproben komplett oder teilweise aufzulösen, kann gemäß der vorliegenden Erfindung als Lysepuffer angesehen werden. Somit müssen Lysepuffer gemäß der vorliegenden Erfindung keine Puffersubstanzen enthalten oder Pufferkapazität besitzen.
Um optimale Ergebnisse des Assays zu erhalten ist der pH-Wert eines Lysepuffers, der bei dem Assay verwendet werden kann ungefähr neutral. Der pH-Wert des Lysepuffers liegt im Bereich von 4 bis 10. In bestimmten Ausführungsformen liegt der pH-Wert im Bereich von 5 bis 9. In einer anderen Ausführungsform liegt er im Bereich von 6 bis 8, in einer weiteren im Bereich von 6,5 bis 7.5.
Beispiele für Lysepuffer können der folgenden Tabelle 1 entnommen werden. Tabelle 1
nb: nicht bestimmt; +/–: mäßig; +: gut; ++: sehr gut; +++: ausgezeichnet
In bestimmten Situationen kann der zyklinabhängige Kinaseinhibitor p16 in den gelösten Proben abgebaut werden und muss so nicht nachgewiesen werden. Dies ist besonders der Fall, wenn die Proben direkt auf ein Lysemedium transferiert werden und darin für eine bestimmte Zeit gelagert werden. Um einen Abbau zu verhindern kann der Lysepuffer des Weiteren einen oder mehrere Agenzien enthalten, welche den Abbau der Bestandteile innerhalb der Rohprobe verhindern. Solche Bestandteile können zum Beispiel Enzyminhibitoren, wie Proteinaseinhibitoren, RNAse-Inhibitoren, DNAse-Inhibitoren, etc. umfassen. Die Inhibitoren können z. B. Proteinaseinhibitoren beinhalten, ausgewählt aus der folgenden Tabelle 2.
Tabelle 2:
Zu Stabilisierungszwecken kann der Lysepuffer auch Bulk-Proteine (z. B. Albumin wie Bovin Serum Albumin oder Kalbserum Albumin oder andere Bulk-Proteine) enthalten, die dem Abbau der Probenproteinen entgegenstehen.
Die Bulk-Proteine können zum Beispiel in Kombination mit Proteinaseinhibitoren verwendet werden oder anstelle von Proteinaseinhibitoren hinzugefügt werden. In einer Ausführungsform kann das Lösungsmittel so ausgewählt werden, damit es mit der Assayleistung (z. B. ELISA) kompatibel ist und die gelösten Proben direkt im Assay verwendet werden können.
In manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der Lysepuffer so angesetzt werden, dass ein spezifischer Anhaltewert festgelegt werden kann.
Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein In-Vitro diagnostisches Produkt. Ein In-Vitro diagnostisches Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung ist durch Festphasen-fixierte Nachweisreagenzien charakterisiert, die für einen zyklinabhängigen Kinaseinhibitor spezifisch sind. In einer Ausführungsform sind die Nachweisreagenzien für den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 spezifisch.
In der Technik gibt es einige In-Vitro diagnostischen Produkte, bei denen Reagenzien zum Nachweis des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in histologischen oder zytologischen Proben eingesetzt werden.
Diese In-Vitro diagnostischen Produkte sind zellbasierende Nachweisprodukte, welche das p16 Antigen in Zellen oder Gewebe nachweisen, jedoch nicht in gelösten Proben.
Da p16 ein intrazelluläres Antigen ist, ist es möglich, dass es von den Nachweisreagenzien in der Lösung erst nach der Permeabilisierung der Zellen erkannt wird. Damit schließt der in der Technik bekannte In-Vitro diagnostische Einsatz von Reagenzien zum Nachweis des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 die Festphasenfixierung der Nachweisreagenzien aus. Nach dem Stand der Technik gibt es keine Lehren über das Design von Testkits oder In-Vitro Diagnostika, die p16 fixierte Festphasen-Nachweisreagenzien enthalten. Ein Verfahren zur Diagnosestellung auf der Basis von gelösten Proben schien nach Stand der Technik nicht durchführbar zu sein und wurde bisher noch nicht vorgeschlagen.
Aus diesem Grund ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein In-Vitro diagnostisches Produkt bereitzustellen, welches Sonden beinhaltet, die gegen den an eine Festphase fixierten zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16^INK4a gerichtet sind und eine Diagnosestellung von Karzinomen und deren Vorläuferläsionen in einer gelösten Probe ermöglichen. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, können die Sonden beispielsweise gegen das p16^INK4a Protein gerichtete Antikörper oder Antikörper-Fragmente enthalten. Ein Vorteil der In-Vitro diagnostischen Produkte der vorliegenden Erfindung ist die leichte und rationelle Diagnosestellung von Karzinomen und deren Vorläuferläsionen. Der Test kann sowohl zu Screeningzwecken, als auch zu Diagnosezwecken geeignet sein und kann zur primären Diagnose und auch zur Überwachung des Krankheitsverlaufes eingesetzt werden. Die In-Vitro diagnostischen Produkte können in bestimmten Ausführungsformen in klinischen Laboratorien zum Point-of-Care-Testing oder sogar zum Selbsttesten einsetzbar sein.
Die In-Vitro diagnostischen Produkte, die Festphasen-fixierte Reagenzien zum Nachweis des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 beinhalten, können für den Nachweis verschiedener Karzinomentitäten und deren jeweilige Vorläuferläsionen geeignet sein. Die In-Vitro diagnostischen Produkte können für die Analyse jeglicher Art von lysierten Körperproben verwendet werden.
Die Antikörper können durch direkte oder indirekte Fixierung an die Festphase fixiert werden. Die direkte Fixierung kann durch kovalente oder nichtkovalente Bindung an Oberflächen erfolgen. Die indirekte Fixierung kann durch Bindung des Antikörpers an Agenzien, welche selbst direkt an Festphasen fixiert sind, erfolgen. Solche Agenzien können Antikörper oder andere Bindeagenzien wie Avidin, Streptavidin, Biotin, Digioxingenin oder ähnliches umfassen.
Die In-Vitro diagnostischen Produkte, die gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, sind ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus

a. einem ELISA Produkt umfassend Antikörper, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet sind, fixiert an ELISA Platten, ELISA Streifen oder ELISA Mikrotiterplatten;
b. einem Lateral-Flow Testprodukt, umfassend Antikörper, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet sind, fixiert an Teststreifen, kolloide Goldpartikel oder Latexpartikel;
c. einem Flow-Through Assay, umfassend Antikörper, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet sind, fixiert an poröse Elemente oder an die Oberfläche von Kapillaren;
d. einem Latexagglutinations-Assay, umfassend Antikörper, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet sind, fixiert an Latexpartikel; und
e. einem Immunoassay, umfassend Antikörper, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet sind, fixiert an Beads, Membrane oder Mikrosphäre.

Die ELISA Produkte können jeglicher, dem Fachmann bekannter Art sein. Diese Produkte umfassen Produkte für Sandwich ELISA Formate, für kompetitive ELISA Formate und jedes andere ELISA Format.
Lateral-Flow Assays zum Einsatz als In-Vitro diagnostisches Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung sind beliebige Lateral-Flow Assays mit mindestens einem Festphasen-fixierten Reagenz, das an den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor bindet. Solche Produkte können mehrere Mechanismen zur Visualisierung der Testergebnisse umfassen. In bestimmten Ausführungsformen können die Tests sekundäre Nachweisreagenzien, die gegen den zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 gerichtet sind umfassen, oder ein andere Bestandteil, der in den Testmomenten Einheiten nachweist. Nachweisbare Einheiten können kolloides Gold, (farbige) Latexpartikel usw. umfassen.
Flow-Through Assays können gemäß der vorliegenden Erfindung Produkte umfassen, die auf Kapillaren oder porösen Elementen (wie Membrane, Beads oder andere dreidimensionale Anordnungen poröser Substanzen) basieren. Abhängig von der Ausführungsform muss die Größe der Poren oder Kapillaren angepasst werden um optimale Flussbedingungen sicherzustellen.
Durch die vorliegende Erfindung ist es möglich, Karzinome frühzeitig zu diagnostizieren. Hauptsächlich Vorstufen von Karzinomen können frühzeitig erkannt werden. Es muss auch hervorgehoben werden, dass es möglich ist, zwischen inflammatorisch bedingten oder metaplastischen Veränderungen dysplastischer Präneoplasien zu unterscheiden. Des Weiteren sind die Ergebnisse, die durch das Verfahren gemäß dieser Erfindung erhältlich sind, keiner subjektiven Auswertung unterlegen, sodass z. B. falsch negative Ergebnisse und falsch positive Ergebnisse eines Pap-Tests oder histologischer Präparationen vermieden werden können. Außerdem zeichnet sich die vorliegende Erfindung durch ein schnelles und einfaches Handling aus, sodass sie für umfassende Screeningmaßnahmen, hauptsächlich auch in Dritte-Welt-Ländern eingesetzt werden kann. Somit leistet die vorliegende Erfindung einen wichtigen Beitrag zur heutigen Krebsdiagnostik.
BEISPIELE
Beispiel 1: Nachweis einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie in einem ELISA Testformat
33 zervikale Abstriche in einem Lysepuffer wurden einem ELISA basierten Nachweis der Überexpression des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in Lösungen, die von den in den Abstrichen enthaltenden Zellen präpariert wurden, unterworfen.
Der ELISA Test wurde wie folgt durchgeführt:
(A) Zelllyse
Zervikale Abstrichbürsten wurden in 15 ml Gefäße gegeben, die 2 ml des mtm Lysepuffer (2% Triton X-100, 0,4% SDS, 0,6 mM PMSF in PBS) enthielten. Die in der Bürste vorliegenden zervikalen Zellen wurden mindestens 20 Stunden lysiert. Die Lysate der zervikalen Abstrichproben wurden dann in 2 ml Röhrchen transferiert und dann bei 4°C (15 min bei 28.000 × g (16.600 rpm HighspeedCentrifuge JEC Mult RF)) zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen transferiert. Der Überschuss kann bei –20°C gelagert werden.
(8) Durchführung des ELISA Tests
Beschichten der ELISA Platten
Die Stock-Lösung des p16 spezifischen Antikörperklons „mtm E6H4" wurde mit PBS verdünnt um eine fertige Beschichtungslösung zu erhalten.
50 μl der Beschichtungslösung wurde in jede Kavität der ELISA Platten gegeben.
Für die Beschichtung wurden die Platten über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Beschichtungslösung wurde von den ELISA Platten entfernt und die Platten wurden in einem automatisierten ELISA Waschgerät wie folgt gespült.

• 7 × 250 μl Waschpuffer (0.1% Tween20 (v/v) in PBS)

Inkubation mit den Proben
Nach Entfernen des Blockpuffers wurden 100 μl der lysierten Zellproben pro Kavität hinzugegeben.
Für die Kalibrierung des Tests wurden verschiedene Konzentrationen des rekombinanten p16 Proteins (0 pg/ml, 50 pg/ml,100 pg/ml, 200 pg/ml, 400 pg/ml, 800 pg/ml) zum Test hinzugefügt.
Die Proben wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden die Proben in einem automatisierten ELISA Waschgerät wie folgt gewaschen.

• 7 × 250 μl Waschpuffer. Der restliche Puffer wurde entfernt.

Inkubation mit einem Detektionsantikörper
Es wurde eine Arbeitslösung aus dem biotinyliertem sekundären Antikörperklon mtm D7D7, der für das p16 Protein spezifisch ist durch Verdünnung der Stocklösung angesetzt.
100 μl der Arbeitslösung wurden pro Kavität hinzugegeben.

• 7 × mit 250 μl Waschpuffer.

Nachweis
Streptavidin-HRP-Polymere (1 mg/ml) wurden 1:10 vorverdünnt. (4 μl + 36 μl Inkubationspuffer); die endgültige Inkubationslösung wurde durch 1:300 Verdünnung mit Inkubationspuffer (0,1% BSA in PBS) bis zur endgültigen Konzentration von 0,33 μg/ml angesetzt.
100 μl dieser Lösung wurden pro Kavität hinzugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde der Puffer entfernt und die Platten wurden manuell mit 200 μl Waschpuffer pro Kavität 5 Mal gewaschen.
Substratinkubation
Das TMB Substrat wurde eine Stunde im Dunkeln auf 25°C equilibriert.
100 μl der Substratlösung wurden pro Kavität hinzugegeben.
Die ELISA Platten wurden bei 25°C exakt 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Hinzugabe von 80 μl 2,5 M H2SO4 gestoppt.
Innerhalb 5 Minuten nach Stoppen der Reaktion, wurde die optische Dichte (OD) bei 450 nm bestimmt. Nach der Auswertung der Ergebnisse lieferte jede Probe einen OD Wert.
Die Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse des Versuchs. Die ELISA Ergebnisse wurden mit den diagnostischen Ergebnissen des Papanicolaou Tests (PAP Test, zervikale Zytologie) der gleichen Patientinnen verglichen. Die zervikale Zytologie wurde gemäß der Münchner Klassifikation II (1990) ausgewertet. Pap II unterscheidet zwischen gutartigen Zellen, Cervicitis und Metaplasien, Pap IV zwischen schwerer Dysplasie und Karzinomen In Situ. Es hat sich herausgestellt, dass Proben, die eine größere OD als 0,9 im ELISA Test liefern, denjenigen Proben entsprechen, die durch den konventionellen cytologischen Pap Test als dysplastisch klassifiziert werden.
Bei OD 0,9 als Grenzwert für die Auswertung der Proben, sehen die ELISA Ergebnisse wie folgt aus:
Tabelle 3
Der ELISA Test war positiv bei allen Proben (100%) von Frauen, die eine schwere Dysplasie hatten und negativ bei allen 30 Proben (100%) von Frauen, die keine Dysplasie hatten.
Unter Verwendung des Grenzwertes, der bei diesen Versuchen bestimmt wurde, wurden zytologische Proben von 300 Patientinnen im vorgestellten ELISA Testformat getestet. Anhand dieser Versuche können Proben, die durch eine zytologische Untersuchung als dysplastisch identifiziert wurden, auch im ELISA Testformat als dysplastisch identifiziert werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass es durch die Quantifizierung des p16 Proteins in gelösten Patientenproben möglich ist, Dysplasien in den Proben nachzuweisen. Die Diagnose im vorliegenden Beispiel basiert auf dem Vergleich des p16 Level, der in einer spezifischen Patientenprobe vorliegt, mit dem Level, der in normalen, nicht dysplastischen Proben vorliegt. Der Vergleich wird im Testformat durch Verwendung des im ELISA Test bestimmten Grenzwertes für die OD durchgeführt. Die Proben werden als positiv klassifiziert, wenn der Wert über diesem Grenzwert liegt.
Beispiel 2: Nachweis einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie in einem Lateral Flow Testformat
Neun zervikale Abstriche in PreservCyt (Cytyc Corporation Boxborough, Mass.) Lösung wurden einem konventionellen PAP Test unterworfen und gleichzeitig einem Lateral Flow basierten Nachweis der Überexpression des zyklinabhängigen Kinaseinhibitor p16 in Lösungen, die aus den von den Abstrichen gewonnenen Zellsuspensionen präpariert wurden. Der Lateral Flow Test wurde wie folgt durchgeführt:
(A) Zelllyse
10 ml der Zellsuspensionen der einzelnen zervikalen, PreservCyt^TM fixierten Abstrichproben wurden in ein 15 ml Reaktionsgefäß transferiert. Die Proben wurden 15 Minuten (3000 rpm, Heraeus Varifuge, rotor 8074) bei Raumtemperatur bei 1500 × g zentrifugiert; der Überstand wurde entfernt, das restliche Methanol konnte verdampfen (15 Minuten bei Raumtemperatur); das Pellet wurde in 500 μl Lysepuffer aufgelöst und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß transferiert. Die Lösung wurde bei 4°C zentrifugiert (15 Minuten bei 28000 × g (16600 rpm Microcentrifuge Biofuge fresco)) und der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen transferiert. Der Überstand kann bei –20°C gelagert werden.
(B) Durchführung des Lateral Flow Assays
Befestigen des Fangantikörpers an eine Membran
Die Stocklösung des p16 spezifischen Antikörperklons E6H4 wurde in TBS (enthaltend 1% Bovin Serum Albumin) aufgelöst, um eine Ready-To-Use Spotting-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg Antikörper/ml zu erhalten. Die Ready-To-Use Lösung wurde auf die Nitrozellulosemembran bei 30 μl/30 cm gespottet. Whatman Dochte wurden an einem Ende der Nitrozellulose befestigt und die Dipsticks wurden bei 37°C eine Stunde getrocknet. Danach konnten sie bei Raumtemperatur equilibrieren und wurden in 4 mm breite Dipsticks geschnitten.
Herstellung der Konjungat-Lösung
Die Stocklösung des p16 spezifischen Antikörperklons mtm D7D7, konjungiert an kolloidem Gold (40 nm Partikelgröße), wurde in TBS (enthaltend 1% Bovin Serum Albumin) aufgelöst, um eine Ready-To-Use Detektions-Antikörper-Lösung mit einer endgültigen Konzentration von 1,0 OD bei 520 nm zu erhalten.
Inkubation mit Proben
Dann wurden 20 μl der lysierten Zellproben zu 20 μl Ready-to-Use Detektions-Antikörper-Lösung in eine Mikrotiterkavität gegeben und vermischt. Der Dipstick, beschichtet mit dem Fangantikörperklon E6H4, wurde in die Kavität gegeben, bis die Probe vollständig aufgesaugt wurde. Das Signal wurde abgelesen während der Dipstick noch nass war.
Ergebnisse
In unserem Testformat zeigten 2 Proben (Probe 1 und 2), die durch die PAP Färbung als PAP IVa klassifiziert wurden und daher dysplastische Zellen enthielten, klar erkennbare violette Banden im Bereich des gespotteten Fangantikörpers. Im Gegensatz dazu wurde keine Bande bei den anderen 7 Proben (Proben 3–9) nachgewiesen, die durch die PAP Färbung als PAP II–III klassifiziert wurden und daher normale Zellen enthielten.
Der ELISA Test wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 4.
Tabelle 4

Claims

Ein In-Vitro Verfahren zum Nachweis zervikaler Karzinome, zervikaler intraepithelialer Neoplasien oder zervikaler Karzinome In-Situ in einer gelösten Probe eines Menschen, wobei das Verfahren folgende Schritte beinhaltet: (a) Auflösen einer von einem Menschen erhaltenen zervikalen Körperprobe in einem Lysepuffer, und (b) Bestimmen der Überexpression des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in der gelösten zervikalen Probe durch Vergleich des Levels des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 innerhalb besagter gelöster zervikaler Probe mit dem Level in einer gelösten gesunden menschlichen zervikalen Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Level des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in der gesunden menschlichen zervikalen Körperprobe als vordefinierter Wert zur Bildung eines Grenzwertes für das Nachweisverfahren bereitgestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Level des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in einer gesunden menschlichen zervikalen Probe in einer standardisierten Probenlösung oder in einer repräsentativen Anzahl gesunder menschlicher zervikaler Proben bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Bestimmung des Levels des zyklinabhängigen Kinaseinhibitors p16 in einer gesunden menschlichen zervikalen Probe a. im Verlauf des Nachweisverfahrens b. bei Kalibrierung des Nachweissystems c. einmal für jedes Lot der Nachweisreagenzien d. als Standardwert für das Nachweisverfahren durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die zervikale Körperprobe ein Abstrich, ein Ausstrich, ein Aspirat, eine Biopsie, eine konservierte zytologische Probe, eine histologische Probe, eine fixierte Zellpräparation oder eine fixierte Gewebepräparation ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei die zervikale Körperprobe a. unmittelbar nach dem Erhalt der Probe b. nach Lagerung und/oder Transport in einem Lagerungspuffer, oder c. nach Transport in einem Transportpuffer aufgelöst wird.