CN107748265A - Cdc6和ki67在制备癌症放疗抵抗的诊断标记物中的应用 - Google Patents

Cdc6和ki67在制备癌症放疗抵抗的诊断标记物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明研究表明：CDC6作为一个癌基因，与正常组织相比，在肿瘤组织中高表达，驱动肿瘤细胞DNA复制和无限增殖。但是经过放疗后，肿瘤细胞出现CDC6持续异常高表达，肿瘤细胞出现衰老，细胞增殖减慢，而KI67是一个细胞增殖状态的分子标志物。这类衰老肿瘤细胞对放疗具有很大抵抗性。因此，肿瘤细胞中CDC6高表达和KI67低表达用于制备癌症放疗抵抗的诊断标记物，也用于制备肿瘤对放射线抵抗或敏感的预测标志物，CDC6作为分子靶标用于制备癌症放射增敏的小分子抑制剂。其中，所述CDC6和KI67要同时联用。CDC6和KI67是指CDC6high（CDC6高表达）和ki67low（ki67低表达）。

Description

CDC6和KI67在制备癌症放疗抵抗的诊断标记物中的应用
技术领域
本发明涉及CDC6和KI67在制备癌症放疗抵抗的诊断标记物中的应用。
背景技术
手术，化疗和放射治疗(简称放疗)是常规的癌症治疗方法。几乎一半的癌症患者都接受放疗。在治愈的癌症患者中，有将近40％患者都受益于放疗。大部分癌症患者在治疗之初对放疗非常敏感。但是患者在治疗过程中逐步产生获得性放疗抵抗，进而促进了肿瘤复发和侵袭转移，导致治疗失败。虽然增加放疗剂量可以促进对肿瘤细胞的杀伤，但是放射线不可避免对正常细胞和组织产生严重的毒副作用。目前缺乏对肿瘤放射敏感性评价有用的生物标记物，临床医生很难判断哪些癌症患者是否适合放疗，并且准确预测癌症对射线是否敏感。因此，发现和确认可以用于准确预测放射敏感性的可靠生物标记物迫切需要，而且对临床的意义巨大，能够为临床实践提供标准指南，同时为精准和个性化放疗提供依据。
放射线可以直接，或者通过产生氧自由基间接导致DNA损伤，甚至染色体断裂。但是机体通过DNA损伤反应(DDR)启动DNA修复机制。DNA损伤修复的程度将决定细胞命运。DNA损伤如果不能及时得到修复，细胞就会通过多种方式死亡，如细胞凋亡，衰老，自噬或者坏死。然而，如果细胞适应了放疗导致的损伤压力，就会产生放疗抵抗，逃避放射导致的死亡。以往研究表明，肿瘤细胞放疗抵抗的产生与细胞周期阻滞，凋亡抵抗、衰老形成、上皮细胞间质转化(EMT)等多种因素密切相关，但具体分子机制目前仍不清楚。因此，探求癌症发生放疗抵抗的分子机制，确定放疗抵抗的分子靶标，对于预测肿瘤的放疗敏感性，发展有效手段促进肿瘤的放疗敏感性具有重要意义。
CDC6是一个ATP酶家族基因，位于17号染色体长臂(17q21.3)。CDC6通过不同机制调控多种细胞生物学行为：(1)作为“复制前体复合物(pre-replication complexes,pre-RC)”的重要组成分子参与启动DNA复制，调控细胞周期和细胞增殖。(2)作为一个执照因子(licensing factor)，CDC6保证整个基因组在一个细胞周期中只复制一次。(3)作为癌基因，CDC6在大多数癌症细胞中高表达，表达水平的高低与癌症的恶性程度，以及患者的预后密切相关。(4)CDC6过表达会增加DNA复制压力，激活DNA损伤反应以及ATM/p53信号转导途径，从而导致基因组不稳定，诱导细胞发生早衰。(5)CDC6可以与凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1结合，阻断凋亡小体形成，抑制细胞凋亡。在多种肿瘤细胞中干扰CDC6可抑制细胞增殖并诱导凋亡。(6)CDC6作为转录因子，激活后可以通过表观遗传学机制抑制钙黏连蛋白E(E-cadherin，CDH1)转录，促进EMT转变，增强细胞侵袭转移活性。因此，CDC6不同程度地参与调控细胞周期、凋亡、衰老和EMT转变等多种细胞生物学行为。
KI67是一个在临床病理学诊断中普遍应用的一个分子，尤其出现在肿瘤活检的组织病理学报告中。它是一个细胞增殖相关的分子标志物。在正常细胞中，顺时升高CDC6表达将加快DNA复制，促进细胞增殖，KI67的表达也增高；但是CDC6长时间的异常高表达将导致正常细胞衰老。衰老的一个典型特征就是增殖减慢，KI67表达降低。正常细胞也可以通过发生癌变，从而逃避细胞衰老。在癌症细胞中，CDC6表达较正常细胞增高，细胞也出现高增殖的状态，KI67表达增高。但是，在放化疗等治疗作用下，癌症细胞受到损伤，出现衰老和凋亡。放射显著增高了CDC6蛋白表达。当放射后的肿瘤细胞出现衰老表型时，出现了显著的放射抵抗。
发明内容
本发明研究表明：CDC6在肿瘤中高表达维持肿瘤细胞维持无限增殖，但是如果CDC6在肿瘤细胞中持续异常高表达，将促进肿瘤细胞衰老。同时导致细胞增殖减慢，KI67表达降低。因此，CDC6和KI67可用于制备癌症放疗抵抗的诊断标记物，用于制备肿瘤对放射线抵抗或敏感的预测标志物，CDC6可以作为分子靶标用于制备癌症放疗致敏制剂。其中，所述CDC6和KI67要同时联用。CDC6和KI67是指CDC6high(CDC6高表达)和ki67low(ki67低表达)。
实验表明：在癌症患者(目前已经检测的主要是鼻咽癌和脑胶质瘤)第一次肿瘤活检的标本中，应用免疫组化检测肿瘤组织中细胞CDC6和KI67的表达情况，可以指导该类型的肿瘤组织是否适合放疗。如果检测结果显示CDC6high和ki67low，癌症患者不适合放疗，因为这种类型肿瘤必然对放射线是抵抗的。如果检测结果显示CDC6high和ki67high，癌症患者适合放疗，这种类型肿瘤对放射线是敏感的。
附图说明
图1：X射线急性照射增强了CDC6蛋白质水平；鼻咽癌细胞CNE2和骨肉瘤细胞U2OS接受10GyX射线急性照射，在照射后1h,24h、48h、72h检测CDC6蛋白表达水平；
图2：放疗抵抗细胞中CDC6蛋白表达水平显著高于亲本细胞，但ki67的蛋白表达水平显著低于亲本细胞。A.鼻咽癌细胞系CNE2细胞大剂量X射线冲击照射，残留的肿瘤细胞再经过间断小剂量放射线维持56周，建立了放射抵抗的细胞系CNE2-R细胞，经过单击多靶模型计算证实了CNE2-R的放疗耐受性；B.同等数量的放疗抵抗细胞和亲本细胞接受同等剂量的放射(6Gy)照射,生存克隆数量的差异显示出CNE2-R的放疗耐受性；C.CNE2-R细胞与亲本细胞比较，细胞增殖明显减慢；D.CNE2-R细胞与亲本细胞接受同等剂量的放射线的照射，凋亡细胞百分比的比较；E.放疗抵抗的癌症细胞比亲本细胞比较，CDC6蛋白质显著升高，ki67的蛋白表达显著减低；
图3：在鼻咽癌肿瘤活检组织中，进行CDC6和Ki67的免疫组化染色；放疗抵抗鼻咽癌肿瘤活检组织的CDC6蛋白质水平高，Ki67表达水平低；放疗敏感的鼻咽癌肿瘤活检组织的CDC6蛋白质水平低，Ki67表达水平高；蛋白表达的强度根据蛋白表达的强度和阳性细胞百分比的积计算，得到的数值进行统计学的相关性分析；
图4：在鼻咽癌细胞CNE2中经过DNA转染提高CDC6蛋白质表达，检测细胞对放射线诱导的凋亡和细胞周期的反应；CDC6上调后，CNE2细胞对射线的敏感性大大减低，出现对射线诱导凋亡的抵抗(A)，细胞周期阻滞在G0/G1期(B)；
图5：放疗抵抗细胞CNE2-R中敲低CDC6蛋白表达水平，显著增强了细胞的放射敏感性；A.CNE2-R细胞转染CDC6的siRNA,确认CDC6蛋白水平的降低，然后接受射线的照射。经过单击多靶模型计算，证实了CNE2-R细胞中CDC6的水平降低，细胞对于放疗更加敏感；B.同等数量的CNE2-R和CDC6敲减的CNE2-R细胞接受同等剂量的放射(10Gy)照射，生存细胞克隆数量的差异显示出CNE2-R中CDC6的敲减增强了细胞对放疗的敏感性；C.CNE2-R和CDC6敲减的CNE2-R接受同等剂量的放射线的照射，凋亡细胞百分比的比较；D.应用CNE2-IR和CNE1-IR细胞构建Tet-on四环素诱导CDC6敲低的细胞系。用这些细胞在免疫缺陷小鼠诱导移植瘤。当瘤体达100mm3左右时喂食含有四环素的饲料诱导CDC6的敲减，待瘤体达约200mm3时，应用以6Gy剂量X射线照射；E.治疗后每3天连续测量肿瘤体积大小，当对照组的肿瘤体积达到1000mm3时，用麻醉下断颈方法处死老鼠，取出瘤体进行比较；F.瘤体取出后检测CDC6蛋白质的表达，放疗抵抗的癌症细胞比亲本细胞比较，CDC6蛋白质显著升高，ki67的蛋白表达显著减低。
具体实施方式
体外和体内动物实验研究：
一、X射线急性照射促进了CDC6蛋白质水平的升高。
鼻咽癌细胞CNE2和骨肉瘤细胞经X射线照射后1小时，24小时，48小时和72小时，CDC6蛋白质表达水平随时间推移逐渐升高(图1)。
二、CDC6蛋白质水平在放疗抵抗的癌症细胞中显著增高。
应用大剂量X射线冲击照射鼻咽癌细胞CNE2，CNE1,HK1和神经胶质瘤细胞U251，残留的肿瘤细胞再经过间断小剂量放射线维持56周，分别建立了鼻咽癌和神经胶质瘤放疗抵抗的细胞模型。应用单击多靶模型验证了CNE2-R放疗抵抗细胞获得了对放疗抵抗(图2A)，克隆生存减少(图2B)，细胞增殖减慢(图2C),细胞对放疗诱导的凋亡减少(图2D)。放疗抵抗的鼻咽癌细胞CNE2-R,CNE1，HK1和神经胶质瘤细胞U251比亲本细胞比较，CDC6蛋白质显著升高，但是ki67的蛋白表达显著减低(图2E)。
三、在鼻咽癌组织中，CDC6的表达水平与癌症的放射敏感性呈正相关，ki67的表达与癌症的放射敏感性呈明显负相关。
放疗敏感和抵抗的鼻咽癌肿瘤组织CDC6和Ki67的免疫组化染色呈现出截然不同的表现。我们检测了48例鼻咽癌肿瘤活检组织中CDC6和代表细胞增殖的Ki67的表达情况。肿瘤组织在放疗前取活检，之后进行放射治疗，治疗后的反应根据RECIST实体瘤疗效评价标准评定。在31例对放疗部分反应(PR)的抵抗肿瘤组织中，CDC6的表达水平高，但ki67表达低；反之，在23例对放疗完全敏感(CR)的肿瘤组织中，CDC6的表达水平低，但ki67表达高。结果提示CDC6highKi67low可以作为预测肿瘤放疗敏感性的有效指标。
四、在鼻咽癌细胞CNE2中升高CDC6表达促进了癌症细胞产生对放疗的抵抗。
为了检测CDC6的升高对癌症细胞的放疗抗性的影响，我们在鼻咽癌细胞CNE2中升高CDC6，然后检测细胞对放射的敏感性。CDC6上调后，CNE2细胞对射线的敏感性大大减低，并且和长期放射照射导致的CNE2-R细胞表型近似，如细胞出现对射线诱导凋亡的抵抗，细胞周期阻滞在G0/G1期(图4)。结果显示CDC6高表达增强了癌症细胞对射线的抵抗。
五、在射线抵抗的CNE2-R细胞中敲低CDC6水平，增强了抵抗细胞对射线的敏感性。
由于CDC6高表达是癌症细胞放疗抵抗的标志物，因此在放疗抵抗的CNE2-R细胞中敲低CDC6的水平，显著地增强了放疗抵抗细胞对放疗的敏感性。应用单击多靶模型验证了CNE2-R放疗抵抗细胞中降低CDC6水平，增强了细胞对放疗的敏感性(图5A)，克隆生存减少(图5B)，细胞对放射线诱导的凋亡的敏感性增强(图5C)。同时，在放疗抵抗的CNE2-R细胞构建的移植瘤模型中，稳定敲低CDC6的表达，显著地增强了放疗抵抗细胞对放射的敏感性(图5D和图5E)。
结论：
急性放疗能够显著增强癌症细胞中的CDC6蛋白质的水平。放射抵抗的癌症细胞中虽然CDC6表达增高，但是增殖减慢，ki67的表达减低。放射抵抗的鼻咽癌肿瘤组织中CDC6的蛋白水平显著升高，但代表细胞增殖的Ki67的蛋白质水平明显降低。癌症细胞中人为升高CDC6的蛋白表达水平显著地增强了癌症细胞的放疗抵抗。反之，在放疗抵抗的癌症细胞中降低CDC6的蛋白水平，显著地增强了放疗抵抗细胞对放疗的敏感性。因此，我们的研究结果确立了癌症细胞CDC6高表达Ki67低表达(CDC6high和ki67low)可以作为癌症放疗抵抗的分子靶标。

Claims (5)

1.CDC6和KI67在制备癌症放疗抵抗的诊断标记物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CDC6和KI67联用。
3.CDC6和KI67在制备肿瘤对放射线抵抗或敏感的预测标志物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CDC6和KI67联用。
5.CDC6作为分子靶标在制备癌症放射增敏的小分子抑制剂中的应用。
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