JP2012032412A - 可溶化身体サンプルにおける新形成疾患を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】上記目的のためのキット並びにインビトロ診断用デバイスの開発もまた、本発明の一側面である。ここで上記開発は、細胞保存培地中の保存細胞として提供される身体サンプルを使用して行われ、そしてその保存細胞は液体ベースの細胞学的プロセスのような細胞学的検査プロセスにて使用することを意図され、調製される。液体ベースの細胞学的プロセスのためのサンプル(以下LBCサンプルと呼ぶ)は適切な溶解培地中で可溶化され、生化学的非細胞ベースの分析に基づいて可溶化身体サンプルから医学が関係する状態を検出するためのキットならびにインビトロ診断用デバイスを開発するために使用される。
【選択図】なし
Description
50年代中頃より、大方の種類の癌に対する予防策が提示されてきている。様々な先進国では、子宮頸癌に関して確立された集団ワイドスクリーニングプログラムが存在する。しかし同様のスクリーニングプログラムが、例えば泌尿器系の癌、呼吸器管の癌、その他の癌のような他の癌実体および各々の前駆段階に利用できる。以下では、この予防法プログラムの欠点を明確に表すため子宮頸癌を例として用いる。しかし以下の事項は必要な変更を加えた上で、あらゆる癌実体に対する他の予防プログラムに当てはめることができる。
本発明は、ヒト被験体の可溶化身体サンプルから新生物性障害を検出するための方法に関する。この方法は以下の工程を包含する:(a)ヒト被験体から身体サンプルを得る工程、(b)溶解培地中で身体サンプルを可溶化する工程、および(c)可溶化身体サンプル中のサイクリン依存性キナーゼインヒビターの過剰発現を、上記可溶化身体サンプル内のサイクリン依存性キナーゼインヒビターのレベルと健康なヒトの可溶化身体サンプルに存在するレベルとを比較することによって決定する工程。本発明の方法にて使用するためのサンプルは、液体ベースの細胞学的方法にて使用されるような、細胞保存溶液中の細胞を含んで、あらゆる種類であり得る。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒト被験体の可溶化身体サンプルから新生物性障害を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)ヒト被験体から身体サンプルを得る工程、
(b)溶解培地中でヒト被験体の身体サンプルを可溶化する工程、
(c)該可溶化身体サンプル中の、
i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;
ii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF ;
を含む群から選択されるマーカー分子の過剰発現を決定する工程であって、該工程は、ヒト被験体の該可溶化身体サンプル中のp16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択される該サイクリン依存性キナーゼインヒビターまたは該細胞周期調節タンパク質p14 ARF のレベルを、可溶化された健康なヒト身体サンプル中に存在するレベルと比較することによって、決定する工程、
を包含する、方法。
(項目2)
前記新生物性障害が、i)子宮頸癌またはそれらの前駆病変;ii)呼吸器の癌またはまたはそれらの前駆病変;iii)泌尿器系の癌またはそれらの前駆病変;iv)HPV感染に関連する癌またはそれらの前駆病変;v)生殖管の癌またはそれらの前駆病変;およびvi)肛門性器管の癌またはそれらの前駆病変を含む群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ヒト被験体の身体サンプルが、スワブ、洗浄、スミア、吸引液、生検、保存細胞標本、LBCサンプル、組織学的標本、固定細胞調製物、固定組織調製物、体液、分泌物、胃腸分泌物、血液、痰、尿、便、液、脳脊髄液、胆汁、リンパまたは骨髄である、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
ヒト被験体の前記身体サンプルが、
a.該サンプルを得た後すぐに、
b.保存緩衝液中での、保存および/または輸送の後に、または
c.輸送緩衝液中での輸送の後に、
可溶化される、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;
ii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF ;
を含む群から選択される2種以上のマーカー分子のレベルが、決定される、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記マーカー分子の検出が、検出される分子に対して特異的な、少なくとも1種のプローブを使用して行われる、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記プローブが、検出可能に標識されている、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記標識が、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、電子発光化合物、蛍光化合物、金属キレート剤、酵素、または生物学的に関連する結合構造からなる群より選択される、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記プローブが、タンパク質および/または核酸である、項目6〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
少なくとも1種のプローブが、抗体、抗体フラグメント、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペプチド擬態物である、項目9に記載の方法。
(項目11)
少なくとも1種のプローブが、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF ;を含む群から選択されるマーカー分子に対して、特異的にハイブリダイズする核酸である、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記方法が、インサイチュハイブリダイゼーション反応および核酸増幅反応を含む群から選択される反応を含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記核酸増幅反応が、PCR、NASBAまたはLCRである、項目12に記載の方法。
(項目14)
項目1〜13のいずれか1項に記載の方法であって、健康なヒトの子宮頸部の身体サンプル中の、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択される前記マーカー分子のレベルが、検出手順についての閾値を設定するための所定の値として提供される、方法。
(項目15)
項目1〜14に記載のいずれか1項に記載の方法であって、健康なヒトの子宮頸部サンプル中の、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択される前記マーカー分子のレベルが、標準化サンプル溶液からか、または健康なヒトの子宮頸部サンプルの代表値から決定される、方法。
(項目16)
項目1〜15のいずれか1項に記載の方法であって、健康なヒトの子宮頸部サンプル中の、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択される前記マーカー分子の決定が、以下:
a.検出手順の過程で、
b.検出系の校正の過程で、
c.検出試薬の各ロットについて一度、または
d.検出方法についての標準値として、
実行される、方法。
(項目17)
固相に固定された一特異性のプローブのみを備える、インビトロ診断用デバイスであって、該一特異性のプローブは、可溶化サンプル中の前記マーカー分子を検出するために、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して特異的である、インビトロ診断用デバイス。
(項目18)
前記プローブが、抗体、抗体フラグメント、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含む、ペプチド擬態物、または核酸である、項目17に記載のインビトロ診断用デバイス。
(項目19)
以下からなる群より選択される、項目17または項目18に記載のインビトロ診断用デバイス:
a.ELISAプレート、ELISAストリップまたはELISAウェルに固定された、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して指向性の、抗体、そのフラグメント、または抗原結合因子を含む、ELISAデバイス;
b.試験ストリップまたはコロイド状金粒子、またはラテックス粒子に固定された、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して指向性の、抗体、そのフラグメント、または抗原結合因子を含む、側方流動試験デバイス;
c.多孔性部材またはキャピラリーの表面に固定された、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して指向性の、抗体、そのフラグメント、または抗原結合因子を含む、フロースルーアッセイデバイス;
d.ラテックス粒子に固定された、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して指向性の、抗体、そのフラグメント、または抗原結合因子を含む、ラテックス凝集アッセイデバイス;
e.ビーズまたは膜に固定された、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して指向性の、抗体、そのフラグメント、または抗原結合因子を含む、免疫アッセイデバイス;
f.ミクロスフェアに固定された、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して指向性の、抗体、そのフラグメント、または抗原結合因子を含む、免疫アッセイデバイス;および
g.固相に固定された、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子の核酸遺伝子産物に、特異的にハイブリダイズするプローブを含む、核酸検出デバイス。
(項目20)
i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子のレベルを決定するためのインビトロ診断用デバイスであって、該デバイスは、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に特異的な、抗体、抗体フラグメント、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペプチド擬態物、および核酸を含む群から選択されるプローブを含み、そして身体サンプルの可溶化のための溶解培地、を含む群から選択される、デバイス。
(項目21)
前記溶解培地が、カオトロピック剤、アニオン洗剤、カチオン洗剤、非イオン性洗剤、両性洗剤、およびアルカリ性組成物からなる群より選択される、少なくとも1種の組成物を含む、項目20に記載のインビトロ診断用デバイス。
(項目22)
前記溶解培地が、プロテイナーゼインヒビター、DNAseインヒビター、およびRNAseインヒビターからなる群より選択される、少なくとも1種の組成物を含む、項目20または項目21に記載のインビトロ診断用デバイス。
(項目23)
前記プロテイナーゼインヒビターが、セリンプロテイナーゼに対するインヒビター、システインプロテイナーゼに対するインヒビター、アスパラギン酸プロテイナーゼに対するインヒビター、金属性プロテイナーゼに対するインヒビター、酸性プロテイナーゼに対するインヒビター、中性プロテイナーゼに対するインヒビター、およびアルカリ性プロテイナーゼに対するインヒビターからなる群より選択される、項目22に記載のインビトロ診断用デバイス。
(項目24)
前記溶解培地が、少なくとも1種の非イオン性洗剤および少なくとも1種のプロテイナーゼインヒビターを含む、項目20〜23のいずれか1項に記載のインビトロ診断用デバイス。
(項目25)
前記溶解培地が、Triton X−100および少なくとも1種のセリンプロテイナーゼのインヒビターを含む、項目24に記載のインビトロ診断用デバイス。
(項目26)
陽性コントロール反応を実行するための少なくとも1種のマーカー分子、前記検出反応を実行するために一般に使用される試薬および緩衝液をさらに含む、項目20〜25のいずれか1項に記載のインビトロ診断用デバイス。
(項目27)
項目20〜26のいずれか1項に記載のインビトロ診断用デバイスであって、陽性コントロール反応を実行するためのマーカー分子として、i)サイクリン依存性キナーゼインヒビタータンパク質であって、ここで該サイクリン依存性キナーゼインヒビターは、p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択される、サイクリン依存性キナーゼインヒビタータンパク質;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF タンパク質を含む群から選択される組換えタンパク質、そのフラグメント、または該タンパク質に由来するポリペプチドをさらに含む、インビトロ診断用デバイス。
(項目28)
研究デバイスまたはインビトロ診断用デバイスであるハイブリッド捕獲デバイスであって、1種以上のサイクリン依存性キナーゼインヒビター核酸に対して相補的か、または逆相補的な核酸を備えるデバイスであって、ここで、該サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、可溶化身体サンプル中の該1種以上のサイクリン依存性キナーゼインヒビターの過剰発現を検出するために、p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 ;およびp14 ARF からなる群より選択される、デバイス。
(項目29)
i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に対して指向性の、抗体、そのフラグメント、または抗原結合因子が固定または接着された固相の使用であって、該使用は、ヒト被験体の可溶化サンプル中の、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子のレベルの決定のための、インビトロ診断用デバイスを製造するための使用であり、ここで、該インビトロ診断用デバイスは、固相に対して固定された一特異性のプローブのみを備え、ここで、該一特異性のプローブは、i)p16 INK4a 、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼインヒビター;およびii)細胞周期調節タンパク質p14 ARF を含む群から選択されるマーカー分子に特異的である、使用。
(項目30)
前記固相が、多孔性部材、キャピラリー、膜、ビーズ、平面、球体、ミクロスフィア、ナノスフィア、コロイド状金粒子、ラテックス粒子およびコロイドを含む群から選択される、項目29に記載の使用。
(項目31)
可溶化身体サンプルから医学的関連状態の診断を評価する際に使用するための、免疫化学的キットおよびインビトロ診断用デバイスを開発するための方法であって、ここで、該キットおよびインビトロ診断用デバイスは、タンパク質またはペプチドのレベルに対する医学的関連状態に特徴的な、マーカー分子の存在あるいは非存在を検出するために設計され、そして、ここで該開発が、LBCサンプルを使用して実施される、方法。
(項目32)
前記医学的関連状態が、疾患である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記疾患が、細胞増殖障害、癌、または前駆病変である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記癌が、頭部および頸部の癌、呼吸器の癌、胃腸管の癌、皮膚および皮膚付属器の癌、中枢神経系および末梢神経系の癌、泌尿器系の癌、生殖器系の癌、肛門性器の癌、内分泌系の癌、軟組織および骨の癌、またはリンパ球産生系および造血系の癌である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記肛門性器の癌が、子宮頸癌である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記医学関連状態に特徴的なマーカー分子が、細胞周期調節タンパク質、メタロプロテイナーゼ、膜貫通型タンパク質、カルシウム結合タンパク質、増殖因子、ウイルス感染に特徴的なマーカー分子、細胞増殖マーカー、およびDNA複製に関連するマーカー、腫瘍マーカータンパク質、およびそれぞれのタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、項目31〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記腫瘍マーカータンパク質が、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、p53、pRb、p14ARF、サイクリンE、サイクリンA、サイクリンB、MN、her2/neu、mdm−2、bcl−2、claudin 1、EGFレセプター、MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、CDC2、CDC6、CDC7プロテインキナーゼ、CDC14プロテインホスファターゼ、Dbf4、PCNA、Ki67、KiS1、Id1、オステオポンチン、CD46、GRP、腎臓ジペプチダーゼ、およびTGFβIIレセプターからなる群より選択される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p16 INK4a である、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択される、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記ウイルス感染に特徴的なマーカー分子が、ウイルスタンパク質である、項目36に記載の方法。
(項目41)
前記ウイルスタンパク質が、HPV L1、HPV L2、HPV E1、HPV E2、HPV E4、HPV E5、HPV E6およびHPV E7からなる群より選択される、HPV遺伝子に由来するHPVタンパク質である、項目40に記載の方法。
(項目42)
可溶化LBCサンプルから医薬的関連状態の診断を評価するための方法であって、以下、
a.タンパク質またはペプチドのレベルに関する、医学関連状態に特徴的なマーカー分子の存在もしくは非存在および/またはレベルを検出する工程;
b.医学関連状態に特徴的な該マーカー分子の存在もしくは非存在および/またはレベルを、健康な非疾患身体サンプルに特徴的であることが公知の存在もしくは非存在および/またはレベルと比較する工程;ならびに
c.LBCサンプルにおいて見出されるレベルと、健康な非疾患身体サンプルに特異的であることが公知のレベルとの間の比較によって、医学的関連状態の診断を評価する工程、
を包含する、方法。
(項目43)
項目42に記載の方法であって、前診断の評価は、以下から選択される1つの特徴に基づく、方法:
a.前記医学的関連状態に特徴的なマーカー分子が、健康な非疾患身体サンプルと比較して、LBCサンプルに含まれる細胞において過剰発現される;
b.該医学的関連状態に特徴的なマーカー分子の発現が、健康な非疾患身体サンプル中において存在する発現と比較して、低下しているか、または失われている;
c.該医学的関連状態に特徴的なマーカー分子の改変形態が、健康な非疾患身体サンプル中に存在するマーカー分子と比較して、LBCサンプルに存在する細胞において発現される、マーカー分子。
(項目44)
前記医学的関連状態が、疾患である、項目42または43に記載の方法。
(項目45)
前記疾患が、細胞増殖障害、癌、または前駆病変である、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記癌が、頭部および頸部の癌、呼吸器の癌、胃腸管の癌、皮膚および皮膚付属器の癌、中枢神経系および末梢神経系の癌、泌尿器系の癌、生殖器系の癌、肛門性器の癌、内分泌系の癌、軟組織および骨の癌、またはリンパ球産生系および造血系の癌である、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記肛門性器の癌が、子宮頸癌である、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記医学関連状態に特徴的なマーカー分子が、細胞周期調節タンパク質、メタロプロテアーゼ、膜貫通型タンパク質、カルシウム結合タンパク質、増殖因子、ウイルス感染に特徴的なマーカー分子、細胞増殖マーカー、およびDNA複製に関連するマーカー、腫瘍マーカータンパク質、およびそれぞれのタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、項目42〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記腫瘍マーカータンパク質が、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、p53、pRb、p14ARF、サイクリンE、サイクリンA、サイクリンB、MN、her2/neu、mdm−2、bcl−2、claudin 1、EGFレセプター、MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、CDC2、CDC6、CDC7プロテインキナーゼ、CDC14プロテインホスファターゼ、Dbf4、PCNA、Ki67、KiS1、Id1、オステオポンチン、CD46、GRP、腎臓ジペプチダーゼ、およびTGFβIIレセプターからなる群より選択される、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p16 INK4a である、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(項目52)
前記ウイルス感染に特徴的なマーカー分子が、ウイルスタンパク質である、項目48に記載の方法。
(項目53)
前記ウイルスタンパク質が、HPV L1、HPV L2、HPV E1、HPV E2、HPV E4、HPV E5、HPV E6およびHPV E7からなる群より選択される、HPV遺伝子に由来するHPVタンパク質である、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記マーカー分子の検出が、検出される分子に対して特異的な、少なくとも1種のプローブを用いて行われる、項目42〜53のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
前記プローブが、検出可能に標識されている、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記標識が、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、電子発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、酵素、または生物学的に関連する結合構造からなる群より選択される、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記プローブが、抗体、抗体フラグメント、ミニ抗体、または抗原結合エピトープを含むペプチド擬態物である、項目54〜56のいずれか1項に記載の方法。
(項目58)
可溶化身体サンプルから医学的関連状態の診断を評価する際に使用するための、キットおよびインビトロ診断用デバイスを開発するための方法であって、ここで、該キットおよびインビトロ診断用デバイスは、核酸レベルに対する医学的関連状態に特徴的な、マーカー分子の存在または非存在を検出するために設計され、ここで該開発は、LBCサンプルを使用して実施され、そして同一のLBCサンプルから調製される細胞標本から得られる情報に関して、LBCサンプルの量の標準化が実施される、方法。
(項目59)
前記医学的関連状態が、疾患である、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記疾患が、細胞増殖障害、癌、または前駆病変である、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記癌が、頭部および頸部の癌、呼吸器の癌、胃腸管の癌、皮膚および皮膚付属器の癌、中枢神経系および末梢神経系の癌、泌尿器系の癌、生殖器系の癌、肛門性器の癌、内分泌系の癌、軟組織および骨の癌、またはリンパ球産生系および造血系の癌である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記肛門性器の癌が、子宮頸癌である、項目61に記載の方法。
(項目63)
前記医学関連状態に特徴的なマーカー分子が、細胞周期調節タンパク質、メタロプロテアーゼ、膜貫通型タンパク質、カルシウム結合タンパク質、増殖因子、ウイルス感染に特徴的なマーカー分子、細胞増殖マーカー、およびDNA複製に関連するマーカー、腫瘍マーカータンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸である、項目58〜62のいずれか1項に記載の方法。
(項目64)
前記腫瘍マーカータンパク質が、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、p53、pRb、p14ARF、サイクリンE、サイクリンA、サイクリンB、MN、her2/neu、mdm−2、bcl−2、claudin 1、EGFレセプター、MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、CDC2、CDC6、CDC7プロテインキナーゼ、CDC14プロテインホスファターゼ、Dbf4、PCNA、Ki67、KiS1、Id1、オステオポンチン、CD46、GRP、腎臓ジペプチダーゼ、およびTGFβIIレセプターからなる群より選択される、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p16 INK4a である、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択される、項目64に記載の方法。
(項目67)
前記ウイルス感染に特徴的なマーカー分子が、ウイルス核酸である、項目63に記載の方法。
(項目68)
前記ウイルス核酸が、HPV L1、HPV L2、HPV E1、HPV E2、HPV E4、HPV E5、HPV E6およびHPV E7からなる群より選択される、HPV遺伝子に由来するHPV核酸である、項目67に記載の方法。
(項目69)
可溶化LBCサンプルから医学的関連状態の診断を評価するための方法であって、以下、
a.生化学的な非細胞ベースの検出方法における適用のために、ある量のLBCサンプルを得る工程であって、ここで、該生化学的な非細胞ベースの方法において使用され得るLBCサンプルの量は、同一のLBCサンプルから調製された細胞標本から得られた情報に関して標準化される、工程;
b.核酸レベルに関する、医学的関連状態に特徴的なマーカー分子の存在もしくは非存在および/またはレベルの検出;
c.医学的関連状態に特徴的な該マーカー分子の存在もしくは非存在および/またはレベルを、健康な非疾患身体サンプルに特徴的であることが公知の存在もしくは非存在および/またはレベルと比較する工程;ならびに
d.LBCサンプルにおいて見出されるレベルと、健康な非疾患身体サンプルに特異的であることが公知のレベルとの間の比較によって、医学的関連状態の診断を評価する工程、
を包含する、方法。
(項目70)
項目69に記載の方法であって、前記診断の評価が、以下から選択される1つの特徴に基づく、方法:
a.医学的関連に特徴的なマーカー分子の存在または非存在であって、このようなマーカー分子の存在または非存在が、疾患サンプルの特徴である、存在または非存在;
b.医学的関連状態に特徴的なマーカー分子が、健康な非疾患身体サンプルと比較して、LBCサンプルに含まれる細胞において過剰発現する;
c.該医学的関連状態に特徴的なマーカー分子の発現が、健康な非疾患身体サンプルにおいて存在する発現と比較して、低下している、または失われている;
d.該医学的関連状態に特徴的なマーカー分子の改変形態が、健康な非疾患身体サンプルにおいて存在するマーカー分子と比較して、LBCサンプルに存在する細胞において発現される、マーカー分子。
(項目71)
前記医学的関連状態が、疾患である、項目69または70に記載の方法。
(項目72)
前記疾患が、細胞増殖障害、癌、または前駆病変である、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記癌が、頭部および頸部の癌、呼吸器の癌、胃腸管の癌、皮膚および皮膚付属器の癌、中枢神経系および末梢神経系の癌、泌尿器系の癌、生殖器系の癌、肛門性器の癌、内分泌系の癌、軟組織および骨の癌、またはリンパ球産生系および造血系の癌である、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記肛門性器の癌が、子宮頸癌である、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記医学関連状態に特徴的なマーカー分子が、細胞周期調節タンパク質、メタロプロテアーゼ、膜貫通型タンパク質、カルシウム結合タンパク質、増殖因子、ウイルス感染に特徴的なマーカー分子、細胞増殖マーカー、およびDNA複製に関連するマーカー、腫瘍マーカータンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸である、項目69〜74のいずれか1項に記載の方法。
(項目76)
前記腫瘍マーカータンパク質が、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、p53、pRb、p14ARF、サイクリンE、サイクリンA、サイクリンB、MN、her2/neu、mdm−2、bcl−2、claudin 1、EGFレセプター、MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、CDC2、CDC6、CDC7プロテインキナーゼ、CDC14プロテインホスファターゼ、Dbf4、PCNA、Ki67、KiS1、Id1、オステオポンチン、CD46、GRP、腎臓ジペプチダーゼ、およびTGFβIIレセプターからなる群より選択される、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p16 INK4a である、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記サイクリン依存性キナーゼインヒビターが、p13.5、p14、p15 INK4b 、p18 INK4c 、p19 INK4d 、p21 WAF1/CIP1 、p27 KIP1 からなる群より選択される、項目76に記載の方法。
(項目79)
前記ウイルス感染に特徴的なマーカー分子が、ウイルス核酸である、項目75に記載の方法。
(項目80)
前記ウイルス核酸が、HPV L1、HPV L2、HPV E1、HPV E2、HPV E4、HPV E5、HPV E6およびHPV E7からなる群より選択される、HPV遺伝子に由来するHPV核酸である、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記マーカー分子の検出が、検出される分子に対して特異的な、少なくとも1種のプローブを使用して行われる、項目69〜80のいずれか1項に記載の方法。
(項目82)
前記プローブが、検出可能に標識されている、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記標識が、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、電子発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、酵素、または生物学的に関連する結合構造からなる群より選択される、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記プローブが、マーカー分子核酸に対して、相補的または逆相補的な核酸である、項目81〜83のいずれか1項に記載の方法。
本発明は、例えば呼吸器管の癌、生殖腺系の癌、泌尿器系の癌、HPV関連癌、または肛門性器系の癌、特に子宮頸癌、およびこれらの癌の各々の前駆段階等の癌のような多数の新生物性障害においてサイクリン依存性キナーゼインヒビター遺伝子産物が過剰発現しているという本出願人の洞察に基づいたものである。サイクリン依存性キナーゼインヒビターの例には、タンパク質p14、p15INK4b、p16INK4a、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1、およびp27KIP1がある。機能的にはサイクリン依存性キナーゼインヒビターではないが、細胞周期制御タンパク質であるp14ARFも本発明の文脈内にて「サイクリン依存性キナーゼインヒビター」の表現に含まれることとなる。
Medium」、Tripath Imaging「Cytorich」など)のような標準的サンプル採取培地あるいは保存培地、輸送培地中に保存され得る。本発明の一実施形態において、標準的サンプル収集培地中に提供される細胞あるいは組織サンプルは、当業者に公知の細胞学的LBC法に使用される方法またはその類似方法に従って調製される液体ベースの細胞学的サンプル(LBCサンプル)である。適切な細胞保存培地は、アルコール、アルデヒド、ケトン、酸、金属イオンもしくは昇華物、エーテルなどからなる群より選択される一つ以上の混合物を含有することができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、(n−またはi−)プロパノール、(n−またはi−、t−)ブタノール、高分枝または非分枝アルコールが挙げられる。アルデヒドとしては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グルタールアルデヒドなどが挙げられる。アセトンのようなケトンを使用することもできる。標準化サンプル溶液に使用するための酸としては、有機酸(酢酸、トリクロロ酢酸、サリチル酸、ピクリン酸)もしくは、例えばクロム酸のような無機酸が挙げられる。標準的サンプル溶液は銀、銅、クロム、水銀、オスミウム、ウランのような金属を含有することができる。酢酸ウラン、二クロム酸カリウム、硫酸アンモニウムなどの塩溶液は、保存培地の成分となることができる。
(a)サイクリン依存性キナーゼインヒビターの発現を検出するための試薬(例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビタータンパク質またはサイクリン依存性キナーゼインヒビター核酸、およびこれら各々の一部分に対するプローブ)、
(b)身体サンプルを可溶化するための溶解培地、
(c)慣用的な補助試薬(例えば、緩衝液、キャリア、マーカーなど、および必要に応じての試薬)、
(d)コントロール反応のための試薬(例えば、例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビタータンパク質もしくはサイクリン依存性キナーゼインヒビター核酸、およびこれら各々の一部分、または細胞の調製物)。
「インビトロ医療診断デバイス」は、単独で使用されるものであれ、組み合わせて使用するものであれ、単にまたは主に、生理学的もしくは病理学的状態に関する、あるいは先天異常に関する情報を提供する目的で、または潜在的被移植者への安全性および適合性を判定する目的で、または治療法を継続調査する目的で、製造者によって血液および組織提供物を含むヒト身体由来サンプルの検査のためにインビトロで使用するよう意図された、試薬製品、校正器、コントロール物質、キット、器具、装置、装備、またはシステムである任意の医療デバイスを意味する。
a.ELISAプレート、ELISA片、またはELISAウェルに固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備えるELISAデバイス;
b.試験ストリップ、金コロイド粒子またはラテックス粒子に固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備える外側フロー試験デバイス;
c.多孔性部材または毛細管表面に固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体備えるフロースルーアッセイデバイス;
d.ラテックス粒子に固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備えるラテックス凝集アッセイデバイス;ならびに
e.ビーズ、膜、またはミクロスフェアに固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備える免疫アッセイデバイス。
「インビトロ医療診断デバイス」とは、単独で使用されるものであれ、組み合わせて使用するものであれ、単にまたは主に、生理学的もしくは病理学的状態に関する情報、または先天異常に関する情報を提供する目的;もしくは潜在的レシピエントへの安全性および適合性を決定する目的;もしくは治療測定をモニタリングする目的で、血液および組織提供物を含むヒト身体由来サンプルの検査のためにインビトロで使用するように製造者によって意図された、試薬製品、校正器、コントロール物質、キット、器具、装置、装備またはシステムである任意の医療デバイスを意味する。
of the Lower Respiratory Tract,Atlas of
Tumor Pathology,Third Series,Fascicle 13,AFIP:Washington 1995」に見出され得、本明細書中に参考として援用される。
溶解培地に提供された33の子宮頸部スワブを、スワブ中に含まれる細胞から調製した溶液内のサイクリン依存性キナーゼインヒビターp16INK4aの過剰発現の検出に基づくELISA法に供した。ELISA試験を以下のように実施した。
子宮頸部スワブブラシを、2mlのmtm溶解培地(PBS中、2% TritonX−100、0.4% SDS、0.6mM PMSF)を入れた15mlの容器に加えた。ブラシ中に存在する子宮頸部細胞を、少なくとも20時間溶解した。次にこの子宮頸部スワブサンプルの溶解物を2mlの試験管に移し、4℃で遠心分離した(28.000Xgにて15分間(16.600rpm Highspeed Centrifuge JEC Multi RF))。上清を新しい試験管に移した。この上清は−20℃で保存し得る。
(ELISAプレートのコーティング)
p16INK4a抗体クローンmtmE6H4のストック溶液をPBS中に希釈し、使用準備済みコーティング液とした。ELISAプレートの各ウェルに、50μlのコーティング液を加えた。コーティングのため、プレートを4℃で一晩インキュベーションした。コーティング液をELISAプレートから除去し、プレートを以下の自動ELISA洗浄器を使用してリンスした:
7X250μl洗浄緩衝液(PBS中、0.1% Tween20(v/v))
洗浄緩衝液の残余物を除去した後、300μlのブロッキング緩衝液(PBS中、2% BSA)を各ウェルに加えた。プレートを振盪機上にて、常温で1時間インキュベートした。
ブロッキング緩衝液を除去した後、100μlの溶解細胞サンプルを各ウェルに加えた。HeLa細胞の溶解物を陽性コントロールとして使用した。この試験の検量のため、この試験おいて、様々な濃度の組換えp16INK4aタンパク質(0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml)を含めた。サンプルを常温で1時間インキュベートした。その後以下の自動ELISA洗浄器上で洗浄を行った:
7X250μl洗浄緩衝液。残存する緩衝液は除去した。
ストック溶液を希釈して、p16INK4aタンパク質に特異的なビオチン化二次抗体クローンmtm D7D7の作用溶液を調製した。
100μlの作用溶液を各ウェルに加えた。常温で1時間インキュベートした後、抗体溶液を除去し、自動ELISA洗浄器でELISAプレートを洗浄した:
7X250μl洗浄緩衝液。
ストレプトアビジンHRPポリマー(1mg/ml)を1:10に前希釈した(4μl+36μlインキュベーション緩衝液)。インキュベーション緩衝液(PBS中、0.1%BSA)中で1:300に希釈して、最終インキュベーション溶液を最終濃度0.33μg/mlに調製した。
この溶液100μlを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。
その後この緩衝液を除去し、各ウェル当たり200μlの洗浄緩衝液を用いて手動で5回、プレートを洗浄した。
TMB基質を暗所にて1時間、25℃に平衡化した。各ウェル当たり100μlの基質溶液を加えた。このELISAプレートを暗所にて、25℃で正確に15分間インキュベートした。次に、80μlの2.5M H2SO4を加えて反応を止めた。反応停止後5分以内に、OD450nmを測定した。この結果を評価した後、各サンプルのODについての値を得た。この実験の結果を表4に示す。このELISAの結果を、同一の患者からのパパニコロー検査(PAP検査、子宮頸部細胞診)の診断結果と比較した。子宮頸部の細胞学をミュンヘン(Munich)分類II(1990)に従って評価した。PAPIIには良性細胞及び子宮頸炎、変質形成が含まれ、PAPIVには重度形成異常及び組織内癌腫が含まれる。ELISAにおいて0.9よりも大きな値のODを呈したサンプルは、従来の細胞診PAP検査によって、形成異常と分類されるサンプルに相当することが判明した。OD0.9をサンプルのための臨界値と適用すると、ELISA結果は以下のように報告され得る。
PreservCyt(Cytyc Corporation,Boxborough,MA)溶液中にて提供された9つの子宮頸部スワブを従来のPAP検査に供し、同時にスワブから得られた細胞懸濁液から調製した溶液中のサイクリン依存性キナーゼインヒビターp16INK4aの過剰発現の検出を、側方流動に供した。側方流動試験は以下のように実施した:
((A)細胞溶解)
PresrvCytTM固定材料として提供された個々の子宮頸部スワブサンプル由来の細胞懸濁液10mlを、15mlの反応容器に移した。このサンプルを常温で15分間、1500Xgにて遠心分離し(3000rpm,Heraeus Varifuge,ローター 8074)、上清を捨てた。残存メタノールを蒸発させて(常温で15分間)、沈殿物を500μlの溶解緩衝液に可溶化し、1.5mlの反応容器に移した。この溶液を4℃で遠心分離し(28000Xgで15分間(16600rpm Microcentrifuge Biofuge fresco))、上清を新たな試験管に移した。上清は−20℃で保存し得る。
(捕獲抗体の膜への塗布)
p16INK4a特異的抗体クローンmtm E6H4のストック溶液をTBS(1%ウシ血清アルブミンを含む)で希釈し、最終濃度1mg抗体/mlの使用準備済みスポッティング溶液を準備した。この使用準備済み溶液をニトロセルロース膜上に30μl/30cmでスポッティングした。Whatman wickをニトロセルロースの片端に接着させ、ディップスティック(dipstick)を37℃で1時間乾燥させた。次にこれを常温で平衡化させ、切断して4mm幅のディップスティックとした。
金コロイド状の金(粒子サイズ40nm)に結合させた、p16INK4a特異的抗体クローンmtm D7D7のストック溶液をTBS(1%ウシ血清アルブミンを含む)で希釈し、520nmでの1.0ODの最終濃度の使用準備済み検出抗体溶液を準備した。
次に20μlの溶解細胞サンプルを、マイクロタイターウェル内の20μl使用準備済み検出抗体溶液に加え混合した。捕獲抗体クローンE6H4で被覆したディップスティックをこのウェルに加え、サンプルを浸漬して完了した。ディップスティックが湿っている間、シグナルを測定した。
本発明者らの検査様式において、PAP染色によってPAP IVと分類され、したがって形成異常細胞を含有する2つのサンプル(サンプル1およびサンプル2)は、捕獲抗体をスポッティングした領域にはっきりと認識できる紫のバンドを呈した。反対に、PAP染色でPAP II〜PAP IIIと分類され、したがって形成異常細胞を含まない他の7つのサンプルでは(サンプル3〜9)についてはバンドは検出されなかった。
この分析のために、50人からの子宮頸部サンプルを用いた。各被験者について2つのサンプルを採取し、一方をUniversal Collection Mediumに、もう一方をPreservCytTM溶液に入れた。両サンプルとも同一の実験期間内に得た。各個体のそれぞれについて、PreservCytTM溶液から調製した子宮頸部シンレイヤー検体の分析に基づく診断が利用可能であった。本研究に含まれる20のサンプルをNILMとして診断して選択し、20サンプルをLSILと選択、そして10サンプルをHSILと選択した。以下のプロトコルに従うRT−PCRによって、全てのサンプルからp16INK4a及びp14ARFの転写産物のレベルをmRNAレベルに対して決定した:
分析を実施するため、UCM並びにPreservCytTM溶液中から細胞を遠心分離によってペレットとした。得られたペレットを直接RNA調製手順に供した。
このペレットを希釈し、使用準備済みのRLT緩衝液に再懸濁した。この均質化した溶解物に70%エタノールを加えた後、この懸濁液をピペッティングによって混合した。RNAの精製及び単離は、製造者の指示に従ってQIAampスピンカラムを使用して行った。RNA濃度を260nmにて光学的に測定した。逆転写反応については、100ngから500ngのRNAを使用した。DNAは以下のDNA分解酵素によって分解した:
17.0μL RNA(6−30 ng/μL)
1.0μl DNaseI Ampグレード(1Unit/μl)(Invitrogen)
2.0μl DNaseアーゼ反応緩衝液(10X)(Invitrogen)
20.0μl 全量25℃で15分間インキュベーションを行い、25mM EDTAを2μl加えて反応を停止し、65℃で10分間インキュベートした。RNAsin存在下でOmniscript逆転写酵素を使用し、DNase消化物の全量を用いてcDNA合成を行った。この反応を37℃で2時間、続いて93℃で5分間行った。その後、この混合物を4℃で保存した。これでTaqman−PCRのための使用準備済みcDNA溶液ができる(約7〜36ng/5μlのcDNA濃度に相当する)。RT−PCRで使用するため、40μlのcDNA反応混合物を30μlのRNaseを含まない水で希釈して容積70μlとした。使用したプライマーは、:
12.5 μl SYBR−Umix
0.25μl プライマー混合物
7.25μl 分子生物学用水
5.0 μl cDNA溶液
25.0 μl 全量
2段階リアルタイムPCRの条件は、:
第1段階:50℃で2分、95℃で10分
第2段階:95℃で15秒、60℃で1分10秒、40サイクル
サンプル中に検出される転写物のレベルに基づいたp16INK4a転写物の過剰発現の程度を、正常組織検体または細胞検体中に存在する転写物レベルと比較して評価することによって、RT−PCR結果の評価を実施した。過剰発現の分析前に、p14ARFのレベルに対して、各サンプル中に検出されるハウスキーピング遺伝子のレベルに関する標準化を行った。正常組織と比較して0から24倍の過剰発現は無関係とみなした。24倍を超えるp16INK4a並びにp14ARFの過剰発現のレベルのみを、サンプル中で有意に上昇した転写物レベルとみなした。評価のためのこのスキームは、いくつかの等しく適切な方法の一つに過ぎないことに注目しなければならない。当業者はRT−PCRの結果を使用して、転写物レベルを評価し得る方法、およびサンプルの臨床的パラメーターに関連付け得る方法を理解する。本実施例で記載される閾値は例示的であり、条件に依存して変動し得る。一サンプルのUCM検体から得られた値と、対応するPreservCytTM検体のものとは同じ結果を示した。検出された転写物レベルを細胞学からの対応する検体の診断と比較すると、転写物レベルの上昇と、細胞学的シンレイヤー検体に基づいて診断された子宮頸部病変の存在との間に、十分な相関性が見られた。
この相互関係は以下の通りであった:
本実施例では、各々のマーカー分子に対し、HSIL疾患と診断された被験者の子宮頸部スワブ、小細胞肺癌を有する被験者の唾液、および口腔癌を有する被験者の口腔由来のスワブのそれぞれかの、PreservCytTM溶液もしくはCytoLytTM溶液中のLBCサンプル各10個を使用した(各癌の実体について計20検体を使用した)。子宮頸部検体及び口腔検体に関して、hrHPV型ならびにp16INK4aおよびp14ARFの転写物の存在に対するハイブリッド捕獲分析を行った。hrHPV型に対するハイブリッド捕獲分析は、Digene Corp.のHybridCaptrue hc2検査を使用して行った。指定されたサイクリン依存性キナーゼインヒビターの転写物に対するハイブリッド捕獲分析は以下のように行った。
本実施例に関して、LBCサンプルの量はLBCサンプルの細胞含量に依存した。Cytyc ThinPrepTMプロセッサーを使用して、各検サンプルのシンレイヤー検体を調製した。シンレイヤー検体調製の前後で、このLKBCサンプルの質量を測定した。ThinPrepTMプロセッサーは各処理工程において、フィルター上に特異的な細胞の密度のために必要なサンプル量のみを消費するので、消費された体積がLBCサンプル中の相対的細胞濃度に関する測定値である。本実施例において、ThinPrepTMプロセッサーによるシンレイヤー検体調整のために消費する量の2倍のLBCを、ハイブリッド捕獲分析のために使用した(LBCサンプルの細胞含量が低すぎるサンプルは除いた)。分析を実施するため、CytoLytTM、PreservCytTM溶液から遠心分離によって細胞をペレットとした。得られたペレットを直接RNA調製手順に供した。このペレットを希釈し、使用準備済みRLT緩衝液中に再懸濁した。均質化した溶解物に70%エタノールを加えた後、この懸濁液をピペッティングによって混合した。RNAの精製及び単離は、製造者による指示に従ってQIAampスピンカラムを使用し、実施した。p16INK4a mRNAの検出には、p16INK4a並びにp14ARFに特異的な40マーDNAオリゴヌクレオチドプローブの混合物を使用した。この混合物中の最も適切なプローブは、以下の配列を含有した。
p14ARFは:
p16INK4aに有望なプローブ配列は以下の通りである。:
RNA−DNAハイブリッド検出のため、Digene Corp.から市販される抗RNA−DNAハイブリッド抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用した。ハイブリダイゼーション溶液を直接マイクロタイタープレートに加え、常温で1時間インキュベートした。製造者の指示に従って、このプレートを洗浄した。二次の抗RNA−DNAハイブリッド抗体およびDigene Corp.によって提供された検出試薬を使用して検出を行った。ハイブリッド捕獲アッセイは、全ての子宮頸部検体についてp16INK4aについて陽性であると示した。この結果はハイブリッド捕獲によって全ての子宮頸部検体がhrHPVについて陽性であるとされたことと一致した。口腔由来の癌検体の約半数をp16INK4aの過剰発現について検査した。p16INK4a陽性であるこれらの検体の全てをhc2によってhrHPVに関して検査した。口腔の癌において、HPV陽性とp16INK4aの過剰発現との間に有意な相関性があった。小細胞肺癌に関しては、検査された事例の10事例の内8事例で、p16陽性と検出された。ハイブリッド捕獲によって得られたp16INK4aについての結果は全て、シンレイヤー検体の免疫細胞化学的分析によって確認し得る。p14ARFに関しては、子宮頸部サンプルについての結果は、p16INK4aについての結果と比較できるものであった。小細胞肺癌に関しては、ハイブリッド捕獲において検査された10の事例のうち内わずか2つの事例のみがp14ARF陽性を示した。この結果は免疫細胞化学によって確認し得る。口腔由来のLBCサンプルでは、免疫細胞化学的な所見と一致して、10事例のうち7の事例でp14ARFを検出し得る。この結果は、ハイブリッド捕獲試験様式におけるLBCサンプル由来のサイクリン依存性キナーゼインヒビターの検出は、幾種類かの癌の存在の診断の評価のために使用し得ることを示す。この結果は、生化学試験が細胞学的検査の補助検査または共同検査として使用され得ることを示唆する。
全てPreservCytTM溶液に準備した、HSILであると細胞学的に分類された子宮頸部スワブ10サンプル、小細胞肺癌であると細胞学的に診断された唾液10サンプル、膀胱腫瘍と診断された被験者からの尿10サンプル、DCISと診断された個体からの細針吸引10サンプルを、細胞の遠心分離に供し、続いて溶解液中に細胞を可溶化した。その後、ELISAに基づいて、スワブに含まれる細胞から調製した溶液中のサイクリン依存性キナーゼインヒビターp16INK4a及びp14ARF、HER−2/Neuの発現レベルの検出した。ELISA試験は以下のように行った。
各10mLのLBCサンプルを遠心分離して細胞を沈殿させた。細胞ペレット[TIME]を700μlのmtm溶解緩衝液(2% トリトンX−100、0.4% SDS、0.6mM PMSFのPBS溶液)中に、80℃で10分間混合し、インキュベートすることによって溶解した。次にLBCサンプル溶解物を4℃で遠心分離した(28.000xgにて15分間(16.600rpm HighspeedCentrifuge JEC Multi RF))。上清を新しい試験管に移した。上清は−20℃で保存し得る。
(ELISAプレートのコーティング)
各タンパク質ついて、分離したELISAプレートを以下のように調製した。p16INK4a、p14ARF、およびHER−2/Neuに特異的な一次抗体のストック溶液をPBS中に希釈し、使用準備済みコーティング溶液を調製した。p16INK4aについては、ELISAプレートのコーティングのためにmtm E6H4を使用した。p14ARFについては、Calbiochemから市販されているp14ARFに対するポリクローナル抗体を使用した。HER−2/Neuについては、DakoCytomationからのポリクローナル抗体をコーティングのために使用した。50μlのコーティング溶液をELISAプレートの各ウェルに加えた。コーティングのため、このプレートを4℃で一晩インキュベーションした。コーティング溶液をELISAプレートから除去し、以下の自動ELISA洗浄器を使用してプレートをリンスした。:
7x250μl洗浄緩衝液(PBS中、0.1%Tween20(v/v))
残った洗浄緩衝液を除去した後、300μlのブロッキング緩衝液(PBS中、2%BSA)を各ウェルに加えた。プレートを震盪器上にて、常温で1時間インキュベーションした。
ブロッキング緩衝液を除去した後、100μlの溶解細胞サンプルを各ウェルに加えた。試験の検量のため、種々の濃度の組換えタンパク質(0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml)を各試験に加えた。サンプルを常温で1時間インキュベーションした。その後以下の自動ELISA洗浄器で洗浄を行った:
7x250μl洗浄緩衝液 残った緩衝液は除去した。
ストック溶液を希釈して、各々のタンパク質に特異的なビオチン化二次抗体の作用溶液を調製した。p16INK4aについてはmtmクローンD7D7を使用し、p14ARFについてはCalbiochemのモノクローナル抗体を使用し、HER−2/NeuにいついてはDakoCytomationのモノクローナル抗体を使用した。100μlの作用溶液を各ウェルに加えた。常温で1時間インキュベーションした後、抗体溶液を除去し、ELISAプレートを自動ELISA洗浄器で洗浄した。
(検出)
ストレプトアビジンHRPポリマー(1mg/ml)を1:10に前希釈した(4μl+36μlインキュベーション緩衝液)。インキュベーション緩衝液(PBS中、0.1%BSA)中に1:300に希釈して、最終濃度0.33μlに最終インキュベーション溶液を調製した。この溶液100μlを各ウェルに加えて、常温で1時間インキュベーションした。その後緩衝液を除去し、各ウェルにつき5回、200μlの洗浄緩衝液を用いて手動でプレートを洗浄した。
TMB基質を暗所にて25℃で1時間平衡化した。100μlの基質溶液を各ウェルに加えた。ELISAプレートを暗所にて25℃で正確に15分間、インキュベーションした。次に80μlの2.5M H2SO4を加えて反応を停止させた。反応停止後5分以内に、OD450nmを決定した。この結果を評価した後、各サンプルのODに関する値を得た。各抗体に関して、バックグラウンドと見られる値を使用して、閾値ODを決定した。このELISAの結果を、同一の個体由来の検体の細胞学的評価の診断結果と比較した。結果を以下の表6に示す。
CytoLytTM中の尿中の細胞の20個のLBCサンプルを本実施例のために使用した。RT−PCRは実施例3に示した同じ方法で実施した。タンパク質分析を実施例2に示したディップスティック検査様式にて行い、平行して、実施例1にて示したELISA様式にて実施した。実験手順はこれらの実施例にて示したように行った。尿LBCサンプル由来の溶解物中で、MCM−5を容易に検出し得ることを示し得る。タンパク質及び核酸のレベルに基づく生化学的非細胞ベースのアッセイによって得られた結果は、細胞学から得られた結果と非常に良く対応する。細胞学ではMCM−5タンパク質に対する免疫細胞学的染色を、診断の評価における補助として利用した。
Claims (1)
- 本願明細書に記載された発明。
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