JP5619336B2 - 可溶化身体サンプルにおける新形成疾患を検出するための方法 - Google Patents
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Description
50年代中頃より、大方の種類の癌に対する予防策が提示されてきている。様々な先進国では、子宮頸癌に関して確立された集団ワイドスクリーニングプログラムが存在する。しかし同様のスクリーニングプログラムが、例えば泌尿器系の癌、呼吸器管の癌、その他の癌のような他の癌実体および各々の前駆段階に利用できる。以下では、この予防法プログラムの欠点を明確に表すため子宮頸癌を例として用いる。しかし以下の事項は必要な変更を加えた上で、あらゆる癌実体に対する他の予防プログラムに当てはめることができる。
本発明は、ヒト被験体の可溶化身体サンプルから新生物性障害を検出するための方法に関する。この方法は以下の工程を包含する:(a)ヒト被験体から身体サンプルを得る工程、(b)溶解培地中で身体サンプルを可溶化する工程、および(c)可溶化身体サンプル中のサイクリン依存性キナーゼインヒビターの過剰発現を、上記可溶化身体サンプル内のサイクリン依存性キナーゼインヒビターのレベルと健康なヒトの可溶化身体サンプルに存在するレベルとを比較することによって決定する工程。本発明の方法にて使用するためのサンプルは、液体ベースの細胞学的方法にて使用されるような、細胞保存溶液中の細胞を含んで、あらゆる種類であり得る。
本発明は、例えば呼吸器管の癌、生殖腺系の癌、泌尿器系の癌、HPV関連癌、または肛門性器系の癌、特に子宮頸癌、およびこれらの癌の各々の前駆段階等の癌のような多数の新生物性障害においてサイクリン依存性キナーゼインヒビター遺伝子産物が過剰発現しているという本出願人の洞察に基づいたものである。サイクリン依存性キナーゼインヒビターの例には、タンパク質p14、p15INK4b、p16INK4a、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1、およびp27KIP1がある。機能的にはサイクリン依存性キナーゼインヒビターではないが、細胞周期制御タンパク質であるp14ARFも本発明の文脈内にて「サイクリン依存性キナーゼインヒビター」の表現に含まれることとなる。
(a)サイクリン依存性キナーゼインヒビターの発現を検出するための試薬(例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビタータンパク質またはサイクリン依存性キナーゼインヒビター核酸、およびこれら各々の一部分に対するプローブ)、
(b)身体サンプルを可溶化するための溶解培地、
(c)慣用的な補助試薬(例えば、緩衝液、キャリア、マーカーなど、および必要に応じての試薬)、
(d)コントロール反応のための試薬(例えば、例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビタータンパク質もしくはサイクリン依存性キナーゼインヒビター核酸、およびこれら各々の一部分、または細胞の調製物)。
「インビトロ医療診断デバイス」は、単独で使用されるものであれ、組み合わせて使用するものであれ、単にまたは主に、生理学的もしくは病理学的状態に関する、あるいは先天異常に関する情報を提供する目的で、または潜在的被移植者への安全性および適合性を判定する目的で、または治療法を継続調査する目的で、製造者によって血液および組織提供物を含むヒト身体由来サンプルの検査のためにインビトロで使用するよう意図された、試薬製品、校正器、コントロール物質、キット、器具、装置、装備、またはシステムである任意の医療デバイスを意味する。
a.ELISAプレート、ELISA片、またはELISAウェルに固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備えるELISAデバイス;
b.試験ストリップ、金コロイド粒子またはラテックス粒子に固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備える外側フロー試験デバイス;
c.多孔性部材または毛細管表面に固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体備えるフロースルーアッセイデバイス;
d.ラテックス粒子に固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備えるラテックス凝集アッセイデバイス;ならびに
e.ビーズ、膜、またはミクロスフェアに固定された、サイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備える免疫アッセイデバイス。
「インビトロ医療診断デバイス」とは、単独で使用されるものであれ、組み合わせて使用するものであれ、単にまたは主に、生理学的もしくは病理学的状態に関する情報、または先天異常に関する情報を提供する目的;もしくは潜在的レシピエントへの安全性および適合性を決定する目的;もしくは治療測定をモニタリングする目的で、血液および組織提供物を含むヒト身体由来サンプルの検査のためにインビトロで使用するように製造者によって意図された、試薬製品、校正器、コントロール物質、キット、器具、装置、装備またはシステムである任意の医療デバイスを意味する。
溶解培地に提供された33の子宮頸部スワブを、スワブ中に含まれる細胞から調製した溶液内のサイクリン依存性キナーゼインヒビターp16INK4aの過剰発現の検出に基づくELISA法に供した。ELISA試験を以下のように実施した。
子宮頸部スワブブラシを、2mlのmtm溶解培地(PBS中、2% TritonX−100、0.4% SDS、0.6mM PMSF)を入れた15mlの容器に加えた。ブラシ中に存在する子宮頸部細胞を、少なくとも20時間溶解した。次にこの子宮頸部スワブサンプルの溶解物を2mlの試験管に移し、4℃で遠心分離した(28.000Xgにて15分間(16.600rpm Highspeed Centrifuge JEC Multi RF))。上清を新しい試験管に移した。この上清は−20℃で保存し得る。
(ELISAプレートのコーティング)
p16INK4a抗体クローンmtmE6H4のストック溶液をPBS中に希釈し、使用準備済みコーティング液とした。ELISAプレートの各ウェルに、50μlのコーティング液を加えた。コーティングのため、プレートを4℃で一晩インキュベーションした。コーティング液をELISAプレートから除去し、プレートを以下の自動ELISA洗浄器を使用してリンスした:
7X250μl洗浄緩衝液(PBS中、0.1% Tween20(v/v))
洗浄緩衝液の残余物を除去した後、300μlのブロッキング緩衝液(PBS中、2% BSA)を各ウェルに加えた。プレートを振盪機上にて、常温で1時間インキュベートした。
ブロッキング緩衝液を除去した後、100μlの溶解細胞サンプルを各ウェルに加えた。HeLa細胞の溶解物を陽性コントロールとして使用した。この試験の検量のため、この試験おいて、様々な濃度の組換えp16INK4aタンパク質(0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml)を含めた。サンプルを常温で1時間インキュベートした。その後以下の自動ELISA洗浄器上で洗浄を行った:
7X250μl洗浄緩衝液。残存する緩衝液は除去した。
ストック溶液を希釈して、p16INK4aタンパク質に特異的なビオチン化二次抗体クローンmtm D7D7の作用溶液を調製した。
100μlの作用溶液を各ウェルに加えた。常温で1時間インキュベートした後、抗体溶液を除去し、自動ELISA洗浄器でELISAプレートを洗浄した:
7X250μl洗浄緩衝液。
ストレプトアビジンHRPポリマー(1mg/ml)を1:10に前希釈した(4μl+36μlインキュベーション緩衝液)。インキュベーション緩衝液(PBS中、0.1%BSA)中で1:300に希釈して、最終インキュベーション溶液を最終濃度0.33μg/mlに調製した。
この溶液100μlを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。
その後この緩衝液を除去し、各ウェル当たり200μlの洗浄緩衝液を用いて手動で5回、プレートを洗浄した。
TMB基質を暗所にて1時間、25℃に平衡化した。各ウェル当たり100μlの基質溶液を加えた。このELISAプレートを暗所にて、25℃で正確に15分間インキュベートした。次に、80μlの2.5M H2SO4を加えて反応を止めた。反応停止後5分以内に、OD450nmを測定した。この結果を評価した後、各サンプルのODについての値を得た。この実験の結果を表4に示す。このELISAの結果を、同一の患者からのパパニコロー検査(PAP検査、子宮頸部細胞診)の診断結果と比較した。子宮頸部の細胞学をミュンヘン(Munich)分類II(1990)に従って評価した。PAPIIには良性細胞及び子宮頸炎、変質形成が含まれ、PAPIVには重度形成異常及び組織内癌腫が含まれる。ELISAにおいて0.9よりも大きな値のODを呈したサンプルは、従来の細胞診PAP検査によって、形成異常と分類されるサンプルに相当することが判明した。OD0.9をサンプルのための臨界値と適用すると、ELISA結果は以下のように報告され得る。
PreservCyt(Cytyc Corporation,Boxborough,MA)溶液中にて提供された9つの子宮頸部スワブを従来のPAP検査に供し、同時にスワブから得られた細胞懸濁液から調製した溶液中のサイクリン依存性キナーゼインヒビターp16INK4aの過剰発現の検出を、側方流動に供した。側方流動試験は以下のように実施した:
((A)細胞溶解)
PresrvCytTM固定材料として提供された個々の子宮頸部スワブサンプル由来の細胞懸濁液10mlを、15mlの反応容器に移した。このサンプルを常温で15分間、1500Xgにて遠心分離し(3000rpm,Heraeus Varifuge,ローター 8074)、上清を捨てた。残存メタノールを蒸発させて(常温で15分間)、沈殿物を500μlの溶解緩衝液に可溶化し、1.5mlの反応容器に移した。この溶液を4℃で遠心分離し(28000Xgで15分間(16600rpm Microcentrifuge Biofuge fresco))、上清を新たな試験管に移した。上清は−20℃で保存し得る。
(捕獲抗体の膜への塗布)
p16INK4a特異的抗体クローンmtm E6H4のストック溶液をTBS(1%ウシ血清アルブミンを含む)で希釈し、最終濃度1mg抗体/mlの使用準備済みスポッティング溶液を準備した。この使用準備済み溶液をニトロセルロース膜上に30μl/30cmでスポッティングした。Whatman wickをニトロセルロースの片端に接着させ、ディップスティック(dipstick)を37℃で1時間乾燥させた。次にこれを常温で平衡化させ、切断して4mm幅のディップスティックとした。
金コロイド状の金(粒子サイズ40nm)に結合させた、p16INK4a特異的抗体クローンmtm D7D7のストック溶液をTBS(1%ウシ血清アルブミンを含む)で希釈し、520nmでの1.0ODの最終濃度の使用準備済み検出抗体溶液を準備した。
次に20μlの溶解細胞サンプルを、マイクロタイターウェル内の20μl使用準備済み検出抗体溶液に加え混合した。捕獲抗体クローンE6H4で被覆したディップスティックをこのウェルに加え、サンプルを浸漬して完了した。ディップスティックが湿っている間、シグナルを測定した。
本発明者らの検査様式において、PAP染色によってPAP IVと分類され、したがって形成異常細胞を含有する2つのサンプル(サンプル1およびサンプル2)は、捕獲抗体をスポッティングした領域にはっきりと認識できる紫のバンドを呈した。反対に、PAP染色でPAP II〜PAP IIIと分類され、したがって形成異常細胞を含まない他の7つのサンプルでは(サンプル3〜9)についてはバンドは検出されなかった。
この分析のために、50人からの子宮頸部サンプルを用いた。各被験者について2つのサンプルを採取し、一方をUniversal Collection Mediumに、もう一方をPreservCytTM溶液に入れた。両サンプルとも同一の実験期間内に得た。各個体のそれぞれについて、PreservCytTM溶液から調製した子宮頸部シンレイヤー検体の分析に基づく診断が利用可能であった。本研究に含まれる20のサンプルをNILMとして診断して選択し、20サンプルをLSILと選択、そして10サンプルをHSILと選択した。以下のプロトコルに従うRT−PCRによって、全てのサンプルからp16INK4a及びp14ARFの転写産物のレベルをmRNAレベルに対して決定した:
分析を実施するため、UCM並びにPreservCytTM溶液中から細胞を遠心分離によってペレットとした。得られたペレットを直接RNA調製手順に供した。
このペレットを希釈し、使用準備済みのRLT緩衝液に再懸濁した。この均質化した溶解物に70%エタノールを加えた後、この懸濁液をピペッティングによって混合した。RNAの精製及び単離は、製造者の指示に従ってQIAampスピンカラムを使用して行った。RNA濃度を260nmにて光学的に測定した。逆転写反応については、100ngから500ngのRNAを使用した。DNAは以下のDNA分解酵素によって分解した:
17.0μL RNA(6−30 ng/μL)
1.0μl DNaseI Ampグレード(1Unit/μl)(Invitrogen)
2.0μl DNaseアーゼ反応緩衝液(10X)(Invitrogen)
20.0μl 全量
25℃で15分間インキュベーションを行い、25mM EDTAを2μl加えて反応を停止し、65℃で10分間インキュベートした。RNAsin存在下でOmniscript逆転写酵素を使用し、DNase消化物の全量を用いてcDNA合成を行った。この反応を37℃で2時間、続いて93℃で5分間行った。その後、この混合物を4℃で保存した。これでTaqman−PCRのための使用準備済みcDNA溶液ができる(約7〜36ng/5μlのcDNA濃度に相当する)。RT−PCRで使用するため、40μlのcDNA反応混合物を30μlのRNaseを含まない水で希釈して容積70μlとした。使用したプライマーは、:
12.5 μl SYBR−Umix
0.25μl プライマー混合物
7.25μl 分子生物学用水
5.0 μl cDNA溶液
25.0 μl 全量
2段階リアルタイムPCRの条件は、:
第1段階:50℃で2分、95℃で10分
第2段階:95℃で15秒、60℃で1分10秒、40サイクル
サンプル中に検出される転写物のレベルに基づいたp16INK4a転写物の過剰発現の程度を、正常組織検体または細胞検体中に存在する転写物レベルと比較して評価することによって、RT−PCR結果の評価を実施した。過剰発現の分析前に、p14ARFのレベルに対して、各サンプル中に検出されるハウスキーピング遺伝子のレベルに関する標準化を行った。正常組織と比較して0から24倍の過剰発現は無関係とみなした。24倍を超えるp16INK4a並びにp14ARFの過剰発現のレベルのみを、サンプル中で有意に上昇した転写物レベルとみなした。評価のためのこのスキームは、いくつかの等しく適切な方法の一つに過ぎないことに注目しなければならない。当業者はRT−PCRの結果を使用して、転写物レベルを評価し得る方法、およびサンプルの臨床的パラメーターに関連付け得る方法を理解する。本実施例で記載される閾値は例示的であり、条件に依存して変動し得る。一サンプルのUCM検体から得られた値と、対応するPreservCytTM検体のものとは同じ結果を示した。検出された転写物レベルを細胞学からの対応する検体の診断と比較すると、転写物レベルの上昇と、細胞学的シンレイヤー検体に基づいて診断された子宮頸部病変の存在との間に、十分な相関性が見られた。
この相互関係は以下の通りであった:
本実施例では、各々のマーカー分子に対し、HSIL疾患と診断された被験者の子宮頸部スワブ、小細胞肺癌を有する被験者の唾液、および口腔癌を有する被験者の口腔由来のスワブのそれぞれかの、PreservCytTM溶液もしくはCytoLytTM溶液中のLBCサンプル各10個を使用した(各癌の実体について計20検体を使用した)。子宮頸部検体及び口腔検体に関して、hrHPV型ならびにp16INK4aおよびp14ARFの転写物の存在に対するハイブリッド捕獲分析を行った。hrHPV型に対するハイブリッド捕獲分析は、Digene Corp.のHybridCaptrue hc2検査を使用して行った。指定されたサイクリン依存性キナーゼインヒビターの転写物に対するハイブリッド捕獲分析は以下のように行った。
本実施例に関して、LBCサンプルの量はLBCサンプルの細胞含量に依存した。Cytyc ThinPrepTMプロセッサーを使用して、各検サンプルのシンレイヤー検体を調製した。シンレイヤー検体調製の前後で、このLKBCサンプルの質量を測定した。ThinPrepTMプロセッサーは各処理工程において、フィルター上に特異的な細胞の密度のために必要なサンプル量のみを消費するので、消費された体積がLBCサンプル中の相対的細胞濃度に関する測定値である。本実施例において、ThinPrepTMプロセッサーによるシンレイヤー検体調整のために消費する量の2倍のLBCを、ハイブリッド捕獲分析のために使用した(LBCサンプルの細胞含量が低すぎるサンプルは除いた)。分析を実施するため、CytoLytTM、PreservCytTM溶液から遠心分離によって細胞をペレットとした。得られたペレットを直接RNA調製手順に供した。このペレットを希釈し、使用準備済みRLT緩衝液中に再懸濁した。均質化した溶解物に70%エタノールを加えた後、この懸濁液をピペッティングによって混合した。RNAの精製及び単離は、製造者による指示に従ってQIAampスピンカラムを使用し、実施した。p16INK4a mRNAの検出には、p16INK4a並びにp14ARFに特異的な40マーDNAオリゴヌクレオチドプローブの混合物を使用した。この混合物中の最も適切なプローブは、以下の配列を含有した。
p14ARFは:
p16INK4aに有望なプローブ配列は以下の通りである。:
RNA−DNAハイブリッド検出のため、Digene Corp.から市販される抗RNA−DNAハイブリッド抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用した。ハイブリダイゼーション溶液を直接マイクロタイタープレートに加え、常温で1時間インキュベートした。製造者の指示に従って、このプレートを洗浄した。二次の抗RNA−DNAハイブリッド抗体およびDigene Corp.によって提供された検出試薬を使用して検出を行った。ハイブリッド捕獲アッセイは、全ての子宮頸部検体についてp16INK4aについて陽性であると示した。この結果はハイブリッド捕獲によって全ての子宮頸部検体がhrHPVについて陽性であるとされたことと一致した。口腔由来の癌検体の約半数をp16INK4aの過剰発現について検査した。p16INK4a陽性であるこれらの検体の全てをhc2によってhrHPVに関して検査した。口腔の癌において、HPV陽性とp16INK4aの過剰発現との間に有意な相関性があった。小細胞肺癌に関しては、検査された事例の10事例の内8事例で、p16陽性と検出された。ハイブリッド捕獲によって得られたp16INK4aについての結果は全て、シンレイヤー検体の免疫細胞化学的分析によって確認し得る。p14ARFに関しては、子宮頸部サンプルについての結果は、p16INK4aについての結果と比較できるものであった。小細胞肺癌に関しては、ハイブリッド捕獲において検査された10の事例のうち内わずか2つの事例のみがp14ARF陽性を示した。この結果は免疫細胞化学によって確認し得る。口腔由来のLBCサンプルでは、免疫細胞化学的な所見と一致して、10事例のうち7の事例でp14ARFを検出し得る。この結果は、ハイブリッド捕獲試験様式におけるLBCサンプル由来のサイクリン依存性キナーゼインヒビターの検出は、幾種類かの癌の存在の診断の評価のために使用し得ることを示す。この結果は、生化学試験が細胞学的検査の補助検査または共同検査として使用され得ることを示唆する。
全てPreservCytTM溶液に準備した、HSILであると細胞学的に分類された子宮頸部スワブ10サンプル、小細胞肺癌であると細胞学的に診断された唾液10サンプル、膀胱腫瘍と診断された被験者からの尿10サンプル、DCISと診断された個体からの細針吸引10サンプルを、細胞の遠心分離に供し、続いて溶解液中に細胞を可溶化した。その後、ELISAに基づいて、スワブに含まれる細胞から調製した溶液中のサイクリン依存性キナーゼインヒビターp16INK4a及びp14ARF、HER−2/Neuの発現レベルの検出した。ELISA試験は以下のように行った。
各10mLのLBCサンプルを遠心分離して細胞を沈殿させた。細胞ペレット[TIME]を700μlのmtm溶解緩衝液(2% トリトンX−100、0.4% SDS、0.6mM PMSFのPBS溶液)中に、80℃で10分間混合し、インキュベートすることによって溶解した。次にLBCサンプル溶解物を4℃で遠心分離した(28.000xgにて15分間(16.600rpm HighspeedCentrifuge JEC Multi RF))。上清を新しい試験管に移した。上清は−20℃で保存し得る。
(ELISAプレートのコーティング)
各タンパク質ついて、分離したELISAプレートを以下のように調製した。p16INK4a、p14ARF、およびHER−2/Neuに特異的な一次抗体のストック溶液をPBS中に希釈し、使用準備済みコーティング溶液を調製した。p16INK4aについては、ELISAプレートのコーティングのためにmtm E6H4を使用した。p14ARFについては、Calbiochemから市販されているp14ARFに対するポリクローナル抗体を使用した。HER−2/Neuについては、DakoCytomationからのポリクローナル抗体をコーティングのために使用した。50μlのコーティング溶液をELISAプレートの各ウェルに加えた。コーティングのため、このプレートを4℃で一晩インキュベーションした。コーティング溶液をELISAプレートから除去し、以下の自動ELISA洗浄器を使用してプレートをリンスした。:
7x250μl洗浄緩衝液(PBS中、0.1%Tween20(v/v))
残った洗浄緩衝液を除去した後、300μlのブロッキング緩衝液(PBS中、2%BSA)を各ウェルに加えた。プレートを震盪器上にて、常温で1時間インキュベーションした。
ブロッキング緩衝液を除去した後、100μlの溶解細胞サンプルを各ウェルに加えた。試験の検量のため、種々の濃度の組換えタンパク質(0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、800pg/ml)を各試験に加えた。サンプルを常温で1時間インキュベーションした。その後以下の自動ELISA洗浄器で洗浄を行った:
7x250μl洗浄緩衝液 残った緩衝液は除去した。
ストック溶液を希釈して、各々のタンパク質に特異的なビオチン化二次抗体の作用溶液を調製した。p16INK4aについてはmtmクローンD7D7を使用し、p14ARFについてはCalbiochemのモノクローナル抗体を使用し、HER−2/NeuにいついてはDakoCytomationのモノクローナル抗体を使用した。100μlの作用溶液を各ウェルに加えた。常温で1時間インキュベーションした後、抗体溶液を除去し、ELISAプレートを自動ELISA洗浄器で洗浄した。
(検出)
ストレプトアビジンHRPポリマー(1mg/ml)を1:10に前希釈した(4μl+36μlインキュベーション緩衝液)。インキュベーション緩衝液(PBS中、0.1%BSA)中に1:300に希釈して、最終濃度0.33μlに最終インキュベーション溶液を調製した。この溶液100μlを各ウェルに加えて、常温で1時間インキュベーションした。その後緩衝液を除去し、各ウェルにつき5回、200μlの洗浄緩衝液を用いて手動でプレートを洗浄した。
TMB基質を暗所にて25℃で1時間平衡化した。100μlの基質溶液を各ウェルに加えた。ELISAプレートを暗所にて25℃で正確に15分間、インキュベーションした。次に80μlの2.5M H2SO4を加えて反応を停止させた。反応停止後5分以内に、OD450nmを決定した。この結果を評価した後、各サンプルのODに関する値を得た。各抗体に関して、バックグラウンドと見られる値を使用して、閾値ODを決定した。このELISAの結果を、同一の個体由来の検体の細胞学的評価の診断結果と比較した。結果を以下の表6に示す。
CytoLytTM中の尿中の細胞の20個のLBCサンプルを本実施例のために使用した。RT−PCRは実施例3に示した同じ方法で実施した。タンパク質分析を実施例2に示したディップスティック検査様式にて行い、平行して、実施例1にて示したELISA様式にて実施した。実験手順はこれらの実施例にて示したように行った。尿LBCサンプル由来の溶解物中で、MCM−5を容易に検出し得ることを示し得る。タンパク質及び核酸のレベルに基づく生化学的非細胞ベースのアッセイによって得られた結果は、細胞学から得られた結果と非常に良く対応する。細胞学ではMCM−5タンパク質に対する免疫細胞学的染色を、診断の評価における補助として利用した。
Claims (15)
- ヒト被験体の可溶化身体サンプルから子宮頸癌またはその前駆病変を検出するためのインビトロの方法であって、該インビトロの方法は、以下の工程:
(a)溶解培地中でヒト被験体から得られた身体サンプルを可溶化する工程、
(b)該可溶化身体サンプル中のp16INK4aまたはp14ARFの過剰発現を決定する工程であって、該工程は、ヒト被験体の該可溶化身体サンプル中のp16INK4aまたはp14ARFのレベルを、可溶化された健康なヒト身体サンプル中に存在するレベルと比較することによって、決定する工程、
からなり、該インビトロの方法が形態学的試験を含む方法を除く、方法。 - 前記ヒト被験体の身体サンプルが、スワブである、請求項1に記載のインビトロの方法。
- 前記ヒト被験体の身体サンプルが、
a.該サンプルが得られた後すぐに、
b.保存緩衝液中での、保存および/または輸送の後に、あるいは
c.輸送緩衝液中での輸送の後に、
可溶化される、請求項1または2のいずれか1項に記載のインビトロの方法。 - p16INK4aおよびp14ARFのレベルが、決定される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記マーカー分子の検出が、検出される分子に対して特異的な、少なくとも1種のプローブを使用して行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 前記プローブが、検出可能に標識されている、請求項5に記載のインビトロの方法。
- 前記標識が、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、電子発光化合物、蛍光化合物、金属キレート剤、酵素、または生物学的に関連する結合構造からなる群より選択される、請求項6に記載のインビトロの方法。
- 前記プローブが、タンパク質および/または核酸である、請求項5〜7のいずれか1項に記載のインビトロの方法。
- 少なくとも1種のプローブが、抗体、抗体フラグメント、または、ミニ抗体である、請求項8に記載のインビトロの方法。
- 少なくとも1種のプローブが、p16INK4aまたはp14ARFに対して、特異的にハイブリダイズする核酸である、請求項8に記載のインビトロの方法。
- 前記インビトロの方法が、インサイチュハイブリダイゼーション反応および核酸増幅反応からなる群から選択される反応を含む、請求項10に記載のインビトロの方法。
- 前記核酸増幅反応が、PCR、NASBAまたはLCRである、請求項11に記載のインビトロの方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のインビトロの方法であって、健康なヒトの子宮頸部の身体サンプル中の、p16INK4aまたはp14ARFのレベルが、検出手順についての閾値を設定するための所定の値として提供される、インビトロの方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のインビトロの方法であって、健康なヒトの子宮頸部サンプル中の、p16INK4aまたはp14ARFのレベルが、標準化サンプル溶液からか、または健康なヒトの子宮頸部サンプルの代表値から決定される、インビトロの方法。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のインビトロの方法であって、健康なヒトの子宮頸部サンプル中の、p16INK4aまたはp14ARFの決定が、以下:
a.検出手順の過程で、または
b.検出系の校正の過程で、
実行される、インビトロの方法。
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