BR112014011563B1 - Método para determinar um risco aumentado de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (hnscc) em um indivíduo humano infectado com papiloma vírus humano (hpv), e kit - Google Patents
Método para determinar um risco aumentado de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (hnscc) em um indivíduo humano infectado com papiloma vírus humano (hpv), e kit Download PDFInfo
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Abstract
MÉTODOS PARA DETERMINAR UM RISCO AUMENTADO DE DIAGNOSTICAR CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE CABEÇA E PESCOÇO (HNSCC) EM UM INDIVÍDUO HUMANO INFECTADO COM PAPILOMA VÍRUS HUMANO, KIT PARA APLICAÇÃO DO MESMO, BEM COMO USO DE ANTICORPOS NA PREPARAÇÃO DO REFERIDO KIT. Métodos e kits para o diagnóstico e determinação de prognóstico de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço são descritos. Um método exemplar para o diagnóstico de carcinoma de células escamosas (HNSCC) de cabeça e pescoço em um indivíduo pode incluir a análise de uma amostra de saliva do indivíduo para a presença de proteínas totais, solCD44 e HPV e usando a combinação de níveis de proteínas totais, HPV, e CD44 em uma aná lise multivaria- da para determinar uma pontuação combinada, segundo o qual um aumento na pontuação acima de um ponto de corte distingue os indivíduos com HNSCC, ou um risco elevado de ocorrência futura do mesmo, de indivíduos sem HNSCC ou de baixo risco de ocorrência futura do mesmo.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido Provisório US 61/559,974, depositado em 15 de novembro de 2011, e para o Pedido Provisório US 61/654,595, depositado em 1° de junho de 2012, cada um dos quais está incorporado neste documento por referência em sua integridade.
[002] Esta invenção foi feita com apoio do governo do National Institutes of Health, sob concessão n° R01CA118584-NIH. O governo tem determinados direitos sobre esta invenção.
[003] O assunto divulgado neste documento geralmente refere-se aos métodos e kits para a detecção, tratamento e prognóstico de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC).
[004] O carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) afeta 50.000 pessoas nos Estados Unidos e 600.000 pessoas no mundo inteiro todos os anos. Os principais fatores de risco incluem uso de tabaco e álcool e a infecção pelo papilomavírus humano (HPV).
[005] Até hoje, não existe programa ou exame de rastreio de HNSCC amplamente aceito (ver, por exemplo, Vokeset alet al., N Engl J Med, 328:184-94 (1993); Lingen et al., Curr Opin Oncol, 13:176-82 (2001); Forastiere et al., N Engl J Med 345:1890-1900 (2001); Patton, Orol Oncol, 39:708-723 (2003); O’Hara et al., Clin Otolaryngol, 27:1334 (2002); Smart, Cancer 72:1061-5 (1993); Sankaranarayanan et al., Cancer, 88:664-73 (2000); Sankaranarayanan et al., Lancet 365:192733 (2005)) porque o padrão-ouro, rastreio por exame físico seguido de biópsia, possui sensibilidade e especificidade limitadas (64% e 74%, respectivamente) (Brocklehurst et al., Cochrane Database Syst Rev,11: CD004150 (2010)) e testes de diagnóstico molecular estão ainda em desenvolvimento (Nagler, Oral Oncol., 45:1006-10 (2009); Mahfouz et al., EurArch Otorhinolaryngol, 267:851-60 (2010)). Técnicas adjuvantes para detecção de câncer bucal que utilizam corantes, autofluorescência ou citologia esfoliativa estão disponíveis, mas revisões recentes questionam se elas melhoram os índices de detecção precoce (Patton et al., J Am Dent Assoc, 139:896-905 (2008); Lingen et al., Oral Oncol 44:10-22 (2008)). Portanto, os esforços se concentraram em ferramentas de diagnóstico molecular. Vários estudos que testaram a saliva para perfis de expressão de RNA (Li et al., Clin Cancer Res,10:8442-8450 (2004)), descoberta do microRNA (Park et al., Clin Cancer Res, 15:5473-5477 (2009)) e análise proteômica (Hu et al., Clin Cancer Res, 14:6246-6252 (2008)) apresentam potencial, mas são um pouco complicados e não validados (Nagler, Oral Oncol., 45:1006-10 (2009); Mahfouz et al., Eur Arch Otorhinolaryngol, 267:851-60 (2010)). Como resultado, a maioria dos pacientes é diagnosticada numa fase tardia, quando os índices de cura são 40% ou inferior. Assim, os testes de detecção precoce são necessários.
[006] De acordo com os propósitos dos materiais, compostos, composições e métodos divulgados, conforme incorporado e amplamente descrito neste documento, o assunto divulgado, em um aspecto, refere-se aos métodos e kits para detectar, tratar e fornecer um prognóstico para o carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço.
[007] Vantagens adicionais serão definidas em parte na descrição abaixo e, em parte, serão óbvias a partir da descrição ou podem ser aprendidas pela prática dos aspectos descritos abaixo. As vantagens descritas abaixo serão realizadas e alcançadas por meio dos elementos e combinações particularmente destacados nas reivindicações anexas. Deve ser compreendido que tanto a descrição geral acima quanto a descrição detalhada abaixo são exemplares e explicativas apenas e não são restritivas.
[008] Figuras 1A a 1B são gráficos que mostram a sobrevida livre de progressão (PFS) (Fig. 1A) e sobrevida geral (OS) (Fig. 1B) de pacientes em estudo. Figura 1C é uma tabela mostrando PFS mediana e índice de PFS e OS em 12, 24 e 36 meses. A Figura 1D é uma tabela mostrando o desvio total, médio, mínimo, máximo e padrão de PFS e OS.
[009] As Figuras 2A a 2RR são gráficos que mostram a PFS (Figuras 2A, 2C, 2E, 2G, 2I, 2K, 2M, 2O, 2Q, 2S, 2U, 2W, 2Y, 2AA, 2CC, 2EE, 2GG, 2II, 2KK, 2MM, 2OO, 2QQ) e OS (Figuras 2B, 2D, 2F, 2H, 2J, 2L, 2N, 2P, 2R, 2T, 2V, 2X, 2Z, 2BB, 2DD, 2FF, 2HH, 2JJ, 2LL, 2NN, 2PP, 2RR) em sujeitos caracterizados como nuclear p16 vs. citoplasmática/sem coloração (Figuras 2A-2B), coloração p16+ vs. p16- (Figuras 2C-2D), solCD44 >10 ng/ml vs. < 10 ng/ml (Figuras 2E-2F), total de proteína < 1mg/ml vs. >1 mg/ml (Figuras 2G-2H), coloração CD44 vs. sem coloração (Figuras 2I-2J), apenas membrana CD44/coloração universal vs. sem coloração/outros (Figuras 2K-2L), membrana EGFR e coloração citoplasmática vs. sem coloração/outros (Figuras 2M-2N), membrana EGFR e citoplasmática vs. outros vs. sem coloração (Figuras 2O-2P), membrana EGFR v. coloração citoplasmática/sem coloração (Figuras 2Q-2R), membrana EGFR vs. somente citoplasmática vs. sem coloração (Figuras 2S-2T), queratinizante vs. não queratinizantes (Figuras 2U-2V), fumante atual vs. não/ex fumante (Figuras 2W-2X), sem exposição ao álcool vs. exposição leve/moderada ao álcool v. exposição pesada ao álcool (Figuras 2Y-2Z), exposição pesada ao álcool vs. exposição leve/sem exposição ao álcool (Figuras 2AA-2BB), câncer no lábio e cavidade oral vs. câncer orofaríngeo (Figuras 2CC-2DD), estágio I/II vs. estágio III/IV do câncer (Figuras 2EE-2FF), estágio I/II/III vs. estágio IV do câncer (Figuras 2GG-2HH), câncer T1-T3 vs. T4 (Figuras 2II-2JJ), N0 vs. N1- N3, Nx (Figuras 2KK-2LL), sexo feminino vs. masculino (Figuras 2MM- 2NN), Brancos vs. Negros (Figuras 2OO-2PP), ou hispânicos vs. não hispânicos (Figuras 2QQ-2RR).
[0010] As Figuras 3A-3C são gráficos que mostram que a superexpressão de CD44 aumentou a proliferação (Fig. A Figura 5 contém lâminas de histologia mostrando coloração de CD44, EGFR e pEGFR (Y1068) em xenotransplantes CAL 27 após o tratamento com siRNA CD44 ou uma sequência codificada. A regulação para baixo de CD44 inibe a expressão de EGFR e sua fosforilação (Y1068) em xenotransplantes CAL 27.
[0011] A Figura 6 mostra a coloração imuno-histoquímica (IHC) de p16, CD44 e EGFR em câncer p16- onde coloração de p16 é citoplasmática e difusa. Neste caso, CD44 colore a membrana e universalmente por todo o tumor. CD44 e EGFR se colocalizam na membrana celular e há alguma coloração citoplasmática de EGFR também.
[0012] A Figura 7 mostra a coloração IHC de p16, CD44 e EGFR em tumores p16+ onde núcleos colorem fortemente para p16 e há também alguma coloração citoplasmática. No entanto, a coloração da membrana CD44 está perdida, somente os linfócitos invasores retêm expressão de CD44. A expressão de EGFR não é vista.
[0013] Os materiais, compostos, composições e métodos descritos neste documento podem ser compreendidos mais facilmente recorrendo-se à seguinte descrição detalhada de aspectos específicos da matéria divulgada, e os exemplos nele incluídos.
[0014] Antes que os presentes materiais, compostos, composições e métodos sejam divulgados e descritos, deve ser compreendido que os aspectos descritos a seguir não estão limitados a métodos sintéticos específicos ou reagentes específicos, visto que, é claro, podem variar. Também deve ser compreendido que a terminologia empregada neste documento tem a finalidade de descrever aspectos particulares apenas e não se destina a ser limitante.
[0015] Também, ao longo desta especificação, são referenciadas várias publicações. As divulgações dessas publicações em suas totalidades estão, por meio deste, incorporadas por referência neste pedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual esta matéria divulgada pertence. As referências divulgadas são também individual e especificamente incorporadas por referência neste documento para o material contido nelas que é discutido no período em que a referência é invocada.
[0016] Neste relatório descritivo e nas reivindicações a seguir, será feita referência a um número de termos, que serão definidos para ter os seguintes significados:
[0017] Ao longo da especificação e reivindicações a palavra "compreender" e outras formas da palavra, tais como "compreendendo" e "compreende", significam inclusive, mas não limitado a, e não se destinam a excluir, por exemplo, outros aditivos, componentes, números inteiros, ou etapas.
[0018] Como usado na descrição e reivindicações acrescentadas, as formas singulares "um" "uma" e "o/a" incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente de outra forma.
[0019] O termo "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui instâncias em que ocorre o referido acontecimento ou circunstância e instâncias onde isso não acontece.
[0020] Intervalos podem ser aqui expressos a partir de "cerca de" um valor particular, e/ou a "cerca de" um outro valor particular. "Cerca de" pode significar dentro de 5% do valor declarado. Quando tal intervalo é expresso, outro aspecto inclui de um determinado valor e/ou para o outro determinado valor. Da mesma forma, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do "cerca de" antecedente, será compreendido que o valor particular forma um outro aspecto. Será adicionalmente compreendido que os pontos de extremidade de cada um dos intervalos são significativos, tanto em relação ao outro ponto de extremidade e independentemente do outro ponto de extremidade. Compreende-se também que há inúmeros valores divulgados neste documento, e que cada valor também é divulgado neste documento como "cerca de" aquele determinado valor além do valor em si. Por exemplo, se o valor "2000" é divulgado, então "cerca de 2000" é também divulgado. Também é compreendido que quando um valor é divulgado, então "menor que ou igual ao" valor, "maior que ou igual ao valor" e possíveis intervalos entre os valores também são divulgados, como apropriadamente compreendido pela pessoa versada na técnica. Por exemplo, se o valor "2000" é divulgado, então "menor que ou igual a 2000", bem como "maior que ou igual a 2000" é também divulgado. Também se compreende que por todo o pedido dados são fornecidos em diferentes formatos e que esses dados representam pontos de extremidade e pontos de partida e intervalos para qualquer combinação de pontos de dados. Por exemplo, se um determinado ponto de dados "10" e um determinado ponto de dados "15" são divulgados, compreende-se que maior que, maior que ou igual (a) menor que, menor que ou igual a, e igual a 10 e 15 são considerados divulgados, bem como entre 10 e 15. Também se compreende que cada unidade entre duas unidades específicas também são divulgadas. Por exemplo, se 10 e 15 são divulgados, então 11, 12, 13 e 14 são também divulgados.
[0021] Referências na especificação e reclamações conclusivas para partes por peso de um determinado elemento ou componente em uma composição denota a relação de peso entre o elemento ou componente e quaisquer outros elementos ou componentes na composição ou artigo para o qual uma peça por peso é expressa. Assim, em um composto constituído por 2 partes por peso do componente X e 5 partes pelo componente de peso Y, X e Y estão presentes em uma razão de peso de 2:5, e estão presentes em tal razão independentemente se os componentes adicionais forem compreendidos na composição.
[0022] A porcentagem de peso (% de peso) de um componente, a menos que especificamente indicado em contrário, é baseada no peso total da formulação ou composição na qual o componente está incluído.
[0023] O termo "indivíduo", "hospedeiro", "sujeito" e "paciente" são usados indistintamente para referir-se a qualquer indivíduo que é o alvo do diagnóstico, prognóstico, administração ou tratamento. O sujeito pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero. Assim, o sujeito pode ser um paciente humano ou veterinário.
[0024] Um "biomarcador" é qualquer gene ou proteína cujo nível de expressão em um tecido ou célula é alterado é comparação ao de uma célula ou tecido normal ou saudável.
[0025] O termo "prognóstico" é reconhecido na técnica e engloba as previsões sobre o provável curso da doença ou a progressão da doença, especialmente com relação à probabilidade de remissão da doença, recaída da doença, reincidência do tumor, metástase e morte. "Bom prognóstico" refere-se à probabilidade de que um paciente com câncer, tal como carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, permaneça livre da doença (ou seja, livre do câncer). "Mau prognóstico" significa a probabilidade de uma recaída ou reincidência do câncer ou tumor subjacente, metástase, ou morte. Pacientes com câncer classificados como tendo um "bom resultado" permanecem livres do câncer ou tumor subjacente. Em contraste, pacientes com câncer com "mau resultado" experimentam recaída da doença, reincidência do tumor, metástase ou morte. Em determinadas modalidades, o prazo para avaliar o prognóstico e o resultado é, por exemplo, menos de um ano, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, quinze, vinte ou mais anos. Como usado aqui, o tempo relevante para avaliar o prognóstico ou tempo de sobrevida livre da doença começa com a remoção cirúrgica do tumor ou supressão, mitigação ou inibição do crescimento do tumor. Assim, por exemplo, em determinadas modalidades, um "bom prognóstico" refere-se à probabilidade de que um paciente com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço permaneça livre do câncer ou tumor subjacente para um período de pelo menos cinco, mais especificamente, um período de pelo menos dez anos. Em outros aspectos da invenção, um "mau prognóstico" refere-se à probabilidade de que um paciente com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço experimente recaída da doença, reincidência do tumor, metástase ou morte dentro de menos de cinco anos, mais especificamente, menos de dez anos. Prazos para avaliar o prognóstico e os resultados fornecidos acima são ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante.
[0026] O termo "tratamento" refere-se à gestão médica de um paciente com a intenção de curar, melhorar, estabilizar ou prevenir uma doença, condição patológica ou transtorno. Este termo inclui tratamento ativo, ou seja, o tratamento direcionado especificamente para a melhora de uma doença, condição patológica ou transtorno e inclui também o tratamento causal, ou seja, o tratamento direcionado para a remoção da causa da doença, condição patológica ou transtorno associado. Além disso, este termo inclui tratamento paliativo, ou seja, tratamento designado para o alívio dos sintomas ao invés da cura da doença, condição patológica ou transtorno; tratamento preventivo, ou seja, o tratamento direcionado a minimizar ou parcial ou completamente inibir o desenvolvimento da doença, condição patológica ou transtorno associado; e tratamento de suporte, ou seja, o tratamento empregado para complementar outra terapia específica direcionada à melhora da doença, condição patológica ou transtorno associado.
[0027] O termo "anticorpos" refere-se aos anticorpos naturais ou sintéticos que se ligam seletivamente a um antígeno alvo. O termo inclui anticorpos policlonais e monoclonais. Além de moléculas de imunoglobulina intactas, também estão incluídos no termo "anticorpos" fragmentos ou polímeros dessas moléculas de imunoglobulina e versões humanas ou humanizadas de moléculas de imunoglobulina que se ligam seletivamente ao antígeno alvo.
[0028] Além disso, são divulgados neste documento materiais, compostos, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em preparação para, ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Estes e outros materiais são divulgados neste documento, e compreende-se que quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. destes materiais são divulgados que, enquanto referência específica das várias combinações individuais e coletivas e permutação desses compostos não pode ser explicitamente divulgada, cada uma é especificamente contemplada e descrita neste documento. Por exemplo, se uma composição for divulgada e uma série de modificações que podem ser feitas a inúmeros componentes da composição for discutida, cada combinação e permutação possíveis são especificamente contempladas a menos que especificamente indicado em contrário. Este conceito aplica-se a todos os aspectos desta divulgação, incluindo, mas não se limitando a, composições e etapas nos métodos de fazer e usar as composições divulgadas. Assim, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser executadas compreende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com qualquer aspecto específico ou combinação de aspectos dos métodos divulgados, e que cada tal combinação é especificamente contemplada e deve ser considerada divulgada.
[0029] Referência agora será feita detalhadamente para aspectos específicos dos materiais, compostos, composições, componentes, dispositivos, artigos e métodos divulgados, cujos exemplos são ilustrados na descrição e nos exemplos a seguir e nas figuras e sua descrição acima e abaixo.
[0030] Ensaios eficientes, baratos e não invasivos para diagnosticar e determinar o prognóstico para o carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) são descritos. Os ensaios divulgados envolvem a detecção de um ou mais biomarcadores, tais como CD44 (por exemplo, CD44 solúvel (solCD44), em uma amostra do sujeito. A Patente U.S. n° 8.088.591 por Franzmann et al. é incorporada por referência na íntegra para sua descrição de biomarcadores que podem ser usados para diagnosticar e monitorar HNSCC em um sujeito. Os níveis elevados desses biomarcadores são capazes de distinguir os pacientes com câncer de controles com alta precisão e especificidade. No entanto, esses biomarcadores são reduzidos em determinadas populações apesar da presença de HNSCC.
[0031] Assim, são divulgados biomarcadores adicionais e fatores de risco que podem ser usados para melhorar a precisão e a especificidade de um ensaio de HNSCC. Por exemplo, ficou demonstrado que os níveis de solCD44 e de proteína total combinados são mais eficazes na distinção de HNSCC de controles do que qualquer marcador sozinho. No entanto, os níveis de solCD44 podem ser menores em sujeitos com infecção pelo papilomavírus humano (HPV). Na verdade, a análise bivariada utilizando níveis de solCD44 e de proteína total funciona melhor em homens negros, nos quais a infecção pelo HPV é menos comum. Portanto, inclusão do status HPV em uma análise multivariada pode melhorar a sensibilidade e precisão do ensaio e permitir a detecção de HPV+ HNSCC.
[0032] Outros biomarcadores associados com detecção ou prognóstico de HNSCC podem ser usados em combinação com proteína total, solCD44 e detecção do HPV para melhorar a sensibilidade e/ou precisão do método divulgado. Por exemplo, os níveis de solCD44 podem variar com base na idade e tabagismo. Exposição ao tabaco, exposição ao álcool, raça, etnia, saúde dental, sexo, nível de educação, idade, saúde geral, histórico familiar de câncer, histórico sexual e situação socioeconômica são exemplos de fatores de risco de HNSCC e fatores demográficos que podem ser utilizados na análise multivariada e usando um ou mais fatores de risco ou fatores demográficos na análise multivariada para determinar a pontuação combinada.
[0033] Portanto, os ensaios, e métodos para usar os ensaios para o diagnóstico e prognóstico, são divulgados que envolvem análise multivariada dos biomarcadores divulgados e fatores de risco para determinar uma pontuação combinada para um sujeito. A pontuação combinada então pode ser usada para determinar a presença de HNSCC, ou o risco de reincidência de HNSCC em um sujeito. Em particular, valores de pontuação de corte combinados podem ser determinados empiricamente, comparando-se valores de controle positivos e negativos.
[0034] Os biomarcadores descritos neste documento incluem genes e proteínas. Tais biomarcadores incluem DNA compreendendo a sequência inteira ou parcial da sequência do ácido nucleico codificando o biomarcador, ou o complemento de tal sequência. Os ácidos nucleicos do biomarcador também incluem RNA que compreende a sequência inteira ou parcial de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de interesse. Uma proteína de biomarcador é uma proteína codificada pelo ou correspondente a um biomarcador de DNA da invenção. Uma proteína de biomarcador compreende a sequência de aminoácidos inteira ou parcial de quaisquer proteínas ou polipeptídeos do biomarcador. Fragmentos e variantes de genes e proteínas do biomarcador também são englobados pela presente invenção. Por "fragmento" compreende-se a uma parte do polinucleotídeos ou uma parte da sequência de aminoácidos e, portanto, a proteína codificada. Polinucleotídeos que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos de biomarcador geralmente compreendem pelo menos 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 ou 1.400 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo de biomarcador completo divulgado neste documento. Um fragmento de um polinucleotídeo de biomarcador geralmente irá codificar pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200 ou 250 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína de biomarcador completa da invenção. "Variante" destina-se a dizer sequências substancialmente semelhantes. Geralmente, as variantes de um biomarcador específico da invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência para esse biomarcador conforme determinado por programas de alinhamento de sequência.
[0035] Os biomarcadores aqui descritos são genes e proteínas cuja superexpressão se correlaciona com o prognóstico de câncer, particularmente de HNSCC. Em determinadas modalidades, a superexpressão seletiva de um biomarcador ou combinação de biomarcadores de interesse em uma amostra do paciente é indicativa de um mau prognóstico de câncer. Por "indicativa de um mau prognóstico" compreende-se que a superexpressão do biomarcador específico ou combinação de biomarcadores está associada com um aumento da probabilidade de recaída ou reincidência do câncer ou tumor subjacente, metástase ou morte, tal como definido acima neste documento. Por exemplo, "indicativa de um mau prognóstico" pode se referir a um aumento da probabilidade de recaída ou reincidência do câncer ou tumor subjacente, metástase ou morte dentro de cinco anos, mais particularmente dez anos. Biomarcadores que são indicativos de um mau prognóstico podem ser denominados aqui como "biomarcadores de resultado ruim". Em outras modalidades, a ausência de superexpressão de um biomarcador ou combinação de biomarcadores de interesse é indicativa de um bom prognóstico. Como usado aqui, "indicativo de um bom prognóstico" refere-se a um aumento da probabilidade que o paciente permanecerá livre do câncer, conforme definido neste documento acima. Em algumas modalidades, "indicativa de um bom prognóstico" refere-se a um aumento da probabilidade que o paciente permanecerá livre do câncer por menos cinco, mais particularmente por menos dez anos. Tais biomarcadores podem ser referidos como "biomarcadores de bom resultado".
[0036] Os biomarcadores divulgados incluem genes e/ou proteínas cuja superexpressão (em comparação com um controle) se correlaciona com o prognóstico de HNSCC. Um gene ou proteína pode ser superexpressado por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou maior em comparação com um controle. Biomarcadores incluem genes e proteínas que são indicativos de um mau prognóstico de HNSCC (ou seja, biomarcadores de mau resultado), bem como aqueles que sejam indicativos de um bom prognóstico (ou seja, biomarcadores de bom resultado). Biomarcadores de particular interesse incluem genes e proteínas envolvidos na regulação do crescimento e proliferação da célula, controle do ciclo celular, transcrição e replicação do DNA, apoptose, transdução de sinal angiogênese/linfogenêse, ou metástase. Em algumas modalidades, os biomarcadores regulam sistemas de protease envolvidos na invasão do tecido adjacente, degradação de matriz extracelular e remodelação do tecido. Outros biomarcadores incluem reguladores da expressão do gene como hipermetilação ou microRNA. Embora qualquer biomarcador cujo padrão de expressão é indicativo de prognóstico de HNSCC possa ser usado para praticar os métodos e ensaios divulgados, em especial modalidades, biomarcadores são selecionadas do grupo consistindo de HPV, proteína total e CD44. Em uma modalidade, o biomarcador de CD44 é solCD44.
[0037] Infecção por HPV pode ser determinada medindo HPV, direta ou indiretamente. Três categorias de ensaios moleculares estão atualmente disponíveis para detecção da infecção por HPV em tecidos e amostras de células esfoliadas. Todos são baseados na detecção de DNA de HPV e incluem: (1) ensaios de hibridização não amplificados (hibridização de transferência Southern (STH), hibridação dot blot (DB) e hibridação in situ (ISH)); (2) ensaios de hibridização amplificados de sinal, tais como ensaios de captura híbrida; e (3) ensaios de amplificação de alvo, tais como PCR e PCR em situ. Hibridização Southern blot requer grandes quantidades de DNA, é trabalhosa e não é reproduzível, enquanto hibridização in situ tem apenas moderada sensibilidade para HPV. Detecção do HPV baseada em PCR é extremamente sensível e específica. Usando essa abordagem, o DNA viral é amplificado in vitro pela polimerase de DNA para gerar uma quantidade adequada de alvo, que é então também diretamente visualizada em gel, ou (a abordagem mais específica) detectada pela sonda específica usando métodos tradicionais de hibridização. Na prática, a sensibilidade do método baseado em PCR é cerca de 10-100 genomas virais de HPV em um contexto de 100 ng de DNA celular. Como o PCR pode ser realizado em quantidades muito pequenas de DNA (10-100 ng), é ideal para uso em amostras com baixo teor de DNA.
[0038] Atualmente, o único método de detecção de HPV aprovado de FDA disponível é o ensaio de captura híbrida II (Qiagen, Valencia, CA). Neste ensaio, DNAs de HPV são hibridizados com sondas de RNA e RNA-DNA híbridos são capturados e detectados por um sistema quimioluminescente. A sensibilidade deste teste é semelhante aos de PCR com base em ensaios, com alta sensibilidade alcançada por sinal, ao invés de amplificação de alvo. O ensaio de HC II atual tem sensibilidade para detecção de 1 pg de HPV (cerca de 50 mil cópias) por ml de amostra. Coleta de amostra adequada é essencial para alcançar a máxima sensibilidade, e um dispositivo de escova- amostragem foi mostrado ser o ideal. O ensaio de HC II contém sondas de RNA sintético complementares a sequência genômica de 13 tipos de HPV de alto risco (tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68) e 5 de baixo risco (6, 11, 42, 43, 44).
[0039] Como alternativa, a infecção pelo HPV pode ser determinada detectando as transcrições de mRNA viral ou através da detecção da proteína celular p16. Para o HPV causar câncer, é necessário infecção persistente e um ambiente celular que permite a expressão de nível elevado dos oncogenes virais E6 e E7 (inicialmente na camada basal da célula e em seguida em todo o epitélio). Portanto, detecção de mRNA E6/E7 pode identificar infecção clinicamente mais significativa do que uma abordagem de DNA.
[0040] O inibidor 2A de quinase dependente de ciclina, (CDKN2A, p16Ink4A, p16) é um correlato celular do aumento da expressão do mRNA E6/E7 oncogênico. As principais ações dos oncogenes do HPV são a degradação de p53 por E6 e, assim, a revogação da apoptose, bem como a liberação do E2F do pRb que leva à ativação contínua do ciclo celular. Fisiologicamente, a ativação de E2F é mediada por fosforilação da proteína Rb. Esta via é estritamente regulamentada por um conjunto de inibidores de quinase dependente de ciclina, entre eles, p16, que bloqueiam pRB das enzimas (quinases dependentes de ciclina). Em células com a transformação de infecções por HPV, a regulação da via Rb-E2F é perturbada por E7 e a ativação de p16 não tem nenhum efeito a jusante. Como resultado, p16 é supre-expressado fortemente e se acumula nas células. Superexpressão P16 tem sido demonstrada na grande maioria dos cânceres e pré-cânceres cervicais enquanto no tecido normal, expressão p16 é encontrada somente raramente.
[0041] Efeitos epigenéticos da infecção por HPV também podem ser usados para detectar o HPV. Loci diferencialmente metilados entre linhas de células de HNSCC de HPV+ e HPV- são descritos em Sartor MA, et al. Epigenetics 6:777-87 (2011), que é incorporado por referência para esses perfis epigenéticos.
[0042] Portanto, a infecção pelo HPV pode ser detectada usando anticorpos que se ligam especificamente a p16INK4a. Alternativamente, infecção por HPV pode ser determinada através da detecção de DNA de HPV, RNA ou proteína. Da mesma forma, a infecção por HPV pode ser determinada através da detecção de oncogenes virais (por exemplo, E6/E7) ou alterações epigenéticas.
[0043] Métodos são divulgados para diagnosticar HNSCC em um sujeito, encenando um tumor de HNSCC em um sujeito, monitorando a eficácia de um tratamento de HNSCC ou determinando o prognóstico de um sujeito diagnosticado com HNSCC, ou prevendo reincidência de HNSCC em um sujeito. Esses métodos incluem análise de uma amostra do corpo do sujeito para a presença de proteínas totais, solCD44 e HPV. A combinação de níveis de proteínas totais, HPV e CD44 podem ser usados em uma análise multivariada para determinar uma pontuação combinada. O método mais também incluir a análise da amostra do corpo para a presença de ácido hialurônico (HA), hialuronidase (HAase), IL-8, ou uma combinação destes. Fatores de risco de HNSCC e/ou fatores demográficos também podem ser usados em combinação com a detecção de proteína total, solCD44 e HPV para melhorar a sensibilidade e/ou exatidão do método divulgado.
[0044] Análise multivariada é baseada no princípio estatístico de estatística multivariada, que envolve a observação e análise de mais de uma variável de resultado estatístico de cada vez. Por exemplo, existem vários métodos de regressão que podem ser usados com análise multivariada, incluindo, mas não se limitando a regressões lineares e não lineares generalizadas, regressões de Poisson e logística, algoritmos de aprendizagem de máquina supervisionada, redes neurais, máquinas de suporte vetorial, modelagem de superfície de resposta e splines de regressão multivariada adaptável. Em algumas modalidades, regressão logística é usada.
[0045] Por exemplo, a análise multivariada pode primeiro envolver a determinação de como níveis de proteína total. solCD44 e p16 mudam com base em variáveis de risco, tais como raça, sexo, uso de fumo e álcool. Modelos matemáticos podem então ser desenvolvidos cujos termos incluem níveis de biomarcador e as variáveis de risco para prever a probabilidade de câncer. A significância estatística associada aos termos reflete sua importância para a previsão. Um modelo matemático pode ser usado para estimar um escore preditivo, que permite desenvolver uma pontuação total de probabilidade de câncer. Por exemplo, após ter investigado como os níveis de marcador e variáveis de risco (por exemplo, raça, sexo, uso de fumo e álcool) são associados com o resultado, incluindo interações, um modelo ajustado pode ser obtido em relação ao logaritmo da chance (log-odds) de biomarcadores e covariáveis. Com base neste modelo, uma pontuação ou uma probabilidade preditiva para ter câncer pode ser estimada em valores especificados de todas as variáveis incluídas no modelo.
[0046] Em algumas modalidades, um aumento na pontuação combinada (preditiva) acima de um ponto de corte distingue sujeitos com HNSCC daqueles sem HNSCC ou de baixo risco de ocorrência futura. Em algumas modalidades, um aumento na pontuação combinada acima de um ponto de corte identifica o estágio do tumor de HNSCC, prevê a eficácia de um tratamento de HNSCC, prevê o prognóstico de um sujeito diagnosticado com HNSCC ou prevê o risco de reincidência de HNSCC. Por exemplo, um aumento na pontuação acima de um ponto de corte pode ser associado a um mau prognóstico ou a probabilidade de reincidência.
[0047] Os ensaios e métodos divulgados podem ser usados para orientar o tratamento terapêutico de um sujeito com HNSCC ou com risco de desenvolver HNSCC. Por exemplo, um sujeito com uma pontuação baixa combinada pode receber um tratamento de única modalidade como radioterapia ou cirurgia sozinha, ao invés de terapia combinada. Isto resultaria na diminuição da morbidade relacionada ao tratamento. Em contraste, um sujeito com uma alta pontuação combinada pode receber tratamentos mais agressivos, tais como cirurgia, radioterapia e quimioterapia, uma vez que maior morbidade relacionada ao tratamento seria justificada dado o maior risco de morte pela doença. Portanto os métodos divulgados podem também incluir qualquer tratar o sujeito diagnosticado com HNSCC ou determinado a ter um prognóstico fraco com cirurgia, radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, terapia alvo, ou qualquer combinação das mesmas.
[0048] Cada um dos biomarcadores divulgados pode ser detectado em um sujeito usando amostras do corpo. Por "amostra do corpo" compreendem-se quaisquer amostras de células, tecidos ou fluidos corporais, em que a expressão de um biomarcador pode ser detectada. Exemplos de tais amostras do corpo incluem, entre outros, sangue, linfa, urina, líquidos ginecológicos, biópsias e manchas. Fluidos corporais úteis na presente invenção incluem sangue, urina, saliva, aspirados de mamilo, lavagens ou qualquer outra secreção corporal ou derivados. Sangue pode incluir qualquer sangue total, plasma, soro ou derivado de sangue. Em modalidades preferenciais, a amostra do corpo compreende enxagues bucais. Métodos para a coleta de várias amostras do corpo são bem conhecidos na técnica.
[0049] Os métodos são úteis na detecção de indivíduos em risco para câncer de cabeça e pescoço, incluindo, por exemplo, fumantes, alcoólatras e indivíduos expostos ao vírus HPV. Os métodos descritos neste documento também permitem a avaliação aprimorada de prognóstico de HNSCC em comparação com a análise de outros indicadores de prognóstico conhecidos. Em determinados aspectos, a sensibilidade e a especificidade é igual ou maior do que a dos métodos de avaliação de prognóstico de câncer conhecidos. A ponte de extremidade para avaliar a especificidade e a sensibilidade é a comparação do prognóstico ou resultado usando os métodos da invenção (ou seja próximo ao momento do diagnóstico) com o resultado clínico real (ou seja, se o paciente manteve-se livre do câncer ou sofreu uma reincidência dentro de um período de tempo especificado). Como usado aqui, "especificidade" refere-se ao nível em que um método da invenção pode identificar com precisão verdadeiros negativos. Em um estudo clínico, a especificidade é calculada dividindo-se o número de verdadeiros negativos pela soma dos verdadeiros negativos e falsos positivos. Por "sensibilidade" compreende-se nível em que um método da invenção pode identificar com precisão as amostras que são verdadeiros positivos. A sensibilidade é calculada em um estudo clínico dividindo-se o número de verdadeiros positivos pela soma de verdadeiros positivos e falsos negativos. Em algumas modalidades, a sensibilidade dos métodos divulgados para a avaliação de HNSCC é pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Além disso, a especificidade dos métodos presentes é de preferência pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em outras modalidades, é avaliado o valor combinado de sensibilidade e especificidade para os métodos de prognóstico da invenção. Por "valor de sensibilidade e especificidade combinadas" compreende-se a soma dos valores de sensibilidade e especificidade individuais, como definido acima neste documento. O valor combinado de sensibilidade e especificidade dos métodos presentes é de preferência pelo menos cerca de 105%, 110%, 115%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160% ou mais.
[0050] Como usado neste documento, as definições de "verdadeiros" e "falsos" negativos e positivos dependerão se o biomarcador ou combinação de biomarcadores em questão são biomarcadores de bom resultado ou de mau resultado. Ou seja, no caso biomarcadores de bom resultado (ou seja, esses indicativos de um bom prognóstico), "verdadeiro positivo" refere-se a essas amostras exibindo superexpressão do biomarcador de interesse, conforme determinado por um exame físico, seguido de biópsia. Uma biópsia positiva na patologia pode indicar se uma amostra é positiva ou negativa.
[0051] Como descrito acima, em algumas modalidades, dois ou mais biomarcadores são usados, mais de preferência, dois ou mais biomarcadores complementares. Por "complementares" compreende- se que detecção da combinação de biomarcadores em uma amostra do corpo resulta na determinação precisa do prognóstico de câncer em uma maior porcentagem de casos do que seria identificado se apenas um dos biomarcadores fosse usado. Assim, em alguns casos, uma determinação mais precisa do prognóstico de câncer pode ser feita usando pelo menos dois dos biomarcadores divulgados.
[0052] Quaisquer métodos disponíveis na técnica para detectar a expressão de biomarcadores são englobados neste documento. A expressão de um biomarcador da invenção pode ser detectada em um nível de ácido nucleico ou um nível de proteína. Por "detecção de expressão" compreende-se determinar a quantidade ou a presença de um gene ou proteína de biomarcador. Assim, "detecção de expressão" abrange instâncias onde um biomarcador é determinado não ser expresso, não ser detectavelmente expresso, expresso em um nível baixo, expresso em um nível normal ou superexpresso. A fim de determinar a superexpressão, a amostra do corpo a ser examinada pode ser comparada com uma amostra correspondente. Por exemplo, uma amostra do corpo correspondente que se origina de uma pessoa saudável. Ou seja, o nível "normal" de expressão é o nível de expressão do biomarcador em, por exemplo, uma amostra de um sujeito ou paciente humano não afetado com HNSCC. A amostra do corpo também pode ser comparada com uma amostra do corpo correspondente de um sujeito tratado para HNSCC. Essa amostra pode estar presente em forma padronizada. Em algumas modalidades, determinação de superexpressão de biomarcador não requer comparação entre a amostra do corpo e uma amostra do corpo correspondente que se origina de uma pessoa saudável. Por exemplo, detecção de superexpressão de um indicativo de biomarcador de mau prognóstico em uma amostra do tumor pode impedir a necessidade de comparação com uma amostra correspondente que se origina de uma pessoa saudável. Além disso, em alguns aspectos da invenção, nenhuma expressão, subexpressão ou expressão normal (ou seja, a ausência de superexpressão) de um biomarcador ou combinação de biomarcadores de interesse fornece informações úteis sobre o prognóstico de um paciente.
[0053] Métodos para detecção da expressão dos biomarcadores da invenção compreendem quaisquer métodos que determinem a quantidade ou a presença dos biomarcadores no nível de proteína ou de ácido nucleico. Tais métodos são bem conhecidos na técnica e incluem, entre outros, "tiras de teste" de fluxo lateral, western blots, northern blots, southern blots, ELISA, imunoprecipitação, imunofluorescência, citometria de fluxo, imuno-histoquímica, técnicas de hibridização de ácidos nucleicos, métodos de transcrição reversa de ácido nucleico e métodos de amplificação de ácidos nucleicos, por exemplo, PCR. Em determinadas modalidades, a expressão de um biomarcador é detectada em um nível de proteína usando, por exemplo, os anticorpos que são dirigidos contra proteínas de biomarcador específicas. Estes anticorpos podem ser usados em vários métodos, como técnicas de Western blot, ELISA, imunoprecipitação ou imuno- histoquímica. Da mesma forma, imunocoloração de tecido pode ser combinada com a avaliação das informações clínicas, os métodos convencionais de prognóstico e a expressão de marcadores moleculares (por exemplo, p16INK4a e solCD44), conhecidos na técnica. Desta forma, os métodos divulgados podem permitir a determinação mais precisa do prognóstico de HNSCC.
[0054] Também aqui são fornecidos kits para diagnosticar um sujeito com HNSCC ou determinar o prognóstico de um sujeito com HNSCC. O kit inclui meios para medir p16INK4a, solCD44, e/ou proteína total. Por exemplo, o kit pode incluir uma pluralidade de anticorpos que se ligam especificamente a p16INK4a. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende o idiotipo do clone de anticorpo E6H4. O kit ainda inclui um agente de detecção (por exemplo, anticorpos secundários e/ou agente colorimétrico) para detectar os anticorpos contidos. O kit ainda inclui uma pluralidade de anticorpos que se ligam especificamente a CD44 (por exemplo, solCD44). O kit ainda inclui um reagente para a determinação da concentração de proteínas totais em uma amostra. O kit também inclui uma amostra de referência de p16INK4a e/ou solCD44. O kit, além disso, pode incluir instruções de utilização do kit (por exemplo, instruções para o diagnóstico de um sujeito), um recipiente, e/ou uma transportadora. Em particular, o kit pode conter uma mídia legível em computador ou um hiperlink que usa algoritmos e tabelas de referência para converter valores de detecção em uma pontuação combinada. Em algumas modalidades, o kit é um imunoensaio de fluxo lateral. Alternativamente, o kit pode compreender uma placa com múltiplos poços, opcionalmente revestida com o anticorpo que se liga especificamente a p16 INK4a, o anticorpo que se liga especificamente a CD44, ou uma combinação dos mesmos.
[0055] Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar ainda certos aspectos dos métodos e composições aqui descritos e não se destinam a limitar o âmbito das reivindicações.
[0056] Os exemplos a seguir são definidos abaixo para ilustrar os métodos e resultados de acordo com o assunto divulgado. Estes exemplos não pretendem incluir todos os aspectos do assunto divulgado neste documento, mas sim ilustrar os resultados e métodos representativos. Estes exemplos não são destinados a excluir equivalentes e variações da presente invenção, que são aparentes para uma pessoa versada na técnica.
[0057] Esforços têm sido feitos para garantir a precisão no que diz respeito a números (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios devem ser considerados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes por peso, a temperatura é em °C ou é em temperatura ambiente e a pressão é atmosférica ou quase atmosférica. Existem inúmeras variações e combinações de condições de reação, por exemplo, concentrações de componente, temperaturas, pressões e outras gamas e condições de reação que podem ser usadas para otimizar a pureza do produto e o rendimento obtido a partir do processo descrito. Apenas experimentação razoável e de rotina deverá otimizar tais condições de processo.
[0058] A relação entre o teste aqui descrito e HPV relacionado ao HNSCC foi estudada olhando-se para como os marcadores aqui descritos melhoram em pacientes cujos tumores são positivos para p16INK4a. Catorze sujeitos com câncer orofaríngeo foram avaliados. Para cada sujeito, foram obtidos os resultados de imuno-histoquímica p16INK4a do tecido de seu tumor e resultados de proteína e solCD44 de seus enxagues bucais. Níveis médios de solCD44 e nível proteína foram inferiores em casos de HPV+ (CD44: 3,17 vs. 4.2, p = 0,55, proteínas: 0,83 vs.1,07, p = 0,49) embora as diferenças não tenham atingido significância estatística. Os testes de solCD44 e proteína que foram medidos usando os sobrenadantes de enxagues bucais foram combinados com níveis de p16 INK4a detectados usando as pellets dos mesmos enxagues buscais.
[0059] Um ensaio in vitro foi realizado para a determinação quantitativa da proteína p16INK4a humana em amostras lisadas de pellets de enxagues bucais. Amostra de pellets foram colocadas em 200 μL de tampão de lise celular (SIGMA) contendo inibidor de protease (Thermo Scientific) para estabilização de p16INK4a solubilizado. Então as amostras foram aquecidas a 95°C por 10 minutos, o que facilita a Lise completa das células para melhor detecção de p16INK4a. A proteína p16INK4a foi quantificada utilizando uma técnica de sanduíche ELISA colorimétrica usando tiras de microtitulação revestidas com p16INK4a específica, anticorpo monoclonal E6H4™ (laboratórios mtm Roche AG) e uma segunda p16INK4a específica, anticorpo monoclonal marcado com HRP. A quantificação foi realizada gerando-se uma curva padrão baseada nos níveis p16INK4a conhecidos (Padrões 1-6). Os níveis em amostras do teste foram determinados por interpolação com base na curva padrão. Um leitor de placas de microtitulação foi usado para medir a absorvância em cada poço no comprimento de onda de 450 nm (comprimento de onda de referência: 620 nm). Um programa de cálculo baseado no método 4- parâmetro foi usado para obter as concentrações de amostra final de p16INK4a. Os resultados são demonstrados em U/mL e amostras de estudo foram medidas em duplicatas, cada um com um volume de 100 μL. Verificou-se um valor de corte de 15 U/mL como limite apropriado para classificar uma amostra clínica individual como positiva para o resultado ELISA p16INK4a Cervatec™ (Roche mtm laboratories AG) por um estudo clínico multicêntrico (protocolo n° 9502-06-REG-DE-001).
[0060] Usando este método combinado, p16INK4a em combinação com CD44 e proteína foi testado em 14 pacientes com HNSCC, incluindo pacientes com carcinoma de célula escamosa (CA) ou carcinomas primários desconhecidos (UK1 CA) de cavidade oral ou da orofaringe. Três voluntários saudáveis (HV) também foram testados (ver tabela 1). Dois pacientes com níveis baixos de CD44 (corte fixado em 2,7 ng/ml) e proteína (corte em 1,0 mg/ml) tinham níveis de p16INK4a acima do corte de 15 U/ml. CD44 e proteína também cada uma identificaram tumores que não foram detectados pelos outros testes. Assim, a adição de p16INK4a ao painel melhora a sensibilidade. Os 3 voluntários saudáveis que foram testados todos tinham níveis para cada marcador abaixo dos cortes. Tabela 1
Tabela 1 (Continuação) 
*1 U/ml=2,8 pg/ml de proteína p16 INK4a. **CA: Câncer, UK 1 CA: Câncer primário desconhecido, HV: Voluntário saudável
[0061] Usando imuno-histoquímica em tecidos de câncer oral, foi avaliado um painel de marcadores (CD44 e EGFR), que estão associados com mau prognóstico. Determinamos a relação entre a expressão de CD44, EGFR, e p16 (o marcador substituto para o HPV) em tecido com níveis de enxague bucal de proteína e solCD44. Tabela 2. Demografia dos pacientes e outras características
Tabela 3. Características da doença, tratamento e resultado 
Tabela 4. CD44, Log2 CD44, e proteína em enxagues bucais por IHC variáveis, status PD e status vital 
Continuação 
CD44 em ng/ml(x5) e proteína em mg/ml. SD: desvio padrão, SE: erro padrão. P: P-valor do teste t de Student.
[0062] A coloração nuclear com o p16 é um indicador eficaz de infecção pelo HPV. Níveis de SolCD44 são mais elevados em HPV- do que HPV+. Tabela 5. Efeitos invariados dos fatores potencialmente de prognósticos sobre PFS e OS
HR (95% CI): taxa de risco estimada e intervalo de confiança correspondente a 95% a partir de modelos de Cox invariados
[0063] Seção bloqueada na Tabela 5 mostra associações significativas entre os níveis de marcadores e variáveis de prognósticos
[0064] O efeito de solCD44 e proteína total na previsão de sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (OS) parece ser independente do estágio.
[0065] Há uma necessidade enorme de um teste de detecção precoce de HNSCC simples, barato e não invasivo. Esforços prévios focaram em CD44, uma glicoproteína transmembrana que está emergindo como um marcador de iniciação de tumor de HNSCC crítico. Quando células SCC-25 (CD44 baixo) foram transfectadas com forma padrão CD44, foi demonstrado que a superexpressão de CD44 resultou em maior resistência de proliferação, migração e cisplatina (Figuras 3A, 3B, 3C). Além disso, knock-down do CD44 usando CAL27 de alta linhagem celular CD44 e EGFR resulta em crescimento tumoral muito diminuído em camundongos (Figura 4A, 2B) (P < 0,05). CD44 tem mostrado interagir com a quinase de tirosina chave tais como EGFR (o alvo para a terapia de cetuximab) para induzir o crescimento e migração. Os dados divulgados na Figura 5 mostram que o total de EGFR e sua forma fosforilada (Y1068) são reduzidos em xenotransplantes de CD44- siRNA, indicando que as duas moléculas são funcionalmente relacionadas.
[0066] Por causa da necessidade crítica por um teste de detecção precoce e o conhecimento de que o CD44 pode ser clivado a uma forma solúvel, solCD44 foi avaliado em enxagues orais de pacientes com câncer e controles. Em um estudo piloto, incluindo 26 pacientes com HNSCC e 10 voluntários saudáveis, foi demonstrado que solCD44 poderia ser detectado em enxagues orais e poderia distinguir os pacientes com doença invasiva de voluntários normais com uma sensibilidade de 79% e 100% de especificidade. Para determinar se este teste iria funcionar em uma população de maior risco, foi desenvolvida uma coorte de controle com um histórico de uso de tabaco e/ou álcool e doença benigna da cabeça e do pescoço. Neste estudo com 102 HNSCC e 69 controles, o teste de ELISA de solCD44 mostrou ter uma sensibilidade de 62% e especificidade de 88% e doença benigna mostrou não afetar significativamente os resultados. Níveis dos marcadores foram determinados serem menores em indivíduos com tumores de laríngeas/hipofaringe que são menos frequentes e localizados mais distalmente no trato aerodigestivo superior (UADT).
[0067] Para melhorar a sensibilidade, marcadores adicionais foram examinados. Proteína total, medida por um ensaio de Lowry simples e originalmente usado como um normalizador para o status de hidratação, foi encontrada elevada em HNSCC em comparação aos controles. Quando a mesma coorte foi avaliada, foi mostrado pela primeira vez que os níveis de solCD44 e proteínas totais combinados, são mais eficazes na distinção entre HNSCC e controles do que qualquer marcador sozinho. Trabalhos mais recentes em uma coorte de 39 controles e 40 casos demonstraram que inclusive outras variáveis de risco, tais como perda de dentes e educação melhoram no teste, resultando em uma área sob a curva (AUC) para a análise multivariada de 0,85. Tabela 7. Modelos de logística ajustados por idade
Tabela 8. SolCD44, log2solCD44 e níveis de proteína em enxagues bucais 
[0068] Es e estudo usou um projeto de caso-controle pa ra avaliar marcadores solúveis para HNSCC em 150 pacientes com HNSCC da cavidade oral e orofaringe e 150 controles de frequência pareados para variáveis importantes. A Tabela 7 mostra uma análise interina de níveis de solCD44, log2 SolCD44 e proteína total em 132 casos e 124 controles. Casos e controles foram frequentemente pareados com sucesso por idade, gênero, raça e etnia (p > 0.5). Ambos os níveis de proteína total e solCD44 são significativamente elevados. Os modelos logísticos na Tabela 8 são todos ajustados por idade. O teste detectou câncer bucal melhor em homens negros. Para as mulheres negras, o tamanho da amostra foi menor. Não houve efeito significativo de marcadores individualmente ou juntos, porém a razão de possibilidades correspondente foi na mesma direção que homens negros. Entre os homens brancos, o efeito de log2 CD44 foi significativo por sozinho, ou quando proteína foi adicionada. Houve uma ligeira melhora para o modelo 3, em comparação com o modelo 1. Finalmente, entre as mulheres brancas, os marcadores foram menos eficazes, com AUCs perto de 0,60. Como o teste de marcador funcionou melhor em homens negros, um grupo onde a infecção pelo HPV é menos comum, expressão do HPV foi examinada nos casos de câncer bucal.
[0069] Trinta e sete casos foram identificados com tecido FFPE disponível. Exceto para um paciente com seguimento de 13,9 meses, todos os restantes 20 pacientes vivos foram seguidos na faixa de 27 a 54,4 meses (média de 37 meses). Catorze de 16 mortes ocorreram dentro dos primeiros 2 anos de seguimento. níveis de proteína total e solCD44 foram avaliados em enxagues bocais e vários padrões de coloração de CD44, EGFR e p16 (como um substituto para a infecção pelo HPV) foram examinados usando IHC. Associações com a sobrevida livre de progressão e global também foram determinadas. Comportamentos demográficos e fatores de risco importantes, tais como gênero, raça, etnia, uso de tabaco e álcool também foram avaliados. Esta coorte tinha a seguinte demografia: a idade média foi de 60,4 anos, 16,2% eram do sexo feminino, 59,5% eram hispânicos, 21,6% eram negros, 64,9% eram fumantes, 50% eram alcoólicos, 57,1% tinham renda inferior a $10.000 por ano. Características de doença do grupo foram as seguintes: 35,1% eram cânceres na cavidade oral (OC) e o restante eram cânceres orofaríngeos (OP); apenas 32,4% dos sujeitos eram de estágio III ou inferior; pacientes foram tratados com epidermoide (43,2%), cirurgia e quimioradioterapia (24,3%), cirurgia sozinha (13,5%), cirurgia e radioterapia (5,4%), cirurgia e quimioterapia (2,7%), quimioterapia sozinha (2,7%) e nada ou faltam dados (5,4%). Quase 57% reincidiram ou progrediram e 43,2% morreram.
[0070] Quarenta e quatro por cento dos tumores eram p16 + conforme definido em 50% ou mais das células de tumor com coloração positiva para p16. Comparação de padrões IHC revelou que a coloração positiva p16, falta de coloração de membrana CD44, falta de padrão de coloração citoplasmática e de membrana EGFR, e tumores não queratinizantes foram significativamente associados com tumores OP em comparação com tumores OC. Não havia diferenças no estágio ou resultados por local do tumor. No que diz respeito à localização de coloração, positividade p16 foi significativamente associada com coloração p16 nuclear ou nuclear e citoplasmática (p < 0001) em vez de apenas coloração citoplasmática ou nenhuma coloração. Da mesma forma a falta de coloração da membrana de CD44 universal (p < 0,0001) foi associada com positividade p16. Falta de coloração citoplasmática e de membrana EGFR universal nos tumores positivos p16 também atingiu significância estatística (p = 0,02). Queratinização, gênero, etnia, raça, tabagismo e uso de álcool não foram significativamente relacionados à positividade p16 neste estudo.
[0071] Níveis de enxágue bucal de SolCD44 e proteína total não mostraram diferenças significativas com base no status de p16 se a definição de p16+ como 1) 50% ou mais de células de tumor p16+ ou 2) qualquer coloração nuclear p16 e não apenas coloração citoplasmática / nenhuma coloração foi usada. No entanto, para solCD44 e proteína total, níveis significativamente mais elevados foram associados com reincidência ou progressão (CD44:10,8 vs. 4,3 p = 0,043, proteína 1.2 vs. 0,8 p = 0,030). Baseado em Kaplan-Meier, teste de logrank e análise de regressão de Cox, preditores significativos da sobrevida livre de progressão foram CD44 (> 10 v. < 10, HR = 3,18 p = 0.011), proteína (> 1 v. < 1, HR = 3,24, p = 0,009), estágio T (T4 v. TI-III, HR = 2,99, p < 0.049), raça (negro v. branco, HR = 5,43, p < 0,0001) e etnia (não hispânicos vs. hispânicos, HR = 3,00, p < 0,014). Gênero quase alcançou importância (feminino v. masculino, HR = 2,39, p < 0,072). Similarmente, preditores significativos de sobrevida global foram CD44>10 (HR = 4,60, p = 0,005), Proteína >1 (HR = 3,38, p = 0,17), Estágio T4 (HR = 2,97, p = 0,035), Raça negra (HR = 6.53, p < 0,001) e Etnia Não hispânico (HR = 4,01, p = 0,008). As seguintes variáveis não mostraram nenhuma importância como preditor de sobrevida livre de progressão e sobrevida global: status p16, padrão de coloração de CD44, padrão de coloração de EGFR, queratinização, histórico de tabagismo, histórico de álcool, local (cavidade oral vs. orofaringe), e idade. Além disso, CD44 e proteína retiveram magnitude de efeito e importância na análise bivariada, incluindo o estágio da doença.
[0072] Neste grupo de HNSCC, apenas 5 sujeitos nunca foram fumantes; destes, 4 eram HPV+. Dos nunca fumantes HPV+ todos estavam vivos e 1 reincidiu. Assim, a falta de associação entre o status p16 e o prognóstico pode ser devida aos poucos nunca fumantes no estudo pois vários estudos mostram que não fumantes HPV+ têm um prognóstico significativamente melhor em relação aos fumantes HPV+.
[0073] Para investigar melhor as associações significativas entre a localização de p16, CD44, e EGFR, realizou-se a coloração de imunofluorescência. A Figura 6 mostra coloração p16-IHC típica onde a coloração é citoplasmática e difusa. Neste caso, CD44 colore a membrana e universalmente por todo o tumor. CD44 e EGFR se colocalizam na membrana celular e há alguma coloração citoplasmática de EGFR também.
[0074] No entanto, quando os tumores são p16+, como mostrado na Figura 7, os núcleos colorem fortemente para p16 e há também alguma coloração citoplasmática. No entanto, a coloração da membrana CD44 está perdida, somente os linfócitos invasores retêm expressão de CD44. A expressão de EGFR não é vista.
[0075] Os métodos das reivindicações anexadas não estão limitados no escopo pelos métodos específicos descritos neste documento, que se destinam como ilustrações de alguns aspectos das reivindicações e quaisquer métodos que são funcionalmente equivalentes estão no âmbito desta divulgação. Várias modificações dos métodos além daqueles mostrados e descritos neste documento destinam-se a enquadrarem-se no âmbito das reivindicações anexadas. Além disso, enquanto apenas determinados métodos e aspectos representativos desses métodos são especificamente descritos, outros métodos e combinações de várias características dos métodos destinam-se a enquadrarem-se no âmbito das reivindicações anexadas, mesmo que não especificamente recitado. Assim, uma combinação de etapas, elementos, componentes ou constituintes pode ser explicitamente mencionada neste documento; no entanto, todas as outras combinações de etapas, elementos, componentes e constituintes são incluídas, mesmo que não explicitamente declarado.
Claims (14)
1. Método para determinar um risco aumentado de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) em um indivíduo humano infectado com papiloma vírus humano (HPV), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma amostra, em que a amostra é obtida de um fluido corporal do indivíduo; (b) medir com um ensaio imunológico o nível de solCD44 na amostra; (c) medir com um ensaio de proteína o nível de proteína total na amostra; (d) combinar o nível de solCD44 medido na amostra com o nível de proteína total medido na amostra e o status HPV do indivíduo, fornecendo assim uma pontuação combinada; (e) fornecer uma pontuação preditiva para ter o risco aumentado de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, em que a pontuação preditiva é obtida por uma análise estatística de solCD44 e proteína total medida e o status HPV de uma população com risco aumentado de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço; (f) determinar o risco aumentado de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço no indivíduo quando a pontuação combinada exceder a pontuação preditiva, sendo que o indivíduo infectado por papiloma vírus humano é identificado pela detecção de p16INK4a.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o risco é um risco de recorrência do HNSCC.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é saliva.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de saliva é um enxague bucal.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um anticorpo diretamente contra CD44 é utilizado para medir o nível de solCD44.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ensaio utilizado é um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima, um ensaio de fluxo lateral ou Western Blot, ou compreende técnicas de imunoprecipitação, imunofluorescência or imunohistoquímica.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda medir o nível de pelo menos um de: ácido hialurônico (AH) e hialuronidase (HAase) na amostra.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo infectado por papiloma vírus humano é identificado pela detecção do DNA ou RNA do HPV, proteína do HPV, ou alterações epigenéticas.
9. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a p16INK4a; pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a CD44; e um reagente para a determinação da concentração de proteínas totais em uma amostra.
10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a p16 INK4a compreende o idiotipo do clone do anticorpo E6H4.
11. Kit, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma amostra de referência de CD44, uma amostra de referência de p16, ou uma combinação das mesmas.
12. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes colorimétricos para a detecção do anticorpo que se liga especificamente a p16INK4a, o anticorpo que se liga especificamente a CD44, ou uma combinação dos mesmos.
13. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que é um imunoensaio de fluxo lateral.
14. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma placa com múltiplos poços, opcionalmente revestida com o anticorpo que se liga especificamente a p16INK4a, o anticorpo que se liga especificamente a CD44, ou uma combinação dos mesmos.
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